專利名稱：一種基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及一種細胞成像方法，特別提供了一種基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法。
背景技術(shù)：
細胞的熒光成像對于觀察活細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，監(jiān)測細胞與外界分子相互作用，定量細胞內(nèi)物質(zhì)含量等方面的工作具有重要作用。
現(xiàn)有的細胞熒光成像方法主要有兩大類一種采用以激光為激發(fā)光源的共聚焦掃描顯微鏡和全內(nèi)反射顯微鏡進行操作。它們通常是直接利用激光器發(fā)射出的激光作為激發(fā)光源進行成像操作的。作為一種成熟的技術(shù)，以激光共聚焦掃描顯微鏡為核心設(shè)備進行細胞成像操作已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。在該技術(shù)中，被聚焦成衍射極限大小的激光光斑逐點掃描樣品，激發(fā)出的熒光信號由點檢測器收集，計算機重組后形成樣品圖像。但是該項技術(shù)存在造價高，難以動態(tài)實時監(jiān)測等明顯的不足。同時，采用全內(nèi)反射顯微鏡作為核心設(shè)備進行細胞成像操作則是以高數(shù)值孔徑的物鏡為基礎(chǔ)，激光在物鏡表面發(fā)生全內(nèi)反射，形成激發(fā)深度為幾百個納米的激發(fā)空間，從而可以實現(xiàn)對單個分子的成像，但是此項技術(shù)對細胞成像僅限于表面的幾百納米空間，給應(yīng)用帶來很大的局限性。
另一種是采用以汞燈為激發(fā)光源的熒光顯微鏡進行操作。選用熒光顯微鏡作為核心設(shè)備是一種非常普遍而常用的細胞熒光成像方法，但是由于汞燈譜線不單一，激發(fā)光源能量不夠集中等因素，對于微弱信號的檢測比較困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法。
本發(fā)明所述一種基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法，該方法以標記了染料的細胞為成像對象，細胞在激光照射下發(fā)出的熒光由顯微鏡物鏡收集，經(jīng)濾光片在CCD監(jiān)測器上成像并得到細胞的熒光照片；其特征在于選用經(jīng)過擴束后的激光作為細胞成像的激發(fā)光源。與汞燈相比較，激光具有單色性好、能量集中、成像清晰度高等優(yōu)點；與單一的激光束直接作為激發(fā)光源相比較，擴束后的激光可以使檢測和成像范圍明顯增大。
最終熒光成像照片中的細胞發(fā)光強度的確定方法是在熒光照片中，參照相對應(yīng)的光學(xué)照片中的圖像位置，每個細胞上取多個像素點的發(fā)光強度值，加和后作為熒光照片中該位置上細胞的發(fā)光強度；在每張熒光照片中取多個細胞計算平均發(fā)光強度作為細胞平均發(fā)光強度。
本發(fā)明所述基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法，其特征在于所述用于細胞成像的細胞濃度為104～106個/mL。濃度過低則視場內(nèi)細胞量少，細胞抽樣困難。濃度過高，易造成多個細胞重疊，不能反映單個細胞的熒光強度。
本發(fā)明所述基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法的專用設(shè)備，其特征在于設(shè)備的光路部分依激光及成像熒光通過路徑的先后順序由激光器(1)、快門(2)、擴束鏡(3)、反射鏡(4)、棱鏡(5)、顯微鏡物鏡(6)、陷波濾光片(7)、帶通濾光片(8)、CCD監(jiān)測器(9)構(gòu)成。
本發(fā)明所述基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法的專用設(shè)備，其特征在于可以在激發(fā)光路上使用快門(2)控制激發(fā)時間，以方便在不同的具體情況下選用。
本發(fā)明所述基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法的專用設(shè)備，其特征在于所述作為細胞成像激發(fā)光源的激光是經(jīng)過擴束鏡(3)擴束的，激光器(1)所發(fā)出的激光波長根據(jù)所用樣品具體情況進行選擇。激光功率密度為20mW/cm2～100mW/cm2。如果激光功率密度過低，細胞產(chǎn)生的熒光信號不能克服背景噪音，成像質(zhì)量差；如果激光功率密度過高，易造成檢測器飽和，直接影響到成像的質(zhì)量。
本發(fā)明基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法的專用設(shè)備，其特征在于所述經(jīng)擴束后的激光通過棱鏡(5)照射在滴于棱鏡(5)靠近濾光片一側(cè)表面的細胞樣品上，預(yù)先標記好染料的細胞在激光照射下發(fā)出的熒光由顯微鏡物鏡(6)收集，經(jīng)陷波濾光片(7)和帶通濾光片(8)后在CCD監(jiān)測器(9)上成像。
本發(fā)明基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法的專用設(shè)備，其特征在于所述光路部分可以通過調(diào)整反射鏡(4)使激光光斑處于顯微鏡物鏡(6)視場中心。
本發(fā)明基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法，用于監(jiān)測細胞與外界分子相互作用過程及定量細胞內(nèi)物質(zhì)含量。
本發(fā)明涉及一種基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法，提供了一種更方便地觀察活細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、監(jiān)測細胞與外界分子相互作用以及定量細胞內(nèi)物質(zhì)含量的方法，本發(fā)明所用細胞成像方法造價低廉、檢測精度和靈敏度較高、便于實現(xiàn)動態(tài)實時監(jiān)測，而且在成像清晰度和成像范圍之間取得了一種很好的處理效果。


圖1光路示意圖；圖2細胞熒光照片；圖3細胞光學(xué)照片；圖4標記了染料的糖分子動態(tài)進入植物細胞的過程；圖5相同孵育時間的S細胞的熒光強度與A細胞的熒光強度差對孵育時間的曲線。
具體實施例方式激光器所發(fā)出的激光波長根據(jù)所用樣品選擇，在以下兩實施例中所用激光波長為488mm。用于細胞成像的細胞濃度約為105個/mL實施例1(染料流入細胞含量測定)傳代培養(yǎng)的懸浮細胞轉(zhuǎn)入離心管后，磷酸緩沖液洗滌兩次，然后用加有Rho123(13.1pM)的磷酸緩沖液稀釋離心沉淀的細胞。將細胞液置于37℃保溫箱中孵育一定時間。離心后用含有轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑的磷酸緩沖液洗滌兩次。使細胞濃度在105個/ml左右，作為用于熒光成像的樣品。
參照細胞在光學(xué)照片中的位置，在熒光照片中每個細胞上取10個像素點的發(fā)光強度值，加和后作為該位置上細胞的發(fā)光強度。每張熒光照片中取10個以上的細胞計算平均發(fā)光強度。
選用敏感細胞(S，羅丹明轉(zhuǎn)運蛋白低表達細胞株)和耐藥細胞(A，羅丹明轉(zhuǎn)運蛋白高表達細胞株)作為模式細胞，分別與不同濃度染料孵育一定時間后，離心，熒光成像。S細胞的熒光強度與A細胞的熒光強度差對染料濃度的曲線見圖4。該曲線初步反映了細胞膜上的P-糖蛋白對底物Rho123的反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系，可以作為進一步計算反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km的基礎(chǔ)。
實施例2(動態(tài)觀察糖分子進入植物細胞的過程)取10uL培養(yǎng)的植物細胞液(細胞濃度在105個/ml左右，作為用于熒光成像的樣品底物)滴于棱鏡后，加1uL預(yù)先標記好染料的寡糖，僅在監(jiān)測器曝光時間打開快門，每10秒鐘記錄一幀細胞熒光照片(見圖4)。
圖4中照片1，2為最初20秒的照片，植物細胞相對模糊。30秒后，細胞個體局部熒光強度增強。隨著時間進一步增加，整個細胞全部發(fā)出熒光(見圖4中的照片9)。這個過程表明了糖分子進入植物細胞的動態(tài)過程。
權(quán)利要求
1.一種基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法，該方法以標記了染料的細胞為成像對象，細胞在激光照射下發(fā)出的熒光由顯微鏡物鏡收集，經(jīng)濾光片在CCD監(jiān)測器上成像并得到細胞的熒光照片；其特征在于選用經(jīng)過擴束后的激光作為細胞成像的激發(fā)光源；最終熒光成像照片中的細胞發(fā)光強度的確定方法是在熒光照片中，參照相對應(yīng)的光學(xué)照片中的圖像位置，每個細胞上取多個像素點的發(fā)光強度值，加和后作為熒光照片中該位置上細胞的發(fā)光強度；在每張熒光照片中取多個細胞計算平均發(fā)光強度作為細胞平均發(fā)光強度。
2.按照權(quán)利要求1所述基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法，其特征在于所述用于細胞成像的細胞濃度為104～106個/mL。
3.一種用于權(quán)利要求1所述基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法的專用設(shè)備，其特征在于設(shè)備的光路部分依激光及成像熒光通過路徑的先后順序由激光器(1)、快門(2)、擴束鏡(3)、反射鏡(4)、棱鏡(5)、顯微鏡物鏡(6)、陷波濾光片(7)、帶通濾光片(8)、CCD監(jiān)測器(9)構(gòu)成。
4.按照權(quán)利要求3所述基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法的專用設(shè)備，其特征在于所述作為細胞成像激發(fā)光源的激光是經(jīng)過擴束鏡(3)擴束的，激光器(1)所發(fā)出的激光功率密度為20mW/cm2～100mW/cm2。
5.按照權(quán)利要求3所述基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法專用設(shè)備，其特征在于所述經(jīng)擴束后的激光通過棱鏡(5)照射在滴于棱鏡(5)靠近濾光片一側(cè)表面的細胞樣品上，預(yù)先標記好染料的細胞在激光照射下發(fā)出的熒光由顯微鏡物鏡(6)收集，經(jīng)陷波濾光片(7)和帶通濾光片(8)后在CCD監(jiān)測器(9)上成像。
6.按照權(quán)利要求3所述基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法的專用設(shè)備，其特征在于所述光路部分可以通過調(diào)整反射鏡(4)使激光光斑處于顯微鏡物鏡(6)視場中心。
7.一種如權(quán)利要求1所述的基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法，用于監(jiān)測細胞與外界分子相互作用過程及定量細胞內(nèi)物質(zhì)含量。
全文摘要
本發(fā)明一種基于激光誘導(dǎo)熒光的細胞成像方法，在激光照射下，標記染料的細胞發(fā)出熒光由顯微鏡物鏡收集，經(jīng)濾光片在CCD監(jiān)測器上成像并得到細胞的熒光照片；其特征在于細胞成像的激發(fā)光源是經(jīng)過擴束后的激光；在熒光照片中的發(fā)光強度值都是多個平均計算得到的結(jié)果。依激光及成像熒光通過路徑的先后順序，本發(fā)明對應(yīng)專用設(shè)備的光路部分由激光器、快門、擴束鏡、反射鏡、棱鏡、顯微鏡物鏡、陷波濾光片、帶通濾光片、CCD監(jiān)測器構(gòu)成。本發(fā)明提供了一種更方便地觀察活細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、監(jiān)測細胞與外界分子相互作用以及定量細胞內(nèi)物質(zhì)含量的方法，本發(fā)明造價低廉、成像范圍較大且成像清晰，檢測精度和靈敏度較高、便于實現(xiàn)動態(tài)實時監(jiān)測。
文檔編號G01N21/64GK1712939SQ20041002079
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月22日
發(fā)明者蓋宏偉, 王玉林, 趙小明, 馬銀法, 林炳承 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所