專利名稱：一種提高生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物光學(xué)檢測儀器領(lǐng)域，更具體地說，它涉及一種提高生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度的方法。
背景技術(shù)：
生物芯片可應(yīng)用于疾病診斷、藥物開發(fā)、藥物個性化治療等生物學(xué)領(lǐng)域，生物芯片掃描儀是用于生物芯片信息檢測的信息讀出裝置，生物芯片上通過點樣儀固定有代表各種生物信息的探針，在其表面標記熒光物質(zhì)；使用時，將被測生物樣品涂敷在生物芯片上進行雜交，如果生物樣品中含有探針一致的信息，二者就結(jié)合在一起，就可以將熒光物質(zhì)固定，然后用蒸餾水沖洗生物芯片，沒有被固定的熒光物質(zhì)將被清洗掉，被固定的熒光物質(zhì)將被保留，因此，生物芯片的檢測，實際上是對雜交后芯片上微弱熒光物質(zhì)的檢測。
現(xiàn)有生物芯片檢測方法有CCD成像法和激光共聚焦掃描法兩種。
CCD成像法是用激發(fā)光源同時照射生物芯片，在檢測端用濾光片濾除激發(fā)光，只讓熒光通過，并通過成像系統(tǒng)在CCD上成像，由CCD記錄二維熒光信號。CCD成像法一次測量可以得到生物芯片上一塊面積的信息，因此其檢測速度快，但橫向分辨率比較低；視場很小，即一次測量的芯片面積較小，當需要測量的芯片面積較大時，就只能多次分塊測量，然后拼接起來。分塊掃描實際上是通過機械運動方式使芯片與成像系統(tǒng)做相對運動，但是由于機械定位誤差，將形成掃描圖像的拼接誤差，所以這種方法不適用于高密度生物芯片檢測，另一方面，CCD靈敏度遠低于光電倍增管，為此檢測靈敏度也是比較低的。
在激光共聚焦掃描法中，使用激光作為激發(fā)光，通過光學(xué)系統(tǒng)將激光會聚，生物芯片放置在焦平面上；然后使生物芯片做二維掃描，激光照射到熒光物質(zhì)時，將產(chǎn)生熒光，由光學(xué)系統(tǒng)收集熒光，最后通過光電倍增管將熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號。在激光共聚焦掃描法中，對生物芯片是逐點掃描的，由于生物芯片放置在焦平面上，因此激發(fā)光的光斑尺寸是非常小的，其橫向分辨率比較高。而且通過在接收端設(shè)置一共軛針孔，可以消除焦平面以外的雜散光的干擾，檢測靈敏度也比較高。但是，在高密度生物芯片檢測中，熒光信號強度非常微弱，作為光電轉(zhuǎn)換器件的光電倍增管的噪聲以及背景光將限制靈敏度的提高。而這個問題是共聚焦法所不能解決的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度受光電倍增管的噪聲以及背景光限制這一問題，給出一種提高靈敏度的方法，以使生物芯片激光共聚焦掃描儀適合于高密度生物芯片的檢測。
本發(fā)明方法包括以下步驟第一步以fm頻率對激發(fā)光源所發(fā)出的光進行強度調(diào)制，使恒定激光激發(fā)時所產(chǎn)生的熒光信號頻率fs為被移到fm-fs，熒光信號具有與光電倍增管的噪聲以及背景光噪聲有所區(qū)別的fm-fs的頻率特征，第二步然后對熒光電信號進行帶通放大，放大后的熒光電信號輸入到相敏檢波電路，同時將調(diào)制激光器用的交流信號做為參考信號輸入到相敏檢波電路，通過相敏檢波解調(diào)電路濾除燥聲并恢復(fù)頻率為fs的熒光信號。
所述的調(diào)制頻率fm與恒定激光激發(fā)時所產(chǎn)生的熒光信號頻率fs之間應(yīng)滿足fm＞＞fs，至少為fm＞10fs。
用半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源，激光的調(diào)制通過直接調(diào)制激光器驅(qū)動電流實現(xiàn)，激發(fā)光源采用包括He-Ne激光器的其它類型激光器，激光的調(diào)制通過斬波器來實現(xiàn)。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明能著降低生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度受光電倍增管的噪聲以及背景光燥聲對靈敏度的影響，滿足高密度生物芯片檢測的需要。


圖1是本發(fā)明實施例1原理圖，圖2是合成器原理圖；圖3是本發(fā)明實施2原理圖；圖4是斬波器中轉(zhuǎn)盤的示意5是斬波器結(jié)構(gòu)圖具體實施方式
下面結(jié)合附圖1、2、3、4、5對本發(fā)明作進一步的描述。
本發(fā)明方法包括以下步驟第一步以fm頻率對激發(fā)光源所發(fā)出的光進行強度調(diào)制，使恒定激光激發(fā)時所產(chǎn)生的熒光信號頻率fs為被移到fm-fs，熒光信號具有與光電倍增管的噪聲以及背景光噪聲有所區(qū)別的fm-fs的頻率特征；第二步然后對熒光電信號進行帶通放大，放大后的熒光電信號輸入到相敏檢波電路，同時將調(diào)制激光器用的交流信號做為參考信號輸入到相敏檢波電路，通過相敏檢波解調(diào)電路濾除燥聲并恢復(fù)頻率為fs的熒光信號。
其工作原理是用正弦波信號對激光器進行強度調(diào)制，設(shè)調(diào)制頻率為fm，激發(fā)光表示為I(t)＝Imcos(2πft)式中Im為激發(fā)光強度；設(shè)芯片勻速掃描、恒定度幅激光(強度為Im)激發(fā)下，產(chǎn)生的熒光信號為Is(t)＝Ismcos(2fst)在調(diào)制后激光激發(fā)下，得到的熒光信號則為I′s(t)＝Ismcos(2πfst)cos(2πfmt)在光電倍增管中轉(zhuǎn)換為電信號為us(t)＝RIsmcos(2πfst)cos(2πfmt)式中R為光電轉(zhuǎn)換參數(shù)。
解調(diào)時，使用正弦信號調(diào)制信號作為同步信號，與熒光電信號相乘，再通過低通濾波器濾除高頻信號，得到原始熒光信號。濾除載波信號在數(shù)學(xué)上可以用在載波信號的一個周期內(nèi)取平均值來表示，輸出信號可表示為輸出信號可表示為u0=12π∫02πuscos(2πfmt)d(2πfmt)=12π∫02πRIsmcos(2πfst)cos2(2πfmt)d(2πfmt)]]>=12π∫02πRIsmcos(2πfst)(1+cos(4πfmt)2)d(2πfmt)=12RIsmcos(2πfst)]]>可見，經(jīng)過相敏檢波后可獲得原始熒光信號。下面分析本方法濾除噪聲的能力。
當光電倍增管的噪聲以及背景光噪聲迭加到熒光信號上時，這種噪聲為加性噪聲。首先考慮頻率為載波高次諧波頻率的噪聲，設(shè)為un(2πnfmt)，其中n為大于1的整數(shù)，由它產(chǎn)生的附加輸出為un0=12π∫02πuncos(2πnfmt)d(2πfmt)]]>=14π∫02πun[cos(2π(n-1)fmt)+cos(2π(n+1)fmt)]d(2πfmt)=0]]>可見相敏檢波電路具有抑制頻率為載波高次諧波頻率的噪聲的能力。當噪聲頻率fn與載波頻率fm無倍數(shù)關(guān)系時，有un0=12π∫02πuncos(2πnfmt)d(2πfmt)]]>=14π∫02πun[cos(2π(fn-fm)t)+cos(2π(fn+fm)t)d(2πfmt)]]>
總的來說，當fn與fmfm無倍數(shù)關(guān)系時，上述積分式的值不為零。但是1)fs+fm與fs-fm值越大，積分式中正負相消的成分越多，積分值越??；2)fn接近為fm不等于1的整數(shù)倍時，在2πfm的2π周期，cos(2π(fs+fm))與cos(2π(fs-fm))接近變化整數(shù)個周期，積分式中正負成分大部相消，積分值接近為零。這就是說，除了fs≈fm的一個窄頻帶內(nèi)，其他頻率的輸入信號均得到較大的衰減，這說明相敏檢波電路具有抑制干擾的能力。從而，證明了本方法提高靈敏度的可行性。
本發(fā)明可以顯著降低生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度受光電倍增管的噪聲以及背景光燥聲對靈敏度的影響，滿足高密度生物芯片檢測的需要。
實施例1以半導(dǎo)體激光器(LD)為激發(fā)光源的提高生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度的方法CY5熒光物質(zhì)的吸收峰值波長約為630nm，因此可以使用波長為635nm的半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源。所述的激發(fā)光源用半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源，激光的調(diào)制通過直接調(diào)制激光器驅(qū)動電流實現(xiàn)，由與半導(dǎo)體激光器相連接的信號發(fā)生器輸出方波電壓信號作為調(diào)制信號，直流電源輸出恒定電壓作為偏置電壓，二者在合成器中合成，形成半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電流，半導(dǎo)體激光器被調(diào)制后輸出方波形狀的激發(fā)光。
由圖1所示，儀器信號發(fā)生器1、直流電源2、合成器3、激光器4、反射鏡5、反射全息帶阻濾光片6、顯微物鏡7、載波片8、二維掃描平臺9、反射全息帶阻濾光片10、聚焦透鏡11、針孔12、光電倍增管13、帶通放大器14、相敏檢波器15。信號發(fā)生器1輸出方波電壓信號作為調(diào)制信號，直流電源2輸出恒定電壓作為偏置電壓，二者在合成器3中合成，形成半導(dǎo)體激光器4的驅(qū)動電流。半導(dǎo)體激光器4被調(diào)制后輸出方波形狀的激發(fā)光，經(jīng)反射鏡5反射，入射到反射全息帶阻濾光片6上，經(jīng)反射全息帶阻濾光片6反射，進入到顯微物鏡7，激發(fā)光被會聚，焦點位于生物芯片8的前表面，激發(fā)出熒光。在測量過程中，生物芯片8由二維掃描平臺9帶動，進行二維掃描。
熒光及散射激發(fā)光由顯微物鏡7收集并轉(zhuǎn)換為平行光，熒光及部分散射激發(fā)光透過反射全息帶阻濾光片6后，散射激發(fā)光被反射全息濾光片10進一步濾光，而熒光通過反射全息帶阻濾光片10。熒光由聚焦透鏡11會聚，通過放置于焦點處的針孔12，而雜散光則不能通過針孔12。通過針孔12的熒光照射在光電倍增管13上，轉(zhuǎn)換為電信號，經(jīng)帶通放大器14放大后輸入到相敏檢波器15，同時信號發(fā)生器1輸出的方波電壓信號也輸入到相敏檢波器15，作為同步參考信號。相敏檢波器15的輸出信號為解調(diào)的熒光信號，并有效減小了光電倍增管13的噪聲影響。
圖2為合成器3的原理圖。合成器同時具有將調(diào)制電壓和偏置電壓合成并轉(zhuǎn)換為電流的功能。使用集成運算放大器作為核心元件，采用差動放大結(jié)構(gòu)。方波調(diào)制電壓Vm經(jīng)電阻R1輸入到集成運算放大器的反相端，直流偏置Vb經(jīng)電阻R2輸入到集成運算放大器的同相端。輸出端電壓V0為V0=(1+RfR1)R3R2+R3Vb-RfR1Vm]]>設(shè)半導(dǎo)體激光器正向?qū)妷簽闉閂D，則半導(dǎo)體激光器工作電流為I=V0-VDRL]]>半導(dǎo)體激光器的輸出功率P為P＝Pth+R(I-Ith)其中，Ith為半導(dǎo)體激光器的閾值電流，Pth為當半導(dǎo)體激光器的工作電流為閾值電流時的輻射功率，R為電光轉(zhuǎn)換效率。
方波電壓信號將使半導(dǎo)體激光器輸出功率為方波形式的光信號。半導(dǎo)體激光器具有高達GHz的調(diào)制頻率，完全可以滿足需要。
實施例2以He-Ne激光器為激發(fā)光源的提高生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度的方法CY5熒光物質(zhì)的吸收峰值波長約為630nm，因此可以使用波長為632.8nm的He-Ne激光器作為激發(fā)光源。激發(fā)光源采用-Ne激光器，激光的調(diào)制通過斬波器來實現(xiàn)，He-Ne激光器所發(fā)出的激發(fā)光由斬波器調(diào)制，調(diào)制后輸出方波形狀的激發(fā)光。如圖3所示，He-Ne激光器4發(fā)射功率恒定的激發(fā)光，激發(fā)光經(jīng)過斬波器16，激發(fā)光被斬波器16調(diào)制，調(diào)制后輸出方波形狀的激發(fā)光，經(jīng)反射鏡5射，入射到分光鏡17一部分光被反射，被光電管18為電信號，作為同步參考信號；分光鏡17射光作為激發(fā)光，入射到反射全息帶阻濾光片6上，經(jīng)反射全息帶阻濾光片6反射，進入到顯微物鏡7，激發(fā)光被會聚，焦點位于生物芯片8的前表面，激發(fā)出熒光。在測量過程中，生物芯片8由二維掃描平臺9帶動，進行二維掃描。
熒光及散射激發(fā)光由顯微物鏡7收集并轉(zhuǎn)換為平行光，熒光及部分散射激發(fā)光透過反射全息帶阻濾光片6后，散射激發(fā)光被反射全息帶阻濾光片10進一步濾光，而熒光通過反射全息帶阻濾光片10。熒光由聚焦透鏡11會聚，通過放置于焦點處的針孔12，而雜散光則不能通過針孔12。通過針孔12的熒光照射在光電倍增管13上，轉(zhuǎn)換為電信號，經(jīng)帶通放大器14放大后輸入到相敏檢波器15，同時光電管5輸出的信號作為同步參考信號也輸入到相敏檢波器15，作為同步參考信號。相敏檢波器15的輸出信號為解調(diào)的熒光信號，并有效減小了光電倍增管13的噪聲影響。
He-Ne激光器輸出激發(fā)光調(diào)制所用的斬波器是由邊緣上開有大小相同均布小孔的轉(zhuǎn)盤與電機轉(zhuǎn)軸連接而成。圖4為斬波器16的示意圖，在轉(zhuǎn)盤的邊緣開有分布均勻、半徑相同的小孔，激光可以通過小孔。激光垂直照射轉(zhuǎn)盤表面，轉(zhuǎn)盤繞圓心轉(zhuǎn)動時，從轉(zhuǎn)盤另一側(cè)可得到強度調(diào)制的激光。圖5為斬波器的結(jié)構(gòu)圖，轉(zhuǎn)盤19通過轉(zhuǎn)軸20連接電機21，繞圓心勻速轉(zhuǎn)動，電機21機固定架22在底座上。調(diào)制頻率可通過電機21轉(zhuǎn)速和轉(zhuǎn)盤19孔的數(shù)量來確定。設(shè)電機21轉(zhuǎn)速為m轉(zhuǎn)/秒，轉(zhuǎn)盤19孔數(shù)為n，則調(diào)制頻率fm為fm＝m×nHz
權(quán)利要求
1.種提高生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度的方法，其特征在于方法包括以下步驟第一步以fm頻率對激發(fā)光源所發(fā)出的光進行強度調(diào)制，使恒定激光激發(fā)時所產(chǎn)生的熒光信號頻率fs為被移到fm-fs，熒光信號具有與光電倍增管的噪聲以及背景光噪聲有所區(qū)別的fm-fs的頻率特征，第二步然后對熒光電信號進行帶通放大，放大后的熒光電信號輸入到相敏檢波電路，同時將調(diào)制激光器用的交流信號做為參考信號輸入到相敏檢波電路，通過相敏檢波解調(diào)電路濾除燥聲并恢復(fù)頻率為fs的熒光信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度的方法，其特征在于，所述的調(diào)制頻率fm與恒定激光激發(fā)時所產(chǎn)生的熒光信號頻率fs之間應(yīng)滿足fm＞＞fs，至少為fm＞10fs。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度的方法，其特征在于，所述的激發(fā)光源用半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源，激光的調(diào)制通過直接調(diào)制激光器驅(qū)動電流實現(xiàn)，由與半導(dǎo)體激光器相連接的信號發(fā)生器輸出方波電壓信號作為調(diào)制信號，直流電源輸出恒定電壓作為偏置電壓，二者在合成器中合成，形成半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電流，半導(dǎo)體激光器被調(diào)制后輸出方波形狀的激發(fā)光。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度的方法，其特征在于，所述的激發(fā)光源為He-Ne激光器，激光的調(diào)制通過斬波器來實現(xiàn)，He-Ne激光器所發(fā)出的激發(fā)光由斬波器調(diào)制，調(diào)制后輸出方波形狀的激發(fā)光。
5.如權(quán)利要求1或4所述的一種提高生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度的方法，其特征在于，所述的對He-Ne激光器輸出激發(fā)光調(diào)制所用的斬波器是由邊緣上開有大小相同均布小孔的轉(zhuǎn)盤與電機轉(zhuǎn)軸連接而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高生物芯片激光共聚焦掃描儀靈敏度的方法，以使生物芯片激光共聚焦掃描儀適合于高密度生物芯片檢測。第一步以f
文檔編號G01N33/52GK1595152SQ20041002564
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者馬軍山, 袁武, 付東翔, 侯琳琳, 陳家璧 申請人:上海理工大學(xué)