專利名稱：一種診斷過(guò)敏性疾病變應(yīng)原的檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫診斷領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種運(yùn)用納米免疫磁珠(IMB)即包被有變應(yīng)原的磁性微球快速診斷過(guò)敏性疾病過(guò)敏原的方法。
背景技術(shù)：
過(guò)敏性疾病(如哮喘、過(guò)敏性鼻炎等)是臨床上的常見(jiàn)病、多發(fā)病，據(jù)2000年WHO/IAACI報(bào)告指出近些年來(lái)哮喘的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。全國(guó)部分城市對(duì)青少年哮喘流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)(ISSAC調(diào)查)哮喘發(fā)病率為3.3％-5.1％，遠(yuǎn)較10年前(約1％)升高；目前全國(guó)至少有一千萬(wàn)以上兒童患哮喘。
過(guò)敏性疾病是由于各種接觸或吸入變應(yīng)原引起的，變應(yīng)原大部分為蛋白質(zhì)，也可為多肽或糖類以及人工合成的物質(zhì)如藥物等。變應(yīng)原種類很多，多達(dá)數(shù)百種，國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的大約有40-60種。最常見(jiàn)的變應(yīng)原有塵螨、花粉和真菌等。在發(fā)生過(guò)敏的病人血液中會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該過(guò)敏物質(zhì)的抗體，如速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該過(guò)敏物質(zhì)免疫球蛋白E(IgE)。通過(guò)酶標(biāo)的方法能夠測(cè)定該IgE，從而找到相對(duì)應(yīng)的過(guò)敏原。檢查過(guò)敏原的目的是為了找出過(guò)敏的原因。比如酶標(biāo)檢測(cè)到過(guò)敏患者血清中有針對(duì)牛奶的抗體IgE，就表明該患者對(duì)牛奶有過(guò)敏的可能。診斷出特異性的變應(yīng)原對(duì)避免接觸變應(yīng)原及展特異性免疫治療是很重要的。
隨免疫學(xué)的不斷發(fā)展，運(yùn)用各種新的免疫技術(shù)，如化學(xué)發(fā)光技術(shù)、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定技術(shù)、熒光偏振免疫分析測(cè)定技術(shù)等進(jìn)行自動(dòng)化免疫分析的儀器不斷涌現(xiàn)。它們不僅提高了工作人員的效率，還大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度，其中有的靈敏度可達(dá)ng甚至pg級(jí)水平。
納米磁性粒子酶免疫測(cè)定技術(shù)是新型、高效、靈敏、安全的免疫檢測(cè)技術(shù)，它結(jié)合了納米磁性粒子和酶免疫化學(xué)發(fā)光技術(shù)，靈敏度高于傳統(tǒng)酶標(biāo)ELISA法，達(dá)到放射性免疫檢測(cè)法的靈敏度，且無(wú)放射性污染，操作簡(jiǎn)單快捷，具有特異性高等優(yōu)點(diǎn)。因此，研制出變應(yīng)原檢測(cè)用的納米磁性粒子對(duì)變態(tài)反應(yīng)性疾病的診斷和治療是很有價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的即在于提供一種快速、廉價(jià)和特異的診斷過(guò)敏性疾病變應(yīng)原納米磁珠酶免疫化學(xué)發(fā)光分析法。
本發(fā)明采用包被變應(yīng)原的納米磁性粒子，它具有體積小、濃度高、結(jié)合面積大和造價(jià)低廉的特點(diǎn)，可大量、特異性地結(jié)合病人血清中的IgE抗體，分離簡(jiǎn)單、快速，操作方便。
本發(fā)明采用了納米磁性粒子酶免疫分析技術(shù)原理。先以包被蛋白質(zhì)A的磁性納米粒子與待測(cè)病人血清孵育后，血清中的IgG被特異性的去除。再將血清加入包被有變應(yīng)原的磁性納米粒子，血清中IgE與變應(yīng)原特異性地結(jié)合，在加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體，經(jīng)溫育后形成固相包被抗原-抗體-酶標(biāo)記二抗復(fù)合物。洗滌、分離后加入底物AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑，AMPPD在堿性磷酸酶的催化作用下，迅速去磷酸，生產(chǎn)中介體AMPD。AMPD很快分解，從高能激發(fā)狀態(tài)，回到低能量的穩(wěn)定態(tài)，同時(shí)發(fā)射光子，這種發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)1小時(shí)。通過(guò)光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強(qiáng)度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗體的濃度。
本發(fā)明首次采用天然或重組變應(yīng)原進(jìn)行磁性粒子包被。變應(yīng)原可以是來(lái)自以下物質(zhì)的變應(yīng)原屋塵螨，例如Dermatophagoidesfarinae或屋塵螨；真菌(例如鏈格孢屬、曲霉屬、枝孢屬和青霉屬)；樹(shù)花粉，例如樺樹(shù)白樺樹(shù)、榿木、榛樹(shù)、橡樹(shù)、柳樹(shù)、懸鈴木、山毛櫸、榆樹(shù)、楓木、岑樹(shù)和鵝耳櫪的花粉；草花粉，例如蒿、梯牧草、六月禾、早熟禾、黑麥草、果園草鴨茅、豚草、甜春草、黃花茅和黑麥的花粉；貓、狗或馬的皮屑；昆蟲(chóng)(例如蟑螂)；或蝦、蟹、牛奶等食物。
本發(fā)明提供了一種新型的過(guò)敏性疾病檢測(cè)方法，采用包被變應(yīng)原的納米磁性粒子，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、具有高特異性和靈敏性等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明包括以下步驟制備磁性納米粒子。通過(guò)天然或基因工程方法獲得塵螨、真菌和花粉等變應(yīng)原，進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，包被磁性納米粒子。另外，制備用蛋白質(zhì)A包被的納米磁性粒子。選用對(duì)特異性變應(yīng)原過(guò)敏病人血清進(jìn)行鑒定。包被蛋白質(zhì)A的磁性納米粒子與病人血清孵育后，血清中的大部分IgG被特異性的去除。再將血清加入包被有變應(yīng)原的磁性納米粒子，血清中IgE與變應(yīng)原特異性地結(jié)合，在加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)溫育后形成固相包被抗原-抗體-酶標(biāo)記二抗復(fù)合物。洗滌、分離后加入底物AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑，堿性磷酸酶的催化作用下，迅速去磷酸，生產(chǎn)中介體AMPD。AMPD很快分解，從高能激發(fā)狀態(tài)，回到低能量的穩(wěn)定態(tài)，同時(shí)發(fā)射光子，通過(guò)光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強(qiáng)度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗體的濃度。血清特異性IgE超過(guò)100IU/ml的即認(rèn)為該變應(yīng)原反應(yīng)陽(yáng)性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的內(nèi)容，通過(guò)以下的實(shí)施例作具體說(shuō)明實(shí)施例1屋塵螨天然變應(yīng)原的制備屋塵螨收集自深圳大學(xué)師范學(xué)院附中宿舍，并在深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)行純培養(yǎng)獲得。
收集屋塵螨，稱量去脂材料，按1∶5比例(1g屋塵加入5ml提取液)加入碳酸氫鈉-鹽水提取液，提取72小時(shí)。每天在振蕩器上振蕩2小時(shí)，其余時(shí)間放入冰箱提取。
提取完成后，先用多層紗布過(guò)濾，棄去沉淀物，再用布氏漏斗加多層濾紙減壓過(guò)濾，澄清液體。記錄濾液量，放入透囊中透析24小時(shí)。使用碳酸氫鈉-鹽水提取液作為透析用液，每6小時(shí)更換一次。透析完畢，再稱量濾液，如因鹽析作用多出原量或少于原量，進(jìn)行濃縮或稀釋，使之保持原量。校正溶液pH值，使之保持在7。
在嚴(yán)格無(wú)菌操作下，將消毒蔡氏濾器安裝于消毒濾瓶上，用蒸餾水打濕濾板，倒入屋塵溶液。15分鐘后接通真空泵，使濾液穿過(guò)濾材滴入濾瓶，于無(wú)菌下分裝于瓶中。貼好標(biāo)簽，打上批號(hào)，放入4-6℃冰箱儲(chǔ)備待用。
實(shí)施例2花粉天然變應(yīng)原的制備蒿和豚草等植物于開(kāi)花期去野外剪回花枝，插入裝滿水的容器內(nèi)(清水應(yīng)每天更換，以防止枝條腐爛)，下面鋪以白紙，每日輕輕敲打花枝，花粉則隨開(kāi)隨落于紙上。
收集去脂材料，按1∶25加入碳酸氫鈉-鹽水提取液。在冰箱里提取72小時(shí)，每天振蕩或攪拌2小時(shí)。
用常壓或減壓過(guò)濾，澄清液體，并測(cè)定和校正pH值至7。
其余步驟與屋塵螨變應(yīng)原制備。
實(shí)施例3真菌天然變應(yīng)原的制備用曝皿法從空氣中收集菌種。
菌種的分離鑒定。
配置固體培養(yǎng)基，制作帶有培基的無(wú)菌皿碟和斜面培養(yǎng)管。于室外空氣中打開(kāi)皿蓋，曝露3分鐘左右，取回實(shí)驗(yàn)室，在室溫下(或溫箱中)靜置。幾天后，落進(jìn)皿碟中的真菌孢子即發(fā)芽生長(zhǎng)，并形成菌落。于酒精燈下，挑取培養(yǎng)物制成臨時(shí)壓片，在顯微鏡下進(jìn)行鑒定，并將所需要的菌株移至培養(yǎng)管斜面上，保存純菌種。
用液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)，培養(yǎng)天數(shù)視培養(yǎng)物生長(zhǎng)快慢而定。液體培養(yǎng)基的配制方法詳見(jiàn)葉世泰主編的《變態(tài)反應(yīng)學(xué)》(1998年，科學(xué)出版社)。
收集菌毯，用冷水輕輕洗凈上面的殘留培養(yǎng)基?？厝ニ郑尤?5％酒精浸泡1小時(shí)滅活。室溫下自然干燥，用組織打碎機(jī)粉碎。去脂、干燥。
稱量去脂材料，按1∶25加入碳酸氫鈉-鹽水提取液。在冰箱里提取72小時(shí)，每天振蕩或攪拌2小時(shí)。
用常壓或減壓過(guò)濾，澄清液體，并測(cè)定和校正pH值至7。
實(shí)施例4納米磁性粒子的制備和性質(zhì)分析Fe(III)和Fe(II)(0.5M∶0.5M)混合，即FeCl3.6H2O和FeCl2.4H2O溶于在脫氣的蒸餾水中，將20％(w/v)多聚物(Dextran或PVA)水溶液等體積與鐵溶液混合，60℃水浴15分鐘。1M氨水溶液以等體積逐滴滴入鐵多聚物混合溶液，以保持pH在11.5，60℃加熱15分鐘，并劇烈攪拌，將懸液對(duì)水(pH6.5)透析(Sigma透析袋，分子量限制為12400)，12000g離心20分鐘，收集上清，冷凍干燥。
將凍干粒子溶于濃鹽酸，用原子吸收光譜分析Fe含量。TEM分析粒子大小。
納米粒子1ug溶于1ml蒸餾水，與100ug/ml(終濃度)的蛋白A共賦育，以制備蛋白A包被的納米粒子。
實(shí)施例5塵螨變應(yīng)原包被納米粒子用過(guò)敏病人血清進(jìn)行鑒定。包被蛋白質(zhì)A的磁性納米粒子與病人血清孵育后，血清中的大部分IgG被特異性的去除。再將血清加入包被有變應(yīng)原的磁性納米粒子，血清中IgE與變應(yīng)原特異性地結(jié)合，在加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)溫育后形成固相包被抗原-抗體-酶標(biāo)記二抗復(fù)合物。洗滌、分離后加入底物AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑，堿性磷酸酶的催化作用下，迅速去磷酸，生產(chǎn)中介體AMPD。AMPD很快分解，從高能激發(fā)狀態(tài)，回到低能量的穩(wěn)定態(tài)，同時(shí)發(fā)射光子，通過(guò)光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強(qiáng)度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗體的濃度。10份經(jīng)皮試測(cè)試陽(yáng)性的塵螨過(guò)敏病人血清特異性IgE抗體濃度范圍為150-300IU/ml，10份陰性血清抗體濃度范圍為10-48IU/ml。為此采用100IU/ml作為診斷對(duì)該變應(yīng)原反應(yīng)陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。如低于100IU/ml的即為陰性。
實(shí)施例6花粉變應(yīng)原包被納米粒子用過(guò)敏病人血清進(jìn)行鑒定。包被蛋白質(zhì)A的磁性納米粒子與病人血清孵育后，血清中的大部分IgG被特異性的去除。再將血清加入包被有變應(yīng)原的磁性納米粒子，血清中IgE與變應(yīng)原特異性地結(jié)合，在加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)溫育后形成固相包被抗原-抗體-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。洗滌、分離后加入底物AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑，堿性磷酸酶的催化作用下，迅速去磷酸，生產(chǎn)中介體AMPD。AMPD很快分解，從高能激發(fā)狀態(tài)，回到低能量的穩(wěn)定態(tài)，同時(shí)發(fā)射光子，通過(guò)光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強(qiáng)度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗體的濃度。10份經(jīng)皮試測(cè)試陽(yáng)性的花粉過(guò)敏病人血清特異性IgE抗體濃度范圍為150-300IU/ml，10份陰性血清抗體濃度范圍為10-47IU/ml。為此采用100IU/ml作為診斷對(duì)該變應(yīng)原反應(yīng)陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。如低于100IU/ml的即為陰性。
實(shí)施例7真菌變應(yīng)原包被納米粒子用過(guò)敏病人血清進(jìn)行鑒定。包被蛋白質(zhì)A的磁性納米粒子與病人血清孵育后，血清中的大部分IgG被特異性的去除。再將血清加入包被有變應(yīng)原的磁性納米粒子，血清中IgE與變應(yīng)原特異性地結(jié)合，在加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)溫育后形成固相包被抗原-抗體-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。洗滌、分離后加入底物AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑，堿性磷酸酶的催化作用下，迅速去磷酸，生產(chǎn)中介體AMPD。AMPD很快分解，從高能激發(fā)狀態(tài)，回到低能量的穩(wěn)定態(tài)，同時(shí)發(fā)射光子，通過(guò)光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強(qiáng)度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗體的濃度。10份經(jīng)皮試測(cè)試陽(yáng)性的真菌過(guò)敏病人血清特異性IgE抗體濃度范圍為140-310IU/ml，10份陰性血清抗體濃度范圍為10-45IU/ml。為此采用100IU/ml作為診斷對(duì)該變應(yīng)原反應(yīng)陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。如低于100IU/ml的即為陰性。
權(quán)利要求
1.一種新型的診斷過(guò)敏性疾病變應(yīng)原的檢驗(yàn)方法。包括以下步驟制備納米磁性粒子。通過(guò)天然或基因工程方法獲得塵螨、真菌和花粉等變應(yīng)原，進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，包被磁性納米粒子。另外，制備用蛋白質(zhì)A包被的磁性納米粒子。包被蛋白質(zhì)A的磁性納米粒子與待測(cè)病人血清孵育后，血清中的大部分IgG被特異性的去除。再將血清加入包被有變應(yīng)原的磁性納米粒子，血清中IgE與變應(yīng)原特異性地結(jié)合，在加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體，經(jīng)溫育后形成固相包被抗原-抗體-酶標(biāo)記二抗復(fù)合物。經(jīng)洗滌、分離后加入底物AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑，AMPPD在堿性磷酸酶的催化作用下，迅速去磷酸，生產(chǎn)不穩(wěn)定的中介體AMPD。AMPD很快分解，從高能激發(fā)狀態(tài)，回到低能量的穩(wěn)定態(tài)，同時(shí)發(fā)射光子，這種發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)1小時(shí)。通過(guò)光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強(qiáng)度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗體的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用納米磁性粒子酶聯(lián)免疫檢測(cè)的方法，其特征在于用天然或重組塵螨變應(yīng)原包被納米磁性粒子及用于檢測(cè)過(guò)敏病人特異性IgE抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用納米磁性粒子酶聯(lián)免疫檢測(cè)的方法，其特征在于用天然或重組真菌變應(yīng)原包被納米磁性粒子及用于檢測(cè)過(guò)敏病人特異性IgE抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用納米磁性粒子酶聯(lián)免疫檢測(cè)的方法，其特征在于用天然或重組花粉變應(yīng)原包被納米磁性粒子及用于檢測(cè)過(guò)敏病人特異性IgE抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用納米磁性粒子酶聯(lián)免疫檢測(cè)的方法，其特征在于用其他天然或重組變應(yīng)原包被納米磁性粒子及用于檢測(cè)過(guò)敏病人特異性IgE抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型診斷過(guò)敏性疾病變應(yīng)原的檢驗(yàn)方法。通過(guò)天然或重組的方法獲得塵螨、真菌和花粉等變應(yīng)原，并包被在磁性納米粒子。包被蛋白A的磁性納米粒子與待測(cè)病人血清孵育后，血清中的大部分IgG被去除。再將血清加入包被有變應(yīng)原的磁性納米粒子，血清中IgE與變應(yīng)原特異性地結(jié)合，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)溫育后形成固相包被抗體－抗原－酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。洗滌、分離后加入底物AMPPD做化學(xué)發(fā)光劑，AMPPD在堿性磷酸酶的催化作用下去磷酸并生產(chǎn)中介體AMPD，AMPD分解發(fā)射光子。通過(guò)光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強(qiáng)度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗體的濃度。血清特異性IgE超過(guò)100IU/ml的即認(rèn)為該變應(yīng)原反應(yīng)為陽(yáng)性。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1614421SQ20041002810
公開(kāi)日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2004年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者劉志剛, 邢苗, 喻海瓊, 吉坤美, 高波 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)