專利名稱：抗hla－g的單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細(xì)胞株、癌癥診斷方法、診斷試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，具體地說(shuō)，涉及一種抗人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)的單克隆抗體及其分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)常見惡性腫瘤病變中的HLA-G異常表達(dá)來(lái)診斷癌癥的方法。
本發(fā)明還涉及利用該抗體制備的診斷惡性腫瘤的免疫組化試劑盒，以及該試劑盒在癌癥診斷，評(píng)價(jià)癌癥轉(zhuǎn)移和預(yù)后以及治療指導(dǎo)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
為了防止機(jī)體受到諸如病毒和細(xì)菌等外來(lái)病原的侵襲，哺乳動(dòng)物在其進(jìn)化過(guò)程中形成了稱為主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的復(fù)雜系統(tǒng)，可以將自體與異體相區(qū)別。人類的MHC基因組，也稱為人類白細(xì)胞抗原(HLA)體系，位于6號(hào)染色體的短臂上，被分隔成三個(gè)不同的族I，II和III族。經(jīng)典的HLA I族抗原(HLA-A，-B和-C)為高度多態(tài)性的細(xì)胞表面糖蛋白，分子量為40～50kD。在絕大多數(shù)的組織細(xì)胞都有表達(dá)。經(jīng)典的HLA I族抗原與在細(xì)胞內(nèi)處理后的多肽結(jié)合然后將其帶至細(xì)胞表面呈遞給CD8陽(yáng)性的細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞(CTLs)。后者(CTLs)的功能是檢查這些細(xì)胞有無(wú)異體蛋白合成，并將合成異體蛋白的細(xì)胞摧毀。因此，經(jīng)典的HLA I族抗原對(duì)于經(jīng)免疫系統(tǒng)消除以下細(xì)胞極為重要病毒感染的細(xì)胞(感染)，經(jīng)歷癌變的細(xì)胞(癌)，或同種異體移植細(xì)胞(器官移植)。(關(guān)于與HLA系統(tǒng)有關(guān)的生物學(xué)過(guò)程的綜述，參見Sherman等的文章，Am Rev.Immunol.11385，1993。)人類白細(xì)胞抗原G(在本發(fā)明中均稱為HLA-G)為非經(jīng)典的I類抗原。在正常情況，其表達(dá)局限于胎盤的絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞。而在絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，經(jīng)典的HLA I族和II族抗原則表達(dá)缺失。(見McMaster等，J.Immunol.1543771，1995。)HLA-G的基因序列和結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的HLA I基因高度同源，由8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子及1個(gè)3’末端的非翻譯區(qū)組成。HLA-G蛋白的氨基酸順序在重鏈的α1、α2和α3區(qū)域以及輕鏈的β2-微球蛋白區(qū)域與HLA-A、-B和-C蛋白順序的同源性超過(guò)86％。HLA-G蛋白已鑒定為一組分子量為37～39KD的分子，(見Geraghty等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84945，1987；Parham等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.854005，1988；Shimizu等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85227，1988。)與經(jīng)典的HLA I族基因相反，HLA-G基因的多態(tài)性較低，至今僅發(fā)現(xiàn)4個(gè)等位基因。(見Ellis等，Am J.Reprod.Immunol.2384，1990；Kovats等，Science 248220，1990。)不過(guò)，HLA-G基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可被剪切成為異構(gòu)體?，F(xiàn)已觀察到四種表達(dá)膜蛋白的HLA-G mRNA的異構(gòu)體HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3和HLA-G4和三種表達(dá)可溶性蛋白的HLA-G mRNA的異構(gòu)體HLA-G5，HLA-G6和HLA-G7。(見Ishitani等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.853947，1992；Kirszenbaum等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.914029，1994；Fujii等，J.Immunol.1535516。)這些mRNA編碼的蛋白具有全長(zhǎng)或缺少一兩個(gè)區(qū)域，進(jìn)而造成蛋白產(chǎn)物的分子量和功能都有很大的變異。
胎兒一半基因來(lái)至父親，因而對(duì)母親來(lái)講是一種半同種異體物。母親的免疫系統(tǒng)可能會(huì)對(duì)胎兒產(chǎn)生排斥。大量研究已經(jīng)證明，HLA-G在胎盤的絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)能抑制母體免疫反應(yīng)。換言之，HLA-G的作用在于通過(guò)抑制母體免疫反應(yīng)維持母體對(duì)半同種異體胎兒的免疫耐受性。(關(guān)于HLA-G在妊娠中功能的綜述，可參見Rouas-Freiss等，J.Biol.Regul.Homeost.Agents.1493，2000.)在腫瘤生物學(xué)中，HLA I族基因表達(dá)的下調(diào)是一個(gè)常見的現(xiàn)象。(有關(guān)綜述見Garrido等，Immunology Today 1889，1997。)由于HLA I族分子在細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞的活化中發(fā)揮中心作用，HLA I族基因表達(dá)的下調(diào)就成為腫瘤逃逸機(jī)制之一。不過(guò)，由于NK細(xì)胞能水解HLA I族分子表達(dá)減少或者缺失的細(xì)胞，而使HLA I族基因表達(dá)下調(diào)的癌細(xì)胞可能受到NK細(xì)胞的攻擊。(見Lanier LL和Philips JH，Immunol.Today 1786-9，1996。)但因?yàn)镠LA-G具有抑制NK細(xì)胞的功能，如果因腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)HLA-G的異常表達(dá)，就可能為其提供另一種逃避宿主免疫監(jiān)視的機(jī)制。(見Dietl等，Gynecol.Obstet.Invest.33197，1992；Chumbley等，Cell Immunol.155312，1993。)因此，了解HLA-G是否參與了腫瘤免疫逃逸機(jī)制就具有重要的意義。自90年代以來(lái)，各國(guó)對(duì)不同癌癥類型和各種癌細(xì)胞株的HLA-G表達(dá)進(jìn)行了大量研究。絕大多數(shù)研究小組證實(shí)，HLA-G的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上呈陽(yáng)性。然而，在蛋白質(zhì)水平上對(duì)HLA-G表達(dá)的研究結(jié)果則不完全一致。在這些研究中，測(cè)定HLA-G蛋白的方法包括定性和定量多種技術(shù)，如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、免疫印漬、免疫細(xì)胞化學(xué)和酶聯(lián)免疫(ELISA)等。部分采用抗HLA-G單克隆抗體(87G，01G，223G和MEMG/9)的研究得出陰性結(jié)果。(見Amiot等，Human Immunol.59524，1998；Real等，Int.J.Cancer 81512，1999；Frumento等，Tissue Antigens 5630，2000；Hurks等，Invest．Ophthalmol.Vis.Sci.423081，2001。)在主要是采用4H84抗HLA-G單克隆抗體的其它研究中，有21％～51％的結(jié)果則為陽(yáng)性。(見Mizuno等，Br.J.Haematol.111280，2000；Urosevic等，Am.J.Pathol.159817，2001；Urosevic等，Blood 99609，2002；Lefebvre等，J.Pathol.196266，2002；Yang等，Chinese J.Histochem.Cytochem.1070。2001。)根據(jù)文獻(xiàn)和調(diào)查，迄今為止，所有對(duì)癌組織或癌細(xì)胞株的HLA-G蛋白測(cè)定均采用合成的多肽或細(xì)菌合成的重組HLA-G蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的抗HLA-G單克隆抗體來(lái)進(jìn)行。所有的抗體都與重鏈結(jié)合，主要在HLA-G分子的α1區(qū)或α2區(qū)。
如上所述，在多數(shù)癌組織中均檢測(cè)到HLA-G的mRNA的表達(dá)。最近還進(jìn)一步證明在不同類型的惡性腫瘤可能表達(dá)不同HLA-G的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。(見Ritau等，Transplant Proc.332360，2001。)和HLA-G蛋白翻譯后的各種糖蛋白的異構(gòu)體(見McMaster等，J.Immunol.1605922，1998。)。這些發(fā)現(xiàn)提示，在絕大多數(shù)類型的癌癥中都出現(xiàn)HLA-G蛋白的表達(dá)，只是在翻譯的前后以不同的異構(gòu)體出現(xiàn)。所以，對(duì)于檢測(cè)癌癥的HLA-G蛋白表達(dá)來(lái)說(shuō)，檢測(cè)試劑如抗體，必須能夠同時(shí)與多種異構(gòu)體反應(yīng)才能得到好的結(jié)果。而這些由合成多肽和/或細(xì)菌合成的重組HLA-G蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的抗體是不能令人滿意的，因?yàn)楹铣啥嚯闹挥邪被崞矫骓樞蚨?xì)菌合成的重組HLA-G蛋白不能糖基化，產(chǎn)生的抗體不能同時(shí)與多種天然形態(tài)(接近生理?xiàng)l件下的形態(tài))的異構(gòu)體發(fā)生免疫反應(yīng)，從而造成在一些癌癥檢測(cè)中呈陽(yáng)性結(jié)果而另一些癌癥檢測(cè)中呈陰性結(jié)果，故在腫瘤病理檢測(cè)中準(zhǔn)確率不高。因此，有必要改進(jìn)抗HLA-G的單克隆抗體，使之對(duì)所有的異構(gòu)體都具有更高的檢測(cè)特異性和靈敏度。最重要的是，HLA-G不在非妊娠的正常成人組織中表達(dá)，而在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)，具有高度的惡性腫瘤的特異性，適宜用作癌癥診斷，預(yù)后和治療指導(dǎo)的新腫瘤標(biāo)志物。研究表明，HLA-G在癌癥中的表達(dá)與癌細(xì)胞組織學(xué)和疾病發(fā)展階段有關(guān)，其應(yīng)用前景是十分樂(lè)觀的。(見Ugurel等，Cancer 92369，2001；Urosevic等，Am.J.Pathol.159817，2001；Urosevic等，Blood 99609，2002。)發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有抗HLA-G單克隆抗體作為癌癥檢測(cè)標(biāo)志物的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種新的單克隆抗體，命名為HGY。該單克隆抗體是抗人類白細(xì)胞抗原G單克隆抗體，即抗HLA-G單克隆抗體，屬IgG3亞型，進(jìn)一步地，該單克隆抗體能夠與7種HLA-G異構(gòu)體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
本發(fā)明的單克隆抗體可以通過(guò)本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，因此可以從培養(yǎng)本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)液中獲得，或用雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞種植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔產(chǎn)生腹水而獲得。然而，產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的方法不受特別的限制，如通過(guò)基因工程方法得到的能夠與7種HLA-G發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，屬IgG3亞型的抗體，也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種雜交瘤細(xì)胞株，它能夠產(chǎn)生屬IgG3亞型的抗HLA-G單克隆抗體，進(jìn)一步地，它能夠產(chǎn)生與7種HLA-G異構(gòu)體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的單克隆抗體。
本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生，因此，用近似生理?xiàng)l件下的(天然的HLA-G)作為抗原免疫小鼠等動(dòng)物，將該動(dòng)物的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞株，并從中篩選出產(chǎn)生IgG3亞型的，能夠與7種HLA-G異構(gòu)體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，從而獲得本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株。
所述的雜交瘤細(xì)胞株，優(yōu)選的是由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號(hào)為CCTCC NO.C200416的雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞系。
本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面。
本發(fā)明的一種惡性腫瘤的免疫檢測(cè)方法構(gòu)成了本發(fā)明的另一個(gè)方面，該方法使用至少一種上述的單克隆抗體來(lái)檢測(cè)。
進(jìn)一步地，該方法使用上述的任意一種單克隆抗體來(lái)檢測(cè)。該方法可以用于診斷惡性腫瘤；也可以用于評(píng)價(jià)惡性腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后，還可以指導(dǎo)癌癥的治療。
優(yōu)選的是本發(fā)明的免疫檢測(cè)方法，是使用免疫印漬法進(jìn)行，也可以用ELISA技術(shù)進(jìn)行。
本發(fā)明的另一方面是，含有至少一種上述的單克隆抗體的試劑盒，優(yōu)選的試劑盒是含有上述的任意一種單克隆抗體。本發(fā)明的試劑盒可以用于診斷惡性腫瘤，也可以用于惡性腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后，及治療指導(dǎo)。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選采用免疫印漬法或ELISA技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
由于本發(fā)明的單克隆抗體與其他類型的HLA I族抗原不存在交叉反應(yīng)，因此本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)于HLA-G具有高度的特異性。并且本發(fā)明的單克隆抗體與所有HLA-G異構(gòu)體相結(jié)合，雖然不同類型的癌癥可能表達(dá)出不同的HLA-G異構(gòu)體，但是對(duì)不同類型癌癥的各種表達(dá)產(chǎn)物，本發(fā)明單克隆抗體都能夠加以檢測(cè)，因此具有很高的靈敏性。同時(shí)，本發(fā)明的單克隆抗體穩(wěn)定，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法，將本發(fā)明的單克隆抗體制備成各種形式的試劑盒，以方便臨床的大規(guī)模使用，為癌癥的診斷，發(fā)展轉(zhuǎn)移的評(píng)價(jià)以及治療指導(dǎo)提供了一種可靠的有價(jià)值的途徑。


圖1.純化天然HLA-G蛋白的SDS-PAGE和免疫印漬。
用抗體親和層析技術(shù)分離一期妊娠胎盤組織裂解物中的HLA-G蛋白(A)。純化的蛋白用SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色分析(B)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，與抗-HLA-G單克隆抗體4H84進(jìn)行印漬反應(yīng)(C)。
圖2.本發(fā)明抗體HGY與抗-HLA-G單克隆抗體4H84的比較。
用純化天然的HLA-G蛋白4℃過(guò)夜包被ELISA板。洗板和封閉后用不同劑量的抗-HLA-G單抗HGY和4H84室溫保溫1小時(shí)。洗板4次，與羊抗鼠抗體-HRP復(fù)合物室溫保溫1小時(shí)。以TMB為底物顯色，1M HCl終止顯色反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀450/630nm波長(zhǎng)的光密度?？贵w濃度相同時(shí)，HGY與純化HLA-G蛋白的結(jié)合力高于4H84。
圖3.抗體競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。用純化天然HLA-G包被ELISA板，生物素標(biāo)記的抗-HLA-G單抗4H84與不同劑量的未標(biāo)記4H84和本發(fā)明的抗-HLA-G單抗HGY一起再室溫保溫1小時(shí)。洗板后與抗生物素-HRP結(jié)合物室溫保溫1小時(shí)。顯色反應(yīng)用TMB底物液進(jìn)行，1M HCl終止反應(yīng)。未加抗體的孔用作對(duì)照(100％結(jié)合)計(jì)算未標(biāo)記抗體4H84和HGY的競(jìng)爭(zhēng)百分比。HGY不與生物素標(biāo)記的4H84競(jìng)爭(zhēng)，表明HGY的結(jié)合位點(diǎn)不同于4H84。圖4.免疫印漬抗-HLA-G單抗HGY與4H84的性質(zhì)比較。用SDS-PAGE分離培養(yǎng)的絨毛癌細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞和妊娠三個(gè)月內(nèi)流產(chǎn)的胎盤組織裂解物(PL)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，分別與HGY和4H84進(jìn)行印漬反應(yīng)。對(duì)于JEG-3細(xì)胞裂解物，兩種抗體的印漬均為對(duì)應(yīng)于HLA-G1異構(gòu)體的、分子量為38KD的單帶。從胎盤裂解物來(lái)看，4H84可與HLA-G的膜結(jié)合和可溶性異構(gòu)體反應(yīng)，而HGY可以識(shí)別所有的HLA-G蛋白異構(gòu)體HLA-G1(37～39KD)，G2(～30KD)，G3(～20KD)，G4(～29KD)和G5(～34KD)。圖5.抗-HLA-G單克隆抗體HGY對(duì)細(xì)胞株的免疫印漬分析。將乳腺癌細(xì)胞株(MB231和MB468)，卵巢腺癌細(xì)胞株(SK-OV-3)，轉(zhuǎn)移的前列腺癌細(xì)胞株(LnCap)和絨毛癌細(xì)胞株(JEG-3)的培養(yǎng)細(xì)胞裂解，SDS-PAGE分離后用抗-HLA-G單抗進(jìn)行免疫印漬分析。在JEG-3和LnCap細(xì)胞株中有一條38KD的對(duì)應(yīng)于HLA-G1的帶。在MB231，MB468和SK-OV-3細(xì)胞株中，印漬帶大于38KD，與高度糖基化的HLA-G分子對(duì)應(yīng)。在MB468中，有一條對(duì)應(yīng)于HLA-G的可溶形式的帶，而在MB231，SK-OV-3和LnCap細(xì)胞株中有其它異構(gòu)體出現(xiàn)。
圖6.細(xì)胞株免疫印漬分析。先用HGY抗體親和瓊脂糖珠對(duì)勻漿后的培養(yǎng)細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，然后用同一抗體進(jìn)行免疫印漬分析。1＝MB231，2＝人宮頸上皮癌細(xì)胞株(CaSki)，3＝SK-OV-3，4＝LnCap，5＝人胚胎癌株(CaTes-1B)，6＝JEG-3，7＝LCL221(淋巴瘤細(xì)胞株)。在JEG-3中鑒定出一條對(duì)應(yīng)于HLA-G1的單帶而在HLA-G表達(dá)陰性的LCL221細(xì)胞株中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)。其它細(xì)胞株中HLA-G不同的異構(gòu)體表達(dá)。
圖7A原發(fā)性乳腺癌免疫印漬分析。先用HGY抗體親和瓊脂糖珠對(duì)勻漿后的樣品進(jìn)行免疫沉淀，然后用同一抗體進(jìn)行免疫印漬分析。樣品1-4和7為乳腺癌，5為乳腺纖維瘤，6為正常乳腺組織。乳腺癌1-3有對(duì)應(yīng)于HLA-G可溶異構(gòu)體的34KD帶，表達(dá)弱。乳腺癌4有37KD和39KD兩條強(qiáng)帶，與HLA-G1對(duì)應(yīng)，而乳腺癌7有一分子量較高的區(qū)帶，與含不同糖基化的HLA-G1的異構(gòu)體相對(duì)應(yīng)。乳腺纖維瘤和正常組織未見表達(dá)。圖7B原發(fā)性乳腺癌的免疫印漬分析。勻漿樣品直接用于免疫印漬分析?？?HLA-G單克隆抗體為HGY。樣品2為強(qiáng)烈表達(dá)HLA-G1及其它異構(gòu)體的原發(fā)性乳腺癌。樣品5為只表達(dá)HLA-G1的乳腺癌。乳腺纖維瘤(3和4行)和正常乳腺組織(1行)無(wú)表達(dá)。6為妊娠三個(gè)月內(nèi)流產(chǎn)的胎盤組織裂解物，HLA-G1和HLA-G5異構(gòu)體均有表達(dá)。
圖8.原發(fā)性乳腺癌的組織化學(xué)染色切片圖9.膀胱移行細(xì)胞癌和正常膀胱組織HLA-G組織化學(xué)染色切片對(duì)比圖10.大腸癌和正常腸腺體組織HLA-G組織化學(xué)染色切片對(duì)比圖11.肺鱗癌和正常肺組織HLA-G組織化學(xué)染色切片對(duì)比圖12.乳腺導(dǎo)管癌和正常乳腺導(dǎo)管組織HLA-G組織化學(xué)染色切片對(duì)比圖13.子宮內(nèi)膜癌和正常子宮組織HLA-G組織化學(xué)染色切片對(duì)比發(fā)明的具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，所列舉的本發(fā)明抗體在癌癥檢測(cè)和診斷中的特殊應(yīng)用范例有助于更好地了解本發(fā)明的特點(diǎn)，并非對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1本發(fā)明單克隆抗體的制備本發(fā)明的基礎(chǔ)是，采用從妊娠三個(gè)月內(nèi)流產(chǎn)的胎盤組織中純化的天然HLA-G蛋白質(zhì)，其中含有全部HLA-G轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體和糖蛋白異構(gòu)體，來(lái)制備抗HLA-G的單克隆抗體。(見Ishitani等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.853947，1992；Kirszenbaum等，Acad.Sci.U.S.A.914209，1994；Fujii等，J.Immunol.1535516，1994；McMaster等，J.Immunol.1605922，1998；Blastchitze等，Early Pregnancy 567I 2001。)1、HLA-G蛋白的純化●立即收集三個(gè)月內(nèi)的流產(chǎn)病人手術(shù)后的胚胎組織，-80℃凍存?zhèn)溆谩?br> ●純化HLA-G蛋白時(shí)，將冰凍組織在冰上解凍并切成小塊。用50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)懸浮組織，于4℃用Brinkmann Polytron勻漿器進(jìn)行組織勻漿。
●勻漿液經(jīng)39,000g，4℃離心10分鐘，得到沉淀，用上述的離心和懸浮方式洗滌沉淀3至4次。
●用10倍沉淀物體積的裂解緩沖液重新懸浮沉淀，放入振搖器緩慢混合4℃過(guò)夜。
●39,000g，4℃離心30分鐘并收集上清。
●采用兩個(gè)連續(xù)的抗體親和柱對(duì)上清液中的HLA-G蛋白進(jìn)行純化將純化的4H84(抗-HLA-G)和BMM1(抗-β2微球蛋白)單克隆抗體分別直接偶聯(lián)在活化的載體微球上制備成抗體親和層析柱，然后將上清液上柱，洗滌和洗脫。純化的HLA-G的純度通過(guò)電泳和Western blot加以檢驗(yàn)。10％PAGE和ECL Western blot的結(jié)果見附圖1。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)連續(xù)兩次抗體親和層析，包括可溶性異構(gòu)體在內(nèi)的HLA-G蛋白的純度在90％以上，失活的HLA-G蛋白也可以作為免疫原使用。
2、抗純化天然的HLA-G單克隆抗體的制備●按標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)3周齡雌性BALB/c小鼠(Charles River)用上述純化的HLA-G蛋白進(jìn)行腹膜下免疫。(見Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，pp139，1988。)即，將純化的HLA-G蛋白用生理鹽水稀釋至500ug/ml，首次，與完全弗氏佐劑以1∶1比例混合，然后腹膜下注射免疫。之后，用不完全弗氏佐劑與純化的HLA-G蛋白1∶1比例混合液免疫動(dòng)物，間隔3～4周，連續(xù)三次。停止免疫1月，最后用不完全弗氏佐劑與純化的HLA-G蛋白1∶1比例混合液進(jìn)行1次腹膜下增強(qiáng)免疫。增強(qiáng)免疫后10天，用抗體吸附ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中與純化后的天然HLA-G蛋白特異性結(jié)合抗體的滴度。當(dāng)小鼠血清抗HLA-G抗體滴度達(dá)到一定高度后，選擇滴度較高者，按以下方法繼續(xù)進(jìn)行；●處死小鼠，用本領(lǐng)域公知技術(shù)將其脾細(xì)胞與SP2骨髓瘤細(xì)胞株融合雜交。然后用有限稀釋法和抗體捕獲ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞進(jìn)行篩選克隆。篩選出了一個(gè)雜交瘤細(xì)胞株。
●制備抗體，可用a、雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞株優(yōu)化培養(yǎng)基410ml(Gibco)，TANGGO 5ml(Sigma)，ITS(Sigma)0.5ml和FBS(Sigma)75ml。培養(yǎng)7～10天直至所有雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞死亡。400xg離心10分鐘除去細(xì)胞殘骸，上清夜合并。采用蛋白G親和柱(Sigma)按商品說(shuō)明書進(jìn)行抗體的純化。純化的抗體經(jīng)截流分子量為10,000的濾膜(Millipore)4℃ 3000rpm離心30分鐘加以濃縮后-80℃凍存?zhèn)溆谩?br> b、或用雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞種植到BALB/c小鼠腹腔產(chǎn)生腹水用雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞種植到BALB/c小鼠腹腔產(chǎn)生腹水的方法則是將培養(yǎng)的HGY雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞洗滌后注射到BALB/c小鼠腹腔。7-10天后收集腹水，-80℃凍存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2本發(fā)明單克隆抗體的特性用以上制備的單克隆抗體進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，證明1、小鼠抗體分型試劑藥盒(Amersh)測(cè)定，細(xì)胞株產(chǎn)生的單抗亞型為IgG3。
2、其對(duì)HLA-G具有高度的特異性抗體捕獲ELISA測(cè)定表明，本發(fā)明的抗體與其他類型的HLA I族抗原不存在交叉反應(yīng)，(見Gosling和Basso，Immunoassay，Butterworth-Hainemann，London，)證實(shí)了本發(fā)明的抗體對(duì)于HLA-G具有高度的特異性。(見表1)表1 HGY抗體的交叉反應(yīng)

3、其與現(xiàn)有的抗HLA-G單抗比較具有更高的抗原親和性用抗體捕獲ELISA方法對(duì)本發(fā)明抗體和4H84的兩種抗體的對(duì)HLA-G蛋白親和性進(jìn)行比較了。(見Gosling和Basso，Immunoassay，Butterworth-Hainemann，London，)結(jié)果顯示本發(fā)明抗體的親和性高于4H84(圖2)。
4、本發(fā)明單克隆抗體的抗原結(jié)合部位在α1區(qū)臨近糖基化的區(qū)域?yàn)榱舜_定本發(fā)明單克隆抗體的抗原結(jié)合部位，設(shè)計(jì)了與4H84的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定，(參見Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，pp567，1988。)單克隆抗體4H84通過(guò)用一段對(duì)應(yīng)于HLA-G分子上α1區(qū)的第61～83位氨基酸的合成多肽免疫小鼠制備。圖3顯示，兩種抗體與HLA-G分子的不同抗原決定簇相結(jié)合。因?yàn)楸景l(fā)明抗體能識(shí)別所有的HLA-G的蛋白異構(gòu)體，包括翻譯后的糖蛋白的異構(gòu)體(見圖4和圖5)。而所有的HLA-G的蛋白異構(gòu)體都有α1區(qū)，并且HLA-G蛋白還生成翻譯后的糖蛋白的糖基化也在α1區(qū)的86位天冬氨酸上(見Bouteiller PL & Mallet V(1997)J ReprodFertil27-13.McMaster et al(1998)J.Immunol1605922.)，所以本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合部位應(yīng)在α1區(qū)臨近糖基化的區(qū)域。
5、本發(fā)明單克隆抗體可以與同樣組織制備物中的所有HLA-G異構(gòu)體相結(jié)合本發(fā)明單克隆抗體和4H84都與JEG-3細(xì)胞水解物Western印漬上38kD的一條單一區(qū)帶結(jié)合(圖4)，進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明抗體與4H84一樣，對(duì)HLA-G具有特異性。只不過(guò)對(duì)于胎盤水解產(chǎn)物，4H84僅識(shí)別HLA-G的可溶形式和膜結(jié)合部位(HLA-G1和HLA-G5)，而本發(fā)明的單克隆抗體則與同樣組織制備物中的所有HLA-G異構(gòu)體相結(jié)合。
6、使用本發(fā)明單克隆抗體可以檢測(cè)不同類型的癌癥圖5顯示出本發(fā)明抗體與部分癌細(xì)胞株的免疫印跡(Western blot)圖譜。絨毛癌細(xì)胞株JEG-3和前列腺癌細(xì)胞株LnCap具有一38kD的免疫印跡區(qū)帶。而與乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB231、MDA-MB468和卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3的提取物反應(yīng)，本發(fā)明抗體產(chǎn)生多條HLA-G異構(gòu)體的區(qū)帶。這些數(shù)據(jù)顯示，不同類型的癌癥可能表達(dá)出不同的HLA-G異構(gòu)體，對(duì)不同類型癌癥的各種表達(dá)產(chǎn)物，本發(fā)明抗體都能夠加以檢測(cè)。
實(shí)施例3細(xì)胞株和乳腺癌樣品中HLA-G的免疫印漬檢測(cè)導(dǎo)言經(jīng)典的人白細(xì)胞抗原(HLA)I族表達(dá)的下調(diào)是腫瘤生物學(xué)中的常見現(xiàn)象。這種經(jīng)典的HLAI族表達(dá)的改變可能使腫瘤細(xì)胞逃避宿主毒性淋巴細(xì)胞的免疫監(jiān)控。因?yàn)镹K細(xì)胞能水解經(jīng)典的HLA I族缺乏的細(xì)胞，上述改變可使人白細(xì)胞抗原(HLA)I族表達(dá)的下調(diào)的腫瘤細(xì)胞受到NK細(xì)胞的攻擊。Garrido等，Immunology Today 1889，1997。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，作為一種非經(jīng)典的I族抗原，HLA-G的免疫學(xué)功能之一就是抑制NK細(xì)胞的活性。因此腫瘤細(xì)胞如果表達(dá)HLA-G，便可使其免遭NK的消滅。為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，我們采用針對(duì)HLA-G的特異單克隆抗體(HGY)的免疫印漬方法對(duì)5種人癌細(xì)胞株和原發(fā)性乳腺癌組織進(jìn)行了調(diào)查。
材料和方法人乳腺癌和正常乳腺組織來(lái)自外科手術(shù)病人。組織樣品采集后立即放-80C存放直至測(cè)定。人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231)、人宮頸上皮癌細(xì)胞株(CASK1)、人轉(zhuǎn)移性前列腺癌株(LNCAP，F(xiàn)GC)、人卵巢腺癌株(SK-OV-3)和人胚胎癌株(CATES-1B)購(gòu)自ATCC(Rockville，Maryland，USA)。根據(jù)ATCC說(shuō)明書用不同的培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞。
勻漿后的原發(fā)性乳腺癌組織和正常乳腺組織，以及癌細(xì)胞株離心沉淀用1ml裂解液裂解。裂解液含0.5％NP40，0.15M NaCl，5mM EDTA，50mM Tris-HCl，pH7.2和1.0mMPMSF。將裂解物與HGY抗體親和瓊脂糖珠混合，4℃過(guò)夜進(jìn)行免疫沉淀處理。之后用免疫沉淀洗滌緩沖液(0.1MPBS，0.05％NP-40和0.02％NaN3)洗滌沉淀5次(見Sigma用抗體偶聯(lián)活化的瓊脂糖珠的說(shuō)明書，1966)。然后將樣品變性，12％SDS-PAGE分離，室溫3小時(shí)轉(zhuǎn)移至PVDA膜上。用5％牛奶封閉膜，與HGY抗體室溫下保溫1小時(shí)，再與羊抗鼠IgG-HRP復(fù)合物(1∶2000)保溫1小時(shí)。用熒光免疫印漬法進(jìn)行分析(AmershamArlington，Heights，IL)。部分勻漿后的原發(fā)性乳腺癌組織的水解物不經(jīng)免疫沉淀直接用熒光免疫印漬法進(jìn)行分析。
結(jié)果JEG-3是絨毛癌細(xì)胞株，同時(shí)表達(dá)HLA-G和經(jīng)典的I族抗原(HLA-A，B和C)分子。LCL-211為淋巴瘤細(xì)胞株，只表達(dá)Ia族抗原而不表達(dá)HLA-G。在該研究中，JEG-3細(xì)胞水解物被用作陽(yáng)性對(duì)照，LCL-221水解物則用作陰性對(duì)照。(Kovalts等，Science 248220，1990。)在JEG-3中檢測(cè)到一條相當(dāng)于HLA-G1(38kDa)的蛋白單帶，LCL 211則沒有檢測(cè)到。其它所有細(xì)胞株水解物中都檢測(cè)出分子量對(duì)應(yīng)于HLA-G1和其它異構(gòu)體的蛋白質(zhì)，其種類依不同的細(xì)胞株而異(圖6)。對(duì)于乳腺癌組織水解物，一部分先用HGY抗體偶聯(lián)的親和珠進(jìn)行了免疫沉淀處理(圖7A)，另一部分則直接用SDS-PAGE分離(圖7B)。正常乳腺組織用作陰性對(duì)照，妊娠三個(gè)月流產(chǎn)的胎盤組織用作陽(yáng)性對(duì)照。直接和間接免疫印漬試驗(yàn)均未在正常乳腺組織和乳腺纖維瘤中檢測(cè)出HLA-G蛋白，但在不同的乳腺癌癥病人中則鑒定出各種HLA-G的蛋白異構(gòu)體。
討論采用本發(fā)明的抗HLA-G單克隆抗體HGY的以上研究數(shù)據(jù)顯示，癌細(xì)胞株和原發(fā)性乳腺癌都表達(dá)HLA-G蛋白。結(jié)果表明，除了JEG-3絨毛癌細(xì)胞株和正常胚胎組織外，某些類型的癌癥也要表達(dá)HLA-G。HLA-G在癌細(xì)胞異常表達(dá)提示HLA-G可能參與了腫瘤細(xì)胞的逃逸機(jī)制，尤其是使其逃避NK細(xì)胞的水解。完全闡明這一假說(shuō)有待更為深入的研究。
實(shí)施例4乳腺癌和惡性乳腺疾病HLA-G的免疫組化分析采用免疫印漬方法我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性乳腺癌組織中有HLA-G的表達(dá)。本研究的目的就是采用組織化學(xué)的方法檢驗(yàn)乳腺腫瘤中的HLA-G蛋白表達(dá)并了解表達(dá)與組織學(xué)結(jié)果之間可能存在的關(guān)系。
材料和方法人乳腺癌和正常乳腺組織來(lái)自外科手術(shù)病人。組織樣品用4％的多聚甲醛固定，石蠟包埋。對(duì)22份惡變的乳腺腫瘤進(jìn)行了研究。按分化程度將腫瘤分為3組I級(jí)(n＝1)，II級(jí)(n＝8)和III級(jí)(n＝13)。另有正常乳腺組織(n＝3)和乳腺纖維瘤組織(n＝2)。
免疫組化分析時(shí)，對(duì)石蠟包埋塊切片，按標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行直接免疫過(guò)氧化物酶染色。(Bullock GR，Petrusz PTechniques in Immunocytochemistry，Academic Press，New Tork，1982。)切片與HGY單抗于4℃保溫過(guò)夜。此后，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性和非特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)分別用1％過(guò)氧化氫處理及10％正常山羊血清的PBS溶液封閉30分鐘。然后用PBS涮洗切片，與1∶2000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP(Sigma)室溫保溫1小時(shí)。PBS洗片，用二氨基聯(lián)苯胺(Sigma)使結(jié)合抗體顯色5分鐘。此外，用100ug/ml的純化的HLA-G蛋白與HGY抗體4℃保溫過(guò)夜，目的是讓HLA-G蛋白預(yù)先吸附抗HLA-G單抗，而作為特異性質(zhì)控對(duì)照。特異性質(zhì)控對(duì)照還包括用PBS或正常小鼠IgG(Sigma公司產(chǎn)品)替換抗體。
結(jié)果在I級(jí)癌組織中HLA-G的免疫反應(yīng)較弱，相反在II級(jí)腫瘤中HLA-G免疫反應(yīng)性在中等和強(qiáng)反應(yīng)之間。13例III級(jí)樣品中有6例表現(xiàn)出中等至強(qiáng)度的HLA-G免疫反應(yīng)性，其余7例的反應(yīng)性為無(wú)或弱。在正常乳腺組織以及乳腺纖維瘤組織則未檢測(cè)到HLA-G蛋白。圖8為陽(yáng)性染色示例。
討論以上結(jié)果表明68％的乳腺癌有不同程度的HLA-G蛋白的表達(dá)。HLA-G表達(dá)與癌細(xì)胞分化之間有正相關(guān)的趨勢(shì)。
實(shí)施例5癌癥常見類型的HLA-G免疫組化測(cè)定前已發(fā)現(xiàn)，在部分原發(fā)性乳腺癌病人中有HLA-G的表達(dá)，而且表達(dá)與組織學(xué)類型間之間存在相關(guān)的趨勢(shì)。本研究的目的是，考察其它類型的癌癥是否也有HLA-G的異常表達(dá)以及這種表達(dá)是否能用于癌癥的病理診斷和預(yù)后。
材料和方法包括各種常見癌癥的1007個(gè)石蠟包埋切片。第一抗體為抗-HLA-G單抗HGY，第二抗體為EnvisionTM(購(gòu)自DAKO)。用取自流產(chǎn)手術(shù)的正常胚胎組織的石蠟切片作為陽(yáng)性對(duì)照，各種相應(yīng)的正常組織用作陰性對(duì)照。
結(jié)果將染色的切片分為4類無(wú)表達(dá)(-，無(wú)陽(yáng)性染色的癌細(xì)胞)，低表達(dá)(+，陽(yáng)性染色癌細(xì)胞＜25％)，中度表達(dá)(++，陽(yáng)性染色癌細(xì)胞在25％至50％之間)，強(qiáng)表達(dá)(+++，陽(yáng)性染色癌細(xì)胞＞50％)。根據(jù)這種分類的結(jié)果列在表2中。本研究觀察到的所有癌癥都有HLA-G蛋白的表達(dá)。陽(yáng)性染色百分比在42～100％之間。而在相應(yīng)的正常組織則未檢測(cè)到HLA-G蛋白的表達(dá)(圖9)。同時(shí)，結(jié)果還證明HLA-G陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌，肺癌，食道癌，胃癌，直結(jié)腸癌，子宮癌，膀胱癌等癌癥的細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵潤(rùn)有顯著相關(guān)。分析結(jié)果見表3。本研究的其它幾種癌癥因樣本太小未能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
表2HLA-G在各種常見類型的惡性腫瘤的表達(dá)

表3。HLA-G免疫組化的臨床檢測(cè)結(jié)果的臨床意義

討論本研究應(yīng)用本發(fā)明的抗-HLA-G單克隆抗體HGY首次發(fā)現(xiàn)，HLA-G的異常表達(dá)是腫瘤生物學(xué)中的一個(gè)廣泛存在的現(xiàn)象。本研究的結(jié)果還強(qiáng)烈提示，用免疫組化方法測(cè)定HLA-G可成為常見各類癌癥診斷和預(yù)后的新腫瘤標(biāo)志物。又因?yàn)镠LA-G在癌癥的表達(dá)參與了腫瘤的免疫逃逸，而HLA-G的表達(dá)又受各種免疫分子的調(diào)節(jié)；如干擾素能增強(qiáng)HLA-G的表達(dá)。對(duì)HLA-G高表達(dá)的癌癥病人，用干擾素α-治療可能會(huì)適得其反(參見Wagner SN，Rebmann V，Willers CP，Grosse-Wilde H，Goos M._Expression analysisof classic and non-classic HLA molecules before interferon alfa-2b treatment ofmelanoma.Lancet.2000 Jul 15；356(9225)220-1.以及Ugurel S，Rebmann V，F(xiàn)erroneS，Tilgen W，Grosse-Wilde H，Reinhold U.Soluble human leukocyte antigen--G serumlevel is elevated in melanoma patients and is further increased byinterferon-alpha immunotherapy.Cancer.2001 Jul 15；92(2)369-76.)，因此，測(cè)定HLA-G有可能成為指導(dǎo)腫瘤個(gè)性化生物治療的指標(biāo)。
發(fā)明總結(jié)本發(fā)明與用純化的天然HLA-G蛋白免疫小鼠制取抗-HLA-G單克隆抗體有關(guān)。按本發(fā)明方法，HLA-G抗體與HLA-G的選擇性結(jié)合比與抗原HLA-A2，HLA-B4，HLA-C或混合的白細(xì)胞制備液的結(jié)合強(qiáng)1000倍以上。不論HLA-G分子的來(lái)源如何(胎盤或腫瘤)本發(fā)明抗體可以檢測(cè)HLA-G蛋白的所有異構(gòu)體。本發(fā)明抗體與HLA-G的結(jié)合部位不同于其它常用的抗體，如4H84。采用本發(fā)明抗體，已在大多數(shù)癌癥中檢測(cè)到了HLA-G的異常表達(dá)。對(duì)常見類型的癌癥，采用本發(fā)明的免疫組化及其它免疫測(cè)定方法.其測(cè)定結(jié)果具有臨床癌癥診斷和預(yù)后的應(yīng)用價(jià)值。
實(shí)施例6癌癥診斷試劑盒的制備由以上的研究結(jié)果，我們研制了HLA-G免疫組化試劑盒，由于本發(fā)明的抗HLA-G單克隆抗體具有高度特異性和靈敏性，并且理化性質(zhì)穩(wěn)定，可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法方便地制備成為癌癥診斷試劑盒。
以下是用本發(fā)明抗HLA-G單克隆抗體制備的一種診斷試劑盒的具體組成HGY抗HLA-G抗體 18ulHGY抗HLA-G抗體稀釋液 2.5ml兔抗鼠抗體-辣根過(guò)氧化酶復(fù)合物2.5ml3％過(guò)氧化氫 10ml20X磷酸緩沖液50ml5X檸檬酸緩沖液 50ml色原底物溶液(DAB)0.1ml色原底物緩沖液 2.5ml陽(yáng)性對(duì)照片 1張檢定原理該試劑盒是應(yīng)用一種特異性很高的抗HLA-G單克隆抗體(HGY抗HLA-G抗體)結(jié)合在腫瘤組織切片上的HLA-G抗原，然后采用兔抗鼠抗體-辣根過(guò)氧化酶復(fù)合物結(jié)合抗HLA-G抗體。辣根過(guò)氧化酶催化色原底物(DAB)顯色來(lái)檢測(cè)病理組織切片上有無(wú)HLA-G的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，其特征是該單克隆抗體是抗人類白細(xì)胞抗原G單克隆抗體，即抗HLA-G單克隆抗體，屬IgG3亞型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征是該單克隆抗體能夠與7種HLA-G異構(gòu)體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
3.一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征是該雜交瘤細(xì)胞株能夠產(chǎn)生屬IgG3亞型的抗HLA-G單克隆抗體
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞株，其特征是該雜交瘤細(xì)胞株能夠產(chǎn)生可與7種HLA-G異構(gòu)體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的雜交瘤細(xì)胞株，其特征是該雜交瘤細(xì)胞株是由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號(hào)為CCTCC NO.C200416的雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞株。
6.一種權(quán)利要求3、4、5任意一項(xiàng)所述的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。
7.一種惡性腫瘤的免疫檢測(cè)方法，其特征是該方法使用至少一種權(quán)利要求1、2或6所述的單克隆抗體來(lái)檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫檢測(cè)方法，其特征是該方法使用權(quán)利要求1、2或6所述的任意一種單克隆抗體來(lái)檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的免疫檢測(cè)方法，其特征是用該方法診斷惡性腫瘤。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的免疫檢測(cè)方法，其特征是用于評(píng)價(jià)惡性腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后。
11.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的免疫檢測(cè)方法，其特征是用于指導(dǎo)惡性腫瘤的治療。
12.根據(jù)權(quán)利要求7-11任意一項(xiàng)所述的免疫檢測(cè)方法，其特征是該方法使用ELISA技術(shù)進(jìn)行的。
13.根據(jù)權(quán)利要求7-11任意一項(xiàng)所述的免疫檢測(cè)方法，其特征是該方法使用免疫印漬技術(shù)進(jìn)行的。
14.一種試劑盒，其特征是含有至少一種如權(quán)利要求1、2或6所述的單克隆抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征是含有如權(quán)利要求1、2或6所述的任意一種單克隆抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，其特征是用于診斷惡性腫瘤。
17.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，其特征是用于評(píng)價(jià)惡性腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后。
18.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，其特征是用于指導(dǎo)癌癥的治療。
19.根據(jù)權(quán)利要求14-18任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征是所述試劑盒采用ELISA技術(shù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求14-18任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征是所述試劑盒采用免疫印漬技術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單克隆抗體，涉及一種抗人類白細(xì)胞抗原G(HLA－G)的單克隆抗體及其分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株，本發(fā)明的目的是提供一種新的單克隆抗體，命名為HGY，該單克隆抗體是抗人類白細(xì)胞抗原G單克隆抗體，屬IgG3亞型，該單克隆抗體能夠與7種HLA－G異構(gòu)體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)；還提供一種分泌所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。由于本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)于HLA－G具有高度的特異性，并且與所有HLA－G異構(gòu)體相結(jié)合，因此在癌癥的病理檢測(cè)中具有很高的靈敏性。同時(shí)本發(fā)明還公開了利用該抗體診斷惡性腫瘤的方法，以及利用該抗體制備免疫組化試劑盒及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1718588SQ200410040919
公開日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2004年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月26日
發(fā)明者葉尚勉 申請(qǐng)人:四川新創(chuàng)生物科技有限公司