專(zhuān)利名稱(chēng)：一種薄層層析顯色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及薄層層析，具體的說(shuō)是用薄層層析技術(shù)分離未知抗生活性物質(zhì)的一種薄層層析顯色方法。
背景技術(shù)：
薄層色譜法(TLC)是一種基于混合物組分在固定相和流動(dòng)相之間的不均勻分配或保留而將其分離的方法。薄層色譜法是將固定相涂鋪在載板上，使之形成均勻的薄層。待分離的樣品溶液被點(diǎn)加在薄層板上離下沿約為10mm的位置，將下沿向下，放入盛有深度約為5mm的適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相的密閉缸中，進(jìn)行色譜展開(kāi)，從而實(shí)現(xiàn)混合物的分離。對(duì)被展開(kāi)的色譜譜帶(斑點(diǎn))，可通過(guò)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)進(jìn)行定性檢測(cè)和定量測(cè)定。
在使用薄層色譜技術(shù)分離未知抗生物質(zhì)時(shí)，由于未知抗生物質(zhì)結(jié)構(gòu)不清楚，含量又特別小，抗生物質(zhì)本身在紫外光下又不產(chǎn)生熒光，其顯色就產(chǎn)生了困難。由于其含量很少，用硫酸等氧化顯色劑和碘蒸氣也很難看到層析譜帶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種效果明顯、操作簡(jiǎn)便分離未知抗生物質(zhì)的薄層層析顯色方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為對(duì)用薄層層析分離能進(jìn)行生物顯色的未知抗生物質(zhì)，按常規(guī)方法進(jìn)行薄層層析，然后，將生物顯色培養(yǎng)基直接鋪在層析完干燥后的薄板(硅膠)上，再在凝固的生物顯色培養(yǎng)基上涂上檢定菌，最后培養(yǎng)顯色。具體操作過(guò)程如下(1)薄板上平鋪生物顯色培養(yǎng)基將未知的抗生物質(zhì)點(diǎn)在硅膠薄板上，薄板放入層析缸中選取合適的層析液進(jìn)行層析，層析完畢后將薄板取出晾干。將培養(yǎng)檢定菌的生物顯色培養(yǎng)基熔化后，放入恒溫水浴中恒溫至50～55℃，然后倒在晾干的薄板硅膠上。
(2)檢定菌的涂布將檢定菌制成菌懸液，用無(wú)菌鑷子夾無(wú)菌棉球沾菌懸液均勻的涂在薄板上凝固的生物顯色培養(yǎng)基上。
(3)培養(yǎng)顯色在瓷托盤(pán)中放入兩層用無(wú)菌水潤(rùn)濕的無(wú)菌濾紙，再放入經(jīng)步驟(2)處理的薄板，蓋上蓋子，將其放入培養(yǎng)箱中，在28～37℃下培養(yǎng)18～24小時(shí)，進(jìn)行生物顯色。
所述生物顯色培養(yǎng)基為適合于檢定菌生長(zhǎng)的生物顯色培養(yǎng)基。
所述生物顯色培養(yǎng)基中可加入黑色或藍(lán)色墨水，以加大菌落與培養(yǎng)基顏色的對(duì)比度，使生物顯色在照相時(shí)能得到清楚的照片，其加入量為培養(yǎng)基體積的0.5～2％。
此法可用于所有能進(jìn)行生物顯色的抗生活性物質(zhì)。
在進(jìn)行抗菌素篩選工作時(shí)，為了避免病原菌感染的危險(xiǎn)，一般不用病原菌作為檢定菌，而是盡可能選擇一些沒(méi)有毒性且對(duì)某些致病菌具有代表性的微生物作為檢定菌，這些檢定菌稱(chēng)為篩選模型。通常用代表各種微生物類(lèi)型的檢定菌以使拮抗菌所產(chǎn)生的抗菌素的作用絕大部分都能表現(xiàn)出來(lái)。根據(jù)鏈霉菌鑒定手冊(cè)(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類(lèi)組編著，科學(xué)出版社，1975)抑制革蘭氏陽(yáng)性球菌選用金黃色葡萄球菌、革蘭氏陽(yáng)性桿菌選用枯草桿菌、革蘭氏陰性腸道細(xì)菌選用大腸桿菌、結(jié)核桿菌選用分枝桿菌、酵母狀真菌用白色念珠菌、絲狀真菌用青霉、發(fā)癬菌或稻瘟菌。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.效果明顯、準(zhǔn)確穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便。在使用薄層色譜技術(shù)分離未知抗生物質(zhì)時(shí)，由于某些未知抗生物質(zhì)結(jié)構(gòu)不清楚，在紫外光下又不產(chǎn)生熒光，使其顯色非常困難，而且由于其含量很少，即使使用硫酸等氧化顯色劑和碘蒸氣也很難看到層析譜帶；本發(fā)明薄層層析顯色新方法，通過(guò)采用將生物顯色培養(yǎng)基直接倒在薄板上進(jìn)行生物顯色的獨(dú)創(chuàng)技術(shù)，產(chǎn)生了非常顯著的技術(shù)效果，與其它通用顯色方法進(jìn)行對(duì)照，不但可很好的觀察到薄層層析對(duì)未知抗生物質(zhì)的分離效果，而且其操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確穩(wěn)定。
2.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明可應(yīng)用于所有能進(jìn)行生物顯色的抗生活性物質(zhì)在薄層層析分離時(shí)進(jìn)行的生物顯色。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)產(chǎn)生未知抗生物質(zhì)海洋細(xì)菌的篩選選取海水和海泥樣品，用無(wú)菌水稀釋后涂布Zobell 2216E培養(yǎng)基，從中分離純化海洋細(xì)菌。用白念珠菌做檢定菌，挖塊法測(cè)定純化的海洋細(xì)菌對(duì)白念珠的抑制作用，獲得了1株有抑制作用的海洋細(xì)菌。
(2)海洋細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)和抗生活性物質(zhì)的初步純化將海洋細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)后，用酸沉淀和離子交換方法除去發(fā)酵液中的部分雜質(zhì)，初步純化了發(fā)酵產(chǎn)生的未知抗生活性物質(zhì)。
A.材料1.菌株(1)海洋芽孢菌71株，中國(guó)沿海采樣分離得到。
(2)白念珠菌，沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院臨床分離、惠贈(zèng)。
2.培養(yǎng)基(1)抑菌活性培養(yǎng)基(沙氏培養(yǎng)基)葡萄糖4％ 蛋白胨1％ 瓊脂2％ pH5.6 0.8atm滅菌20分鐘。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖0.6％ 玉米面1％ 豆餅粉0.6％ K2HPO40.05％ pH自然0.8atm滅菌20分鐘3.層析液(略)B.方法1檢定菌白念珠菌懸液的制備取一環(huán)白念珠菌斜面種子接種于新鮮沙氏斜面培養(yǎng)基的試管中，37℃培養(yǎng)16～24小時(shí)。從培養(yǎng)好的斜面上取一環(huán)白念珠菌接入裝有20ml無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩三角瓶便制成檢定菌懸液。
2層析樣品的制備取一環(huán)新鮮海洋細(xì)菌種子斜面接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在28℃、140～180轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)完畢后將發(fā)酵液加酸調(diào)pH3～4，放在70℃水浴中保溫10分鐘，取出冷卻后離心取上清液，上清液過(guò)732+交換柱，用氨水洗脫活性物質(zhì)，將未知活性物質(zhì)再經(jīng)過(guò)G-15凝膠柱純化，即可獲得層析樣品。
C.結(jié)果1.未知抗生物質(zhì)的層析將層析樣品點(diǎn)在硅膠G薄板上，然后放入層析缸中層析，層析完畢后將層析板取出晾干后，將在50～55℃保溫溶化的沙氏固體培養(yǎng)基鋪在層析板上。
2.檢測(cè)菌培養(yǎng)用無(wú)菌鑷子夾住無(wú)菌棉球沾白念珠菌懸液涂于層析板凝固的培養(yǎng)基表面，將涂菌的層析板放入裝有兩層用無(wú)菌水潤(rùn)濕的無(wú)菌濾紙的瓷托盤(pán)中，將瓷托盤(pán)蓋上蓋后放入37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18～24小時(shí)后，取出發(fā)現(xiàn)在Rf＝0.33處有一條明顯的抑菌帶。
3.其它顯色方法的對(duì)照檢查在層析板鋪沙氏固體培養(yǎng)基前，將層析板在紫外光下檢測(cè)和進(jìn)行碘顯色(因?yàn)樽贤夤鈾z測(cè)和碘顯色對(duì)有機(jī)化合物沒(méi)有破壞，顯色后還可以進(jìn)行生物顯色)。結(jié)果紫外光檢測(cè)和碘顯色出現(xiàn)的譜帶與生物顯色的譜帶不重合，表明①未知抗生物質(zhì)得到了較好的分離。②未知抗生物質(zhì)含量很少，在碘蒸氣下看不到譜帶，在紫外光下也沒(méi)有吸收。
權(quán)利要求
1.一種薄層層析顯色方法，將含有未知的抗生物質(zhì)的層析樣品點(diǎn)在硅膠層析薄板上，薄板放入盛有適宜培養(yǎng)基的層析缸中進(jìn)行層析，層析完畢后，將薄板取出晾干，其特征在于(1)將溶化的生物顯色培養(yǎng)基直接鋪在按常規(guī)方法層析后晾干的層析薄板上；(2)將檢定菌制成菌懸液，涂在層析薄板上的生物顯色培養(yǎng)基表面；(3)將涂菌的層析薄板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)顯色。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述薄層層析顯色方法，其特征在于所述生物顯色培養(yǎng)基為適合于檢定菌生長(zhǎng)的生物顯色培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述薄層層析顯色新方法，其特征在于所述生物顯色培養(yǎng)基恒溫于50～55℃，鋪在層析完的干燥層析板上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述薄層層析顯色方法，其特征在于所述生物顯色培養(yǎng)基中加入黑色或藍(lán)色墨水，以加大菌落與培養(yǎng)基顏色的對(duì)比度，使生物顯色在照相時(shí)能得到清楚的照片，其加入量為培養(yǎng)基體積的0.5～2％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述薄層層析顯色方法，其特征在于所述檢定菌制成菌懸液后，用無(wú)菌鑷子夾住無(wú)菌棉球沾菌懸液涂在層析板上凝固的生物顯色培養(yǎng)基表面。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述薄層層析顯色方法，其特征在于所述培養(yǎng)顯色是在瓷托盤(pán)中放入兩層無(wú)菌濾紙，并用無(wú)菌水潤(rùn)濕后，再放入涂菌的層析薄板，然后，將托盤(pán)加蓋后放入培養(yǎng)箱中顯色。
全文摘要
本發(fā)明涉及薄層層析顯色方法，具體的說(shuō)是用薄層層析技術(shù)分離未知抗生活性物質(zhì)的一種薄層層析顯色方法。其具體操作為(1)將溶化的生物顯色培養(yǎng)基直接鋪在按常規(guī)方法層析后晾干的層析薄板上；(2)將檢定菌制成菌懸液，涂在層析薄板上的生物顯色培養(yǎng)基表面；(3)將涂菌的層析薄板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)顯色。本發(fā)明可應(yīng)用于所有能進(jìn)行生物顯色的抗生活性物質(zhì)在薄層層析分離時(shí)進(jìn)行的生物顯色，其具有效果明顯、準(zhǔn)確穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N30/94GK1743842SQ200410050370
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2004年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月3日
發(fā)明者馬成新, 郭敬斌, 胡江春, 薛德林, 王書(shū)錦 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所