專利名稱：紅豆杉植物及其細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇以及同系物的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種運(yùn)用高效液相色譜測(cè)定紅豆杉植物及其細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇以及同系物的方法，特別是一種利用高效液相色譜同時(shí)測(cè)定紅豆杉植物及其細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇、10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III和三尖杉寧堿的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇已被臨床證明對(duì)治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌等有明顯療效的抗癌藥物。紅豆杉植物和紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中均含有紫杉醇及豐富的紫杉烷類化合物，紫杉烷類化合物中的10-去乙酰基巴卡亭III和巴卡亭III是合成紫杉醇的前體，這兩種成分在紅豆杉植物中的含量比紫杉醇多，在太平洋紅豆杉中巴卡亭III的含量高達(dá)0.2％，分離提取的回收率也比紫杉醇高，已成為合成紫杉醇的主要原料之一。三尖杉寧堿對(duì)于治療白血病，配合地塞米松對(duì)粒細(xì)胞性白血病療效較好，然而，三尖杉寧堿和紫杉醇的分子結(jié)構(gòu)、性質(zhì)非常相似，是紫杉烷類化合物中最難彼此分離的兩種物質(zhì)，成為紫杉醇分離純化過程中的難點(diǎn)。
通過建立紅豆杉植物及其細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇、10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿等四種成分含量測(cè)定方法，具有重要的應(yīng)用價(jià)值一是為評(píng)價(jià)不同地區(qū)的紅豆杉植物中紫杉醇及其同系物含量提供依據(jù)；二是在栽培紅豆杉中篩選出紫杉醇及其同系物含量較高的優(yōu)株，以及為決定紅豆杉植物的最佳采收季節(jié)提供依據(jù)；三是在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，通過定期取樣分析，可監(jiān)測(cè)紫杉醇合成的高峰期以及紫杉烷類化合物相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系；四是在紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)中，篩選出紫杉醇及其同系物含量較高的細(xì)胞株；五是為分離純化紫杉醇工藝的改進(jìn)提供依據(jù)；六是為紫杉醇藥品質(zhì)量提供依據(jù)。
關(guān)于紫杉醇及其同系物的測(cè)定，國(guó)內(nèi)外有很多文獻(xiàn)報(bào)道，其中具有代表性的例如羅士德等(植物資源與環(huán)境1994，3(2)31～33)采用Watmanpartisi1 ODS柱，流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙腈體積比為20∶41∶39，分析了“紅豆杉及其近緣植物”中的紫杉醇、巴卡亭III、三尖杉寧堿三種成分的含量，其結(jié)果顯示，上述三種成分在HPLC色譜圖中反映的分離效果不理想，三尖杉寧堿峰和紫杉醇峰未能實(shí)現(xiàn)基線分離；項(xiàng)偉等(植物資源與環(huán)境1997，6(1)56～57)采用反相C18柱，流動(dòng)相也用甲醇∶水∶乙腈體積比為20∶41∶39分析了云南紅豆杉中紫杉醇、巴卡亭III、10-去乙?；馍紝帀A、taxuyunnanine A和10-deacetyltaxuyunnanine A的含量。均未提出有關(guān)10-去乙?；涂ㄍII的測(cè)定方法，其原因是10-去乙?；涂ㄍII的極性比其它紫杉烷類化合物的極性大得多，而三尖杉寧堿和紫杉醇之間又是極難分離的，使之在液相色譜分離中，雖然滿足了10-去乙?；涂ㄍII和巴卡亭III及其雜質(zhì)成分分離的洗脫比例條件，但是，卻不能滿足三尖杉寧堿和紫杉醇之間的分離，反之亦然。因此，只采用一種洗脫比例是不可能同時(shí)分離出紅豆杉植物提取物或紅豆杉細(xì)胞提取物或紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液提取物中10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇四種成分以及其它雜質(zhì)成分的。
申請(qǐng)人在開發(fā)應(yīng)用高效液相色譜中發(fā)現(xiàn)，紅豆杉植物和紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中含有多種紫杉烷類化合物以及復(fù)雜的雜質(zhì)成分，要將上述四種成分在較短的時(shí)間內(nèi)同時(shí)分離是比較困難的。申請(qǐng)人在已公開的等度洗脫法基礎(chǔ)上，采用分步等度洗脫法，完成了測(cè)定上述四種成分采用流動(dòng)相為乙腈∶水∶甲醇體積比為27∶44∶29，在反相色譜柱Nova-Pak C18上等度洗脫，先分離出結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常類似的三尖杉寧堿和紫杉醇；而用極性較大的流動(dòng)相甲醇∶水體積比為43∶57，在相同的色譜柱上等度洗脫分離出極性較大的10-去乙酰基巴卡亭III和巴卡亭III。此方法需要二次進(jìn)樣分步驟測(cè)定，其不足之處是測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)、程序繁瑣、工作量大，且所需的檢測(cè)費(fèi)用較高。
還有一種叫梯度洗脫法，有關(guān)報(bào)導(dǎo)如V.Bringi等在公開專利申請(qǐng)書(WO 97/44476.1997)中用Phenomenex Curosil-G柱，采用二元梯度比例洗脫，流動(dòng)相為乙腈和含0.01m molKH2PO4的緩沖水溶液，也能分離出10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、紫杉醇三種成分，紫杉醇的保留時(shí)間約8分鐘。而用Phenomenex IB-SIL Phenyl柱和采用另一種二元梯度比例洗脫，流動(dòng)相是乙腈和含0.015m molKH2PO4的緩沖水溶液，分離出10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、紫杉醇三種成分，紫杉醇的保留時(shí)間約為9.5分鐘，但以上二種方法均未提及三尖杉寧堿的測(cè)定。此外，V.Bringi等(WO97/44476.1997)使用Diphenyl柱，用二元梯度比例洗脫，流動(dòng)相為乙腈和含0.015m molKH2PO4的緩沖水溶液，此時(shí)，雖然能夠同時(shí)分離出上述四種成分及其它幾個(gè)紫杉烷化合物，但是紫杉醇的保留時(shí)間為31～33分鐘，完成一個(gè)分析測(cè)定至少需要40分鐘，因此，此法不適用于日常大量的分析。需要特別指出的是，以上方法均使用了緩沖溶液，雖然在許多液相色譜分離中，流動(dòng)相加入緩沖溶液，可以增加色譜峰的分離度，但在液相色譜系統(tǒng)中極易產(chǎn)生結(jié)晶鹽，會(huì)導(dǎo)致管路堵塞、泵頭磨損及色譜柱壽命縮短等，因此，應(yīng)盡可能不使用緩沖溶液為佳。
總之，以上方法存在要么分析時(shí)間較長(zhǎng)，要么不能夠把三尖杉寧堿峰和紫杉醇峰實(shí)現(xiàn)基線分離，且梯度比例洗脫法均使用了緩沖溶液，存在操作比較繁瑣的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種既簡(jiǎn)便又快速測(cè)定紅豆杉植物及其細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇、10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III和三尖杉寧堿的方法。
本發(fā)明可由如下方式來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明采用反相色譜柱為Nova-Pak C18，它是美國(guó)Waters公司生產(chǎn)，規(guī)格為3.9×150mm，填料粒度為4μm，流動(dòng)相由乙腈和水二種色譜試劑組成，首先用乙腈∶水體積比為30∶70的比例平衡色譜系統(tǒng)，紅豆杉細(xì)胞提取物或紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液提取物或紅豆杉植物提取物進(jìn)入系統(tǒng)，梯度洗脫，在0～10分鐘，乙腈∶水的體積比從30∶70逐步變化到50∶50，梯度變化曲線為0.5～0.7；然后，繼續(xù)以50∶50的比例洗脫3分鐘；最后，用30∶70的比例平衡系統(tǒng)5分鐘，共18分鐘完成一個(gè)分析測(cè)定，紫杉醇的保留時(shí)間為11.12～11.8分鐘。見梯度表1、2。
梯度表1時(shí)間(min) 乙腈％(A) 水％(B) 流速(mL/min) 線形0 30 7010.510 50 501 113 50 501 018 30 701 1四種成分的保留時(shí)間如下所示組分 保留時(shí)間(min)10-去乙酰基巴卡亭III 3.17巴卡亭III 5.03
三尖杉寧堿 10.30紫杉醇 11.12梯度表2時(shí)間(min)乙腈％(A)水％(B) 流速(mL/min) 線形0 30 70 1 0.710 50 50 1 113 50 50 1 018 30 70 1 1四種成分的保留時(shí)間如下所示組分 保留時(shí)間(min)10-去乙?；涂ㄍII 3.24巴卡亭III5.41三尖杉寧堿 11.04紫杉醇 11.80本發(fā)明所采用的紅豆杉細(xì)胞提取物或紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液提取物以及紅豆杉植物提取物是用有機(jī)溶劑提取得到的粗提物，在色譜柱Nova-Pak C18上梯度洗脫，10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇四種成分峰同時(shí)在HPLC色譜圖上基線分離。紅豆杉細(xì)胞提取物或紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物提取物以及紅豆杉植物提取物是短葉紅豆杉、中國(guó)紅豆杉、東北紅豆杉、南方紅豆杉、西藏紅豆杉、云南紅豆杉、漿果紅豆杉或曼地亞紅豆杉的樹皮、枝葉、細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)液的提取物。
本發(fā)明由于采用了改進(jìn)的梯度比例洗脫法，色譜柱分離的峰塔板數(shù)增加，梯度洗脫法紫杉醇峰塔板數(shù)為3.26×104，當(dāng)檢測(cè)器的靈敏度是0.05Aufs時(shí)，紫杉醇的最低檢出量可達(dá)0.001μg，此外，本發(fā)明不需要使用緩沖溶液，同樣使紅豆杉植物及其細(xì)胞培養(yǎng)物中10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇在HPLC色譜圖上的色譜峰得到很好的分離效果，從而使本發(fā)明能快速、簡(jiǎn)便同時(shí)測(cè)定紅豆杉植物及其細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇、10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III和三尖杉寧堿，具有準(zhǔn)確、靈敏度高和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合色譜圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。


圖1為本發(fā)明測(cè)定紅豆杉細(xì)胞的色譜圖。
圖2為用等度比例乙腈∶水∶甲醇測(cè)定紅豆杉細(xì)胞的色譜圖。
圖3為用等度比例甲醇∶水測(cè)定紅豆杉細(xì)胞的色譜圖。
實(shí)驗(yàn)儀器與試藥Waters 515 WDL-95高效液相色譜儀由美國(guó)Waters公司生產(chǎn)，色譜工作站軟件由大連化學(xué)物理研究所開發(fā)。對(duì)照品即10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇購(gòu)于SIGMA公司，純度均大于97％以上；紅豆杉細(xì)胞提取物或紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液提取物以及紅豆杉植物提取物由申請(qǐng)人提供；HPLC分析用色譜純?cè)噭┘状?、乙腈和純凈水，提取用分析純?cè)噭┘状?、丙酮、二氯甲烷和蒸餾水。
色譜條件色譜柱為Nova-Pak C18柱，它由美國(guó)Waters公司生產(chǎn)，規(guī)格3.9×150mm，填料粒度4μm；流速為1mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為227nm；檢測(cè)器靈敏度為0.05Aufs；柱溫為35℃；流動(dòng)相采用乙腈和水，洗脫程序采用梯度表1。
制定標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)四種成分對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)含量，采用外標(biāo)法，準(zhǔn)確定量紅豆杉細(xì)胞提取物或紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液提取物以及紅豆杉植物提取物中四種成分的含量。精密稱取10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇四種對(duì)照品，分別加甲醇溶解制成每1mL中約含0.5mg對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇的混合對(duì)照品溶液，10-去乙?；涂ㄍII的濃度依次為0.001066、0.00533、0.01066、0.02665、0.0533mg/mL，巴卡亭III的濃度依次為0.00112、0.0056、0.0112、0.028、0.056mg/mL，三尖杉寧堿的濃度依次為0.00104、0.0052、0.0104、0.026、0.052mg/mL，紫杉醇的濃度依次為0.001034、0.00517、0.01034、0.02585、0.0517mg/mL。取以上各濃度的混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣5μL，按上述色譜條件分別測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。各自的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(n＝5)分別為Y＝(3.087×107)x+(25570.686) r＝0.9993Y＝(2.502×107)x+(103175.688) r＝0.9952Y＝(2.412×107)x+(-19541.428) r＝0.9999Y＝(2.962×107)x+(-16402.496) r＝1.0000線性范圍0.001～0.3μg。
精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn)配制10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇的對(duì)照品混合溶液，濃度分別為0.01066，0.0112，0.0104，0.01034mg/mL，進(jìn)樣5μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，其相對(duì)誤差(RSD)分別為0.83％，0.76％，0.89％，0.52％。取供試品溶液1份，進(jìn)樣5μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，第1、2、3天相同方法測(cè)定。10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇的日內(nèi)相對(duì)誤差(RSD)分別為0.58％，0.63％，0.61％，0.55％，日間相對(duì)誤差(RSD)分別為2.98％，2.16％，2.07％，2.36％。結(jié)果表明供試品溶液至少在3天內(nèi)是穩(wěn)定的。
實(shí)施例一紅豆杉細(xì)胞提取物的制備精確稱取中國(guó)紅豆杉凍干細(xì)胞粉0.2g，加20mL甲醇浸泡24小時(shí)后，用超聲波振蕩15分鐘，細(xì)胞用濾紙過濾，加20mL甲醇重復(fù)超聲三次，合并濾液減壓濃縮至干，加10mL二氯甲烷和10mL蒸餾水萃取，共萃取三次，收集二氯甲烷溶液濃縮至干，用甲醇溶解洗脫并定容10mL，用0.45μm濾膜過濾，濾液供HPLC測(cè)定，每次進(jìn)樣5μL。
紅豆杉細(xì)胞采用二種方法進(jìn)行測(cè)定1、在上述的色譜條件下，采用本發(fā)明的二元梯度比例洗脫，見梯度表1，使上述四種成分峰同時(shí)在HPLC色譜圖上實(shí)現(xiàn)基線分離，見色譜圖1，并對(duì)四種成分進(jìn)行定量分析。
梯度表1時(shí)間(min)乙腈％(A) 水％(B) 流速(mL/min) 線形0307010.51050501 11350501 01830701 1四種成分的保留時(shí)間如下所示組分保留時(shí)間(min)10-去乙?；涂ㄍII3.17巴卡亭III 5.03三尖杉寧堿 10.30紫杉醇 11.12
2、在上述的色譜條件下，采用等度洗脫法分二次進(jìn)樣分別測(cè)定四種成分，采用等度比例乙腈∶水∶甲醇體積比為27∶44∶29為流動(dòng)相分離三尖杉寧堿和紫杉醇，并對(duì)其進(jìn)行定量分析，三尖杉寧堿和紫杉醇的保留時(shí)間分別是9.90，11.15分鐘，見色譜圖2；另外采用極性較大的等度比例甲醇∶水體積比為43∶57為流動(dòng)相分離極性較大的10-去乙酰基巴卡亭III和巴卡亭III，并對(duì)其進(jìn)行定量分析，10-去乙?；涂ㄍII和巴卡亭III的保留時(shí)間分別是6.95，11.67分鐘，見色譜圖3。
這二種方法的含量測(cè)定結(jié)果比較見表1。
表1 表中D表示10-去乙?；涂ㄍII，B表示巴卡亭III，C表示三尖杉寧堿，T表示紫杉醇。
實(shí)施例二紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液提取物的制備將云南紅豆杉細(xì)胞用200目濾布過濾，濾液即為紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液。準(zhǔn)確量取培養(yǎng)液5mL，直接加10mL二氯甲烷萃取，共萃取三次，收集二氯甲烷溶液濃縮至干，用甲醇溶解洗脫并定容5mL。用0.45μm濾膜過濾，濾液供HPLC測(cè)定，每次進(jìn)樣5μL。
細(xì)胞培養(yǎng)液采用實(shí)施例一所述的二種方法進(jìn)行測(cè)定，含量測(cè)定結(jié)果比較見表2。
表2

表中D表示10-去乙?；涂ㄍII，B表示巴卡亭III，C表示三尖杉寧堿，T表示紫杉醇。
實(shí)施例三紅豆杉植物提取物的制備精密稱取南方紅豆杉枝葉粉碎的干粉5克，加入30mL丙酮和20mL水即丙酮和水體積比為6∶4浸提，并用磁力攪拌器攪拌和過濾4次，每次為60分鐘，合并濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收丙酮，回收丙酮后剩余的水部分分別加50mL二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷溶液減壓濃縮至干，甲醇溶解洗脫并定容100mL，搖勻，用0.45μm濾膜過濾，濾液供HPLC測(cè)定，每次進(jìn)樣5μL。
紅豆杉枝葉采用實(shí)施例一所述的二種方法進(jìn)行測(cè)定，含量測(cè)定結(jié)果比較見表3。
表3

表中D表示10-去乙酰基巴卡亭III，B表示巴卡亭III，C表示三尖杉寧堿，T表示紫杉醇。
以上測(cè)定結(jié)果表明，用兩種方法測(cè)定紅豆杉枝葉、紅豆杉細(xì)胞及培養(yǎng)液中10-去乙酰基巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉寧堿及紫杉醇四種成分的含量的結(jié)果基本上一致，本發(fā)明分析時(shí)間大大縮短，色譜試劑用量大大減少，又可以同時(shí)分析四種成分，具備快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種紅豆杉植物及其細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇以及同系物的測(cè)定方法，其特征在于色譜柱是Nova-Pak C18，流動(dòng)相由乙腈和水二種色譜試劑組成，首先用乙腈∶水體積比為30∶70的比例平衡色譜系統(tǒng)，紅豆杉細(xì)胞提取物或紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液提取物或紅豆杉植物提取物進(jìn)入系統(tǒng)，梯度洗脫，在0～10分鐘，乙腈∶水的體積比從30∶70逐步變化到50∶50，梯度變化曲線為0.5～0.7；然后，繼續(xù)以50∶50的比例洗脫3分鐘；最后，用30∶70的比例平衡系統(tǒng)5分鐘，紫杉醇的保留時(shí)間為11.12～11.8分鐘。
2.依權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于紅豆杉細(xì)胞提取物或紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液提取物以及紅豆杉植物提取物是用有機(jī)溶劑提取得到的粗提物，在色譜柱Nova-Pak C18上梯度洗脫，10-去乙?；涂ㄍII、巴卡亭III、三尖杉寧堿和紫杉醇四種成分峰同時(shí)在HPLC色譜圖上基線分離。
3.依權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于紅豆杉細(xì)胞提取物或紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物提取物以及紅豆杉植物提取物是短葉紅豆杉、中國(guó)紅豆杉、東北紅豆杉、南方紅豆杉、西藏紅豆杉、云南紅豆杉、漿果紅豆杉或曼地亞紅豆杉的樹皮、枝葉、細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)液的提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種紅豆杉植物及其細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇以及同系物的測(cè)定方法，其特征在于色譜柱是Nova－Pak C
文檔編號(hào)G01N30/34GK1588044SQ20041005153
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月16日
發(fā)明者黃巧明, 夏惠青, 侯嵩生, 王國(guó)亮, 李志良 申請(qǐng)人:梅縣梅雁生物工程研究所