專利名稱：鼻咽癌血清學(xué)診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鼻咽癌診斷設(shè)備，特別涉及一種鼻咽癌血清學(xué)診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
由于鼻咽癌患者與健康人血清之間EB病毒(Epstein barr virus，EBV)相關(guān)抗體的種類及含量高低存在著差別。應(yīng)用間接免疫酶方法測(cè)定血清EB病毒抗體IgA水平作為鼻咽癌的輔助診斷手段已沿用了近三十年，檢查結(jié)果主要依賴顯微鏡觀察進(jìn)行主觀判斷。為了對(duì)這一方法進(jìn)行改進(jìn)，應(yīng)用基因工程方法生產(chǎn)了各種EB病毒相關(guān)的抗原如核抗原(EBNAs)、即刻早期蛋白抗原(ZEBRA)、彌散型早期抗原(EA-D)、衣殼抗原(VCA)、膜抗原(MA)等。應(yīng)用上述抗原的組合已建立了檢測(cè)血清中相應(yīng)IgA或IgG抗體水平的酶聯(lián)吸附測(cè)定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)方法，發(fā)揮了ELISA方法可利用儀器讀數(shù)，使結(jié)果判斷更為客觀，操作也更簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。部分試劑盒已作為商品提供臨床應(yīng)用。
用不同的EBV相關(guān)抗原來(lái)區(qū)別鼻咽癌患者血清與健康人之間的差異，涉及到各種EBV相關(guān)抗原的制備，純化及抗原的優(yōu)化組合等問(wèn)題，是現(xiàn)有試劑盒成本高的原因之一。由于價(jià)格高，目前市場(chǎng)提供的ELISA試劑盒在鼻咽癌高發(fā)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中難于推廣應(yīng)用。要將ELISA方法推廣到鼻咽癌高發(fā)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用就必須提高ELISA試劑盒的性價(jià)比。在不影響檢測(cè)效果的條件下更經(jīng)濟(jì)地制備EB病毒相關(guān)抗原是提高試劑盒性價(jià)比的重要途經(jīng)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種性價(jià)比高、易于推廣應(yīng)用的鼻咽癌血清學(xué)診斷試劑盒。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的該鼻咽癌血清學(xué)診斷試劑盒組成為(1)EBV早期復(fù)合蛋白(EB-EAc)包被的96孔板1塊；(2)樣品稀釋液 100人份；(3)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG使用液100人份；(4)顯色液 A液0.04％聯(lián)苯二胺 100人份；B液0.015％過(guò)氧化氫 100人份；(5)終止液 2mol/L硫酸 100人份；(6)陽(yáng)性對(duì)照鼻咽癌患者混合血清 1mL；(7)陰性對(duì)照健康人混合血清 1mL；(8)25倍濃縮的洗滌液0.2M pH7.0磷酸鹽緩沖液 50mL。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明以經(jīng)過(guò)處理的含EB病毒早期復(fù)合蛋白(EBV-EAc)的細(xì)胞蛋白作為ELISA包被抗原檢測(cè)各類血清，其準(zhǔn)確性(判斷鼻咽癌的敏感性與特異性之和)高于當(dāng)前的市售試劑盒。在檢測(cè)鼻咽癌血清方面本試劑盒與檢測(cè)血清VCA-IgA或EA-IgA抗體的間接酶方法，檢測(cè)血清EBV-DNA酶抗體的中和法有互補(bǔ)性，其中與VCA-IgA方法存在更明顯的互補(bǔ)，二者聯(lián)合應(yīng)用可提高鼻咽癌檢出率。將本試劑盒用于鼻咽癌血清學(xué)篩查時(shí)，可先用本試劑盒檢測(cè)血清的EAc-IgG抗體水平，陽(yáng)性者再用間接酶方法測(cè)VCA-IgA滴度，將具有雙項(xiàng)陽(yáng)性者作為判斷高危人群的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床檢查或隨訪，能提高早期鼻咽癌的檢出率。這種聯(lián)合篩查方法經(jīng)實(shí)踐檢驗(yàn)是目前可應(yīng)用于高發(fā)地區(qū)鼻咽癌血清學(xué)篩查的最快捷最經(jīng)濟(jì)的途徑。本試劑盒的待測(cè)血清只作對(duì)倍稀釋，即先在反應(yīng)孔中加入50微升樣品稀釋液后再加入50微升血清原液即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不須另外稀釋待測(cè)血清，檢測(cè)時(shí)間僅需2小時(shí)，既減少了檢測(cè)誤差，又節(jié)省了工時(shí)，在操作方面具有顯著的獨(dú)特性。


圖1是本發(fā)明的EBV-EAc抗原與各類血清的反應(yīng)結(jié)果測(cè)試圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明采用一種抗原提取液處理能表達(dá)EBV-EAc的Raji細(xì)胞，然后應(yīng)用免疫吸附方法去除與健康人有反應(yīng)的蛋白成份。建立了直接應(yīng)用含有EBV-EAc細(xì)胞蛋白作為ELISA抗原的鼻咽癌血清學(xué)診斷試劑盒。該試劑盒組成為(1)EBV早期復(fù)合蛋白(EB-EAc)包被的96孔板1塊；(2)樣品稀釋液 100人份(0.05ml/人)；(3)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG使用液100人份(0.1ml/人)；(4)顯色液 A液0.04％聯(lián)苯二胺 100人份(0.05ml/人)；B液0.015％過(guò)氧化氫 100人份(0.05ml/人)；(5)終止液 2mol/L硫酸 100人份(0.1ml/人)；(6)陽(yáng)性對(duì)照鼻咽癌患者混合血清 1mL；(7)陰性對(duì)照健康人混合血清 1mL；(8)25倍濃縮的洗滌液0.2M pH7.0磷酸鹽(P.B.S)緩沖液50mL。
根據(jù)ELISA操作步驟用這個(gè)試劑盒檢測(cè)血清可以診斷鼻咽癌。操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下將健康人血清、鼻咽癌患者血清、其它腫瘤患者血清、現(xiàn)場(chǎng)篩查血清和試劑盒內(nèi)的陽(yáng)性、陰性血清各0.05mL加到反應(yīng)板上(1人/孔)。依常規(guī)ELISA方法溫育、洗滌(將試劑盒內(nèi)備好洗滌液進(jìn)行25倍稀釋后應(yīng)用)三次、每孔再加入試劑盒內(nèi)備好的二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG使用液，溫育、洗滌后每孔分別加入顯色液A和B各0.05mL顯色10分鐘后加入終止液0.1mL。將反應(yīng)孔的顏色與陽(yáng)性對(duì)照孔作對(duì)比，或用酶標(biāo)讀數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè)，待檢血清孔吸光度A與陰性對(duì)照孔吸光度A之比＞2.1時(shí)，該孔血清的IgG抗EBV-Eac為陽(yáng)性，可作為判斷鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)。
一、材料與方法材料1.反應(yīng)板內(nèi)抗原的制備表達(dá)EBV-EAc的含EBV基因組的細(xì)胞(通常為正丁酸誘導(dǎo)后的RaJi細(xì)胞)，懸浮于10倍于細(xì)胞壓積的抗原提取液(主要成份Tris-HCL緩沖液、氯化鎂、氯化鉀和巰基乙醇)中，-20℃過(guò)夜，室溫解凍，超聲粉碎機(jī)處理細(xì)胞懸液，10000rpm4℃離心10分鐘，取上清液用健康人IgG瓊脂糖珠吸附3次后，測(cè)定蛋白濃度，-80℃保存作為ELISA抗原。以0.1μg/孔濃度包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板。
2.待測(cè)血清健康人血清、鼻咽癌患者血清、其它腫瘤患者血清和現(xiàn)場(chǎng)篩查血清每例1mL。
3.二抗、顯色液、終止液和洗滌液與試劑盒內(nèi)所列相同方法1.應(yīng)用免疫印跡方法了解制備的EBV-EAc抗原與各類血清的反應(yīng)；2.應(yīng)用本試劑盒對(duì)待檢血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)以了解(1)本試劑盒檢測(cè)鼻咽癌血清的敏感性和特異性；(2)本試劑與現(xiàn)有方法(EA-IgA、VCA-IgA間接酶法和DNA酶中和法)對(duì)各類血清進(jìn)行平行測(cè)定結(jié)果；(3)本試劑與現(xiàn)有方法(EA-IgA、VCA-IgA間接酶法和DNA酶中和法)在檢測(cè)鼻咽癌血清中的互補(bǔ)性；(4)本試劑與市售的3種EBV-ELISA試劑盒的平行測(cè)定結(jié)果；(5)本試劑在高危人群血清學(xué)篩查中的應(yīng)用。
二、結(jié)果1.EBV-EAc抗原與各類血清的反應(yīng)EA抗原為復(fù)合物，在圖1中，1、2為EAc細(xì)胞蛋白SDS-PAGE考馬氏亮藍(lán)染色，3、4、5、6為western blot圖，3、5與鼻咽癌血清反應(yīng)，4與正常人血清反應(yīng)，6為未誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞蛋白與鼻咽癌血清呈陰性反應(yīng)。
2.用本試劑盒檢測(cè)各種血清的結(jié)果應(yīng)用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490/630下測(cè)定各組的光密度A均值分組 A均值NPC(266例) 0.488(P)非NPC腫瘤(286例) 0.195健康人群(347例) 0.159(N)P/N＞2.1EAc-IgG陽(yáng)性率 (Cutoff A值＝0.3)分組 陽(yáng)性人數(shù)NPC(266) 248/266(93.23％)非NPC腫瘤(286) 43/286(15.03％)健康人群(347) 4/347(6.92％)即特異性93.08％(323/347)敏感性93.23％(248/266)
3.本試劑與EA-IgA，VCA-IgA間接酶法和EBV相關(guān)的DNA酶抗體中和法的比較檢測(cè)臨床血清1327例，其中懷疑鼻咽癌331例，病理確診鼻咽癌83例，其四項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果如下檢測(cè)鼻咽癌陽(yáng)性率指標(biāo) 陽(yáng)性率cutoff值EAc-IgG 95.18％(79/83)A值＝0.3VCA-IgA 84.33％(70/83)滴度1∶10EA-IgA 71.08％(59/83)滴度1∶10DNAase抗體 79.17％(57/72)中和率30％4.本試劑與EA-IgA，VCA-IgA間接酶法和DNA酶中和法檢測(cè)鼻咽癌血清的互補(bǔ)性(1)與VCA-IgA間接酶法EA-IgG 例數(shù) VCA-IgA陽(yáng)性 VCA-IgA陰性陽(yáng)性 79 67 12陰性 43 1合計(jì) 83 70 13 (2).
與EBV-DNA酶抗體中和法EA-IgG 例數(shù) DNAase陽(yáng)性 DNAase陰性陽(yáng)性 68 56 12陰性 41 3合計(jì) 72 57 15(3).
與EA-IgA間接酶法EA-IgG 例數(shù)EA-IgA陽(yáng)性EA-IgA陰性陽(yáng)性 79 58 21陰性 41 3合計(jì) 83 59 245.本試劑盒與市售EBV相關(guān)抗體檢測(cè)試劑盒比較(1)待測(cè)血清處理試劑盒待測(cè)血清處理美國(guó)Trinity EBV-IgA 20倍稀釋血清美國(guó)Trinity EBV EAD-IgG 20倍稀釋血清香港神龍EBNA1-IgA 20倍稀釋血清本試劑盒 對(duì)倍稀釋血清(2)檢測(cè)結(jié)果鼻咽癌56例 正常人群34例試劑 敏感度 特異度美國(guó)Trinity EBV-IgA 70.00％ 85.29％美國(guó)Trinity EBV EAD-IgG 85.45％ 88.25％香港神龍EBNA1-IgA87.50％ 91.17％本試劑盒 94.64％ 88.25％6.本試劑在血清學(xué)篩查中的應(yīng)用參與國(guó)家科技部十五攻關(guān)現(xiàn)場(chǎng)廣東羅定5871人群的鼻咽癌篩查，結(jié)果如下
EAc-IgG陽(yáng)性713/5871(12.14％)VCA-IgA陽(yáng)性477/5871(8.12％)VCA-IgA與EA-IgG雙相陽(yáng)性有134例(2.28％)，將其確定為高危人群，從中新發(fā)現(xiàn)鼻咽癌5例。其余陰性或單項(xiàng)陽(yáng)性患者一年隨訪期間未發(fā)現(xiàn)鼻咽癌。
以上測(cè)試結(jié)果可得出(1)以經(jīng)過(guò)處理的含EBV-EAc的細(xì)胞蛋白作為ELISA包被抗原檢測(cè)各類血清，其準(zhǔn)確性(判斷鼻咽癌的敏感性與特異性之和)高于當(dāng)前的市售試劑盒。
(2)在檢測(cè)鼻咽癌血清方面本試劑盒與VCA-IgA或EA-IgA間接酶方法，EBV-DNA酶中和法有互補(bǔ)性，其中與VCA-IgA存在更明顯的互補(bǔ)，二者聯(lián)合應(yīng)用可提高鼻咽癌檢出率。
(3)將本試劑盒用于鼻咽癌血清學(xué)篩查時(shí)，可先用本試劑盒檢測(cè)血清的EAc-IgG抗體水平，陽(yáng)性者再用間接酶方法測(cè)VCA-IgA滴度，將雙項(xiàng)陽(yáng)性作為判斷高危人群的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床檢查或隨訪，能提高早期鼻咽癌的檢出率。本方法經(jīng)實(shí)踐檢驗(yàn)是目前最快捷經(jīng)濟(jì)的高發(fā)地區(qū)鼻咽癌血清學(xué)篩查途徑。
(4)本試劑盒的待測(cè)血清只作對(duì)倍稀釋，即先在反應(yīng)孔中加入50微升樣品稀釋液后再加入50微升血清原液即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不須另外稀釋待測(cè)血清，檢測(cè)時(shí)間僅需2小時(shí)，既減少了檢測(cè)誤差，又節(jié)省了工時(shí)，在操作方面具有顯著的獨(dú)特性。
權(quán)利要求
1.一種鼻咽癌血清學(xué)診斷試劑盒，其組成為(1)EBV-EAc蛋白包被的96孔板1塊；(2)樣品稀釋液 100人份；(3)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG使用液100人份；(4)顯色液A液0.04％聯(lián)苯二胺100人份；B液0.015％過(guò)氧化氫 100人份；(5)終止液2mol/L硫酸 100人份；(6)陽(yáng)性對(duì)照鼻咽癌患者混合血清 1mL；(7)陰性對(duì)照健康人混合血清 1mL；(8)25倍濃縮的洗滌液0.2M pH7.0磷酸鹽緩沖液50mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及鼻咽癌診斷設(shè)備。公開(kāi)了一種鼻咽癌血清學(xué)診斷試劑盒，其組成為(1)EBV－EA復(fù)合蛋白包被的96孔板1塊；(2)樣品稀釋液100人份；(3)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG使用液100人份；(4)顯色液A液(0.04％聯(lián)苯二胺)100人份；B液(0.015％過(guò)氧化氫)100人份；(5)終止液(2mol/l硫酸)100人份；(6)陽(yáng)性對(duì)照鼻咽癌患者混合血清1ml；(7)陰性對(duì)照健康人混合血清1ml；(8)25倍濃縮的洗滌液50ml。本發(fā)明的鼻咽癌血清學(xué)診斷試劑盒性價(jià)比高、應(yīng)用時(shí)不必稀釋血清，省時(shí)、高效、易于推廣應(yīng)用，特別適用于高發(fā)區(qū)人群的鼻咽癌血清學(xué)篩查。
文檔編號(hào)G01N33/544GK1648666SQ200410052180
公開(kāi)日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者張昌卿, 肖錫賓, 孫韻, 張穎, 葉永照, 洪明晃 申請(qǐng)人:中山大學(xué)腫瘤防治中心