專利名稱：定量檢測(cè)赤潮異彎藻的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)赤潮異彎藻的方法，具體是一種定量檢測(cè)赤潮異彎藻的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法。用于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)是一種廣泛分布于世界近岸海域的常見(jiàn)的有害藻類，也是我國(guó)近海常見(jiàn)的赤潮生物，曾經(jīng)有多次引發(fā)赤潮的報(bào)道，給海洋漁業(yè)和人類健康帶來(lái)巨大威脅。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)赤潮異彎藻，隨時(shí)了解其在海洋中的動(dòng)態(tài)變化具有重要意義。在分類學(xué)上，赤潮異彎藻屬于黃藻門異彎藻屬。傳統(tǒng)的鑒別方法，即從形態(tài)學(xué)上區(qū)分赤潮異彎藻，主要是利用光學(xué)顯微鏡直接觀察和計(jì)數(shù)，操作時(shí)存在一定困難，且過(guò)程煩瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，當(dāng)樣品量多時(shí)工作量極大，因此主要用于藻的定性和分離，而不適用于藻的定量研究。因此，發(fā)展用于快速檢測(cè)赤潮異彎藻的新方法和新技術(shù)極具現(xiàn)實(shí)意義。但是，目前國(guó)內(nèi)國(guó)際關(guān)于這方面的研究進(jìn)展不大，尚未形成非常有效的對(duì)該藻進(jìn)行定性和定量測(cè)定的成熟技術(shù)?；诳贵w技術(shù)的間接性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法具有特異、靈敏、高效、易操作、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，且能同時(shí)分析大量的樣本，是一種對(duì)目標(biāo)抗原進(jìn)行定性定量分析的有效手段。目前，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法主要在醫(yī)學(xué)檢測(cè)和微生物學(xué)檢測(cè)研究中應(yīng)用，用于對(duì)整個(gè)藻細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道則較少。另外，雖然藻細(xì)胞抗體的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，但不易獲得高特異性的抗體。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，辛澤毓等在《高技術(shù)通訊》(2003.3，第13卷，74-79頁(yè))上發(fā)表的“兩種角毛藻酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的建立和應(yīng)用”，該文介紹了制備了鼠抗旋鏈角毛藻和柔弱角毛藻多克隆抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種抗體與三種角毛藻屬海藻有很強(qiáng)的交叉反應(yīng)，而與其他屬海藻交叉反應(yīng)很小或沒(méi)有。應(yīng)用這兩種抗體分別建立了旋鏈和柔弱角毛藻的競(jìng)爭(zhēng)型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)方法，檢測(cè)極限分別達(dá)到146個(gè)和521個(gè)藻細(xì)胞。該競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)具有較高的檢測(cè)靈敏度，但是該檢測(cè)方法需要預(yù)先用較多的藻細(xì)胞裂解溶液包被酶標(biāo)板，因此需要進(jìn)行藻細(xì)胞的大量連續(xù)培養(yǎng)，增加了檢測(cè)過(guò)程的工作量。此外，沒(méi)有獲得具有種間高特異性的抗體使得檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值大大降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足和缺陷，提供一種借助高特異性多克隆抗體定量檢測(cè)赤潮異彎藻的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，使其快速、簡(jiǎn)便定量，而且客觀、準(zhǔn)確地對(duì)該藻進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，即間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，以專一性地識(shí)別赤潮異彎藻的抗體作為基礎(chǔ)，首先以赤潮異彎藻標(biāo)準(zhǔn)樣品和待檢樣品包被酶標(biāo)板，37℃孵育后用脫脂奶粉溶液封閉，洗板后加入特異性抗赤潮異彎藻抗血清稀釋溶液，37℃孵育后洗板，加入酶標(biāo)二抗溶液，37℃孵育，洗板后加入酶反應(yīng)底物，孵育后加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng)；然后用酶標(biāo)儀測(cè)定板上各孔的吸光值，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，得出赤潮異彎藻定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線形范圍經(jīng)過(guò)計(jì)算得出直線方程，根據(jù)得到的方程對(duì)待測(cè)樣品中的赤潮異彎藻進(jìn)行定量。
以下通過(guò)步驟對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的具體限定(1)以赤潮異彎藻標(biāo)準(zhǔn)樣品和待檢樣品包被酶標(biāo)板，每孔100微升，37℃20-40分鐘后用10％脫脂奶粉溶液封閉，37℃20-40分鐘后洗板，加入特異性抗赤潮異彎藻抗血清稀釋溶液，37℃孵育10-20分鐘后洗板，加入酶標(biāo)二抗溶液，37℃孵育10-20分鐘，洗板后加入酶反應(yīng)底物，孵育10-15分鐘后加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng)。
(2)用酶標(biāo)儀測(cè)定板上各孔的吸光值，然后計(jì)算出相應(yīng)的吸光率％，計(jì)算公式為A/A0×100％，A0為飽和吸光值，取值3.5，A為各孔的吸光值，接著計(jì)算出各孔吸光率的Logit值，以之為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品梯度稀釋液中藻細(xì)胞密度的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制出赤潮異彎藻定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，找出其線性范圍并計(jì)算出吸光率的Logit值和對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞密度的常用對(duì)數(shù)值的直線相關(guān)方程，線性相關(guān)系數(shù)必須在0.99以上，根據(jù)得到的線性方程，代入待測(cè)樣品孔吸光率的Logit值，即求出對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞密度的常用對(duì)數(shù)值，經(jīng)過(guò)指數(shù)運(yùn)算完成對(duì)待測(cè)樣品中赤潮異彎藻的定量。
本發(fā)明的原理是特異性的抗體可以專一地識(shí)別特定的抗原決定簇，因而可對(duì)抗原進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，在37℃孵育的條件下，標(biāo)準(zhǔn)樣品和待檢樣品中的藻細(xì)胞會(huì)被高吸附力的酶標(biāo)板所吸附，多余的蛋白吸附位點(diǎn)通過(guò)封閉過(guò)程去除，加入高親和力的特異性抗血清稀釋溶液之后，酶標(biāo)板上的藻細(xì)胞會(huì)和溶液中的抗體結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)酶標(biāo)板上結(jié)合的抗體量即可算出相應(yīng)的待檢樣本中的藻細(xì)胞含量，因此可準(zhǔn)確地對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定。
本發(fā)明所述的抗體，它可以經(jīng)由赤潮異彎藻免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而獲得，這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通常包括(但不局限于)兔、鼠、豬、狗、牛、羊、馬等。特異性的抗體可以直接使用，另一方面抗體的特異性可以經(jīng)由一些常規(guī)的手段，如本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的抗體封閉技術(shù)等，得到提高，另外，抗體本身也可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記而進(jìn)行使用。
本發(fā)明所述的抗赤潮異彎藻抗體具有較好的種特異性。利用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定所述的抗體與其它藻之間的交叉反應(yīng)，結(jié)果表明它只能識(shí)別赤潮異彎藻而不識(shí)別其它藻，故可用于赤潮異彎藻的定性鑒別。
所述的以赤潮異彎藻標(biāo)準(zhǔn)樣品包被酶標(biāo)板，是指以經(jīng)過(guò)精確光鏡計(jì)數(shù)的含有赤潮異彎藻細(xì)胞的梯度稀釋溶液包被酶標(biāo)板。所述的以赤潮異彎藻待檢樣品包被酶標(biāo)板，是指以待檢天然海水樣品或者天然海水樣品濃縮溶液包被酶標(biāo)板。
這種方法不僅克服了赤潮異彎藻常規(guī)檢測(cè)中的缺點(diǎn)，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。
由于本發(fā)明提供了快速、簡(jiǎn)便定量檢測(cè)該藻的方法，使監(jiān)測(cè)某海區(qū)或養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)海水中赤潮異彎藻的動(dòng)態(tài)變化成為可能。通過(guò)監(jiān)測(cè)到的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，可以掌握海水中該種藻的數(shù)量，并及時(shí)做出調(diào)整以減少經(jīng)濟(jì)損失；同時(shí)，將這些動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)(諸如營(yíng)養(yǎng)鹽、其他物種的數(shù)量、水文氣象資料等)結(jié)合，可為科學(xué)研究海洋生態(tài)中各因素之間的相互影響關(guān)系提供一些有益幫助。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法作進(jìn)一步的理解實(shí)施例1.用于檢測(cè)赤潮異彎藻的抗體的制備本發(fā)明所用的赤潮異彎藻藻種由中國(guó)海洋大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)部提供。通過(guò)反復(fù)在顯微鏡下挑取單個(gè)藻細(xì)胞獲得純培養(yǎng)物。所用的培養(yǎng)基是常規(guī)的f/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光照/黑暗周期為14h/10h，光照強(qiáng)度為3000Lx，培養(yǎng)溫度為18℃-22℃。
處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的赤潮異彎藻培養(yǎng)液，用甲醛固定(終濃度0.5-1％)后，10000r/min離心10min收集藻細(xì)胞，再用蒸餾水清洗一遍，磷酸緩沖鹽溶液清洗兩遍，每步均通過(guò)離心收集藻細(xì)胞，離心條件均為10000r/min，10min。將藻細(xì)胞轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，甩去殘余水分，-20℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前取出，每管用0.6ml滅菌的磷酸緩沖鹽溶液重懸浮，混勻，與等體積的福氏完全佐劑(Sigma公司)混合乳化，乳化程度盡量完全，乳化物用于免疫家兔，選擇皮下注射和肌肉注射方式，劑量為107個(gè)細(xì)胞/兔。間隔兩周后加強(qiáng)免疫，除佐劑換為福氏不完全佐劑外，其它步驟不變，之后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次。從第3次加強(qiáng)免疫后一周，兔耳靜脈取血，分離血清，用常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清效價(jià)，當(dāng)血清效價(jià)到達(dá)較高水平時(shí)，不再免疫，采集家兔全血清，檢驗(yàn)后分裝保存于-20℃。最后獲得的抗赤潮異彎藻抗血清效價(jià)為1∶22000。
實(shí)施例2.抗赤潮異彎藻抗血清特異性的鑒定本實(shí)施例選用了我國(guó)近海常見(jiàn)的幾株浮游植物作為參照藻，它們是旋鏈角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、纖細(xì)角毛藻(Chaetoceros gracilis)、微型角毛藻(Chaetoceros minutissimus)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、諾氏海鏈藻(Thalassiosira nordenskioldi)、膜質(zhì)舟形藻(Navicula membranacea)、尖刺偽菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、米氏裸甲藻(Gymnodinium mikimotoi)、裸甲藻(Gymnodinium sp.)、紅色裸甲藻(Gymnodinium sanguineum)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarens)、微型原甲藻(Prorocentrum minimum)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)，它們均分離自天然海水，通過(guò)反復(fù)在顯微鏡下挑取單個(gè)藻細(xì)胞獲得純培養(yǎng)物。按實(shí)施例1所述的方法培養(yǎng)和收集這些藻。
按權(quán)利要求所述的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)步驟進(jìn)行抗赤潮異彎藻抗血清的特異性鑒定。所有藻用1ml磷酸緩沖鹽溶液重懸浮，顯微鏡計(jì)數(shù)后，取相同細(xì)胞量(2.0×104)懸浮于磷酸緩沖鹽溶液(終體積1ml)，用不含藻細(xì)胞的磷酸緩沖鹽溶液溶液作為陰性對(duì)照，數(shù)據(jù)結(jié)果列于表1。從表中可以看出，赤潮異彎藻吸光值/陰性對(duì)照吸光值(P/N)＞2.1，其他海藻的P/N值都在1.5以下，說(shuō)明抗赤潮異彎藻抗血清有很高的特異性，可以專一地識(shí)別赤潮異彎藻，因此可用于赤潮異彎藻的定性檢測(cè)。
因此，對(duì)于某待檢樣品，以本實(shí)施例所述的步驟進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)反應(yīng)，如果P/N值大于2.1，即可判定該樣品中有赤潮異彎藻的存在；如果該樣品為純培養(yǎng)物，則可判定該純培養(yǎng)物為赤潮異彎藻。這種定性測(cè)定方法的優(yōu)點(diǎn)是，由于使用的是赤潮異彎藻的專一性抗血清，因此能非常準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中是否存在赤潮異彎藻。
實(shí)施例3.對(duì)赤潮異彎藻的定量測(cè)定1.按實(shí)施例1所述的方法培養(yǎng)和收集赤潮異彎藻。
2.以含有0、38、192、960、4800、24000、120000、600000個(gè)細(xì)胞/毫升的赤潮異彎藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)溶液和待檢測(cè)樣品溶液包被酶標(biāo)板，每孔100微升，37℃溫育20分鐘后用10％脫脂奶粉溶液封閉，37℃溫育20分鐘后洗板，加入抗赤潮異彎藻血清稀釋液(1∶15000)，37℃孵育15分鐘后洗板，加入酶標(biāo)二抗溶液(羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶，稀釋12000倍)，37℃孵育15分鐘，洗板后加入酶反應(yīng)底物TMB基質(zhì)液，孵育10分鐘后加入2mol/L硫酸終止反應(yīng)，讀取板上各孔450nm處的吸光值。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線以赤潮異彎藻標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中藻細(xì)胞數(shù)目的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光率(％)，即標(biāo)準(zhǔn)樣品孔吸光值A(chǔ)/A0×100，為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以赤潮異彎藻標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中藻細(xì)胞密度的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以吸光率的Logit值，即ln[A/(A0-A)]，為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線線性檢測(cè)范圍的直線方程。其線性方程為ln[A/(A0-A)]＝0.7927×log藻細(xì)胞密度-5.1664，相關(guān)系數(shù)為R＝0.9954，線性檢測(cè)范圍在192～480000個(gè)細(xì)胞/毫升之間。
4.定量計(jì)算和分析根據(jù)待測(cè)樣品的吸光值，首先計(jì)算出各自的吸光率，接著計(jì)算出吸光率的Logit值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程，求出相應(yīng)的log藻細(xì)胞密度值，即可方便地計(jì)算出待測(cè)樣品中赤潮異彎藻細(xì)胞的密度，對(duì)應(yīng)的原始水樣中赤潮異彎藻的密度也可經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單計(jì)算得出結(jié)果。
實(shí)施例4.應(yīng)用本法對(duì)海水樣品的實(shí)際定量根據(jù)實(shí)施例3所述的方法，對(duì)5份海水樣品進(jìn)行了赤潮異彎藻細(xì)胞的定量檢測(cè)。對(duì)這5份海水樣品，分別用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法和顯微計(jì)數(shù)法檢測(cè)后，結(jié)果列于表2。經(jīng)比較分析，發(fā)現(xiàn)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法和顯微計(jì)數(shù)法檢測(cè)的結(jié)果基本吻合。
表1各海藻與抗赤潮異彎藻抗血清的交叉反應(yīng)檢測(cè)海藻名稱 吸光值P/N值赤潮異彎藻 0.403 4.7旋鏈角毛藻 0.103 1.2柔弱角毛藻 0.121 1.4纖細(xì)角毛藻 0.117 1.4微型角毛藻 0.108 1.3中肋骨條藻 0.114 1.3諾氏海鏈藻 0.129 1.5膜質(zhì)舟形藻 0.131 1.5尖刺偽菱形藻 0.092 1.1新月菱形藻 0.058 0.7米氏裸甲藻 0.131 1.5裸甲藻 0.097 1.1紅色裸甲藻 0.104 1.2塔瑪亞歷山大藻 0.094 1.1微型原甲藻 0.115 1.4海洋原甲藻 0.074 0.9東海原甲藻 0.113 1.3陰性對(duì)照 0.085 1.0表2海水樣品中赤潮異彎藻密度的檢測(cè)結(jié)果。表中樣品為赤潮異彎藻的純種培養(yǎng)物加天然海水稀釋而成。密度(個(gè)細(xì)胞/毫升)的測(cè)定結(jié)果均為6份平行樣品測(cè)定結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
樣品編號(hào) 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯微計(jì)數(shù)結(jié)果1 (6.4±1.1)×102(7.5±0.4)×1022 (2.0±0.2)×103(2.6±0.4)×103
3(6.1±0.6)×103(6.6±0.2)×1034(1.7±0.2)×104(1.5±0.3)×1045(4.9±0.5)×105(5.3±0.1)×105本發(fā)明成功地制備了抗赤潮異彎藻的抗體，并建立了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)方法，應(yīng)用該方法可定性定量地檢測(cè)赤潮異彎藻。發(fā)明人在世界上首次運(yùn)用高特異性多克隆抗體對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定性定量檢測(cè)，并取得了較好的結(jié)果。本方法的優(yōu)點(diǎn)能同時(shí)進(jìn)行定量和定性檢測(cè)，通過(guò)該方法既可知道待檢樣品中是否有赤潮異彎藻存在，還可同時(shí)知道該藻的數(shù)目有多少。本方法的另一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是快速，整個(gè)過(guò)程在數(shù)個(gè)小時(shí)之內(nèi)可以完成，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果比較準(zhǔn)確。
權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)赤潮異彎藻的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，其特征在于，以識(shí)別赤潮異彎藻的抗體為基礎(chǔ)，首先以赤潮異彎藻標(biāo)準(zhǔn)樣品和待檢樣品包被酶標(biāo)板，37℃孵育后用脫脂奶粉溶液封閉，洗板后加入特異性抗赤潮異彎藻抗血清稀釋溶液，37℃孵育后洗板，加入酶標(biāo)二抗溶液，37℃孵育，洗板后加入酶反應(yīng)底物，孵育后加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng)；然后用酶標(biāo)儀測(cè)定板上各孔的吸光值，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，得出赤潮異彎藻檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線形范圍經(jīng)過(guò)計(jì)算得出線性方程，對(duì)待測(cè)樣品中的赤潮異彎藻進(jìn)行定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)赤潮異彎藻的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，其特征是，以下通過(guò)步驟作進(jìn)一步的限定(1)以赤潮異彎藻標(biāo)準(zhǔn)樣品和待檢樣品包被酶標(biāo)板，每孔100微升，37℃20-40分鐘后用10％脫脂奶粉溶液封閉，37℃20-40分鐘后洗板，加入特異性抗赤潮異彎藻抗血清稀釋溶液，37℃孵育10-20分鐘后洗板，加入酶標(biāo)二抗溶液，37℃孵育10-20分鐘，洗板后加入酶反應(yīng)底物，孵育10-15分鐘后加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng)；(2)用酶標(biāo)儀測(cè)定板上各孔的吸光值，然后計(jì)算出相應(yīng)的吸光率％，計(jì)算公式為A/A0×100％，A0為飽和吸光值，取值3.5，A為各孔的吸光值，接著計(jì)算出各孔吸光率的Logit值，以之為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品梯度稀釋液中藻細(xì)胞密度的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制出赤潮異彎藻定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，找出其線性范圍并計(jì)算出吸光率的Logit值和對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞密度的常用對(duì)數(shù)值的直線相關(guān)方程，線性相關(guān)系數(shù)必須在0.99以上，根據(jù)得到的線性方程，代入待測(cè)樣品孔吸光率的Logit值，即求出對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞密度的常用對(duì)數(shù)值，經(jīng)過(guò)指數(shù)運(yùn)算完成對(duì)待測(cè)樣品中赤潮異彎藻的定量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)赤潮異彎藻的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，其特征是，所述的識(shí)別赤潮異彎藻的抗體，它能特異性地識(shí)別赤潮異彎藻，經(jīng)由赤潮異彎藻細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或細(xì)胞分離組分免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)赤潮異彎藻的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，其特征是，所述的以赤潮異彎藻標(biāo)準(zhǔn)樣品包被酶標(biāo)板，是指以經(jīng)過(guò)精確光鏡計(jì)數(shù)的含有赤潮異彎藻細(xì)胞的梯度稀釋溶液包被酶標(biāo)板。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)赤潮異彎藻的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，其特征是，所述的以赤潮異彎藻待檢樣品包被酶標(biāo)板，是指以待檢天然海水樣品或者天然海水樣品濃縮溶液包被酶標(biāo)板。
全文摘要
一種定量檢測(cè)赤潮異彎藻的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，用于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以識(shí)別赤潮異彎藻的抗體為基礎(chǔ)，首先以赤潮異彎藻標(biāo)準(zhǔn)樣品和待檢樣品包被酶標(biāo)板，37℃孵育后用脫脂奶粉溶液封閉，洗板后加入特異性抗赤潮異彎藻抗血清稀釋溶液，37℃孵育后洗板，加入酶標(biāo)二抗溶液，37℃孵育，洗板后加入酶反應(yīng)底物，孵育后加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng)；然后用酶標(biāo)儀測(cè)定板上各孔的吸光值，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，得出赤潮異彎藻檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線形范圍經(jīng)過(guò)計(jì)算得出線性方程，對(duì)待測(cè)樣品中的赤潮異彎藻進(jìn)行定量。本發(fā)明可快速、簡(jiǎn)便的定量檢測(cè)赤潮異彎藻，克服了赤潮異彎藻常規(guī)檢測(cè)中的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1588073SQ20041005285
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月15日
發(fā)明者李榮秀, 于志剛, 亓海剛, 辛澤毓, 米鐵柱 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)