專利名稱：一種測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法
所屬技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明用于測(cè)定雷公藤多苷的免疫控制效價(jià)，特別是一種通過檢測(cè)小白鼠胸腺萎縮程度來測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法。
背景技術(shù)：
雷公藤多苷是用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的首選臨床藥物，它是從衛(wèi)矛科植物雷公藤根中提取出來的一些次代謝產(chǎn)物的混合體，成分復(fù)雜，毒性大。國(guó)家至今尚未制訂出一個(gè)控制其質(zhì)量好壞的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)雷公藤的廠家通常都采用LD50測(cè)定法來控制毒性。半數(shù)致死量(簡(jiǎn)稱LD50)是指藥物引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物半數(shù)死亡的劑量。由于個(gè)體差異，同一劑量的藥物給同一動(dòng)物，可以出現(xiàn)死亡或不死亡。而LD50在表示藥物毒性時(shí)，比較靈敏，準(zhǔn)確。一般以mg/kg表示(藥物劑量/體重)。測(cè)定LD50常用動(dòng)物為小白鼠，體重18-22g，雄雌均可(雌的不得懷孕)將不同性別和體重的動(dòng)物均勻分成4或6組，每組10只。給藥途徑和臨床應(yīng)用相同，給藥容量不超過0.6ml為宜。一般觀察7天，以死亡為主要指標(biāo)。但實(shí)驗(yàn)證明毒性相同的兩批雷公藤多苷產(chǎn)品其效價(jià)有很大的區(qū)別，僅靠LD50測(cè)定法不能測(cè)定雷公藤多苷的效價(jià)，無法確保生產(chǎn)的雷公藤多苷低毒高效。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服單純依靠LD50測(cè)定法控制雷公藤多苷質(zhì)量，難以區(qū)分毒性相同的不同批次雷公藤產(chǎn)品的效價(jià)比的缺陷，提供一種通過檢測(cè)小白鼠胸腺萎縮程度測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法，將生物效價(jià)法和LD50法結(jié)合起來，控制雷公藤多苷的質(zhì)量，使生產(chǎn)的雷公藤多苷低毒高效。
本發(fā)明解決現(xiàn)有技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法，其特征是首先對(duì)一批次的多組小白鼠分別進(jìn)行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，尋求導(dǎo)致小白鼠胸腺萎縮呈線性關(guān)系的劑量范圍；接著在該劑量范圍對(duì)同一批次的多組小白鼠分別進(jìn)行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，連續(xù)數(shù)天給藥后，稱重，將小白鼠斷頸處死，剖取胸腺稱重，計(jì)算比較兩者的胸腺指數(shù)。以注射氫化可的松的小白鼠胸腺為參照確定雷公藤多苷的效價(jià)，所述的胸腺指數(shù)＝[胸腺(mg)/100g體重]的平方根。實(shí)驗(yàn)證明雷公藤多苷在小劑量時(shí)對(duì)幼年小鼠胸腺無明顯影響，大劑量時(shí)才能使胸腺萎縮。本發(fā)明通過對(duì)小白鼠分組進(jìn)行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，使小白鼠胸腺萎縮，將小白鼠處死后取出胸腺稱重，求出胸腺指數(shù)；以注射氫化可的松的小白鼠胸腺指數(shù)為基準(zhǔn)，比較雷公藤多苷的生物效價(jià)。
本發(fā)明中所述的實(shí)驗(yàn)小白鼠隨機(jī)分成四或六組，其中二分之一組注射氫化可的松，劑量范圍為16.4mg/kg～40mg/kg；另二分之一組注射雷公藤多苷，劑量范圍為64mg/kg～125mg/kg。
本發(fā)明中所述的小白鼠為出生18～20日齡，體重11～13g，胸腺為67mg～77mg的ICR幼鼠。因?yàn)橛资篌w重及胸腺重量都是隨著日齡的增加而增加，并且18日齡、19日齡及20日齡時(shí)幼鼠胸腺指數(shù)趨向平衡，有利于實(shí)驗(yàn)，減小胸腺指數(shù)相差太大帶來的不利影響。經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明符合該日齡和體重的ICR幼鼠其胸腺重量多在67mg～77mg之間，ICR為國(guó)際通用對(duì)標(biāo)準(zhǔn)小鼠品系的稱呼。(實(shí)驗(yàn)小鼠的品系之一)本發(fā)明中所述的給藥注射時(shí)間為每天一次，每次0.2ml/只，連續(xù)給藥3天，在給藥后第4天處死稱重。因?yàn)榻o藥5天的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)差異較大，故選擇給藥3天。
本發(fā)明中所述的雷公藤多苷采用一種或多種助溶劑加熱溶解，再用生理鹽水稀釋至無顆粒物質(zhì)沉淀即可；氫化可的松用生理鹽水稀釋至所需濃度。由于高濃度的氫化可的松藥液在低溫下容易產(chǎn)生析晶現(xiàn)象，過高濃度的氫化可的松不利于腹腔注射(20mg/ml的有析晶現(xiàn)象產(chǎn)生)。本發(fā)明中采用吐溫-80作為助溶劑。
本發(fā)明中所述的注射采用腹腔注射方式。因?yàn)楦骨蛔⑸漭^皮下肌肉注射反應(yīng)更明顯，而尾靜脈注射操作難度大，技術(shù)要求較高，普通人員不容易掌握，故選擇腹腔注射的方式進(jìn)行。
本發(fā)明首次將小白鼠胸腺萎縮檢測(cè)應(yīng)用在中藥領(lǐng)域測(cè)定雷公藤多苷的生物效價(jià)，通過對(duì)小白鼠腹腔注射雷公藤多苷或氫化可的松，使小鼠胸腺萎縮，剖取胸腺并稱重，計(jì)算比較胸腺指數(shù)，確定雷公藤多苷相對(duì)于氫化可的松的效價(jià)比和不同雷公藤多苷之間的效價(jià)比，以此來控制雷公藤多苷的毒性，做到低毒高效。此外，本發(fā)明還可以用在雷公藤制劑和其內(nèi)含成分(主要二萜類、三萜類)或單體(雷公藤甲素、生物堿、氯內(nèi)酯甲等等)及具有免疫抑制作用的其它中藥類(主要內(nèi)含二萜類成分)，測(cè)定相應(yīng)生物效價(jià)。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
具體實(shí)施方式(1).正常小鼠胸腺的重量取留仔數(shù)為8只/窩出生為18日齡，19日齡、20日齡、21日齡的ICR清潔級(jí)健康小鼠，稱重，解剖取其胸腺稱重。由表一可見，幼鼠體重及胸腺重量都是隨著日齡的增加而增加，并且18日齡、19日齡及20日齡時(shí)幼鼠胸腺指數(shù)趨向平衡，故本發(fā)明選擇日齡為18～20、體重為11g～13g、胸腺為67mg～77mg的幼鼠作為雷公藤多苷效價(jià)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物，以胸腺指數(shù)作為反應(yīng)指標(biāo)，胸腺指數(shù)＝[胸腺(mg)/100g體重]的平方根。
表一 正常ICR小鼠胸腺參數(shù)表 (2).雷公藤多苷劑量范圍的摸索取出生為18～20日齡，體重為11～13g的ICR小鼠75只，雌雄不計(jì)。按體重將其隨機(jī)分成五組(雷公藤多苷125mg/kg，100mg/kg，80mg/kg，64mg/kg，51.2mg/kg)，15只一組，連續(xù)給藥3天，在給藥后第四天，稱重，將小鼠斷頸處死，解剖取其胸腺稱重，計(jì)算。表二表明和胸腺指數(shù)呈線性關(guān)系的雷公藤劑量范圍在64mg/kg～125mg/kg。
表二 雷公藤多苷注射劑量與胸腺指數(shù)對(duì)照表
(3).氫化可的松劑量范圍的摸索取出生為18～20日齡，體重為11～13g的ICR幼鼠75只，雌雄不記。按體重將其隨機(jī)分成5組(氫化可的松40mg/kg，32mg/kg，20.5kg/mg，16.4mg/kg)，15只/組。連續(xù)給藥3天，在給藥后第四天，稱重，將小鼠斷頸處死，解剖取其胸腺，計(jì)算。表三表明和胸腺指數(shù)呈線性關(guān)系的氫化可的松劑量范圍在16.4mg/kg～40mg/kg。
表三 氫化可的松注射劑量與胸腺指數(shù)對(duì)照表
(4).市購(gòu)雷公藤多苷(批號(hào)2001001)與氫化可的松的對(duì)比實(shí)驗(yàn)取出生為18～20日齡，體重為11～13g的ICR幼鼠60只，雌雄不計(jì)，按體重將其隨機(jī)分成4組，15只/組)，氫化可的松2組高劑量(20mg/kg)，低劑量(16mg/kg)；雷公藤多苷2組高劑量(80mg/kg)，低劑量(64mg/kg)。連續(xù)給藥3天，給藥后第四天，稱重，將小鼠斷頸處死，解剖取其胸腺，計(jì)算胸腺指數(shù)。R值按量反應(yīng)平行線簡(jiǎn)算法計(jì)算，表四計(jì)算得R＝0.130，即雷公藤多苷效價(jià)是氫化可的松的0.130倍。
表四 雷公藤多苷小鼠重量法實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(5).本單位生產(chǎn)的雷公藤多苷(批號(hào)001121)與氫化可的松的對(duì)比實(shí)驗(yàn)取出生為18-20日齡，體重為11-13g的ICR幼鼠60只，雌雄不計(jì)。按體重將其隨機(jī)分成4組，15只/組，氫化可的松2組高劑量(21mg/kg)，低劑量(14.7mg/kg)；雷公藤多苷2組高劑量(120mg/kg)，低劑量(84mg/kg)。連續(xù)給藥3天，給藥后第四天，稱重，將小鼠斷頸處死，解剖取其胸腺，計(jì)算胸腺指數(shù)。R值同樣按量反應(yīng)平行線簡(jiǎn)算法計(jì)算，由表五計(jì)算得R＝1.525，即本單位生產(chǎn)的雷公藤多苷效價(jià)是氫化可的松的1.525倍。
表五 本單位生產(chǎn)的雷公藤多苷小鼠重量法實(shí)驗(yàn)結(jié)果
上述(2)～(5)操作步驟中的雷公藤多苷采用吐溫-80加熱溶解，再用生理鹽水稀釋至無顆粒物質(zhì)沉淀即可；氫化可的松用生理鹽水稀釋至所需濃度采用腹腔注射給藥，注射時(shí)間為每天一次，每次0.2ml/只，連續(xù)給藥3天，在給藥后第4天處死稱重。
單次給藥量0.2ml是根據(jù)小鼠的體重與所確定的劑量mg/kg及所配置的藥物濃度而定，實(shí)驗(yàn)中小鼠體重按其平均體重20g。
如 事先按照給藥0.2ml/只配好所需的藥物濃度即可。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法，其特征是首先對(duì)一批次的多組小白鼠分別進(jìn)行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，尋求導(dǎo)致小白鼠胸腺萎縮呈線性關(guān)系的劑量范圍；接著在該劑量范圍對(duì)同一批次的多組小白鼠分別進(jìn)行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，連續(xù)數(shù)天給藥后，稱重，將小白鼠斷頸處死，剖取胸腺稱重，計(jì)算比較兩者的胸腺指數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法，其特征是所述的實(shí)驗(yàn)小白鼠隨機(jī)分成四或六組，其中二分之一組注射氫化可的松，劑量范圍為16.4mg/kg～40mg/kg；另二分之一組注射雷公藤多苷，劑量范圍為64mg/kg～125mg/kg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法，其特征是所述的小白鼠為出生18～20日齡，體重11～13g，胸腺為67mg～77mg的ICR幼鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法，其特征是所述的給藥注射時(shí)間為每天一次，連續(xù)給藥3天，在給藥后第4天處死。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法，其特征是所述的給藥注射時(shí)間為每天一次，連續(xù)給藥3天，在給藥后第4天處死。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法，其特征是所述的雷公藤多苷采用一種或多種助溶劑加熱溶解，再用生理鹽水稀釋至無顆粒物質(zhì)沉淀即可；氫化可的松用生理鹽水稀釋至所需濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法，其特征是所述的注射采用腹腔注射方式。
全文摘要
本發(fā)明用于測(cè)定雷公藤多苷的免疫控制效價(jià)，特別是一種測(cè)定雷公藤多苷效價(jià)的方法。雷公藤多苷成分復(fù)雜，毒性大。生產(chǎn)廠家通常用LD50法來控制毒性。但毒性相同的兩批雷公藤多苷產(chǎn)品效價(jià)有很大的區(qū)別，僅靠LD50測(cè)定法不能測(cè)定雷公藤多苷的效價(jià)，無法確保產(chǎn)品低毒高效。本發(fā)明公開了一種測(cè)定方法，其特征是先對(duì)一批次的多組小白鼠分別進(jìn)行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，尋求導(dǎo)致小白鼠胸腺萎縮呈線性關(guān)系的劑量范圍；接著在該劑量范圍對(duì)同一批次的多組小白鼠分別進(jìn)行氫化可的松和雷公藤多苷的注射，連續(xù)數(shù)天給藥后，稱重，將小白鼠斷頸處死，剖取胸腺稱重，計(jì)算比較兩者胸腺指數(shù)，將生物效價(jià)法和LD50法結(jié)合起來控制雷公藤多苷的質(zhì)量。
文檔編號(hào)G01N33/48GK1727894SQ20041005335
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2004年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月28日
發(fā)明者金春暉, 吳錦權(quán), 章美英, 朱承偉 申請(qǐng)人:浙江得恩德制藥有限公司