專利名稱：一種高通量篩選反向蛋白質(zhì)芯片、制備方法及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適用于高通量篩選的蛋白質(zhì)芯片、其制備方法及利用所述芯片的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)芯片是繼基因芯片之后，作為基因芯片的補(bǔ)充發(fā)展起來的一種生物芯片技術(shù)。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者和體現(xiàn)者。在轉(zhuǎn)錄時(shí)，一個(gè)基因可能以多種mRNA形式剪接，并且同一蛋白質(zhì)可能以多種形式進(jìn)行翻譯后的修飾，一個(gè)蛋白質(zhì)組不是一個(gè)基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目可以超過基因組的數(shù)目。因此，蛋白質(zhì)表達(dá)譜比mRNA表達(dá)譜更能真實(shí)地反映生物體的功能機(jī)制。蛋白質(zhì)芯片提供了在同一時(shí)相分析整個(gè)蛋白質(zhì)組的可能。
現(xiàn)有蛋白質(zhì)芯片的制作，首先是按照預(yù)先設(shè)計(jì)的方式將大量不同的蛋白質(zhì)點(diǎn)陣于固相載體上，形成蛋白質(zhì)的陣列，即蛋白質(zhì)芯片，然后往芯片上加入帶有特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子，通過兩者的結(jié)合進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能分析、檢測(cè)和用于藥物篩選。
生命科學(xué)研究的微量化、自動(dòng)化技術(shù)、組合化學(xué)以及新的檢測(cè)方法為新藥發(fā)現(xiàn)賦予了新的概念--高通量藥物篩選。目前，高通量藥物篩選是發(fā)現(xiàn)新藥的重要途徑。一個(gè)新的藥物作用靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)后，建立一個(gè)穩(wěn)定、敏感、可信的高通量篩選模型，然后對(duì)大量未知樣品進(jìn)行針對(duì)該靶點(diǎn)的篩選，是高通量藥物篩選的主旨。
目前，蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用于藥物篩選的方法主要是，將大量功能蛋白質(zhì)點(diǎn)陣于片基上，然后均勻覆蓋待測(cè)樣品，觀察其與某種蛋白質(zhì)的作用。這種方法的局限性在于一次只能篩選一種樣品，同時(shí)不能對(duì)大量未知樣品針對(duì)一個(gè)藥物作用靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行篩選，從某種意義上說，這種方法是蛋白質(zhì)芯片對(duì)蛋白質(zhì)功能研究的一個(gè)補(bǔ)充，所以說這種方法還不是完全意義上的高通量藥物篩選蛋白質(zhì)芯片。
本發(fā)明所述反向蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用于高通量藥物篩選，將進(jìn)一步提高藥物篩選的效率，會(huì)大幅度降低成本，這種技術(shù)會(huì)為高通量藥物篩選注入新的活力。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在高通量藥物篩選中的局限，本發(fā)明提供一種針對(duì)一個(gè)藥物作用靶點(diǎn)可以對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行篩選的反向蛋白質(zhì)芯片。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種簡(jiǎn)單、低成本、易于實(shí)施的用于高通量新藥篩選的反向蛋白質(zhì)芯片的制備方法。
本發(fā)明所述反向蛋白質(zhì)芯片由固相載體和作為藥物作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)，其中所述作為藥物作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)預(yù)先固定在固相載體的表面。
利用本發(fā)明所述反向蛋白質(zhì)芯片的制備和檢測(cè)包括如下步驟1)在固相載體表面均勻固定一層作為藥物作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)薄層；2)在允許待測(cè)樣品與藥物靶點(diǎn)相互作用的條件下，將待測(cè)未知樣品點(diǎn)陣于蛋白質(zhì)層上，使待測(cè)樣品通過與作為靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)的相互作用而被結(jié)合；3)洗去未與蛋白質(zhì)結(jié)合的樣品后，再均勻覆蓋用于與藥物作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的配體物或底物；4)檢測(cè)所述固相載體上是否存在不帶有上述標(biāo)記的暗點(diǎn)或區(qū)域，作為有待進(jìn)一步復(fù)篩的陽性樣品。
本發(fā)明所述的反向蛋白質(zhì)芯片中，所述被均勻固定在固相載體上的蛋白質(zhì)可以選自任一已知可以作為藥物作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)，例如膜受體、核受體和酶，如G蛋白偶聯(lián)受體、雌激素受體LOX-1膜蛋白受體等。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述反向蛋白質(zhì)芯片上采用氧化型低密度脂蛋白受體LOX-1，用于篩選LOX-1受體拮抗劑。在本發(fā)明又一具體實(shí)施方案中，所述反向蛋白質(zhì)芯片上采用雌激素受體ER，用于篩選雌激素受體拮抗劑。本發(fā)明另一具體實(shí)施方案中，所述反向蛋白質(zhì)芯片上采用彈性蛋白酶，用于篩選彈性蛋白酶抑制劑。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，能夠利用本發(fā)明所述反向蛋白質(zhì)芯片，通過點(diǎn)陣于其上預(yù)先固定有藥物作用靶蛋白質(zhì)的芯片進(jìn)行高通量篩選的樣品，包括但不限于，化合物、天然產(chǎn)物(包括動(dòng)物、植物、礦物、微生物及其他原材料)和中藥提取物。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，用于本發(fā)明所述反向蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)的標(biāo)記物，應(yīng)當(dāng)為能夠與所選靶點(diǎn)蛋白質(zhì)具有特異性結(jié)合反應(yīng)的配體、DNA和酶底物，只要所述標(biāo)記物不影響待測(cè)物與所述蛋白質(zhì)之間的相互作用。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉如何選擇適于本發(fā)明所述反向蛋白質(zhì)芯片的所述固相載體。具體的，能夠用于本發(fā)明的固相載體包括但不限于表面帶有活化基團(tuán)的玻璃片、醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、尼龍膜、硅片、鋼片等。事實(shí)上，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，不影響所選靶蛋白質(zhì)與待測(cè)樣品結(jié)合以及標(biāo)記物對(duì)靶蛋白質(zhì)標(biāo)記的任一固相載體均適于本發(fā)明。
本發(fā)明所述反向蛋白質(zhì)芯片突破了目前蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行藥物篩選不能上通量的局限，實(shí)現(xiàn)了一種藥物高通量篩選分子或細(xì)胞模型對(duì)大量待篩樣品在生物芯片上的處理。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)越性在于第一，將高通量新藥篩選嫁接于蛋白質(zhì)芯片上，可以大大提高新藥篩選的通量，一張蛋白質(zhì)芯片可以容納至少10個(gè)384孔板的容量；第二，本方法耗材少、成本低，一方面極大地減少了建立高通量篩選模型所需蛋白質(zhì)的用量，同時(shí)也節(jié)省了待測(cè)樣品的用量，每個(gè)點(diǎn)樣品量?jī)H納升級(jí)；第三，本發(fā)明蛋白質(zhì)芯片適合于任何受體-配體、受體-DNA和酶-底物相互作用的藥物篩選系統(tǒng)。


圖1藥物高通量篩選蛋白質(zhì)芯片的制備原理示意圖。
圖2用藥物高通量篩選蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行膜受體-配體模型的高通量篩選。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，以舉例方式進(jìn)一步說明本發(fā)明所述反向蛋白質(zhì)芯片及利用所述芯片的檢測(cè)方法。
實(shí)施例1以膜受體為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選蛋白質(zhì)芯片以及利用所述芯片對(duì)凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)拮抗劑的篩選已知，LOX-1是一種主要由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的膜受體，氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)是其天然配體。以LOX-1-oxLDL相互作用建立分子模型，高通量篩選LOX-1受體拮抗劑。具體制被檢測(cè)過程如下1.載體玻片的表面清潔處理與活化先將載玻片放入1∶10稀釋了的去污劑溫水中，以超聲處理5min，然后用蒸餾水多次沖洗，再以100％甲醇沖洗，洗凈的玻片放于烘箱內(nèi)烘干。將玻片浸入第一層包被液APTS(氨基丙基三甲氧基硅烷，aminopropyltrimethoxysilane)中浸泡10min，再以95％乙醇洗滌，放入空氣中干燥，然后于真空烘箱內(nèi)80℃烘烤2小時(shí)。
氨基化后的玻片浸入第二種包被液BS3中(雙磺琥珀酰亞胺基辛二酸酯，bis-sulfosuccinimidyl suberate)，室溫下浸泡20min，然后在無塵烘箱內(nèi)37℃干燥15min。
這樣制好的活化玻片與蛋白連接(共價(jià)結(jié)合)后，以蒸餾水沖洗6h，蛋白連接仍保持良好?？稍诟稍飾l件下保存6周。
2.蛋白質(zhì)芯片的制備
將制備的膜受體蛋白LOX-1(0.5mg/ml)，均勻鋪于活化玻片表面，使之均勻吸附于活化玻片上。為了避免受體蛋白失活，此過程在冰上進(jìn)行，然后4℃晾干，用PBS沖洗3次，晾干后將待測(cè)樣品(化合物、天然產(chǎn)物、中藥提取物等)點(diǎn)陣于如上制備的包被LOX-1的玻片上。
點(diǎn)樣完成后，將玻片置于濕度30-40％的芯片雜交盒，室溫反應(yīng)。20min后以PBS沖洗玻片3次，每次1min。晾干后加入適量熒光標(biāo)記的配體，覆以蓋玻片使之均勻分布后，置于濕度30-40％、封閉芯片雜交盒，15min后以PBS沖洗玻片3次，每次1min。
點(diǎn)樣區(qū)域四個(gè)角及中心分別點(diǎn)有兩個(gè)陽性對(duì)照，為未標(biāo)記熒光的LOX-1特異性配體，oxLDL。
3.檢測(cè)將如上述加入待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)芯片在芯片掃描儀(Scaner-3，中科院光電所)以激發(fā)520nm，發(fā)射560nm波長(zhǎng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
一旦陽性待測(cè)樣品與LOX-1結(jié)合后，競(jìng)爭(zhēng)了LOX-1與其熒光標(biāo)記的特異配體oxLDL結(jié)合的位點(diǎn)，則掃描結(jié)果顯示為暗點(diǎn)，而背景顯示熒光亮度。
如圖2所示，四周及中心陽性對(duì)照物與LOX-1結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)了熒光標(biāo)記配體的與其結(jié)合，顯示為暗點(diǎn)，未結(jié)合待測(cè)樣品被洗去后顯示為強(qiáng)的綠色熒光背景。
4.結(jié)果分析運(yùn)用Photoshop分析軟件，每一張蛋白芯片設(shè)有數(shù)個(gè)陽性對(duì)照，以陽性對(duì)照暗點(diǎn)的灰度值為標(biāo)準(zhǔn)，分析樣品暗點(diǎn)的灰度值。
陽性抑制率％＝(陽性藥OD值/陰性對(duì)照OD值)*100％樣品抑制率％＝(樣品OD值/陰性對(duì)照OD值)*100％以陽性藥抑制率為閾值為標(biāo)準(zhǔn)確定復(fù)篩樣品。
實(shí)施例2以雌激素受體為靶點(diǎn)的高通量篩選蛋白質(zhì)芯片以及利用所述芯片對(duì)雌激素受體拮抗劑的高通量藥物篩選。
雌激素受體(ER)是核受體的一種，當(dāng)雌激素受體α(ERα)配體結(jié)合區(qū)(LBD)或DNA結(jié)合區(qū)(DBD)與其特異性配體或DNA結(jié)合后，引起熱休克蛋白(HSP)結(jié)構(gòu)改變，使其不能與共激活因子結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄。
1.載體表面的清潔處理與活化同實(shí)施例1。
2.蛋白質(zhì)芯片的制備將純化的ERα(0.5mg/ml)，均勻鋪于活化玻片表面，使之均勻吸附于活化玻片上，為了避免受體蛋白失活，此過程在冰上進(jìn)行，然后4℃晾干，用PBS沖洗3次，晾干后將待測(cè)樣品點(diǎn)陣于包被ERα的玻片上。
點(diǎn)樣完成后，將玻片置于濕度30-40％的芯片雜交盒，室溫反應(yīng)。20min后以PBS沖洗玻片3次，每次1min。晾干后加入適量FAM(N-3-fluoranthylmaleimide，Sigma)標(biāo)記的DNA，包含雌激素反應(yīng)元件(ERE)的雙鏈寡核苷酸，覆以蓋玻片使之均勻分布后置于濕度30-40％、封閉芯片雜交盒，15min后以PBS沖洗玻片3次，每次1min。芯片陽性對(duì)照為未標(biāo)記的ERE。
3.檢測(cè)將經(jīng)上述處理的反向蛋白質(zhì)芯片在芯片掃描儀以激發(fā)488nm，發(fā)射508nm波長(zhǎng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。因?yàn)殛栃源郎y(cè)樣品與ERα結(jié)合后，競(jìng)爭(zhēng)了其DBD位點(diǎn)，所以掃描結(jié)果顯示為暗點(diǎn)，而背景顯示藍(lán)色熒光亮度。
4.結(jié)果分析運(yùn)用Photoshop分析軟件，每一張蛋白芯片設(shè)有數(shù)個(gè)陽性對(duì)照，以陽性對(duì)照暗點(diǎn)的灰度值為標(biāo)準(zhǔn)，分析樣品暗點(diǎn)的灰度值。
陽性抑制率％＝(陽性藥OD值/陰性對(duì)照OD值)*100％樣品抑制率％＝(樣品OD值/陰性對(duì)照OD值)*100％以陽性藥抑制率為閾值為標(biāo)準(zhǔn)確定復(fù)篩樣品。
實(shí)施例3以彈性蛋白酶為靶點(diǎn)的高通量篩選蛋白質(zhì)芯片以及利用所述芯片進(jìn)行彈性蛋白酶抑制劑的高通量藥物篩選。
1.載體玻片的表面清潔處理及活化先將載玻片放入10％的NaOH中，95％乙醇清洗，烘干。以1％的瓊脂糖溶液3ml鋪板，待其凝固后浸泡于蒸餾水中，每2小時(shí)換水一次，6小時(shí)以后取出置37℃恒溫孵育箱中孵育，烘干后取出。
2.彈性蛋白酶芯片的制備將經(jīng)如上處理的玻片，表面均勻鋪一層彈性蛋白酶(0.5mg/ml)溶液，置于芯片雜交盒中，加水保濕，置4℃冰箱中使彈性蛋白酶自然吸附(5小時(shí))，吸附后取出，pH7.4的Tris-HCl溶液沖洗3次，晾干，使用芯片點(diǎn)樣儀將待測(cè)樣品(中科院電工所)點(diǎn)陣于玻片上，置于芯片雜交盒中反應(yīng)，15min后用PH7.4的Tris-HCl溶液沖洗3次。
晾干后在玻片上均勻鋪彈性蛋白酶底物-彈性蛋白，重新置于芯片雜交盒中，加水保濕，置37℃恒溫孵育箱中孵育，每2小時(shí)加水一次，8小時(shí)后取出，觀察結(jié)果。
3.檢測(cè)彈性蛋白酶與底物反應(yīng)后呈黃色，而當(dāng)所點(diǎn)樣品抑制彈性蛋白酶活性時(shí)，點(diǎn)樣處應(yīng)不顯色，使用顯微照相機(jī)攝像，PhotoShop分析，點(diǎn)樣處為暗點(diǎn)，蛋白芯片背景為黃色。
4.結(jié)果分析運(yùn)用Photoshop分析軟件，每一張蛋白芯片設(shè)有數(shù)個(gè)陽性對(duì)照，以陽性對(duì)照暗點(diǎn)的灰度值為標(biāo)準(zhǔn)，分析樣品暗點(diǎn)的灰度值。
陽性抑制率％＝(陽性藥OD值/陰性對(duì)照OD值)*100％
樣品抑制率％＝(樣品OD值/陰性對(duì)照OD值)*100％以陽性藥抑制率為閾值為標(biāo)準(zhǔn)確定復(fù)篩樣品。
權(quán)利要求
1.一種用于高通量篩選的反向蛋白質(zhì)芯片，其由固相載體和作為藥物作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)組成，其中所述作為藥物作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)預(yù)先固定在固相載體的表面。
2.權(quán)利要求1所述的反向蛋白質(zhì)芯片，其作為靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)以薄層形式均勻固定于固相載體表面。
3.權(quán)利要求1所述的反向蛋白質(zhì)芯片，其中所述作為靶點(diǎn)的蛋白選自膜受體蛋白、核受體蛋白和酶。
4.根據(jù)權(quán)利1所述的反向蛋白質(zhì)芯片，其中固相載體選自表面帶有活化基團(tuán)的玻璃片、醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、硅片、尼龍膜、鋼片。
5.一種利用權(quán)利要求1所述反向蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行高通量檢測(cè)的方法，包括步驟1)在固相載體表面均勻固定一層作為藥物作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)薄層；2)在允許待測(cè)樣品與藥物靶點(diǎn)相互作用的條件下，將待測(cè)未知樣品點(diǎn)陣于蛋白質(zhì)層上，使待測(cè)樣品通過與作為靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)的相互作用而被結(jié)合；3)洗去未與蛋白質(zhì)結(jié)合的樣品后，再均勻覆蓋用于與藥物作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的配體物或底物；4)檢測(cè)所述固相載體上是否存在不帶有上述標(biāo)記的暗點(diǎn)或區(qū)域，作為有待進(jìn)一步復(fù)篩的陽性樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中將待測(cè)樣品點(diǎn)陣形式分布于預(yù)先固定有作為藥物靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)的固相載體表面。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中將經(jīng)標(biāo)記的特異性配體均勻覆蓋于吸附有蛋白和樣品的固相載體上。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中經(jīng)標(biāo)記的配體選自蛋白質(zhì)，DNA和酶底物。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的標(biāo)記物選自熒光指示劑、同位素、生物素。
10.一種制備權(quán)利要求1所屬高通量篩選用反向蛋白質(zhì)芯片的制備方法，包括以下步驟1)常規(guī)清潔處理固體載片，然后表面?；幚矶蛊渚哂形降鞍谆钚?；2)將受體蛋白(或酶)均勻固定于活化后的固體載片表面；3)將待測(cè)樣品點(diǎn)陣于固定受體蛋白的載片，置于濕度30％-40％封閉芯片雜交盒，溫度和反應(yīng)時(shí)間由具體蛋白反應(yīng)條件而定，洗去未與受體蛋白結(jié)合的樣品；4)加入熒光標(biāo)記的特異性配體(或DNA，或酶底物)，覆以蓋玻片使之均勻分布于固體載片，置于濕度30％-40％封閉芯片雜交盒，溫度和反應(yīng)時(shí)間由具體受體-配體(或受體-DNA，或酶-底物)反應(yīng)條件而定，洗去未與受體蛋白結(jié)合的熒光標(biāo)記配體(或DNA，或底物)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于高通量藥物篩選的蛋白質(zhì)芯片，及其制備技術(shù)及其檢測(cè)方法。具體的，本發(fā)明的高通量篩選反向蛋白質(zhì)芯片是將藥物作用靶點(diǎn)相關(guān)的蛋白質(zhì)以薄層形式均勻固定于固相載體表面，然后在蛋白層上以點(diǎn)陣形式分布待篩選樣品，將選自熒光、同位素以及其他可檢測(cè)物質(zhì)的標(biāo)記物標(biāo)記的受體蛋白特異性配體與固相載體表面受體蛋白進(jìn)行結(jié)合，檢測(cè)結(jié)果顯示背景為結(jié)合配基均勻信號(hào)，待測(cè)樣品與受體蛋白有特異性結(jié)合后，陽性結(jié)果為反向的暗點(diǎn)。采用本發(fā)明所述反向蛋白質(zhì)芯片技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)一個(gè)藥物作用靶點(diǎn)對(duì)化合物、天然產(chǎn)物、中藥提取物在生物芯片上的大量快速篩選。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1719253SQ20041006355
公開日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月9日
發(fā)明者杜冠華, 張?zhí)焯? 周勇 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所