專(zhuān)利名稱(chēng)：致病性細(xì)菌免疫檢測(cè)芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)糞便、土壤、水、食品、發(fā)酵材料等以及水、環(huán)境中致病性細(xì)菌的致病性細(xì)菌免疫檢測(cè)芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
致病性細(xì)菌盡管種類(lèi)繁多但各種屬間在形態(tài)結(jié)構(gòu)等各有其特點(diǎn)，一般可經(jīng)過(guò)不同染色方法和或通過(guò)顯微鏡可以得到鑒定。目前細(xì)菌檢驗(yàn)有生化培養(yǎng)方法該方法優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)到的細(xì)菌結(jié)果可靠，缺點(diǎn)是檢測(cè)所化時(shí)間很長(zhǎng)，在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)有些菌之間會(huì)會(huì)發(fā)生抑制而影響檢測(cè)結(jié)果可靠性，探針標(biāo)記的免疫方法；檢測(cè)結(jié)果可靠，缺點(diǎn)是探針標(biāo)記較貴而且一種探針只能檢測(cè)一種細(xì)菌，工作量大；pcr基因擴(kuò)增可以對(duì)一些特殊細(xì)菌有針對(duì)性檢測(cè)但需設(shè)計(jì)引物，不但費(fèi)時(shí)而且較貴同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。如腸道致病菌大腸桿菌0157、0139型霍亂、傷寒、痢疾等感染引發(fā)的傳染性疾病。在我國(guó)不僅流行地域廣、群體發(fā)病率高而且亦有較高的死亡率，嚴(yán)重影響人民群眾的身心健康，每年為此類(lèi)疾病的防治國(guó)家要投入大量人力、物力，所以對(duì)此疾病的防治受到社會(huì)各界的重視。目前國(guó)內(nèi)外在分子水平上對(duì)腸道致病菌的檢測(cè)方法是先培養(yǎng)篩選然后用基因擴(kuò)增的方法經(jīng)凝膠電泳分析進(jìn)行快速檢測(cè)?；蛩缴贤ㄟ^(guò)檢測(cè)目的基因如rfbE、flicH7等特異性序列來(lái)檢測(cè)鑒定大腸桿菌0157H7；通過(guò)檢測(cè)目的基因如ctxA、Hly、TcpA毒力基因等來(lái)檢測(cè)0139型霍亂弧菌。其它的檢測(cè)方法也有一些報(bào)道，比如通過(guò)檢測(cè)不同微生物的特異性16S rRNA來(lái)鑒定這些不同的微生物，這些方法存在假陽(yáng)性高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等技術(shù)缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于提出一種快速、準(zhǔn)確的用于對(duì)糞便、土壤、水、植物種子、食品、發(fā)酵材料中的致病性細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)的致病性細(xì)菌免疫檢測(cè)芯片及其制備方法，本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明所述產(chǎn)品是一種致病性細(xì)菌免疫檢測(cè)芯片，包括載體，在載體上通過(guò)設(shè)在其上的含氨基或醛基的化學(xué)基團(tuán)固定互不相同的細(xì)菌抗體，且相同的細(xì)菌抗體按陣列排列在載體上。
本發(fā)明所述方法是一種用于制造致病性細(xì)菌免疫檢測(cè)芯片的制備方法，先取載玻片并將其清洗，再將清洗好的載玻片浸入含有0.1-10.0％氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮/水的溶液3-30分鐘，取出后，載玻片用丙酮洗2-6遍，每次1-5分鐘，再用去離子蒸餾水沖洗1-5遍，每次1-5分鐘，再在60-180℃下烘干，使載玻片表面的硅烷化，然后，在載玻片表面修飾氨基或醛基，最后，將致病性細(xì)菌抗體按陣列設(shè)置在載玻片上，并將其置于0℃-55℃潮濕環(huán)境中存放0.1-72小時(shí)后取出，用pH4.0-10，離子濃度0.00-0.75m/L的緩沖液清洗1-5遍。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用活細(xì)菌表面完整的抗原或受體，可以特異地與修飾在固相載體(使用的載體可以是聚苯乙烯，纖維膜，玻璃，微孔板，PVDF膜中的一種，載體的表面經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，可以用戊二醛修飾法，聚賴(lài)氨酸修飾法，多糖修飾法，BSA-NHS修飾法，水凝膠修飾法其中的一種。)表面的抗體結(jié)合的原理，將對(duì)被檢測(cè)的樣本作出評(píng)價(jià)。對(duì)樣品可直接檢測(cè)，不需要進(jìn)行預(yù)處理、分離、培養(yǎng)。同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣品中各種細(xì)菌，不需分別對(duì)每一種細(xì)菌分離，只需將樣品上清液加到修飾有抗體的載體上，孵育10-50分鐘，即可根據(jù)各點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的抗體上結(jié)合的細(xì)菌而判定細(xì)菌種類(lèi)，對(duì)樣品含細(xì)菌情況作出正確評(píng)價(jià)。本方法結(jié)果不僅可以檢測(cè)樣品中有無(wú)細(xì)菌而且還可以同時(shí)報(bào)告出樣品中含有多少種細(xì)菌，不需要再進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果可靠而且省時(shí)省力。


圖1是本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11..載玻處理1).載玻片清洗取載玻片用水清洗干凈，放入由1/3過(guò)氧化氫和2/3濃硫酸組成的溶液中，浸泡0.5-3.0小時(shí)。然后用去離子水或蒸餾水沖洗2-6遍，再用去離子水或蒸餾水煮沸2-30分鐘；在氮?dú)饬飨赂稍铮诟稍锾幈４鎮(zhèn)溆谩?br> (1).載玻片表面的氨基硅烷化清洗好的載玻片浸入含有0.1-10.0％氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)的95％丙酮/水的溶液3-30分鐘，取出后，玻片用丙酮洗2-6遍，每次1-5分鐘，再用去離子蒸餾水沖洗1-5遍，每次1-5分鐘，最后在60-180℃下烘干，置于干燥處保存。
(2).載玻片表面的醛基修飾將硅烷化后的載玻片放入含1％-10％戊二醛的PB溶液(0.001-0.150MpH4.5-11.0)中，在室溫下浸泡0.1-10小時(shí)，取出后先用PB(0.001-0.150MpH4.5-11.0)洗2-6次，然后用去離子蒸餾水沖洗3遍，用氮?dú)獯蹈?，置?℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)載.玻片表面的氨基修飾(1)取0.5-3.0g的瓊脂糖加至100ml的雙蒸水配成瓊脂糖溶液，完全混合微波爐煮沸2-10分鐘；(2)將1-5ml瓊脂糖溶液覆蓋在60℃左右加在載玻片上；(3)瓊脂糖凝固后，載玻片在10-120℃下過(guò)夜干燥。可室溫干燥條件下保存；(4)在使用之前，將含瓊脂糖膜的載玻片浸入0.1-100mM的NaIO4溶液，室溫下放置0.05-6.00小時(shí)，再用雙蒸水徹底沖洗干凈，并用氮?dú)饬鞲稍铮谑覝鼗虻蜏馗稍锉４妗?br> 在以上修飾有化學(xué)基因的載體上用手工或用點(diǎn)樣儀點(diǎn)上相應(yīng)的抗體(球菌、桿菌等各種致病性細(xì)菌)。置于0℃-55℃潮濕環(huán)境中(將載體放在潮濕盒子內(nèi))內(nèi)存放0.1-72小時(shí)后取出載體，用pH4.0-10，離子濃度0.00-0.75m/L的緩沖液清洗1-5遍。以除去載體上未結(jié)合的抗體。即可用各種致病細(xì)菌檢測(cè)或吹干避光保存?zhèn)溆谩?br> 2、待檢樣品處理取待檢樣品(糞便、土壤、植物種子、食品、發(fā)酵材料)1-5g粉碎加緩沖液1-50ml溶解混勻過(guò)濾或200-800轉(zhuǎn)離心除去大顆粒，溶液備用，水、尿等樣品可直接用于檢測(cè)。
3、取出1置備好的載玻片，加上0.5-5ml樣品液，在2℃-60℃放置潮濕環(huán)境中0.1-72小時(shí)，取出后用緩沖液沖洗，除去未結(jié)合的游離xj。然后在顯微鏡或CCD上觀察或染色觀察各點(diǎn)結(jié)合細(xì)菌情況以確定該樣品中含哪些細(xì)菌。
實(shí)施例2本發(fā)明所述產(chǎn)品是一種致病性細(xì)菌免疫檢測(cè)芯片，包括載體1，在載體上通過(guò)設(shè)在其上的含氨基或醛基的化學(xué)基團(tuán)固定互不相同的細(xì)菌抗體2，且相同的細(xì)菌抗體按陣列排列在載體上。
實(shí)施例3本發(fā)明所述方法是一種用于制造致病性細(xì)菌免疫檢測(cè)芯片的制備方法，先取載玻片并將其清洗，再將清洗好的載玻片浸入含有0.1-10.0％氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮/水的溶液3-30分鐘，取出后，載玻片用丙酮洗2-6遍，每次1-5分鐘，再用去離子蒸餾水沖洗1-5遍，每次1-5分鐘，再在60-180℃下烘干，使載玻片表面的硅烷化，然后，在載玻片表面修飾氨基或醛基，最后，將致病性細(xì)菌抗體按陣列設(shè)置在載玻片上，并將其置于0℃-55℃潮濕環(huán)境中存放0.1-72小時(shí)后取出，用pH4.0-10，離子濃度0.00-0.75m/L的緩沖液清洗1-5遍，上述載玻片的清洗是用水清洗干凈，放入由過(guò)氧化氫和濃硫酸體積比為1∶2組成的混合液中，浸泡0.5-3.0小時(shí)。然后用去離子水或蒸餾水沖洗2-6遍，再用去離子水或蒸餾水煮沸2-30分鐘；在氮(或其它惰性氣體)氣流下吹干；在載玻片上修飾醛基是將硅烷化后的載玻片放入含1％-10％戊二醛的PB溶液(0.001-0.150M pH4.5-11.0)中，在室溫下浸泡0.1-10小時(shí)，取出后先用PB(0.001-0.150MpH4.5-11.0)洗2-6次，然后用去離子蒸餾水沖洗3遍，用氮?dú)獯蹈桑糜?℃保存?zhèn)溆?；在載玻片上修飾氨基采用如下方法(1)配置0.5-3.0g的瓊脂糖加至100ml的雙蒸水配成瓊脂糖溶液，完全混合微波爐煮沸2-10分鐘；(2)將1-5ml瓊脂糖溶液覆蓋在60℃左右預(yù)熱的硅烷化后的載玻片上；(3)瓊脂糖凝固后，載玻片在10-120℃下過(guò)夜干燥?？墒覝馗稍飾l件下保存；(4)在使用之前，將含瓊脂糖膜的載玻片浸入0.1-100mM的NaIO4溶液，室溫下放置0.05-6.00小時(shí)，取出再用雙蒸水徹底沖洗干凈，并用氮?dú)饬鞲稍?，于室溫或低溫干燥保存?br> 權(quán)利要求
1.一種致病性細(xì)菌免疫檢測(cè)芯片，包括載體(1)，其特征在于在載體上通過(guò)設(shè)在其上的含氨基或醛基的化學(xué)基團(tuán)固定互不相同的細(xì)菌抗體(2)，且相同的細(xì)菌抗體按陣列排列在載體上。
2.一種用于制造權(quán)利要求1所述芯片的制備方法，其特征在于先取載玻片并將其清洗，再將清洗好的載玻片浸入含有0.1-10.0％氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮/水的溶液3-30分鐘，取出后，載玻片用丙酮洗2-6遍，每次1-5分鐘，再用去離子蒸餾水沖洗1-5遍，每次1-5分鐘，再在60-180℃下烘干，使載玻片表面的硅烷化，然后，在載玻片表面修飾氨基或醛基，最后，將致病性細(xì)菌抗體按陣列設(shè)置在載玻片上，并將其置于0℃-55℃潮濕環(huán)境中存放0.1-72小時(shí)后取出，用pH4.0-10，離子濃度0.00-0.75m/L的緩沖液清洗1-5遍。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于載玻片的清洗是用水清洗干凈，放入由過(guò)氧化氫和濃硫酸體積比為1∶2組成的混合液中，浸泡0.5-3.0小時(shí)。然后用去離子水或蒸餾水沖洗2-6遍，再用去離子水或蒸餾水煮沸2-30分鐘；在氮(或其它惰性氣體)氣流下吹干。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于在載玻片上修飾醛基是將硅烷化后的載玻片放入含1％-10％戊二醛的PB溶液(0.001-0.150M pH4.5-11.0)中，在室溫下浸泡0.1-10小時(shí)，取出后先用PB(0.001-0.150M pH4.5-11.0)洗2-6次，然后用去離子蒸餾水沖洗3遍，用氮?dú)獯蹈?，置?℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于在載玻片上修飾氨基采用如下方法(1)配置0.5-3.0g的瓊脂糖加至100ml的雙蒸水配成瓊脂糖溶液，完全混合微波爐煮沸2-10分鐘；(2)將1-5ml瓊脂糖溶液覆蓋在60℃左右預(yù)熱的硅烷化后的載玻片上；(3)瓊脂糖凝固后，載玻片在10-120℃下過(guò)夜干燥?？墒覝馗稍飾l件下保存；(4)在使用之前，將含瓊脂糖膜的載玻片浸入0.1-100mM的NaIO4溶液，室溫下放置0.05-6.00小時(shí)，取出再用雙蒸水徹底沖洗干凈，并用氮?dú)饬鞲稍?，于室溫或低溫干燥保存?br> 全文摘要
本發(fā)明所述產(chǎn)品是一種致病性細(xì)菌免疫檢測(cè)芯片，包括載體，在載體上通過(guò)設(shè)在其上的含氨基或醛基的化學(xué)基團(tuán)固定互不相同的細(xì)菌抗體，且相同的細(xì)菌抗體按陣列排列在載體上。上述芯片的制備方法，先取載玻片并將其清洗，再將清洗好的載玻片浸入含有0.1－10.0％氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮/水的溶液3－30分鐘，取出后，載玻片用丙酮洗2－6遍，每次1－5分鐘，再用去離子蒸餾水沖洗1－5遍，每次1－5分鐘，再在60－180℃下烘干，使載玻片表面的硅烷化，然后，在載玻片表面修飾氨基或醛基，最后，將致病性細(xì)菌抗體按陣列設(shè)置在載玻片上，并將其置于0℃－55℃潮濕環(huán)境中存放0.1－72小時(shí)后取出，用pH4.0－10，離子濃度0.00－0.75m/L的緩沖液清洗1－5遍。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1603832SQ20041006517
公開(kāi)日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者唐祖明, 陸祖宏, 郁穎蕾, 史智揚(yáng) 申請(qǐng)人:東南大學(xué)