專利名稱：酶法測定鋅離子含量的方法及鋅離子診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶法測定血清、血漿等樣品中鋅離子含量的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的鋅離子診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鋅元素與生物的生長發(fā)育有關(guān)，具有重要的生理功能、營養(yǎng)作用和臨床診療意義。測定血清中鋅離子含量及Cu2+/Zn2+比值，對評價(jià)機(jī)體鋅元素的營養(yǎng)狀況和診療許多疾病均具有重要的實(shí)用價(jià)值。
現(xiàn)有技術(shù)中鋅離子的測定方法有絡(luò)合滴定法、熒光光度法、比色法、極譜法、原子吸收分光光度法、陽極溶出伏安法和中子活化法等。絡(luò)合滴定法耗時(shí)費(fèi)力，標(biāo)本用量大，特異性低；熒光光度法操作簡單，但需要具備熒光光度計(jì)；極譜法中，單掃描示波極譜儀操作簡便，特異性較好，一些實(shí)驗(yàn)室采用這種小型儀器檢測鋅離子；陽極溶出伏安法是利用沉積在電極上的鋅溶出之后，檢測其陽極電流強(qiáng)度，該電流強(qiáng)度與鋅的濃度成正比；原子吸收分光光度法(AAS法)，具有特異性高(干擾小)、檢出限低(樣品量少)、精密度好(CV≤3.6％)、回收率高(達(dá)到99％)、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠最為準(zhǔn)確地分析樣品中鋅元素的含量，其操作方法也比較簡單，但儀器價(jià)格十分昂貴。
相對而言比色法應(yīng)用較為普遍。該方法檢測鋅離子快速、靈敏度高，能夠得到與AAS法近似的結(jié)果，但操作步驟較為復(fù)雜。比色法一般都要加入鹽酸胍或者三氯醋酸等物質(zhì)，使鋅離子及其它金屬離子從蛋白結(jié)合物中釋放出來；加入氰化物作掩蔽劑，使其絡(luò)合除了鋅離子之外的其它金屬離子；加入水合氯醛作為暴露劑，并避免氰化物與鋅離子絡(luò)合，使鋅離子能夠特異地與吡啶偶氮酚類化合物反應(yīng)顯色。常用的顯色劑及其與鋅離子絡(luò)合后在最大吸收峰的摩爾吸光系數(shù)(單位L·mol-1·cm-1)為1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚，56,000；1-[(5-氯-2-吡啶)偶氮]-2-萘酚，69,000；4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚，84,000；2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙基氨基酚，120,000；2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(N-n丙基-N-3-磺化丙氨基)酚，130,000。
酶法測定鋅離子是近年來發(fā)展起來的新方法。該方法操作最為方便、易于自動(dòng)化，且價(jià)格低廉、特異性高、精密度好，是非常適合國情、應(yīng)用前景十分看好的一種檢測方法。但是，應(yīng)用不同的檢測試劑和測試路線，檢測的靈敏度、檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)有很大差別，直接影響到該方法的使用與推廣，這正是人們在該領(lǐng)域內(nèi)不斷研究、發(fā)展和創(chuàng)新的原因所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酶法測定鋅離子含量的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的鋅離子診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑，能夠利用紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀對血漿、血清等樣品中鋅離子的含量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確測定，以便推廣使用酶法檢測鋅離子的方法以及相應(yīng)的診斷試劑盒，使該領(lǐng)域內(nèi)檢測手段得到進(jìn)一步豐富和發(fā)展。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的之一，一種酶法測定鈉離子含量的方法，采用以下步驟進(jìn)行首先，將需要測定的樣品與含有4-硝基酚磷酸和堿性磷酸酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，
然后，將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長405nm的吸光度的上升速度，進(jìn)而測算出樣品中鋅離子的含量。
測定過程中，被測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500，反應(yīng)溫度控制在20℃～50℃，反應(yīng)時(shí)間控制在2～30分鐘，檢測時(shí)設(shè)定副波長在505nm以上。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明另外一個(gè)目的——鋅離子診斷試劑盒，可以是由以下成分組成的單劑緩沖液 40～200mmol/l，4-硝基酚磷酸 1～50mmol/l，堿性磷酸酶 4000～60000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積 10～80％。
也可以將以上單劑中的成分進(jìn)行組合配制成雙劑，使試劑更為穩(wěn)定，比如 雙劑配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I和試劑II中成分可以互換，從而形成多種配方。
以上配制鋅離子診斷試劑盒時(shí)，選擇緩沖液的基本要求是PH值在6.0～11.0范圍之內(nèi)，可以是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸(Tris-HCl)緩沖液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液”、“咪唑～鹽酸(Imidazole-HCl)緩沖液”、“雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“碳酸鈉～碳酸氫鈉緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂～氫氧化鈉緩沖液”、“磷酸(Phosphate)緩沖液”或者“磷酸鹽(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)緩沖液”中的至少一種，但緩沖液的選擇范圍并不受這些列舉所限制。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑，其用量約占所在試劑總體積的10～80％(或者濃度在10～50mmol/l范圍之內(nèi))。用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種，但選擇范圍同樣不受這些列舉所限制。
研究表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑還是雙劑，如下配方成分關(guān)系的診斷試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液 80～120mmol/l，4-硝基酚磷酸 5～15mmol/l，堿性磷酸酶 14000～30000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積 20～50％。
本發(fā)明應(yīng)用堿性磷酸酶反應(yīng)比色法，在鋅離子的激活下，堿性磷酸酶酶解4-硝基酚磷酸(4-Nitrophenyl Phosphate)成為4-硝基酚和磷酸根。4-硝基酚在405nm有吸收峰，從而使得405nm處的吸光度上升，反應(yīng)所引起的吸光度變化與樣品中鋅離子的含量成正比。這樣，通過在固定時(shí)間間隔內(nèi)測定主波長405nm處吸光度的上升速度，便能定量反映出樣品中鋅離子的含量。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，通過鋅離子激活堿性磷酸酶的特性，定量反映出被測樣品中鋅離子的含量，測試結(jié)果準(zhǔn)確，不受樣品中是否存在其它金屬離子的影響；(2)參與酶反應(yīng)的成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結(jié)果，而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進(jìn)行，不會(huì)污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用；(5)應(yīng)用本發(fā)明提供的測定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑、干試劑等多種形式的試劑，主要用于測定人體和其它動(dòng)物體內(nèi)鋅離子的含量，也可以結(jié)合稀釋、濃縮等輔助手段來測定其它樣品中的鋅離子；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)鋅離子診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，存在于其中的各種成分的三維空間結(jié)構(gòu)保持完整，很好地保證了應(yīng)用測試效果。配成雙劑以后，能夠進(jìn)一步降低各成分之間的交叉影響，檢測結(jié)果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長時(shí)間儲(chǔ)存。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不能理解為對本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。
實(shí)施例一(單劑)按以下成分和用量配制鋅離子診斷試劑盒雙甘氨肽緩沖液 80mmol/l，4-硝基酚磷酸 5mmol/l，堿性磷酸酶 14000U/l，乙二醇 50％(占試劑總體積)。
在全自動(dòng)生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間10分鐘、測試主波長405nm、測試副波長505nm以上，被測鋅離子樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(吸光度上升，下同)。
加入樣品和配成的單劑，兩者在分析儀內(nèi)部自動(dòng)混勻，檢測、記錄405nm吸光度的上升情況。根據(jù)速率法、終點(diǎn)法等方法，對照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測算出樣品中鋅離子的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
實(shí)施例二(雙劑例之一)按以下成分和用量配制鋅離子診斷試劑盒試劑I——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，4-硝基酚磷酸 10mmol/l，甘油 50％(占試劑I總體積)；試劑II——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，堿性磷酸酶 20000U/l，乙二醇 50％(占試劑II總體積)。
在全自動(dòng)生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度30℃、反應(yīng)時(shí)間15分鐘、測試主波長405nm、測試副波長505nm以上，被測鋅離子樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)。
先加入樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內(nèi)部自動(dòng)混勻，檢測、記錄405nm吸光度的上升情況。根據(jù)速率法、終點(diǎn)法等方法，對照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測算出樣品中鋅離子的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
實(shí)施例三(雙劑例之二)按以下成分和用量配制鋅離子診斷試劑盒
試劑I——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，堿性磷酸酶 25000U/l，甘油 50％(占試劑I總體積)；試劑II——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，4-硝基酚磷酸 12mmol/l，丙二醇 20mmol/l。
在全自動(dòng)生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間10分鐘、測試主波長405nm、測試副波長505nm以上，被測鋅離子樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)。
先加入樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內(nèi)部自動(dòng)混勻，發(fā)生以下原理性反應(yīng)
檢測、記錄405nm主波長吸光度的上升情況。根據(jù)速率法、終點(diǎn)法等方法，對照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測算出樣品中鋅離子的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法，完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀器，測定出樣品的中鋅離子的含量，測試靈敏度高、精確度好，不受樣品中是否存在其它金屬離子的影響，也不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。而且，本發(fā)明提供的鋅離子診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，長時(shí)間存放之后仍然能夠準(zhǔn)確檢測各種類型樣品中鋅離子的含量。
權(quán)利要求
1.一種酶法測定鋅離子含量的方法，包括以下步驟①將待測樣品與含有4-硝基酚磷酸和堿性磷酸酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，②將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長405nm的吸光度的上升速度，測算出樣品中鋅離子的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法測定鋅離子含量的方法，其特征在于待測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶法測定鋅離子含量的方法，其特征在于反應(yīng)溫度控制在20℃～50℃，反應(yīng)時(shí)間控制在2～30分鐘，檢測時(shí)設(shè)定副波長在505nm以上。
4.一種鋅離子診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液40～200mmol/l，4-硝基酚磷酸 1～50mmol/l，堿性磷酸酶4000～60000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積 10～80％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鋅離子診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液的PH范圍是6.0～11.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鋅離子診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸緩沖液”、“三乙醇胺緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液”、“咪唑～鹽酸緩沖液”、“雙甘氨肽緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“碳酸鈉～碳酸氫鈉緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂～氫氧化鈉緩沖液”、“磷酸緩沖液”或者“磷酸鹽緩沖液”中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鋅離子診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。
8.權(quán)利要求4～7中任意一種鋅離子診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑或雙劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶法測定鋅離子含量的方法及鋅離子診斷試劑盒。發(fā)明應(yīng)用堿性磷酸酶反應(yīng)比色法，在鋅離子的激活下，堿性磷酸酶酶解4－硝基酚磷酸生成4－硝基酚，通過檢測405nm主波長吸光度的上升速度，定量反映出樣品中鋅離子的含量。該方法特異性高，不受樣品中其它金屬離子的影響，也不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試結(jié)果精確、準(zhǔn)確性好。將診斷試劑盒制成雙劑可減少各成分的交叉影響，保持試劑的穩(wěn)定性，便于長期儲(chǔ)存。該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N21/31GK1786695SQ200410066189
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司