專利名稱：基于原子力顯微鏡觀察的生物樣品包埋塊的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物樣品的制備方法，特別涉及的是一種基于原子力顯微鏡觀察的生物樣品包埋塊的制備方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
20世紀80年代原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)發(fā)明以后，它在生物領域中的應用也越來越多，其中有不少是利用AFM來觀察生物樣品超薄切片的精細結構。較早的文獻見之于“Imaging of the Surface Structures of EponThin Sections Created with a Glass Knife and a Diamond Knife by the Atomic ForceMicroscope”(Amako K，Takade A，Umeda A et al.J Electron Microsc.1993，42(1993)121-123)、“Atomic force microscopy of embedment-free sections of cellsand tissues”(Ushiki T，Shigeno M & Abe K.Arch Histol Cytol.1994，57(1994)427-432)，他們嘗試利用AFM來觀察供透射電鏡用的超薄切片，獲得了一些細胞和組織的初步AFM圖像，如采用金剛石刀和玻璃刀分別對包埋塊進行切片，并比較兩者的差別；采用脫樹脂的辦法試圖暴露超薄切片表面的細胞結構，但他們得到的圖像分辨率都不是很高。近些年來不少研究者在這方面有了改進，獲得了一些細胞內(nèi)的超微結構圖像，如“Atomic force microscopy ofhistological sections using a new electron beam etching method”(Osada T，ArakawaH，Ichikawa M et al.J Microsc.189(1998)43-49)、“Morphological study of thehealthy human culomotor nerve by atomic force microscopy”(Melling M，Karimian-Teherani D，Behnam M et al.NeuroImage 20(2003)795-801)等。但這些文獻中提到的利用AFM觀察生物樣品超薄切片的制樣方法，仍是沿用電鏡超薄切片法，典型的步驟如戊二醛、四氧化鋨雙固定，從低濃度到高濃度的乙醇梯度脫水，漸次提高滲透液比例的逐級滲透等等都是照搬透射電子顯微鏡生物樣品的制備方法。事實上，為了電鏡研究發(fā)展而來的這套方法對于AFM研究生物樣品的精細結構未必是最合適的，其中存在著不少的問題，例如(1)四氧化鋨不能提高AFM圖像的反差，并且昂貴，有一定毒性；(2)四氧化鋨與乙醇、戊二醛能發(fā)生氧化還原反應而產(chǎn)生沉淀，對AFM觀察細胞的超微結構有不利影響；(3)這套方法步驟較為繁瑣，耗時頗長，一般技術人員需要經(jīng)專業(yè)訓練才能掌握，不適宜推廣使用。因此，發(fā)展一種適合于AFM觀察的生物樣品包埋塊的制備方法很有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種基于原子力顯微鏡觀察的生物樣品包埋塊的制備方法，步驟較為簡潔，成本低廉，所得的圖像分辨率不受影響，更適合于AFM使用。
為實現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明利用2％戊二醛固定液對生物樣品進行低溫固定，0.2mol/L磷酸緩沖液沖洗后，按照50％→70％→95％→無水乙醇→絕對乙醇的乙醇梯度進行脫水。環(huán)氧樹脂618滲透并包埋，加熱溫度和時間為35℃12小時→45℃12小時→60℃24小時。從而獲得了適合于AFM觀察的生物樣品包埋塊。
本發(fā)明的方法包括如下步驟1、將生物樣品用冰水預冷卻的質(zhì)量百分比為2％的戊二醛固定液低溫固定1～2小時。固定液配方為0.2mol/L磷酸緩沖液50ml，質(zhì)量百分比為25％的戊二醛水溶液8ml，加超純水至100ml，事先置冰水浴中冷卻備用。
所述生物樣品如果是組織樣品，且取的是腦、脊髓等對缺氧極敏感的組織，可以用血管灌流法，事先用固定液灌流固定，再取出所需組織，放入裝有預冷的固定液的盤內(nèi)，切成小于2mm見方的立方體小塊，然后立即用冰水浴冷卻的質(zhì)量百分比為2％的戊二醛固定液固定1～2小時。一般組織可以在動物處死后立即取材，以保證所取的材料盡量在生活狀態(tài)，整個操作要在半分鐘內(nèi)完成。如果是細胞樣品，先倒去培養(yǎng)液，加入0.2mol/L磷酸緩沖液沖洗幾次，再加入預冷的2％戊二醛固定液，低溫固定1小時，輕輕刮下細胞，離心收集到成團的細胞團塊即可進行后續(xù)的操作。
2、將樣品用冰水預冷的0.2mol/L磷酸緩沖液沖洗兩次后，將樣品依次轉(zhuǎn)入質(zhì)量百分比為50％的乙醇→70％乙醇→95％乙醇→無水乙醇→絕對乙醇，進行乙醇梯度脫水，每次10～15分鐘。其中，無水乙醇和絕對乙醇要分別各換一次，50％和70％乙醇水溶液需要事先用冰水預冷，其它濃度的脫水可在室溫下進行。
通常市售的無水乙醇含有微量水分，為此在無水乙醇中加入烤干的無水硫酸銅或無水硫酸鈉，吸去水分，或必要時將無水乙醇重新蒸餾除去水分，以制得所謂的“絕對”乙醇。
3、樣品脫水完后，直接轉(zhuǎn)入環(huán)氧樹脂618混合液∶絕對乙醇＝1∶1的體積比的液體中并置搖床上滲透1～2小時，然后將此液倒去，用濾紙吸去殘余，隨后加入環(huán)氧樹脂618混合液，置35℃的溫箱中滲透3～5小時。中間晃動幾次，以利于滲透完全。環(huán)氧樹脂618混合液配方為環(huán)氧樹脂618∶十二烷基琥珀酸酐(DDSA)∶甲基內(nèi)次甲基四氫鄰苯二甲酸酐(MNA)∶2，4，6-二甲氨基甲基苯酚(DMP-30)＝4∶1∶3∶0.2，該比例為體積比。
4、將樣品挑出，濾紙吸去殘余，用環(huán)氧樹脂618混合液把組織塊包埋在預先干燥過的膠囊或包埋板中，然后置烘箱中加熱聚合，聚合溫度和時間為35℃12小時，45℃12小時，60℃24小時，得到所需的生物樣品包埋塊。
本發(fā)明方法中，樣品經(jīng)冰水浴冷卻的戊二醛固定液固定之后，無需進行四氧化鋨(OsO4)的后固定，采用乙醇進行梯度脫水，無需塊染，并且無需使用環(huán)氧丙烷過渡，方法步驟較為簡單，使用的試劑常見、價格便宜且無毒，與一般供電鏡觀察的包埋塊制備步驟相比，無需昂貴的鋨酸固定，省去了一些對保存精細結構和提高分辨率無關的步驟，使得整體的制樣時間大為縮短，成本低廉，適合各種動物組織和細胞樣品。


圖1為本發(fā)明實施例1中制備的樣品在原子力顯微鏡空氣中觀察的圖像。
圖2為本發(fā)明實施例2中制備的樣品在原子力顯微鏡空氣中觀察的圖像。
圖3為本發(fā)明實施例3中制備的樣品在原子力顯微鏡空氣中觀察的圖像。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步描述。
實施例1人舌鱗狀細胞癌組織樣品取自某醫(yī)院口腔頜面外科臨床手術，切成小于2mm見方的小塊后，以冰水預冷的2％戊二醛固定液固定2小時。固定液配方為0.2mol/L磷酸緩沖液50ml，25％戊二醛水溶液8ml，加超純水至100ml，事先置冰水浴中冷卻備用。然后用0.2mol/L磷酸緩沖液沖洗兩次，再進行乙醇梯度脫水，脫水過程如下在冷凍條件下(0℃～4℃)，50％乙醇水溶液、15分鐘，70％乙醇水溶液、15分鐘，在室溫條件下，95％乙醇水溶液、15分鐘，無水乙醇更換一次、每次10分鐘，絕對乙醇更換一次、每次10分鐘。
樣品脫水完后，直接轉(zhuǎn)入環(huán)氧樹脂618混合液∶絕對乙醇＝1∶1的體積比的滲透液中并置搖床上滲透2小時，然后將此液倒去，用濾紙吸去殘余，隨后加入環(huán)氧樹脂618混合液，置35℃的溫箱中滲透5小時。中間晃動幾次，以利于滲透完全。其中環(huán)氧樹脂618混合液配方為環(huán)氧樹脂618∶十二烷基琥珀酸酐∶甲基內(nèi)次甲基四氫鄰苯二甲酸酐∶2，4，6-二甲氨基甲基苯酚＝4∶1∶3∶0.2，該比例為體積比。將樣品挑出后，用濾紙小心吸去殘余液體，再用環(huán)氧樹脂618混合液進行包埋。放入烘箱中加熱聚合，在35℃溫度下加熱12小時，在45℃溫度下加熱12小時，在60℃溫度下加熱24小時，得到所需的生物樣品包埋塊。
將所得的包埋塊切片后轉(zhuǎn)移到云母片上置AFM輕敲模式下觀察。所得圖像見圖1視野中可見呈分裂相的細胞核，核內(nèi)染色質(zhì)活躍，相對細胞質(zhì)較少，核質(zhì)比大，細胞形態(tài)異常，這些都是腫瘤細胞的典型特征。掃描范圍30μm×30μm。
實施例2將C6細胞培養(yǎng)后倒去培養(yǎng)液，先用0.2mol/L磷酸緩沖液沖洗兩次，再加入冰水預冷的2％戊二醛固定液低溫固定1小時，離心后得到的細胞團用乙醇溶液進行梯度脫水，依次為50％→70％→95％→無水乙醇→絕對乙醇，每次10分鐘，其中無水乙醇和絕對乙醇分別要更換一次，50％和70％的乙醇需要冰水預冷并在低溫下進行脫水。樣品脫水完后，直接轉(zhuǎn)入環(huán)氧樹脂618混合液∶絕對乙醇＝1∶1的體積比的液體中并置搖床上滲透1小時，然后倒去該液體，用濾紙吸干殘余，隨后加入環(huán)氧樹脂618混合液，置35℃的溫箱中滲透3小時。中間晃動幾次，以利于滲透完全。將樣品挑出，用濾紙小心吸去殘余混合液，用環(huán)氧樹脂618混合液包埋于塑料包埋板中。然后加熱聚合，加熱溫度和時間為35℃12小時，45℃12小時，60℃24小時。得到的樣品包埋塊切片后貼附在云母表面。AFM接觸模式下成像。所得圖像見圖2。
圖2所顯示的是若干腫瘤細胞，示細胞內(nèi)巨大的核，膜結構清晰，可見核仁，近核區(qū)域細胞器豐富，細胞外的平整區(qū)域為環(huán)氧樹脂。掃描范圍30μm×30μm。
實施例3Tca8113細胞培養(yǎng)后，棄培養(yǎng)液，用0.2mol/L磷酸緩沖液沖洗后，加入冰水預冷的2％戊二醛固定液低溫固定1.5小時，離心后得到的細胞團用乙醇溶液進行梯度脫水，依次為50％→70％→95％→無水乙醇→絕對乙醇，每次12分鐘，無水和絕對乙醇分別更換一次，50％和70％的乙醇需要冰水預冷并在低溫下進行脫水。樣品脫水完后，直接使用環(huán)氧樹脂618混合液∶絕對乙醇＝1∶1的體積比的液體中置搖床上滲透1.5小時，然后將該液倒去，用濾紙吸去殘余，隨后加入環(huán)氧樹脂618混合液，置35℃的溫箱中滲透3.5小時。將樣品從中挑出，用濾紙小心吸去殘余，用環(huán)氧樹脂618混合液進行包埋。然后進行加熱聚合，加熱溫度和時間為35℃12小時，45℃12小時，60℃24小時。得到的樣品包埋塊切片后貼附在云母表面。AFM接觸模式下成像。所得圖像見圖3膜結構清晰，核仁完整，與Osada、Melling等使用的制樣方法相比，分辨水平相似，局部胞內(nèi)的超微結構甚至更為清晰。掃描范圍30μm×30μm。
權利要求
1.一種基于原子力顯微鏡觀察的生物樣品包埋塊的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)將生物樣品用冰水預冷卻的質(zhì)量百分比為2％的戊二醛固定液低溫固定1～2小時；2)將樣品用冰水預冷的0.2mol/L磷酸緩沖液沖洗兩次后，依次轉(zhuǎn)入質(zhì)量百分比為50％的乙醇、70％乙醇、95％乙醇、無水乙醇及絕對乙醇，進行乙醇梯度脫水，每次10～15分鐘，其中，無水乙醇和絕對乙醇分別各換一次，50％和70％乙醇水溶液需要事先用冰水預冷；3)樣品脫水后直接轉(zhuǎn)入環(huán)氧樹脂618混合液∶絕對乙醇＝1∶1的體積比的液體中并置搖床上滲透1～2小時，然后將此液倒去，加入環(huán)氧樹脂618混合液，置35℃的溫箱中滲透3～5小時；其中環(huán)氧樹脂618混合液配方為環(huán)氧樹脂618∶十二烷基琥珀酸酐∶甲基內(nèi)次甲基四氫鄰苯二甲酸酐∶2，4，6-二甲氨基甲基苯酚＝4∶1∶3∶0.2，該比例為體積比；4)將樣品挑出，用環(huán)氧樹脂618混合液進行包埋，然后加熱聚合，聚合溫度和時間為35℃12小時，45℃12小時，60℃24小時，得到所需的生物樣品包埋塊。
2.權利要求1的基于原子力顯微鏡觀察的生物樣品包埋塊的制備方法，其特征在于所述固定液采用0.2mol/L磷酸緩沖液50ml，質(zhì)量百分比為25％的戊二醛水溶液8ml，加超純水至100ml配制而成。
3.權利要求1的基于原子力顯微鏡觀察的生物樣品包埋塊的制備方法，其特征在于所述生物樣品為切成小于2mm見方小塊的組織樣品。
4.權利要求1的基于原子力顯微鏡觀察的生物樣品包埋塊的制備方法，其特征在于所述生物樣品為經(jīng)0.2mol/L磷酸緩沖液沖洗后的細胞樣品。
全文摘要
一種基于原子力顯微鏡觀察的生物樣品包埋塊的制備方法，屬于生物工程技術領域。利用2％戊二醛固定液對生物組織樣品或細胞樣品等進行低溫固定，經(jīng)0.2mol/L磷酸緩沖液沖洗后，按照50％→70％→95％→無水乙醇→絕對乙醇的乙醇梯度進行脫水，經(jīng)環(huán)氧樹脂618滲透后進行包埋，然后加熱聚合，加熱溫度和時間為35℃12小時→45℃12小時→60℃24小時。從而獲得了適合于原子力顯微鏡觀察的生物樣品包埋塊。本發(fā)明方法步驟較為簡單，所用試劑多為國產(chǎn)，易得且價格低廉，適合各種動物組織和細胞樣品的包埋塊制作。
文檔編號G01N1/44GK1587959SQ20041006658
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月23日 優(yōu)先權日2004年9月23日
發(fā)明者李鑫輝, 季彤, 胡曉芳, 劉蘋, 張曉東, 胡鈞 申請人:上海交通大學