專利名稱：一種定量檢測塔瑪亞力山大藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用免疫學(xué)方法檢測海洋環(huán)境中微型生物的技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及通過競爭性抗原抗體結(jié)合抑制檢測塔瑪亞力山大藻的方法和試劑盒，及其用于檢測塔瑪亞力山大藻的用途。
背景技術(shù)：
塔瑪亞力山大藻(Alexandrium tamarense)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛存在的浮游植物，也是我國近海常見的甲藻優(yōu)勢種之一。本種是我國近海常見的赤潮生物，曾經(jīng)有多次引發(fā)赤潮的報(bào)道，會(huì)引起大量魚類死亡、貝類和人中毒事件，給海洋漁業(yè)和人類健康帶來巨大威脅。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確、快速地檢測塔瑪亞力山大藻，隨時(shí)了解其在海洋中的動(dòng)態(tài)變化具有重要意義。
在分類學(xué)上，塔瑪亞力山大藻屬于甲藻門亞力山大藻屬。傳統(tǒng)的鑒別方法，即從形態(tài)學(xué)上區(qū)分塔瑪亞力山大藻，主要是利用光學(xué)顯微鏡直接觀察和計(jì)數(shù)，操作時(shí)存在一定困難，且過程煩瑣，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，當(dāng)樣品量多時(shí)工作量極大，主要用于藻的定性和分離，而不適用于藻的定量研究。因此，發(fā)展用于快速檢測塔瑪亞力山大藻的新方法和新技術(shù)極具現(xiàn)實(shí)意義。但是，目前國內(nèi)國際關(guān)于這方面的研究進(jìn)展不大，尚未形成非常有效的對(duì)藻類進(jìn)行定性和定量測定的成熟技術(shù)。
基于抗體技術(shù)的競爭性ELISA方法具有特異、靈敏、高效、易操作、造價(jià)低廉等優(yōu)點(diǎn)，且能同時(shí)分析大量的樣本，是一種對(duì)目標(biāo)抗原進(jìn)行定性定量分析的有效手段。目前，競爭性ELISA方法主要在醫(yī)學(xué)檢測和微生物學(xué)檢測研究中應(yīng)用，尚未用于對(duì)整個(gè)藻細(xì)胞進(jìn)行檢測的報(bào)道。另外，雖然藻細(xì)胞抗體的制備過程簡單，但不易獲得高特異性的抗體。
因此，本領(lǐng)域迫切的需要一種快速檢測塔瑪亞力山大藻的方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，在本發(fā)明的第一個(gè)方面，公開了一種檢測待測樣品中塔瑪亞力山大藻數(shù)量的免疫學(xué)方法，包括步驟
(a)使固定有塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片的固相載體同時(shí)與待測樣品以及抗塔瑪亞力山大藻抗體接觸；(b)將固相載體與待測樣品和抗塔瑪亞力山大藻抗體分開；(c)檢測與固相載體結(jié)合的抗塔瑪亞力山大藻抗體的量，所述固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片與待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞競爭結(jié)合抗塔瑪亞力山大藻抗體，而且存在于所述待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞數(shù)目是根據(jù)抗塔瑪亞力山大藻抗體與固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片結(jié)合或不結(jié)合的相對(duì)程度測定的。
在該方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，抗塔瑪亞力山大藻抗體是多克隆或單克隆是抗體。更優(yōu)選的，多克隆抗體是通過用塔瑪亞力山大藻細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或細(xì)胞分離組分免疫動(dòng)物制備的，優(yōu)選動(dòng)物選自兔、鼠、豚鼠、雞、羊、牛、馬、狗、豬。
在該方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片以106-107細(xì)胞/毫升的濃度固定在固相載體上。
在該方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(c)的檢測是通過抗塔瑪亞力山大藻多克隆抗體的二抗，其中二抗與標(biāo)記物偶聯(lián)。優(yōu)選標(biāo)記物選自放射性同位素、生物素、酶、熒光素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。更優(yōu)選的酶是辣根過氧化物酶。
在該方面的還有一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，固相載體是酶標(biāo)板。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，公開了一種試劑盒，含有(a)固定有塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片的固相載體；(b)抗塔瑪亞力山大藻細(xì)胞的抗體；和(c)偶聯(lián)有標(biāo)記物的二抗，針對(duì)抗塔瑪亞力山大藻細(xì)胞抗體。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面，公開了上述試劑盒的用途，用于檢測塔瑪亞力山大藻細(xì)胞。


圖1顯示了抗塔瑪亞力山大藻抗血清效價(jià)測定曲線，分別用不同稀釋比例稀釋的包被物包被酶標(biāo)板，經(jīng)過常規(guī)ELISA步驟后分別獲得的結(jié)果。
圖2顯示了實(shí)施例3中用已知濃度的系列稀釋的塔瑪亞力山大藻定標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3顯示了實(shí)施例3中根據(jù)圖2的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的直線方程。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的目的是提供塔瑪亞力山大藻免疫學(xué)檢測的方法，它可以客觀、準(zhǔn)確地對(duì)該藻進(jìn)行檢測。具體包括本發(fā)明提供的檢測方法，即競爭性間接ELISA法，以專一性地識(shí)別塔瑪亞力山大藻的抗體作為基礎(chǔ)。
抗體的產(chǎn)生本發(fā)明所述的抗體可以經(jīng)由塔瑪亞力山大藻免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而獲得，這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常包括(但不局限于)兔、鼠、豬、狗、牛、羊、馬等。特異性的抗體可以直接使用，另一方面抗體的特異性可以經(jīng)由一些常規(guī)的手段，如抗體封閉技術(shù)等，得到提高，這也是為本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的，另外，抗體本身也可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記而進(jìn)行使用。
本發(fā)明所述的抗塔瑪亞力山大藻抗體具有較好的種特異性。利用競爭ELISA測定所述的抗體與其它藻之間的交叉反應(yīng)率，結(jié)果表明它只能識(shí)別塔瑪亞力山大藻而不識(shí)別其它藻，故可用于塔瑪亞力山大藻的定性鑒別。
本發(fā)明所述的二抗可以經(jīng)由直接購買通用的二抗或由一種動(dòng)物的IgG免疫另一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而獲得，這一技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
與二抗偶聯(lián)的標(biāo)記物可以是一直接可檢測基團(tuán)，如金屬溶膠(如金溶膠)、發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)(如花青、酞菁、部花青、三苯基甲基、馬菁)等的結(jié)合位點(diǎn)，見應(yīng)用化學(xué)論題，紅外吸收發(fā)色團(tuán)、M.Matsuoka編，Plenum Press，New York，NY，1990，應(yīng)用化學(xué)論題，染料的化學(xué)和應(yīng)用，Waring等，Plenum Press，New York，NY，1990，和熒光探針和研究化學(xué)手冊，Haugland，Molecular Probes，Inc.1996，和放射性標(biāo)記、酶、磁性顆粒，濁度誘導(dǎo)劑等的結(jié)合位點(diǎn)，或它可已攜帶這樣的可直接檢測的基團(tuán)。
酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)具有靈敏度高(可百倍于常規(guī)檢測技術(shù))、操作簡便、步驟可控、高效快速等優(yōu)點(diǎn)，且能同時(shí)分析大量的樣本，是一種對(duì)目標(biāo)抗原進(jìn)行定量分析的有效手段。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定(1)以塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解液包被酶標(biāo)板，過夜后用BSA溶液封閉，孵育后洗板，加入已知數(shù)量的塔瑪亞力山大藻懸浮液，加入塔瑪亞力山大藻的抗體稀釋液，孵育后洗板，加入酶標(biāo)二抗溶液，孵育，洗板后加入酶反應(yīng)底物，孵育后加入終止液終止反應(yīng)；(2)用酶標(biāo)儀測定板上各孔的吸光值，經(jīng)過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，得出塔瑪亞力山大藻定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線形范圍經(jīng)過計(jì)算得出直線方程，根據(jù)得到的方程對(duì)待測樣品中的塔瑪亞力山大藻進(jìn)行定量。
用酶標(biāo)儀測定板上各孔的吸光值，然后計(jì)算出相應(yīng)的抑制率％，計(jì)算公式為A/A0×100％，其中A0為最大值，即加入的已知濃度的藻細(xì)胞系列梯度稀釋液中，藻細(xì)胞數(shù)為0時(shí)的吸光值；A為其它各孔的吸光值，接著計(jì)算出各孔抑制率的自然對(duì)數(shù)值，以之為縱坐標(biāo)，以藻細(xì)胞系列梯度稀釋液中藻細(xì)胞數(shù)目的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制出塔瑪亞力山大藻定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，找出其線性范圍并計(jì)算出抑制率的自然對(duì)數(shù)值和對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞數(shù)目常用對(duì)數(shù)值的直線相關(guān)方程，線性相關(guān)系數(shù)必須在0.99以上。
本發(fā)明的最主要理論基礎(chǔ)是特異性的抗體可以專一地識(shí)別特定的抗原決定簇，因而可對(duì)抗原進(jìn)行定性和定量檢測。該方法的基本原理如下一定量的藻細(xì)胞經(jīng)破碎后，裂解物包被于固相載體上(如酶標(biāo)板等)，經(jīng)封閉后，同時(shí)加入抗體和競爭抗原(即含有目標(biāo)藻的標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測樣品)，這樣，固相上的藻細(xì)胞和液相中的藻細(xì)胞就會(huì)競爭結(jié)合抗體，通過檢測固相上競爭到的抗體量即可算出相應(yīng)的競爭樣本中的藻細(xì)胞含量，因此可準(zhǔn)確地對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測定。
這種分析方法不僅克服了塔瑪亞力山大藻常規(guī)檢測中的缺點(diǎn)，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。
本發(fā)明首次提供了快速、簡便、大批量定量檢測該藻的方法，使監(jiān)測某海區(qū)或養(yǎng)殖場內(nèi)海水中塔瑪亞力山大藻的動(dòng)態(tài)變化成為可能。通過監(jiān)測到的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，可以掌握海水污染狀況，并即時(shí)做出調(diào)整以減少經(jīng)濟(jì)損失；同時(shí)，將這些動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)(諸如營養(yǎng)鹽、其他物種的數(shù)量、氣象資料等)結(jié)合，可為科學(xué)研究海洋生態(tài)中各因素之間的相互影響關(guān)系提供一些有益幫助。
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明實(shí)施例1本發(fā)明所用的塔瑪亞力山大藻藻種由中國海洋大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)部提供。通過反復(fù)在顯微鏡下挑取單個(gè)藻細(xì)胞獲得純培養(yǎng)物。所用的培養(yǎng)基是常規(guī)的f/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光照/黑暗周期為12h/12h，光照強(qiáng)度為4000Lx，培養(yǎng)溫度為22℃～25℃。
處于對(duì)數(shù)生長期的塔瑪亞力山大藻培養(yǎng)液，用甲醛固定(終濃度1.5～2％)后，10000r/min離心10min收集藻細(xì)胞，再用蒸餾水清洗一遍，PBS清洗兩遍，每步均通過離心收集藻細(xì)胞，離心條件均為10000r/min，10min。將藻細(xì)胞轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendorf管，甩去殘余水分，-20℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前取出，每管用0.6ml滅菌的PBS重懸浮，混勻，與等體積的福氏完全佐劑(SIGMA公司)混合乳化，乳化程度盡量完全，乳化物用于免疫新西蘭大白兔(購自中科院上海生物工程研究中心動(dòng)物房)，選擇皮下注射和肌肉注射方式，劑量為107個(gè)細(xì)胞/兔。間隔兩周后加強(qiáng)免疫，除佐劑換為福氏不完全佐劑(購自SIGMA公司)外，其它步驟不變，之后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次。從第3次加強(qiáng)免疫后一周，兔耳靜脈取血，分離血清，用常規(guī)ELISA檢測血清效價(jià)，當(dāng)血清效價(jià)到達(dá)較高水平時(shí)，不再免疫，采集家兔全血清，檢驗(yàn)后分裝保存于-20℃。如圖1所示，最后獲得的抗塔瑪亞力山大藻抗血清效價(jià)為1∶64000。
實(shí)施例2本實(shí)施例選用了膠州灣常見的幾株優(yōu)勢浮游植物作為參照藻，它們是旋鏈角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、纖細(xì)角毛藻(Chaetoceros gracilis)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、米氏裸甲藻(Gymnodinium mikimotoi)、裸甲藻(Gymnodinium sp)、諾氏海鏈藻(Thalassiosiranordenskioeldii)、尖刺偽菱形藻(Pseudonitzschia pungens)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、膜質(zhì)舟形藻(Navicula membranacea)，它們均分離自膠州灣天然海水，通過反復(fù)在顯微鏡下挑取單個(gè)藻細(xì)胞獲得純培養(yǎng)物。按實(shí)施例1所述的方法培養(yǎng)和收集這些藻。
用競爭ELISA步驟進(jìn)行抗塔瑪亞力山大藻抗血清的特異性鑒定。所有藻用1ml PBS重懸浮，顯微鏡計(jì)數(shù)后，取相同細(xì)胞量(3.2×106)懸浮于PBS(終體積1ml)。各個(gè)海藻分別用PBS稀釋成濃度梯度。
以塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解液包被酶標(biāo)板，每孔50-100微升，4℃過夜或37℃，3-5小時(shí)后用1-3％BSA溶液封閉，孵育1-2小時(shí)后洗板，加入各海藻稀釋液，加入塔瑪亞力山大藻的抗體稀釋液，37℃或室溫孵育30-60分鐘后洗板，加入酶標(biāo)二抗溶液，37℃或室溫孵育30-60分鐘，洗板后加入酶反應(yīng)底物，孵育10分鐘后加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng)。分別作競爭抑制曲線，根據(jù)結(jié)果算出各個(gè)海藻與抗塔瑪亞力山大藻抗血清之間的交叉反應(yīng)率，結(jié)果列于表1。
表1 各海藻與抗塔瑪亞力山大藻抗血清的交叉反應(yīng)率(％)

從表中可以看出，以塔瑪亞力山大藻的交叉反應(yīng)率為標(biāo)準(zhǔn)(100％)，其他海藻的交叉率都在3％以下，這樣的反應(yīng)率是非常低的，說明抗塔瑪亞力山大藻抗血清有很高的特異性，可以專一地識(shí)別塔瑪亞力山大藻，因此可用于塔瑪亞力山大藻的定性檢測。
因此，對(duì)于某待檢樣品，以本實(shí)施例所述的步驟進(jìn)行競爭ELISA反應(yīng)，如果有明顯較高的交叉反應(yīng)率，即可判定該樣品中有塔瑪亞力山大藻的存在；如果該樣品為純培養(yǎng)物，則可判定該純培養(yǎng)物為塔瑪亞力山大藻。這種定性測定方法的優(yōu)點(diǎn)是，由于使用的是塔瑪亞力山大藻的專一性抗血清，因此能非常準(zhǔn)確地檢測樣品中是否存在塔瑪亞力山大藻。
實(shí)施例31.按實(shí)施例1所述的方法培養(yǎng)和收集塔瑪亞力山大藻。
2.以106～107個(gè)細(xì)胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解液包被酶標(biāo)板(每孔100微升)，4℃過夜后用2％BSA溶液封閉，37℃孵育2小時(shí)后洗板，加入分別含有40～6.25×106個(gè)細(xì)胞的塔瑪亞力山大藻梯度稀釋液，加入抗體稀釋液(1∶10000)，37℃孵育45分鐘后洗板，加入酶標(biāo)二抗溶液(羊抗兔IgG-HRP，稀釋10000倍)，37℃孵育45分鐘，洗板后加入酶反應(yīng)底物TMB基質(zhì)液，孵育10分鐘后加入2mol/L硫酸終止反應(yīng)，讀取板上各孔450nm處的吸光值。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線以塔瑪亞力山大藻標(biāo)準(zhǔn)梯度稀釋液中藻細(xì)胞數(shù)目的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的抑制率(％)，即標(biāo)準(zhǔn)樣品孔吸光值(A)/最大吸光值(A0)×100，為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)。以塔瑪亞力山大藻標(biāo)準(zhǔn)梯度稀釋液中藻細(xì)胞數(shù)目的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率的自然對(duì)數(shù)值，即1n(A/(A0-A)，為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的直線方程(見圖3)。
4.定量計(jì)算和分析如步驟2所述，加入待測樣品。根據(jù)待測樣品的吸光值，首先計(jì)算出各自的抑制率，接著計(jì)算出抑制率的自然對(duì)數(shù)值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程，求出相應(yīng)的1g[藻細(xì)胞數(shù)]值，即可方便地計(jì)算出待測樣品中塔瑪亞力山大藻細(xì)胞的數(shù)目，對(duì)應(yīng)的原始水樣中塔瑪亞力山大藻的濃度也可經(jīng)過簡單計(jì)算得出結(jié)果。
實(shí)施例4.
以103～104個(gè)細(xì)胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解液包被酶標(biāo)板(每孔100微升)，按實(shí)施例3所述的競爭ELISA步驟操作，最后獲得的競爭抑制曲線相關(guān)方程為1n(A/(A0-A)＝-1.5534×1g(藻細(xì)胞數(shù))+6.2990，線性相關(guān)系數(shù)為R2＝0.9731，競爭抑制的線性范圍在125000～5000000個(gè)細(xì)胞之間。
實(shí)施例5.
以106～107個(gè)細(xì)胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解液包被酶標(biāo)板(每孔100微升)，按實(shí)施例3所述的競爭ELISA步驟操作，最后獲得的競爭抑制曲線相關(guān)方程為1n(A/(A0-A)＝-1.2941×1g(藻細(xì)胞數(shù))+5.6354，線性相關(guān)系數(shù)為R2＝0.993，競爭抑制的線性范圍在24～6250000個(gè)細(xì)胞之間。
實(shí)施例6.
以109～1010個(gè)細(xì)胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解液包被酶標(biāo)板(每孔100微升)，按實(shí)施例3所述的競爭ELISA步驟操作，最后獲得的競爭抑制曲線相關(guān)方程為1n(A/(A0-A)＝-1.0784×1g(藻細(xì)胞數(shù))+4.0026，線性相關(guān)系數(shù)為R2＝0.9888，競爭抑制的線性范圍在10000～6250000個(gè)細(xì)胞之間。
實(shí)施例7以106～107個(gè)細(xì)胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解液包被酶標(biāo)板(每孔100微升)，按實(shí)施例3所述的競爭ELISA步驟操作，加入分別含有0～108個(gè)細(xì)胞的塔瑪亞力山大藻梯度稀釋液時(shí)，最后獲得的競爭抑制曲線相關(guān)方程ln(A/(A0-A)＝-1.8432×lg(藻細(xì)胞數(shù))+6.0041，線性相關(guān)系數(shù)為R2＝0.9565。
實(shí)施例8.
以106～107個(gè)細(xì)胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解液包被酶標(biāo)板(每孔100微升)，按實(shí)施例3所述的競爭ELISA步驟操作，加入分別含有50～7×106個(gè)細(xì)胞的塔瑪亞力山大藻梯度稀釋液時(shí)，最后獲得的競爭抑制曲線相關(guān)方程為ln(A/(A0-A)＝-1.2941×lg(藻細(xì)胞數(shù))+5.6354，線性相關(guān)系數(shù)為R2＝0.993。
實(shí)施例9.
以106～107個(gè)細(xì)胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解液包被酶標(biāo)板(每孔100微升)，按實(shí)施例3所述的競爭ELISA步驟操作，加入分別含有0～104個(gè)細(xì)胞的塔瑪亞力山大藻梯度稀釋液時(shí)，最后獲得的競爭抑制曲線相關(guān)方程ln(A/(A0-A)＝-1.7796×lg(藻細(xì)胞數(shù))+6.1167，線性相關(guān)系數(shù)為R2＝0.9632。
根據(jù)實(shí)施例4-9的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選用106-107個(gè)細(xì)胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解液包被酶標(biāo)板；用分別含有50～7×106個(gè)細(xì)胞的塔瑪亞力山大藻梯度稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)競爭抗原。
實(shí)施例10根據(jù)實(shí)施例3所述的方法，對(duì)采自青島膠州灣水域的6份海水樣品進(jìn)行了塔瑪亞力山大藻的競爭ELISA定量檢測。對(duì)這6份海水樣品，分別用競爭ELISA法和顯微計(jì)數(shù)法檢測后，結(jié)果列于表2。
表2 海水樣品中塔瑪亞力山大藻數(shù)目的定量結(jié)果


表2中數(shù)據(jù)為50微升加樣液(相當(dāng)于250毫升原始海水樣品)中塔瑪亞力山大藻的細(xì)胞數(shù)目(個(gè))，均為5次測定結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。經(jīng)比較分析表2中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這兩種方法所獲的定量結(jié)果基本相同。說明用競爭ELISA檢測塔瑪亞力山大藻，可獲得與常規(guī)定量方法一樣準(zhǔn)確的效果。
本發(fā)明中，發(fā)明人成功地制備了高特異性的抗塔瑪亞力山大藻多克隆抗體，并建立了競爭ELISA方法，應(yīng)用該方法可定性定量地檢測塔瑪亞力山大藻。發(fā)明人在世界上首次將競爭ELISA方法用于藻細(xì)胞的定性定量檢測，并取得了好的結(jié)果。
本方法的優(yōu)點(diǎn)本方法最大的優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)進(jìn)行定量和定性檢測，通過該方法既可知道待檢樣品中是否有塔瑪亞力山大藻存在，還可同時(shí)知道該藻的數(shù)目有多少。本方法的另一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是定量結(jié)果準(zhǔn)確。
另外本方法操作過程簡單、省時(shí)，整個(gè)過程數(shù)小時(shí)內(nèi)即可全部完成，可以實(shí)現(xiàn)海區(qū)中塔瑪亞力山大藻的動(dòng)態(tài)跟蹤監(jiān)測。
權(quán)利要求
1.一種檢測待測樣品中塔瑪亞力山大藻數(shù)量的免疫學(xué)方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)使固定有塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片的固相載體同時(shí)與待測樣品以及抗塔瑪亞力山大藻抗體接觸；(b)將固相載體與待測樣品和抗塔瑪亞力山大藻抗體分開；(c)檢測與固相載體結(jié)合的抗塔瑪亞力山大藻抗體的量，所述固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片與待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞競爭結(jié)合抗塔瑪亞力山大藻抗體，而且存在于所述待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞數(shù)目是根據(jù)抗塔瑪亞力山大藻抗體與固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片結(jié)合或不結(jié)合的相對(duì)程度測定的。我廠
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗塔瑪亞力山大藻抗體是多克隆或單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述多克隆抗體是通過用塔瑪亞力山大藻細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或細(xì)胞分離組分免疫動(dòng)物制備的，所述動(dòng)物選自兔、鼠、豚鼠、雞、羊、牛、馬、狗、豬。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片以106-107細(xì)胞/毫升的濃度固定在固相載體上。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)的檢測是通過抗塔瑪亞力山大藻多克隆抗體的二抗，其中所述二抗與標(biāo)記物偶聯(lián)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記物選自放射性同位素、生物素、酶、熒光素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶是辣根過氧化物酶。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相載體是酶標(biāo)板。
9.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有(a)固定有塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片的固相載體；(b)抗塔瑪亞力山大藻細(xì)胞的抗體；和(c)偶聯(lián)有標(biāo)記物的二抗，針對(duì)抗塔瑪亞力山大藻細(xì)胞抗體。
10.權(quán)利要求9所述的試劑盒的用途，其特征在于，該試劑盒用于檢測塔瑪亞力山大藻細(xì)胞。
全文摘要
公開了一種檢測待測樣品中塔瑪亞力山大藻數(shù)量的免疫學(xué)方法，包括步驟(a)使固定有塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片的固相載體同時(shí)與待測樣品以及抗塔瑪亞力山大藻抗體接觸；(b)將固相載體與待測樣品和抗塔瑪亞力山大藻抗體分開；(c)檢測與固相載體結(jié)合的抗塔瑪亞力山大藻抗體的量，所述固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片與待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞競爭結(jié)合抗塔瑪亞力山大藻抗體，而且存在于所述待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞數(shù)目是根據(jù)抗塔瑪亞力山大藻抗體與固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細(xì)胞裂解碎片結(jié)合或不結(jié)合的相對(duì)程度測定的。還公開了用于該檢測方法的試劑盒及其用途。
文檔編號(hào)G01N33/532GK1760673SQ200410067109
公開日2006年4月19日 申請日期2004年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月13日
發(fā)明者于志剛, 李榮秀, 辛澤毓, 亓海剛, 米鐵柱 申請人:中國海洋大學(xué), 上海交通大學(xué)