專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫濁度測(cè)定法及測(cè)定裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定被測(cè)液中溶解的抗原、特別是尿中白蛋白濃度的免疫濁度測(cè)定法及其測(cè)定裝置。
背景技術(shù)：
以往的抗原測(cè)定方法有在被測(cè)液所含的抗原中混合特異結(jié)合的抗體，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使其生成抗原抗體復(fù)合物，致使上述被測(cè)液混濁，然后從其濁度求出抗原濃度的方法。此種方法的濁度可采用光照射上述被測(cè)液，然后通過(guò)測(cè)定溶液中產(chǎn)生的散射光或透過(guò)溶液的透射光來(lái)獲得。但濁度變大的話(huà)，散射光強(qiáng)度也變大，而透射光強(qiáng)度卻變小。
如

圖17所示，這種測(cè)定方法中，與抗原的摩爾濃度相比，抗體的摩爾濃度在很大的范圍內(nèi)幾乎是相等的，即可從抗體過(guò)剩區(qū)域A～B到當(dāng)量區(qū)C進(jìn)行測(cè)定。在圖17的A～B區(qū)內(nèi)，濁度隨抗原濃度的增加而增加，而在C區(qū)內(nèi)，濁度對(duì)應(yīng)于抗原濃度的變化量小。同時(shí)，在抗原過(guò)剩區(qū)D，濁度隨著抗原濃度的增加而降低(前區(qū)現(xiàn)象)。因此，要測(cè)定抗原濃度，須在圖17的A～B區(qū)域內(nèi)作檢測(cè)線，根據(jù)檢測(cè)線，從濁度測(cè)定值算出抗原濃度。
如上所述，因?yàn)榭乖瓭舛纫獜目贵w過(guò)剩區(qū)A～B到當(dāng)量區(qū)C進(jìn)行測(cè)定，所以以往測(cè)定需要加大抗體濃度。這樣有時(shí)低濃度區(qū)內(nèi)的靈敏度就被犧牲了。另外，實(shí)際上為了確認(rèn)抗原濃度不在抗原過(guò)剩區(qū)D區(qū)，即為了確認(rèn)不是圖17中的D區(qū)時(shí)，就要進(jìn)行稀釋被測(cè)液或者追加添加抗體的操作。被測(cè)液中的抗原濃度處在D區(qū)內(nèi)時(shí)，從濁度測(cè)定值可計(jì)算出兩個(gè)濃度值。為此有必要確認(rèn)抗原濃度不處在D區(qū)內(nèi)(如專(zhuān)利文獻(xiàn)1及2)。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1特開(kāi)2004-045 384號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2國(guó)際公開(kāi)第02/052265號(hào)單行本發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是要解決免疫濁度測(cè)定法中的上述問(wèn)題，在不犧牲低濃度區(qū)的靈敏度的情況下，擴(kuò)大被測(cè)液的可測(cè)濃度范圍。同時(shí)提供不需要為確認(rèn)抗原濃度不處在抗原過(guò)剩區(qū)，即不處在圖17中的D區(qū)而進(jìn)行的稀釋被測(cè)液或追加添加抗體的操作的免疫濁度測(cè)定法。
本發(fā)明所涉及的免疫濁度測(cè)定法，首先在含有待分析物抗原的被測(cè)液中混合含有可與上述待分析物產(chǎn)生特異結(jié)合反應(yīng)的抗體的試劑，來(lái)獲得混合液。這時(shí)因特異結(jié)合反應(yīng)而生成抗原抗體復(fù)合物，由于此導(dǎo)致上述被測(cè)液的濁度提高。
然后，對(duì)所得上述混合液的濁度進(jìn)行離散地多次或連續(xù)測(cè)定，找出所得濁度測(cè)定值與混合后經(jīng)過(guò)時(shí)間之間的關(guān)系。再根據(jù)上述關(guān)系測(cè)定出上述測(cè)定值的極大值或極小值Speak，求出顯示上述Speak的經(jīng)過(guò)時(shí)間Tpeak。
通過(guò)上述步驟分析上述濁度的變化，并根據(jù)該變化確認(rèn)上述被檢測(cè)液中是否發(fā)生前區(qū)現(xiàn)象，根據(jù)前區(qū)現(xiàn)象的有無(wú)就能夠決定上述待分析物的濃度。
優(yōu)選的是在上述步驟(2)用散射光測(cè)定上述濁度，在上述步驟(4)檢測(cè)出極大值。
另外，優(yōu)選從上述Speak與上述Tpeak的關(guān)系判定上述待分析物濃度。
優(yōu)選從上述混合后經(jīng)過(guò)時(shí)間T的時(shí)刻的上述光學(xué)特性的測(cè)定值S(T)與上述經(jīng)過(guò)時(shí)間Tpeak間的關(guān)系來(lái)決定上述待分析物的濃度。但這種情況下優(yōu)選滿(mǎn)足T＞Tpeak。
優(yōu)選計(jì)算出上述混合后經(jīng)過(guò)時(shí)間T的時(shí)刻的上述光學(xué)特性測(cè)定值S(T)的微分值dS(T)/dT，以上述微分值的極性反轉(zhuǎn)時(shí)刻為上述Tpeak，以這一時(shí)刻的測(cè)定值S(T)為Speak，由此在測(cè)出Speak的同時(shí)，求出顯示上述Speak的上述Tpeak。
優(yōu)選當(dāng)上述Tpeak低于或等于規(guī)定值T0時(shí)，判定上述被測(cè)液中上述待分析物的濃度高于或等于規(guī)定值C0。
優(yōu)選上述待分析物是人血清白蛋白。
優(yōu)選上述抗體是單克隆抗體，上述試劑中含兩種或兩種以上上述單克隆抗體，上述兩種或兩種以上單克隆抗體分別與人血清白蛋白的不同部位產(chǎn)生特異結(jié)合反應(yīng)。
優(yōu)選上述被測(cè)液是尿。
本發(fā)明還涉及實(shí)施上述免疫濁度測(cè)定法的免疫濁度測(cè)定裝置。
本免疫濁度測(cè)定裝置具備照射上述被測(cè)液的光源、盛裝上述被測(cè)液并使上述光透過(guò)上述被測(cè)液的樣品池、檢測(cè)透過(guò)上述被測(cè)液的透射光的光學(xué)傳感器1和/或檢測(cè)上述光在上述被測(cè)液中傳輸時(shí)產(chǎn)生的散射光的光學(xué)傳感器2、在上述樣品池中混合上述被測(cè)液和含有上述抗體的試劑的混合器以及控制上述混合器、并解析上述光學(xué)傳感器1和/或上述光學(xué)傳感器2輸出信號(hào)的計(jì)算機(jī)。
依據(jù)上述被測(cè)液和上述試劑混合后，上述光學(xué)傳感器1和/或上述光學(xué)傳感器2的輸出信號(hào)測(cè)定上述被測(cè)液中的抗原濃度。
另外，本發(fā)明涉及的免疫濁度測(cè)定裝置具備照射上述被測(cè)液的光源、盛裝上述被測(cè)液并使上述光透過(guò)上述被測(cè)液的樣品池、檢測(cè)透過(guò)上述被測(cè)液的透射光的光學(xué)傳感器1和/或檢測(cè)上述光在被測(cè)液中傳輸時(shí)產(chǎn)生的散射光的光學(xué)傳感器2、對(duì)上述光學(xué)傳感器1和/或上述光學(xué)傳感器2的輸出信號(hào)進(jìn)行微分的微分器1和/或微分器2、在上述樣品池中混合上述被測(cè)液和含有上述抗體的試劑的混合器、控制上述混合器并解析上述光學(xué)傳感器1、上述光學(xué)傳感器2及上述微分器1和/或上述微分器的輸出信號(hào)的計(jì)算機(jī)。
依據(jù)上述被測(cè)液與上述試劑混合后的上述光學(xué)傳感器1和/或上述光學(xué)傳感器2的輸出信號(hào)、或者上述微分器1和/或微分器2的輸出信號(hào)測(cè)定上述被測(cè)液中的抗原濃度。
發(fā)明的效果依據(jù)本發(fā)明，不用稀釋等操作就可以擴(kuò)大被測(cè)液中的抗原濃度可測(cè)范圍，其實(shí)用性好，提高了測(cè)定和檢查的效率并節(jié)省人力。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1 適用本發(fā)明的免疫濁度測(cè)定裝置一實(shí)施方案的俯視簡(jiǎn)圖。
圖2 圖1所示免疫濁度測(cè)定裝置的側(cè)視簡(jiǎn)圖。
圖3 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖4 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖5 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖6 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖7 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖8 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖9 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖10 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖11 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖12 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖13 實(shí)施方案1中光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化圖。
圖14 經(jīng)過(guò)300秒那一點(diǎn)時(shí)，以光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)為濁度，用縱軸表示，被測(cè)液濃度用橫軸表示時(shí)的曲線。
圖15 以圖5～13中各被測(cè)液的濃度為橫軸，濁度的極大值(Speak)為縱軸時(shí)的曲線。
圖16 以顯示極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)為橫軸，以濁度的極大值(Speak)為縱軸時(shí)的曲線。
圖17 抗原濃度與濁度關(guān)系的曲線。
圖18 光學(xué)傳感器5輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化的曲線。
圖19 光學(xué)傳感器5輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化的曲線。
圖20 光學(xué)傳感器5輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化的曲線。
圖21 光學(xué)傳感器5輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化的曲線。
圖22 以經(jīng)過(guò)300秒那一點(diǎn)時(shí)的光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)為濁度，用縱軸表示，被測(cè)液的濃度用橫軸表示時(shí)的曲線。
圖23 適用本發(fā)明的免疫濁度測(cè)定裝置的另一實(shí)施方案的俯視簡(jiǎn)圖。
圖24 表示SC45(虛線)和SC90(實(shí)線)隨時(shí)間變化的曲線。
圖25 表示Tpeak和濃度關(guān)系的曲線。
符號(hào)說(shuō)明1 樣品池2 注入口3 半導(dǎo)體激光組件(レ一ザモジユ一ル)4 近似平行光(略平行光)5 光學(xué)傳感器6 混合器7 計(jì)算機(jī)8 表示液體流束方向的箭頭9 液面10 表示液體注入方向的箭頭
11 散射光12 微分器實(shí)施發(fā)明的最佳方案首先說(shuō)明萌發(fā)本發(fā)明的以往的免疫濁度測(cè)定方法。介紹采用圖1和圖2所示裝置的免疫濁度測(cè)定方法的實(shí)施方法。圖1為以往例及本發(fā)明的溶液濃度測(cè)定法所采用的裝置的概要結(jié)構(gòu)俯視簡(jiǎn)圖。圖2為圖1中光學(xué)系統(tǒng)的側(cè)面簡(jiǎn)圖。圖1和圖2所示的樣品池1由上部有開(kāi)口的長(zhǎng)方體的鋁制容器構(gòu)成。
在樣品池1中，光路的兩端鑲有玻璃板作為光學(xué)窗。樣品池1內(nèi)裝有被測(cè)液的情況下，光可在被測(cè)液中透過(guò)。用A表示光在樣品池1中傳輸方向的距離，即光學(xué)窗間的距離，用B表示與光傳輸方向垂直方向的距離。這里以A＝0.75cm、B＝0.4cm的情況進(jìn)行說(shuō)明。
注入口2配置在如圖1所示樣品池1的沒(méi)有光學(xué)窗的側(cè)面，其內(nèi)徑(直徑)為0.1cm。如圖2所示，注入口2的截面中心配置在距樣品池1的底面距離為x、距光學(xué)窗距離為z的位置。
箭頭10所示的試劑注入方向與光學(xué)窗平行，與后述的近似平行光4的光軸垂直。這樣的配置，使從注入口2的截面的中心向注入方向延伸的注入軸與近似平行光4的光軸在上述樣品池的溶液中有交點(diǎn)。此處顯示x＝0.15cm，z＝0.1cm的情況。
本裝置具備作為光源的半導(dǎo)體激光組件3，投射波長(zhǎng)780nm、強(qiáng)度3.0mW、光束直徑0.12cm的近似平行光4。此近似平行光4的光軸與樣品池1的底面平行、位于距底面0.4cm的位置上。因此光軸與注入口2位于距底面相同的高度上。
光學(xué)傳感器5檢測(cè)近似平行光4在被測(cè)液中傳輸時(shí)產(chǎn)生的散射光11。泵6將試液從注入口2注入樣品池內(nèi)的被測(cè)液中，計(jì)算機(jī)7解析光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)，還控制泵6。
在圖1中用符號(hào)8模擬表示試液從注入口2注入時(shí)產(chǎn)生的渦流。符號(hào)9表示被測(cè)液的液面，液面最凹處位于距樣品池1的底面高為h的位置上。
樣品池1內(nèi)壁的拐角為r。因?yàn)閲?yán)格講拐角處不是直角，所以當(dāng)h＝0.8cm時(shí)，存有0.23ml左右的液體。在本發(fā)明中將與液面9最凹處接觸的面定義為液面。根據(jù)此定義，本實(shí)施方案中，注入方向與液面平行。
以下說(shuō)明用本裝置測(cè)定以尿?yàn)楸粶y(cè)液的尿中人血清白蛋白濃度的操作。
首先以已被確認(rèn)人血清白蛋白濃度低于或等于0.03mg/dl的尿?yàn)槿軇?，在此溶劑中加入人血清白蛋白，調(diào)制濃度＝1mg/dl、3mg/dl、5mg/dl、10mg/dl、15mg/dl、20mg/dl、30mg/dl、50mg/dl和100mg/dl的被測(cè)液。
然后為形成中性反應(yīng)系統(tǒng)，用0.05M的莫普斯(モプス)和濃度為4重量％的聚乙二醇6000調(diào)制莫普斯緩沖液至pH為7.4。
之后將取自兔子的多克隆人血清白蛋白抗體溶解在0.05M的莫普斯水溶液(pH7.4)中，調(diào)制抗體濃度為2.5mg/dl的試劑(抗體水溶液)。
然后，將9μl人血清白蛋白濃度為0mg/dl(作為溶劑用的尿(由于未添加人血清白蛋白，所以將其人血清白蛋白濃度視為0)的被測(cè)液導(dǎo)入樣品池1。再將145μl莫普斯緩沖液導(dǎo)入樣品池1并攪拌。
這時(shí)計(jì)算機(jī)7開(kāi)始記錄光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)。圖18顯示開(kāi)始記錄后，光學(xué)傳感器5輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化。圖18中，橫軸表示開(kāi)始記錄輸出信號(hào)后的經(jīng)過(guò)時(shí)間，縱軸表示光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)(標(biāo)記為SC90)。還有，因?yàn)楣鈱W(xué)傳感器5檢測(cè)的是被測(cè)液中產(chǎn)生散射光中與近似平行光4傳輸方向成90度方向上傳輸?shù)纳⑸涔猓詷?biāo)記為「SC90」。
經(jīng)過(guò)5秒后，計(jì)算機(jī)開(kāi)始控制移液管或泵等混合器6，用約3秒的時(shí)間從注入口2將40μl試劑(抗體水溶液)注入樣品池1。
還有，圖18中，從試劑開(kāi)始混合后5秒那一刻開(kāi)始，在3秒或3秒以上的時(shí)期內(nèi)，由于混合好的試劑的流束進(jìn)入近似平行光4的光路，致使透射光的強(qiáng)度和傳輸方向發(fā)生紊亂，光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)發(fā)生急劇變化。用影線顯示這種輸出信號(hào)的變化區(qū)域。
用同樣的方法測(cè)定人血清白蛋白濃度為1mg/dl、3mg/dl、5mg/dl、10mg/dl、15mg/dl、20mg/dl、30mg/dl、50mg/dl和100mg/dl的被測(cè)液。
其中，圖19～21分別示出光學(xué)傳感器5對(duì)人血清白蛋白的濃度為3mg/dl、10mg/dl和100mg/dl的被測(cè)液的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化。與圖18同樣，在這些圖中用影線顯示了光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)產(chǎn)生急劇變化的區(qū)域。
由圖18～21可知，一過(guò)300秒，顯示濁度的光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)就飽和了。因此，把到300秒那一時(shí)刻時(shí)，光學(xué)傳感器5對(duì)這些被測(cè)液的輸出信號(hào)作為濁度，用縱軸表示，被測(cè)液的濃度用橫軸表示的話(huà)，可得圖22。
由圖22可知，濃度為0～30mg/dl的區(qū)域相當(dāng)于圖17的A～B區(qū)，濃度為50mg/dl的區(qū)域相當(dāng)于C區(qū)，濃度為100mg/dl的區(qū)域相當(dāng)于D區(qū)。
在圖22所示場(chǎng)合，用濃度0～30mg/dl的濁度作成檢測(cè)線，就可對(duì)濃度進(jìn)行定量。
但是，被測(cè)液濃度高于約50mg/dl時(shí)，僅用被測(cè)液與試劑混合經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后的濁度，由于前區(qū)現(xiàn)象有時(shí)就不能一味地判定出濃度的高低。如濁度(到300秒那一刻時(shí)的光學(xué)傳感器的輸出信號(hào))為7.5的情況下，就無(wú)法區(qū)別被測(cè)液濃度到底是20mg/dl，還是50mg/dl～100mg/dl。
因此，當(dāng)被測(cè)液中的人血清白蛋白濃度為50mg/dl或以下時(shí)，還有必要加用其它一些方法確認(rèn)濃度。換句話(huà)說(shuō)，用上述測(cè)定方法時(shí)，被測(cè)液可測(cè)定的濃度范圍就限制在低于或等于50mg/dl。
鑒于上述背景，本發(fā)明的目的就是要解決免疫濁度測(cè)定法中的上述問(wèn)題，而不犧牲低濃度范圍內(nèi)的靈敏度，并擴(kuò)大被測(cè)液的可測(cè)濃度范圍。還有就是提供不需要為確認(rèn)抗原濃度處于抗原過(guò)剩區(qū)，即不處于圖17的D區(qū)而進(jìn)行的稀釋被測(cè)液或者添加抗體的操作的免疫濁度測(cè)定法。
具體講，本發(fā)明涉及的免疫濁度測(cè)定法由于實(shí)施了(1)將含有待分析物抗原的被測(cè)液與試劑混合，調(diào)配混合液的步驟，(2)離散地多次或連續(xù)測(cè)定經(jīng)調(diào)配的上述混合液濁度的步驟，(3)求出所得濁度測(cè)定值與混合后經(jīng)過(guò)時(shí)間的關(guān)系的步驟，(4)根據(jù)上述關(guān)系，測(cè)定上述測(cè)定值的極大值或極小值Speak，求出顯示上述Speak的上述經(jīng)過(guò)時(shí)間Tpeak的步驟，從而避免了由于前區(qū)現(xiàn)象所引起的上述問(wèn)題的產(chǎn)生。
實(shí)施方案1
本實(shí)施方案涉及的是，用與人血清白蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體，以尿?yàn)楸粶y(cè)液來(lái)測(cè)定尿中白蛋白的例子。
免疫濁度測(cè)定法中，需要通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使抗原和抗體凝聚。即要求抗原和抗體結(jié)合，此結(jié)合物通過(guò)抗體分子而交聯(lián)，生成大的顆粒(抗原抗體復(fù)合物)。因此，在與抗原結(jié)合的結(jié)合部位至少要有相異的兩種抗體。
另外，抗原抗體復(fù)合物粒徑大小要能表示出上述測(cè)定值的極大值或極小值，因種種條件而異，例如優(yōu)選為約25μm或以上。
從上述可知，一般免疫濁度測(cè)定法要用多克隆抗體。但眾所周知，即便是混合結(jié)合部位相異的多種單克隆抗體作為試劑，因抗原和抗體凝聚、生成抗原抗體復(fù)合物，從而用免疫濁度測(cè)定法可以測(cè)定抗原濃度。同時(shí)，被測(cè)液與含有結(jié)合部位相異的多種單克隆抗體的試劑混合后，通過(guò)觀察分析濁度的過(guò)渡現(xiàn)象，還可擴(kuò)大測(cè)定濃度的范圍。
下面用圖1～22說(shuō)明具體實(shí)施例。圖1和圖2與采用以往技術(shù)完全相同，操作也相同。在本實(shí)施方案中，用此裝置以尿?yàn)楸粶y(cè)液，測(cè)定了尿中人血清白蛋白的濃度。
首先，與用以往技術(shù)同樣，采用已被確認(rèn)了其人血清白蛋白濃度低于或等于0.03mg/dl的尿?yàn)槿軇?，并添加人血清白蛋白到該溶劑中，再調(diào)配出濃度為3mg/dl、5mg/dl、10mg/dl、30mg/dl、50mg/dl、100mg/dl、150mg/dl、250mg/dl、300mg/dl和500mg/dl的被測(cè)液。
然后與用以往技術(shù)同樣，在構(gòu)成中性反應(yīng)系統(tǒng)所用的緩沖液的組分采用了莫普斯，其濃度和緩沖液的pH采用了一般常用的值。調(diào)配出含0.05M莫普斯和濃度為4重量％的聚乙二醇6000，pH為7.4的莫普斯緩沖液。
另外還備好了與人血清白蛋白不同結(jié)合部位特異性結(jié)合的取自小鼠的3種(AHSA1、AHSA2、AHSA3)單克隆抗體。AHSA1、AHSA2、AHSA3是分別由獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心受托號(hào)FERM BP-8308號(hào)、FERM BP-8309號(hào)和FERM BP-7938號(hào)所示細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。
將這3種單克隆抗體以1∶1∶8的摩爾比(＝AHSA1的摩爾濃度∶AHSA2的摩爾濃度∶AHSA3的摩爾濃度)，溶解在上述莫普斯緩沖液中，調(diào)配成試劑(抗體水溶液)。3種抗體的總濃度為2.4mg/dl。
之后與以往技術(shù)相同，將人血清白蛋白濃度為0mg/dl(作溶劑用的尿(因未添加人血清白蛋白，所以其濃度實(shí)際上被看成為0))、3mg/dl、5mg/dl、10mg/dl、30mg/dl、50mg/dl、100mg/dl、150mg/dl、250mg/dl、300mg/dl和500mg/dl的被測(cè)液9μl導(dǎo)入樣品池1，再將上述試劑145μl也導(dǎo)入樣品池1后進(jìn)行攪拌。
攪拌后，讓計(jì)算機(jī)7開(kāi)始記錄光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)。圖3～13顯示了開(kāi)始記錄后的光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)的經(jīng)時(shí)變化。在圖3～13中，橫軸表示開(kāi)始記錄輸出信號(hào)后經(jīng)過(guò)的時(shí)間，縱軸表示光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)(標(biāo)記為SC90)。記錄開(kāi)始后5秒那一刻，計(jì)算機(jī)開(kāi)始控制混合器6，用約3秒的時(shí)間從注入口2將40μl試劑(抗體水溶液)注入樣品池1。
如圖3～13所示，自試劑開(kāi)始混合后5秒那一刻開(kāi)始，在3秒或以上的時(shí)間內(nèi)，由于混合后的試劑的流束進(jìn)入了近似平行光4的光路，所以致使透射光強(qiáng)度和傳輸方向被打亂，光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)發(fā)生急劇變化。在圖中用影線標(biāo)示出這一變化區(qū)域。
圖3和圖4顯示了濃度為0mg/dl和3mg/dl的被測(cè)液與試劑混合后經(jīng)過(guò)的時(shí)間與光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)間的關(guān)系。與采用以往技術(shù)的圖18～21情況相同，輸出信號(hào)單調(diào)增加，一過(guò)300秒就飽和而達(dá)到一定值。
但是，與上述不同的是，對(duì)于濃度為5mg/dl、10mg/dl、30mg/dl、50mg/dl、100mg/dl、150mg/dl、250mg/dl、300mg/dl和500mg/dl的被測(cè)液，如圖5～13所示，試劑混合后，光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)急劇增加，呈現(xiàn)出極大值，其后，單調(diào)減少，一過(guò)300秒就飽和而達(dá)到一定值。
在圖14中，以濃度為0mg/dl、3mg/dl、5mg/dl、10mg/dl、30mg/dl、50mg/dl、100mg/dl、150mg/dl、250mg/dl、300mg/dl和500mg/dl的被測(cè)液，與試劑混合后300秒那一刻時(shí)的光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)作為濁度，表示在縱軸上，橫軸表示被測(cè)液濃度。由圖14可知，濃度0～50mg/dl的區(qū)域相當(dāng)于圖17的A～B區(qū)，濃度100mg/dl的區(qū)域相當(dāng)于C區(qū)，濃度150mg/dl或以上的區(qū)域相當(dāng)于D區(qū)。
在圖22所示的場(chǎng)合，以濃度為0～50mg/dl的濁度值作出檢測(cè)線可對(duì)濃度進(jìn)行定量。但當(dāng)被測(cè)液濃度超過(guò)約100mg/dl時(shí)，有時(shí)就不能用前區(qū)現(xiàn)象來(lái)判定濃度。如濁度(經(jīng)過(guò)300秒后那一刻的光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào))為2.4時(shí)，就無(wú)法區(qū)別被測(cè)液的濃度到底是30mg/dl，還是150～250mg/dl或以下。因此，就需要用別的方法另行確認(rèn)被測(cè)液中人血清白蛋白濃度是否處于100mg/dl或以下。換句話(huà)說(shuō)，在上述測(cè)定方法中，可測(cè)定的被測(cè)液的濃度范圍被限制在了100mg/dl或以下。
這樣與以往的技術(shù)同樣，有時(shí)不能只根據(jù)被測(cè)液與試劑混合后，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后的濁度(圖14)，一味地用前區(qū)現(xiàn)象判定濃度。因此可測(cè)定的被測(cè)液的濃度范圍就受到了限制。
為此，如下面所述，分析了被測(cè)液與試劑混合后濁度的過(guò)渡現(xiàn)象。首先以圖5～13中所示各被測(cè)液的濃度為橫軸，濁度的極大值(Speak)為縱軸繪出圖15。
然后，以表示此極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)為橫軸，濁度的極大值(Speak)為縱軸繪出圖16。在圖16中，各點(diǎn)的橫寫(xiě)數(shù)字表示濃度(mg/dl)。由圖16可知，表示極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)隨著濃度的升高而變短，濃度一超過(guò)100mg/dl就逐漸接近約18秒。
由上述可知，在圖14的基礎(chǔ)上，再利用圖16就可擴(kuò)大被測(cè)液的可測(cè)濃度范圍。例如，濁度(300秒后那一刻的光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào))為2.4時(shí)，僅按圖14就不能區(qū)別被測(cè)液濃度到底是約30mg/dl還是150～250mg/dl。而并用圖16的話(huà)就可以對(duì)上述情況加以區(qū)別、并判定出濃度。即表示此時(shí)的極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)約為35秒時(shí)，可判定濃度為30mg/dl，表示極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)約為18秒時(shí)，可判定濃度為150～250mg/dl。這樣，從被測(cè)液與試劑混合，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后的濁度(圖14)和示出極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)的關(guān)系就可果斷地判定出濃度。由此可知，在本實(shí)施方案所示的實(shí)例中，就成功地將被測(cè)液的可測(cè)濃度范圍擴(kuò)大到了～500mg/dl范圍。
如上所述，求出濁度測(cè)定值的極大值(Speak)和表示極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)的關(guān)系，再用混合后經(jīng)過(guò)所定時(shí)間T那一刻時(shí)的濁度測(cè)定值S(T)和經(jīng)過(guò)時(shí)間Tpeak的關(guān)系就可判定出被測(cè)液的濃度。
但在濃度為0mg/dl和3mg/dl這樣的低濃度場(chǎng)合時(shí)，不存在濁度測(cè)定值的極大值。這種情況下，因?yàn)楸豢闯墒翘幱诳贵w過(guò)剩區(qū)即圖17中的A～B區(qū)，所以?xún)H用經(jīng)過(guò)所定時(shí)間T那一刻時(shí)的濁度測(cè)定值S(T)也可果斷地判定出濃度。
這時(shí)，優(yōu)選所定時(shí)間T滿(mǎn)足T＞Tpeak。這樣可提高重復(fù)性。此外，優(yōu)選T為S飽和的時(shí)間。另一方面，T＜Tpeak也沒(méi)關(guān)系。在這種場(chǎng)合可用更短的測(cè)定時(shí)間定出濃度。
在本實(shí)施方案中提到用散射光測(cè)定濁度，然而用透射光也能測(cè)定濁度。但在這種場(chǎng)合，因?yàn)闈岫扰c透射光強(qiáng)度是反相變化的，若以透射光強(qiáng)度的極小值為Speak，并以顯示出極小值的經(jīng)過(guò)時(shí)間為T(mén)peak的話(huà)，也可獲得同樣的效果。
而且，同時(shí)測(cè)定散射光和透射光，相互參照測(cè)定結(jié)果還可提高測(cè)定可靠性。
實(shí)施方案2用圖15說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例2。本實(shí)施例是用圖15和圖16決定濃度的示例。
例如當(dāng)濁度的極大值為5.5時(shí)，僅用圖15就不能區(qū)別被測(cè)液濃度到底是約30mg/dl還是150mg/dl～250mg/dl，而并用圖16就可對(duì)其加以區(qū)別，判定出濃度。即顯示出此時(shí)的極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)若是35秒左右的話(huà)，則濃度就可判定為30mg/dl；表示極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)若為18秒左右的話(huà)，就可判定濃度為150mg/dl～250mg/dl。
這樣，將被測(cè)液與試劑混合后，從濁度的極大值(Speak)(圖15)和顯示極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)的關(guān)系就可果斷地判定濃度。由此，在本實(shí)施例所示的例子中成功地將被測(cè)液濃度范圍擴(kuò)大到了～500mg/dl。
在本實(shí)施方案中，因?yàn)樵跍y(cè)定濁度極大值的那一時(shí)刻就可測(cè)定出濃度，所以與實(shí)施方案1相比，更有利于提高測(cè)定速度。但是，在極大值不存在的低濃度場(chǎng)合，要用經(jīng)過(guò)所定時(shí)間后的濁度來(lái)決定濃度，因此并用實(shí)施方案2和實(shí)施方案1會(huì)更有效。
實(shí)施方案3用圖16說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案3。從圖16可知，顯示極大值的經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)為規(guī)定值T0或其以上(圖16中，T018秒)時(shí)，僅用Tpeak就可果斷地決定濃度。因此，經(jīng)過(guò)時(shí)間(Tpeak)為規(guī)定值T0或其以下時(shí)，將濃度判定為規(guī)定值C0(圖16中，C0為100mg/dl)；為規(guī)定值T0或其以上時(shí)，可從圖16讀取的Tpeak來(lái)判定濃度。由于本實(shí)施方案也可在測(cè)定出濁度極大值的那一時(shí)刻來(lái)決定濃度，所以與實(shí)施方案1相比，更有利于提高測(cè)定速度。
但是，在極大值不存在的低濃度場(chǎng)合，是用經(jīng)過(guò)所定時(shí)間后的濁度來(lái)判定濃度。由此可知并用本實(shí)施方案和實(shí)施方案1效果更大。
實(shí)施方案4用圖23說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案4。圖23是本發(fā)明中可應(yīng)用的免疫濁度測(cè)定裝置的另一種實(shí)施方案。在圖23中，符號(hào)1～11所示的結(jié)構(gòu)要素與圖1中的符號(hào)1～11相同。12為對(duì)光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)進(jìn)行微分的微分器，計(jì)算機(jī)7可分析其輸出信號(hào)。此裝置是以微分器12輸出信號(hào)的符號(hào)反轉(zhuǎn)時(shí)刻為極大值，所以可以精度更高地快速識(shí)別極大值。
如上所述，由于采用本實(shí)施方案可快速識(shí)別更微小的極大值，因而可快速判定低濃度的被測(cè)液的濃度。
用上述的散射光強(qiáng)度標(biāo)記為SC90的光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)表示極大值的條件是，抗體和抗原特異性結(jié)合生成的抗原抗體復(fù)合物的粒徑要比所定值大。
這與散射光強(qiáng)度因散射光傳輸方向而改變有關(guān)。即溶液中懸浮顆粒的粒徑與激勵(lì)光(相當(dāng)于近似平行光4)的波長(zhǎng)相比足夠小(為波長(zhǎng)的1/20或更小)時(shí)，散射光強(qiáng)度的分布不受其傳輸方向的影響。
但是，向前散射光(與激勵(lì)光的傳輸方向的夾角小于或等于90度)的強(qiáng)度隨粒徑的增大而增強(qiáng)。同時(shí)，抗原抗體復(fù)合物的粒徑增大的話(huà)就意味著顆粒濃度的降低。
由上述可知，抗原抗體復(fù)合物一旦隨著抗原抗體反應(yīng)的進(jìn)行而成長(zhǎng)的話(huà)，SC90就增加，進(jìn)而抗原抗體復(fù)合物成長(zhǎng)，粒徑變大，向前散射光強(qiáng)度因增強(qiáng)而造成的逆轉(zhuǎn)及顆粒濃度變小帶來(lái)的影響，就會(huì)使SC90降低，即出現(xiàn)極大值。
用圖24說(shuō)明此現(xiàn)象。圖24左側(cè)的縱軸相當(dāng)于溶液中產(chǎn)生的散射光中，向與近似平行光4傳輸方向成45度的方向傳輸?shù)纳⑸涔獾膹?qiáng)度。
這是將圖1所示光學(xué)傳感器5配置在可檢測(cè)溶液中產(chǎn)生的散射光中向與近似平行光4傳輸方向成45度方向傳輸?shù)纳⑸涔獾奈恢脮r(shí)，光學(xué)傳感器5的輸出信號(hào)。將其標(biāo)記為SC45。用虛線表示白蛋白濃度為10mg/dl時(shí)的SC45。
另一方面，用實(shí)線表示那時(shí)的SC90的信號(hào)(相當(dāng)于圖6)。虛線和實(shí)線的測(cè)定條件與圖6的場(chǎng)合相同。但SC45的縱軸所示的絕對(duì)值并不對(duì)應(yīng)圖6的情況，是任意值。由圖24可知，在300秒間，SC45在不斷增強(qiáng)，顯示抗原抗體復(fù)合物在成長(zhǎng)。
這樣，顯示SC90極大值的一例的粒徑，用圖1所示裝置與上述抗體組合時(shí)，約25μm或以上。
在上述實(shí)施方案3中采用了如圖16中所示的SC90的峰和經(jīng)過(guò)時(shí)間的關(guān)系的曲線。但如圖25所示，即便用表示Tpeak與濃度關(guān)系的曲線，僅Tpeak也可測(cè)定出濃度。
工業(yè)上利用的可能性本發(fā)明涉及的免疫濁度測(cè)定法最適用于尿的檢查等。
權(quán)利要求
1.免疫濁度測(cè)定法，其是將含有待分析物抗原的被測(cè)液與含有與所述待分析物能進(jìn)行特異結(jié)合反應(yīng)的抗體的試劑混合，通過(guò)檢測(cè)由所述特異結(jié)合反應(yīng)生成的抗原抗體復(fù)合物所產(chǎn)生的與濁度相關(guān)的信號(hào)，來(lái)對(duì)所述待分析物進(jìn)行定性或定量測(cè)定的免疫濁度測(cè)定法，其特征在于包括(1)將所述被測(cè)液和所述試劑混合獲得混合液的步驟；(2)離散地多次或連續(xù)測(cè)定所獲得的前述混合液濁度的步驟；(3)求解所得的濁度測(cè)定值與混合后所經(jīng)過(guò)的時(shí)間的關(guān)系的步驟；以及(4)根據(jù)所述關(guān)系，檢測(cè)出的所述測(cè)定值的極大值或極小值Speak，求出顯示所述Speak的經(jīng)過(guò)時(shí)間Tpeak的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫濁度測(cè)定法，其中，所述步驟(2)中通過(guò)散射光測(cè)定所述濁度，所述步驟(4)中檢測(cè)出極大值。
3.如權(quán)利要求1所述的免疫濁度測(cè)定法，其中，根據(jù)所述Speak和Tpeak的關(guān)系決定所述待分析物的濃度。
4.如權(quán)利要求1所述的免疫濁度測(cè)定法，其中，根據(jù)所述混合后經(jīng)過(guò)時(shí)間為T(mén)那一時(shí)刻時(shí)的所述光學(xué)特性的測(cè)定值S(T)和所述經(jīng)過(guò)時(shí)間Tpeak的關(guān)系來(lái)決定所述待分析物的濃度。
5.如權(quán)利要求4所述的免疫濁度測(cè)定法，其中，滿(mǎn)足T＞Tpeak。
6.如權(quán)利要求1所述的免疫濁度測(cè)定法，其中，先計(jì)算出所述混合后經(jīng)過(guò)時(shí)間T時(shí)的所述光學(xué)特性測(cè)定值S(T)的微分值dS(T)/dT，然后，以所述微分值極性反轉(zhuǎn)那一時(shí)刻作為所述Tpeak，以這一時(shí)刻的測(cè)定值S(T)為Speak，據(jù)此，在檢測(cè)Speak的同時(shí)，求出顯示所述Speak的所述Tpeak。
7.如權(quán)利要求1所述的免疫濁度測(cè)定法，其中，所述的Tpeak為規(guī)定值T0或其以下時(shí)，就判定所述被測(cè)液中的所述待分析物的濃度為規(guī)定值C0或其以上。
8.如權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的免疫濁度測(cè)定法，其中，所述待分析物是人血清白蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的免疫濁度測(cè)定法，其中，所述的抗體是單克隆抗體，所述的試劑中含有兩種或兩種以上所述單克隆抗體、所述的兩種或兩種以上單克隆抗體分別與人血清白蛋白的不同部位產(chǎn)生特異結(jié)合。
10.如權(quán)利要求9所述的免疫濁度測(cè)定法，其中，所述被測(cè)液是尿。
11.免疫濁度測(cè)定裝置，其用于實(shí)施權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)所述的免疫濁度測(cè)定法，其特征在于，該裝置具備照射所述被測(cè)液的光源、盛裝所述被測(cè)液并使所述光透射所述被測(cè)液以及使所述被測(cè)液與含有抗體的試劑混合的樣品池、檢測(cè)透射所述被測(cè)液的透射光的光學(xué)傳感器1和/或檢測(cè)所述光在所述被測(cè)液中傳輸時(shí)產(chǎn)生的散射光的光學(xué)傳感器2、解析所述光學(xué)傳感器1和/或所述光學(xué)傳感器2輸出信號(hào)的計(jì)算機(jī)，該裝置根據(jù)所述被測(cè)液與所述試劑混合后的所述光學(xué)傳感器1和/或所述傳感器2的輸出信號(hào)來(lái)測(cè)定所述被測(cè)液中的抗原濃度。
12.免疫濁度測(cè)定裝置，其用于實(shí)施權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)所述的免疫濁度測(cè)定法，其特征在于，該裝置具備照射所述被測(cè)液的光源、盛裝所述被測(cè)液并使所述光透射所述被測(cè)液以及使所述被測(cè)液與含有抗體的試劑混合的樣品池、檢測(cè)透射所述被測(cè)液的透射光的光學(xué)傳感器1和/或檢測(cè)所述光在所述被測(cè)液中傳輸時(shí)產(chǎn)生的散射光的光學(xué)傳感器2、對(duì)所述光學(xué)傳感器1和/或所述光學(xué)傳感器2的輸出信號(hào)進(jìn)行微分的微分器1和/或微分器2、解析所述光學(xué)傳感器1和所述光學(xué)傳感器2以及所述微分器1和/或微分器2的輸出信號(hào)的計(jì)算機(jī)，該裝置根據(jù)所述被測(cè)液和所述試劑混合后的所述微分器1和/或所述微分器2的輸出信號(hào)來(lái)測(cè)定所述被測(cè)液中的抗原濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供不需要稀釋等操作，可擴(kuò)大濃度測(cè)定范圍的免疫濁度測(cè)定法。該方法觀察濁度變化的過(guò)渡現(xiàn)象，測(cè)出濁度的極大值或極小值，然后從表示這些極大值或極小值的時(shí)間、濁度及極大值和/或極小值來(lái)判定被測(cè)液的濃度。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1576844SQ20041006840
公開(kāi)日2005年2月9日 申請(qǐng)日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
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