專利名稱：白斑癥病毒快速檢測試劑盒及其制備使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及養(yǎng)殖病害病原檢測技術的改進，具體講是一種白斑癥病毒(white spotsyndrome virus，WSSV)快速檢測試劑盒及其制備使用方法，其屬于免疫學和病毒學交叉技術領域。
背景技術：
白斑癥病毒病是對蝦養(yǎng)殖中危害嚴重的疾病之一，導致很高的對蝦死亡率，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。鑒于白斑癥尚無有效的治療方法，快速準確的病毒分離檢測技術已成為各國學者研究的焦點之一。目前，白斑癥病毒病的診斷主要是依靠實驗室內(nèi)對白斑癥病毒檢測來確診，現(xiàn)實驗室檢測方法有PCR法；DNA探針原位雜交法；透射電鏡觀察法；光鏡下HE染色觀察法，酶聯(lián)免疫吸附檢測法以及斑點免疫印跡檢測法等。這些方法，操作程式較為復雜，需要一定的實驗室儀器設備，且耗時較長，整個過程需要幾個乃至十幾個小時，達不到快速、現(xiàn)場檢測的目的。PCR法靈敏度高，可用于無癥狀病蝦的檢測，但其高靈敏度易導致假陽性結果；酶聯(lián)免疫吸附檢測法及斑點免疫印跡檢測法，是目前常用的檢測方法，但被檢組織的內(nèi)源酶可以對其檢測結果產(chǎn)生干擾，導致假陽性的出現(xiàn)。因此一種適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害病原的快速、準確、簡便、現(xiàn)場、無假陽性的檢測方法的研制勢在必行，以期達到早發(fā)現(xiàn)、早預防的目的。
斑點免疫滲濾法(Dot-immuogold filtration assay，DIGFA)，是本世紀八十年代發(fā)展起來的一種免疫學檢測方法，具有簡便、快速、準確等優(yōu)點。目前在醫(yī)學檢驗中主要應用于檢測HBsAg、HCG和HIV等。斑點免疫滲濾法包括間接法和夾心法。間接法測抗體固定于膜上的特異性抗原+樣品中的相應抗體+金標記的抗抗體或SPA顯色；夾心法測抗原固定于膜上的多克隆抗體+樣品中待測抗原+金標記的特異性單克隆抗體顯色。此法在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害病原檢測方面的應用還是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對白斑癥病毒病嚴重危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)的現(xiàn)狀，迫切需要一種簡便、快速、準確、現(xiàn)場的檢測方法和低等水生生物生理學特點而設計發(fā)明的，以達到快速、準確、簡便、現(xiàn)場的檢測目的。
本發(fā)明以現(xiàn)有技術的實際特點由于其一，低等水生節(jié)肢動物體內(nèi)無抗體的形成，不能用間接法測樣品中的抗體；其二，對水生養(yǎng)殖動物疾病的診斷是一個群體的概念，可以通過對個體的檢測達到對群體做出診斷的目的。因此，本發(fā)明根據(jù)這些特點，將目前斑點免疫滲濾法進行改進，提供一種白斑癥病毒快速檢測試劑盒及其制備使用方法，采用直接法檢測抗原從靶器官中簡單的提取病毒，直接將含病毒的待測樣品液固定于膜上，再加金標記的特異性單克隆抗體，顯色，使斑點免疫滲濾法檢測步驟簡化、時間縮短。
本發(fā)明的目的是由以下技術方案實現(xiàn)的，研制了一種白斑癥病毒快速檢測試劑盒，其包括充墊在盒內(nèi)的吸水材料和硝酸纖維素膜組成的檢測裝置；C液含牛血清白蛋白的吐溫-磷酸鹽緩沖液；D液吐溫-磷酸鹽緩沖液；該試劑盒還包括A液滲透壓小于360毫滲克分子/公斤的低滲液；B液金標抗白斑癥病毒的單克隆抗體探針，該單抗探針是經(jīng)過膠體金標記的兩種單抗按一定的比例配制而成；該兩種單抗是由兩株雜交瘤細胞分別分泌的抗白斑癥病毒囊膜單抗E和抗白斑癥病毒核衣殼單抗D(簡稱為單抗E和D)；該兩株雜交瘤細胞的保藏號分別為CCTCC-C200421和CCTCC-C200422，保藏日期2004/12/14，該兩株雜交瘤細胞的培養(yǎng)物名稱分別為小鼠雜交瘤細胞株WSSV-E和小鼠雜交瘤細胞株WSSV-C，保藏單位CCTCC；地址中國武漢大學內(nèi)。
所述的兩種單抗E和D的膠體金標記方法為(1)膠體金的制備18-20納米膠體金顆粒制備，將氯金酸溶液與檸檬酸鈉混合，加熱制成膠體金溶液。用碳酸鉀將該膠體金溶液的pH值調(diào)至8.2-8.3，備用；(2)金標抗體的制備將適量的單抗E和D分別加入到上述(1)的膠體金溶液中，慢攪10分鐘，加入牛血清白蛋白，4℃過夜；然后將其在4℃下，18000g離心110分鐘；取離心沉淀，用含有牛血清白蛋白、疊氮鈉的吐溫-磷酸鹽緩沖液懸起，制成金標單抗E和D；該金標單抗E和D按一定的比例配制成金標單抗探針B液，4℃保存。
所述適量的單抗E和D，是指單抗?jié)舛葹?.5克/升時，每毫升膠體金標記的單抗量為15-20微升。
所述的滲透壓為小于360毫滲克分子/公斤的低滲液A液，其組成為蒸餾水；或自來水；或pH 7.0-7.6的磷酸鹽緩沖液；或pH 7.0-7.6的Tris-氯化鈉緩沖液。
所述的分別分泌單抗E和D的兩雜交瘤細胞，其制備方法如下(1)抗原的制備取蝦白斑綜合癥病蝦腮稱重與A液1∶10勻漿，提取病毒，得裸露核衣殼的白斑癥病毒液，4℃?zhèn)溆茫?2)用上述(1)步提純的病毒液為抗原，免疫Balb/c小白鼠；(3)將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞的融合，培養(yǎng)得520株雜交瘤細胞；(4)采用間接免疫熒光法篩選出抗白斑癥病毒的陽性雜交瘤細胞株；(5)采用有限稀釋法對其中30株陽性雜交瘤細胞進行了克隆；(6)通過免疫電鏡，篩選出抗白斑癥病毒的單抗E和D用于金標記。
本發(fā)明的白斑癥病毒快速檢測試劑盒的檢測使用方法，所述該使用方法的步驟如下(1)取待檢蝦鰓稱重，與A液按1∶10(W/V)的比例混合，勻漿，再沉降5-10分鐘，取上清作為檢測樣品，待檢；(2)取上述檢測樣品2微升，經(jīng)檢測裝置孔滴在硝酸纖維素膜上，形成直徑約2毫米的樣品點，晾干；(3)加入C液，滲入；(4)加入B液，滲入；(5)再加入D液，滲入；(6)檢測結果硝酸纖維素膜上出現(xiàn)紅色斑點的為陽性，無紅色斑點的為陰性；陽性代表檢測樣品中有白斑癥病毒，陰性則無該病毒。
本發(fā)明的優(yōu)點在于由于通過A液滲透壓小于360毫滲克分子/公斤的低滲液對檢測樣品的技術處理即通過低滲處理使白斑癥病毒的囊膜破裂，使包裹在囊膜內(nèi)的核衣殼暴露出來，即核衣殼蛋白抗原與抗核衣殼單克隆抗體的結合位點暴露出來；將兩種單抗(E和D)作為檢測抗體同時使用時，可明顯提高檢測的靈敏度，本發(fā)明的B液是金標記抗白斑癥病毒的單克隆抗體探針，該單抗探針是經(jīng)過膠體金標記的兩種單抗按一定的比例配制而成，用此對樣品進行檢測，其檢測靈敏度較單一金標單抗的斑點免疫滲濾檢測增加了10倍(見表1)。這是由于本發(fā)明，首先利用低滲處理使白斑癥病毒的囊膜破裂，使包裹在囊膜內(nèi)的核衣殼暴露出來，進而選擇了兩種金標單抗——金標單抗E和金標單抗D同時使用，增加了單克隆抗體的與病毒的結合位點，尤其是白斑癥病毒的核衣殼蛋白為2-3種蛋白高度重復表達，這使抗核衣殼單抗D與其結合位點增加明顯，最終其檢測靈敏度顯著增加。含白斑癥病毒的樣品液包被在硝酸纖維膜上，用本發(fā)明的膠體金標記的抗白斑癥病毒單抗E和D，通過抗體的滲濾，與包被在該膜上的抗原快速反應，顯色，來檢測樣品液中的白斑癥病毒，肉眼可見的明顯紅色斑點表示陽性，表明檢測樣品液中有白斑癥病毒；無紅色斑點出現(xiàn)，為陰性，表明檢測樣品液中無白斑癥病毒。檢測反應只需3分鐘，并且不需要孵育及任何儀器設備。此法與斑點免疫印跡法比較，靈敏度與其相同。本發(fā)明的白斑癥病毒快速檢測試劑盒經(jīng)實際應用證明是一種快速、方便、準確、現(xiàn)場、無假陽性的快速檢測試劑盒。
附圖及其具體實施方式
本發(fā)明的實施例結合附圖進一步描述如下

圖1為囊膜破碎的白斑癥病毒電鏡檢測結果；圖中的箭指白斑癥病毒囊膜；箭頭指白斑癥病毒核衣殼。
圖2為單抗E與白斑癥病毒囊膜結合的免疫電鏡檢測結果；圖中的箭指白斑癥病毒核衣殼；箭頭指膠體金離子與病毒結合部位；羽箭指白斑癥病毒囊膜。
圖3為單抗D與白斑癥病毒核衣殼結合的免疫電鏡檢測結果；圖中的箭指白斑癥病毒核衣殼；箭頭指膠體金離子與病毒結合部位；羽箭指白斑癥病毒囊膜。
圖4為白斑癥病毒快速檢測試劑盒的檢測結果；圖中的紅色斑點的為陽性，無紅色斑點的為陰性；斑點的紅色強弱與檢測樣品所含病毒量成正相關。
參見圖1-4本發(fā)明的白斑癥病毒快速檢測試劑盒，其包括充墊在盒內(nèi)的吸水材料和硝酸纖維素膜組成的檢測裝置；C液含牛血清白蛋白的吐溫-磷酸鹽緩沖液；D液吐溫-磷酸鹽緩沖液；A液滲透壓小于360毫滲克分子/公斤的低滲液；B液金標抗白斑癥病毒的單克隆抗體探針，該單抗探針是經(jīng)過膠體金標記的兩種單抗按一定的比例配制而成；該兩種單抗是由兩株雜交瘤細胞分別分泌的抗白斑癥病毒囊膜單抗E和抗白斑癥病毒核衣殼單抗D(簡稱為單抗E和D)；該兩株雜交瘤細胞的保藏號分別為CCTCC-C200421和CCTCC-C200422，保藏日期2004/12/14。
實施例1.
所述的兩種單抗E和D的膠體金標記方法為(1)膠體金的制備18-20nm膠體金顆粒制備，將0.01％氯金酸溶液100ml與0.1％檸檬酸鈉2.5ml混合，加熱致100℃制成膠體金溶液，該溶液的pH值用0.2％碳酸鉀調(diào)至8.2-8.3，備用；(2)金標抗體的制備將適量的單抗E和單抗D分別加入到上述(1)的膠體金溶液中，慢攪10min，加入1％牛血清白蛋白，4℃過夜；然后將其在4℃下，18000g離心110min；取離心沉淀，用含有1％牛血清白蛋白、0.02％疊氮鈉、0.5％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液(PBSKCI 0.2g，NaCI 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，蒸餾水1000ml，pH 7.4)懸起，其用量為原體積的十分之一。制成金標單抗E和金標單抗D；金標單抗E和金標單抗D按1∶1比例配制成金標單抗探針B液，4℃保存。金標單抗斑點免疫滲濾檢測的比較，見表1表1 金標單抗斑點免疫滲濾檢測的比較

注++較強陽性；+陽性；-陰性。
檢測樣品液為含10％(W/V)蝦鰓的A液，勻漿液后得到的上清液。
金標單抗E+金標單抗D兩種金標單抗混合比例為1∶1。
結果金標單抗探針其檢測靈敏度較單株金標單抗的斑點免疫滲濾檢測增加了10倍。
實施例2.
所述適量的單抗，其適量是單抗?jié)舛葹?.5g/L時，每毫升膠體金標記的最適單抗量為15-20μl。將1μl抗體加入1ml膠體金中，混均，加入10％氯化鈉100μl，觀察顏色變化，如果變藍，則說明抗體不足，再不斷的增加抗體量，直至膠體金顏色不變?yōu)闇剩诖嘶A上，將此抗體量增加50-100％，此時為適宜單抗量。用此適宜單抗量進行膠體金標記，所得膠體金探針無沉淀、無非特異性吸附，達到實驗標準。
實施例3.
所述的滲透壓小于360mOsm/Kg的低滲液A液，其組成為蒸餾水；或自來水；或pH 7.0-7.6的磷酸鹽緩沖液；或pH 7.0-7.6的Tris-氯化鈉緩沖液。
本發(fā)明的低滲液，滲透壓小于360mOsm/Kg，其滲透壓低于淡水動物——螯蝦血滲透壓389-410mOsm/Kg，也低于海水動物——中國對蝦血滲透壓600mOsm/Kg。從蝦血中分離出的白斑癥病毒其囊膜完整，因而，蝦血為白斑癥病毒的等滲液，因白斑癥病毒的囊膜類似于生物膜，在低滲液中，在滲透壓的作用下，囊膜外的水分進入囊膜內(nèi)，致使囊膜漲破。白斑癥病毒的囊膜在滲透壓小于360mOsm/Kg的液體中，囊膜均漲破，見圖1。自來水滲透壓為39mOsm/Kg，蒸餾水滲透壓為30mOsm/Kg。
實施例4.
所述的分別分泌單抗E和D的兩株雜交瘤細胞，其制備方法如下(1)抗原的制備取蝦白斑綜合癥病蝦腮稱重與A液1∶10勻漿，提取病毒，得裸露核衣殼的白斑癥病毒液，見圖1，4℃?zhèn)溆茫?2)用上述(1)步提純的病毒液為抗原，免疫Balb/c小白鼠；(3)將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞的融合，培養(yǎng)得520株雜交瘤細胞；(4)采用間接免疫熒光法篩選出抗白斑癥病毒的陽性雜交瘤細胞株；(5)采用有限稀釋法對其中30株陽性雜交瘤細胞進行了克隆；(6)通過免疫電鏡，篩選出抗白斑癥病毒囊膜單抗E和抗白斑癥病毒核衣殼單抗D用于金標記。見圖2、圖3。
實施例5.
所述的白斑癥病毒快速檢測試劑盒的檢測使用方法，所述的白斑癥病毒的檢測步驟1)取待檢蝦鰓稱重，與A液按1∶10(W/V)的比例混合，加少量石英砂用研缽研磨、勻漿1分鐘，再沉降5-10分鐘，取上清作為檢測樣品，待檢，見圖1；2)取上述檢測樣品2μl，滴入孔中硝酸纖維膜上，形成直徑2mm的點，晾干；3)加入100μl的C液(含有1％牛血清白蛋白、0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液)，滲入；4)加入100μl的B液，滲入；5)再加入100μl的D液(0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液)，滲入；6)檢測結果硝酸纖維膜(孔徑為0.45μm)上出現(xiàn)紅色斑點的為陽性，無紅色斑點的為陰性。陽性代表檢測樣品中有病毒，陰性則無，見圖4。
實施例6.
本發(fā)明的白斑癥病毒快速檢測試劑盒的檢測使用方法的重復性與穩(wěn)定性測定1)本發(fā)明的白斑癥病毒快速檢測試劑盒的檢測使用重復性實驗選擇2種樣品，其分別是患白斑癥病的蝦鰓，正常蝦鰓。用同一批次的膠體金標記抗白斑癥病毒的單克隆抗體探針檢測患白斑癥病的蝦鰓樣品為陽性，正常蝦鰓樣品為陰性。同樣樣品，用五個不同批次的膠體金標記抗白斑癥病毒的單克隆抗體探針檢測結果同上。
2)穩(wěn)定性實驗將本專利的白斑癥病毒快速檢測試劑盒中的試劑放入4℃與室溫下，每5天用室溫下存放的該快速檢測試劑盒試劑檢測以上2種樣品一次，每30天用4℃下存放的該快速檢測試劑盒試劑檢測以上2種樣品一次。結果4℃下存放的該快速檢測試劑盒試劑有效期12個月。室溫下存放的該快速檢測試劑盒試劑有效期30天。
實施例7.
本發(fā)明的白斑癥病毒快速檢測試劑盒的檢測結果與斑點免疫印跡法比較，見表2表2 斑點免疫滲濾法與斑點免疫印跡比較

注++較強陽性；+陽性；-陰性。
檢測樣品液為含10％(W/V)蝦鰓的A液，勻漿液后得到的上清液。
結果其靈敏度與斑點免疫印跡法相同。
本領域的普通技術人員都會理解，在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明所用儀器及試劑冰凍切片機(購自LEICA公司)；熒光顯微鏡(購自O1YMPUS公司)；倒置相差顯微鏡(購自O1YMPUS公司)；氯金酸(購自中國上海試劑一廠，批號85-01-02，分析純)；1640(購自GIBCO公司)；胎牛血清(購自HYCLONE公司)；HAT(購自GIBCO公司)；異硫氰酸熒光素標記的羊抗小鼠IgG抗體(購自SIGMA公司)；牛血清白蛋白(購自SIGMA公司)；硝酸纖維素膜(購自PALL公司)；堿性磷酸酶標記羊抗小鼠血清(購自SIGMA公司)；堿性磷酸酶標記親和素(購自SIGMA公司)；NBT-BCIP(購自SIGMA公司)；二甲亞砜(購自SIGMA公司)。
權利要求
1.一種白斑癥病毒快速檢測試劑盒，其包括充墊在盒內(nèi)的吸水材料和硝酸纖維素膜組成的檢測裝置；C液含牛血清白蛋白的吐溫-磷酸鹽緩沖液；D液吐溫-磷酸鹽緩沖液；其特征在于；該試劑盒還包括A液滲透壓小于360毫滲克分子/公斤的低滲液；B液金標抗白斑癥病毒的單克隆抗體探針，該單抗探針是經(jīng)過膠體金標記的兩種單抗按一定的比例配制而成；該兩種單抗是由兩株雜交瘤細胞分別分泌的抗白斑癥病毒囊膜單抗E和抗白斑癥病毒核衣殼單抗D(簡稱為單抗E和D)；該兩株雜交瘤細胞的保藏號分別為CCTCC-C200421和CCTCC-C200422。
2.根據(jù)權利要求1所述白斑癥病毒快速檢測試劑盒，其特征在于所述的兩種單抗E和D的膠體金標記方法為(1)膠體金的制備18-20納米膠體金顆粒制備，將氯金酸溶液與檸檬酸鈉混合，加熱制成膠體金溶液。用碳酸鉀將該膠體金溶液的pH值調(diào)至8.2-8.3，備用；(2)金標抗體的制備將適當量的單抗E和D分別加入到上述(1)的膠體金溶液中，慢攪10分鐘，加入牛血清白蛋白，4℃過夜；然后將其在4℃下，18000g離心110分鐘；取離心沉淀，用含有牛血清白蛋白、疊氮鈉的吐溫-磷酸鹽緩沖液懸起，制成金標單抗E和D；該金標單抗E和D按一定的比例配制成金標單抗探針B液，4℃保存。
3.根據(jù)權利要求2所述白斑癥病毒快速檢測試劑盒，其特征在于所述適量的單抗E和D，是指單抗?jié)舛葹?.5克/升時，每毫升膠體金標記的單抗量為15-20微升。
4.根據(jù)權利要求1所述白斑癥病毒快速檢測試劑盒，其特征在于所述的滲透壓為小于360毫滲克分子/公斤的低滲液A液，其組成為蒸餾水；或自來水；或pH 7.0-7.6的磷酸鹽緩沖液；或pH 7.0-7.6的Tris-氯化鈉緩沖液。
5.根據(jù)權利要求1所述對蝦白斑綜合癥病原快速檢測試劑盒，其特征在于所述的分別分泌單抗E和D的兩雜交瘤細胞，其制備方法如下(1)抗原的制備取蝦白斑綜合癥病蝦腮稱重與A液1∶10勻漿，提取病毒，得裸露核衣殼的白斑癥病毒液，4℃?zhèn)溆茫?2)用上述(1)步提純的病毒液為抗原，免疫Balb/c小白鼠；(3)將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞的融合，培養(yǎng)得520株雜交瘤細胞；(4)采用間接免疫熒光法篩選出抗白斑癥病毒的陽性雜交瘤細胞株；(5)采用有限稀釋法對其中30株陽性雜交瘤細胞進行了克??；(6)通過免疫電鏡，篩選出抗白斑癥病毒的單抗E和D用于金標記。
6.權利要求1所述白斑癥病毒快速檢測試劑盒的檢測使用方法，其特征在于所述的檢測使用方法的步驟(1)取待檢蝦鰓稱重，與A液按1∶10(W/V)的比例混合，勻漿，再沉降5-10分鐘，取上清作為檢測樣品，待檢；(2)取上述檢測樣品2微升，經(jīng)檢測裝置孔滴在硝酸纖維素膜上，形成直徑約2毫米的樣品點，晾干；(3)加入C液，滲入；(4)加入B液，滲入；(5)再加入D液，滲入；(6)檢測結果硝酸纖維素膜上出現(xiàn)紅色斑點的為陽性，無紅色斑點的為陰性；陽性代表檢測樣品中有白斑癥病毒，陰性則無該病毒。
全文摘要
本發(fā)明是白斑癥病毒快速檢測試劑盒，包括檢測裝置；含牛血清白蛋白的吐溫－磷酸鹽緩沖液；吐溫－磷酸鹽緩沖液；低滲液；金標記抗白斑癥病毒的單克隆抗體探針，該探針是經(jīng)過膠體金標記的兩種單抗E和D按比例配制而成；該兩種單抗E和D是由兩株雜交瘤細胞分別分泌的抗白斑癥病毒囊膜的單抗E和抗白斑癥病毒核衣殼單抗D；該兩株雜交瘤細胞的保藏號分別為CCTCC－C200421和CCTCC－C200422。兩該單抗E和D作為檢測抗體同時使用時，可明顯提高檢測的靈敏度。檢測反應只需3分鐘并且不需孵育及任何儀器設備，其檢測的靈敏度與斑點免疫印跡法相同。該試劑盒具有簡便、快速、準確、現(xiàn)場、無假陽性等特點。
文檔編號G01N33/569GK1641354SQ200410075530
公開日2005年7月20日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權日2004年12月17日
發(fā)明者戰(zhàn)文斌, 王曉潔 申請人:中國海洋大學