專(zhuān)利名稱(chēng)：定量的快速水平側(cè)流方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種定性和定量的快速水平側(cè)流方法及系統(tǒng)，適用于分析生物標(biāo)本中(尤其是含全血、或紅細(xì)胞、或白細(xì)胞或其它細(xì)胞的生物標(biāo)本)的待檢物質(zhì)，以得到定性或定量的分析結(jié)果。
背景技術(shù)：
定量、快速、靈敏的診斷方法是當(dāng)今日益普及的“床前及時(shí)診斷”(Point of care test，POCT)的發(fā)展方向。而真正的“快速”要求對(duì)待檢標(biāo)本不做任何處理直接檢測(cè)。然而，生物學(xué)標(biāo)本中多含細(xì)胞，比如血液含有大量的紅細(xì)胞、白細(xì)胞及其它類(lèi)型的細(xì)胞，在實(shí)施檢測(cè)前往往要求耗時(shí)的分離步聚，以去除待檢標(biāo)本中的細(xì)胞。而且，由于個(gè)體之間紅細(xì)胞比積的差異，使相同體積的全血可因不同的紅細(xì)胞比積得到不同體積的血漿/血清體積，即可能使結(jié)果因加樣量不同有所差異。另一方面，自80年代問(wèn)世的，基于毛細(xì)管層析原理(水平側(cè)流)的快速免疫檢測(cè)方法(快速檢測(cè)試紙條)逐漸普及，被廣泛應(yīng)用于早孕、吸毒、傳染病的早期診斷。這些檢測(cè)試紙多用于已去除了細(xì)胞的生物標(biāo)本，只做定性檢測(cè)。
要求任何水平側(cè)流系統(tǒng)與方法真正可以應(yīng)用于快速定量檢測(cè)，必須滿(mǎn)足以下條件1、可以自動(dòng)地分離待檢標(biāo)本中的細(xì)胞；2、可在短時(shí)間內(nèi)(5～60分鐘)實(shí)現(xiàn)在液態(tài)才能完成的生化反應(yīng)；3、檢測(cè)結(jié)果滿(mǎn)足特定的用不含細(xì)胞的樣本(如血漿和血清)同樣的靈敏度和特異性要求；4、檢測(cè)方法相對(duì)地不受標(biāo)本中紅細(xì)胞比積的影響，即相對(duì)體積非依賴(lài)性。
5、可以規(guī)模性生產(chǎn)。
已有許多嘗試建立可用于全血檢測(cè)的快速水平側(cè)流方法(例如美國(guó)專(zhuān)利US 6,136,610；美國(guó)專(zhuān)利US6,528,323，WO03/3008933，美國(guó)專(zhuān)利US 5,766,552等)，但都因不能同時(shí)滿(mǎn)足以上條件而失敗。它們或者不能有效地阻隔細(xì)胞，使紅細(xì)胞漏出或溶血，造成背景(本底)過(guò)高不能滿(mǎn)足靈敏度/特異性要求；或者因液體標(biāo)本的過(guò)濾效率過(guò)低，使其體積過(guò)少而不足以完成所需生化反應(yīng)；或者因過(guò)濾速度過(guò)慢而不能在短時(shí)間內(nèi)完成快速檢測(cè)；或者因其檢測(cè)方法本身要求嚴(yán)格的體積依賴(lài)性，而不能克服個(gè)體全血標(biāo)本中紅細(xì)胞比積差異的困難；或者并未探討/闡述其工作原理，使其結(jié)果的可重復(fù)性及其結(jié)構(gòu)的可規(guī)模性生產(chǎn)性受到質(zhì)疑。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述的缺陷，本發(fā)明的主要目的在于提供一種可以用于全血的，或其它含細(xì)胞生物標(biāo)本的定量/定性的快速水平側(cè)流方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種可以用于全血的，或其它含細(xì)胞生物標(biāo)本的定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種定量的快速水平側(cè)流方法，用生化反應(yīng)的平臺(tái)，實(shí)施對(duì)不限于人類(lèi)待檢的液態(tài)生物標(biāo)本作各種待檢項(xiàng)目，用過(guò)濾結(jié)構(gòu)阻隔液態(tài)標(biāo)本中所含的細(xì)胞，得到完成其生化反應(yīng)所需的液體體積；并通過(guò)該平臺(tái)結(jié)構(gòu)，形成有效的毛細(xì)管層析壓差，使已過(guò)濾的液體及溶解于其中的待檢物質(zhì)在該平臺(tái)上經(jīng)毛細(xì)管層析作用定向流動(dòng)；并根據(jù)生化反應(yīng)中待檢物質(zhì)和對(duì)照物質(zhì)所產(chǎn)生的可被檢測(cè)的光密度判斷檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明方法的生化反應(yīng)的平臺(tái)由測(cè)試條和測(cè)試盒外殼組成，測(cè)試條的結(jié)構(gòu)具有兩端并以保證有效的細(xì)胞過(guò)濾、毛細(xì)管層析和生化反應(yīng)；以測(cè)試盒外殼保證液態(tài)生物標(biāo)本的加樣結(jié)果的觀察和測(cè)試條物理結(jié)構(gòu)的固定；其生物標(biāo)本可加在測(cè)試盒外殼上兩端加樣口的任一端或兩端。
本發(fā)明方法的測(cè)試條的細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)由單層或多層不同孔徑的過(guò)濾膜組成，其直接與樣本中細(xì)胞接觸的過(guò)濾膜孔徑小于待阻隔的細(xì)胞直徑。
本發(fā)明方法的測(cè)試條的細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)使用了雙面膠，促使濾過(guò)液體朝預(yù)設(shè)方向呈優(yōu)勢(shì)流動(dòng)。
本發(fā)明方法的測(cè)試條的細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)與毛細(xì)管層析壓差要求保持一致，以保證有效的液體濾過(guò)及層析過(guò)程中的液體流速。
本發(fā)明方法的細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)，與毛細(xì)管層析壓差要求一致，由具有不同孔徑、毛細(xì)引力的膜材料，組建細(xì)胞過(guò)濾——層析試紙條，使含細(xì)胞的液態(tài)待檢生物標(biāo)本在過(guò)濾中體積損失最少，并在被物理過(guò)濾后，液體在被收集原點(diǎn)處毛細(xì)管層析壓差小于生化反應(yīng)區(qū)，從而使過(guò)濾后的液體受毛細(xì)引力驅(qū)動(dòng)在測(cè)試層析條上定向移動(dòng)。
本發(fā)明方法的細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)，可用使待過(guò)濾細(xì)胞聚集的化學(xué)試劑預(yù)處理過(guò)濾膜，使待過(guò)濾物因聚集而體積增大，而提高過(guò)濾膜對(duì)細(xì)胞的阻隔效果。
本發(fā)明方法使待過(guò)濾細(xì)胞聚集的化學(xué)試劑采用抗紅細(xì)胞抗體或植物蛋白凝集素，抗紅細(xì)胞抗體針對(duì)紅細(xì)胞膜表面暴露的抗原決定簇可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
本發(fā)明方法用抗紅細(xì)胞抗體預(yù)處理過(guò)濾膜是包括用表面活性劑Tween-20處理膜以增加抗體對(duì)過(guò)濾膜的吸附。
本發(fā)明方法的測(cè)試條的毛細(xì)管層析壓差來(lái)自于組裝測(cè)試條的材料及其組裝結(jié)構(gòu)；根據(jù)生化檢測(cè)項(xiàng)目要求，含細(xì)胞的液態(tài)生物標(biāo)本可加樣在測(cè)試盒的任一端或兩端；不同的加樣方式有不同的細(xì)胞過(guò)濾-層析-生化反應(yīng)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明方法的待檢液態(tài)生物標(biāo)本是含細(xì)胞的全血，但不限于全血標(biāo)本；含細(xì)胞的待檢液態(tài)生物標(biāo)本可含抗凝劑或不含抗凝劑，在經(jīng)過(guò)反應(yīng)平臺(tái)的過(guò)濾結(jié)構(gòu)后得到的液體體積滿(mǎn)足生化反應(yīng)所需。
本發(fā)明方法的生化反應(yīng)過(guò)程利用了雙向水平側(cè)流降低生化反應(yīng)中的背景；并以生化反應(yīng)中待檢物與對(duì)照物所產(chǎn)生的光密度值之比的相對(duì)光密度值RI分析檢測(cè)結(jié)果，而提高檢測(cè)的靈敏度，減少盒間差，使檢測(cè)結(jié)果為相對(duì)地非體積依賴(lài)性。
本發(fā)明方法的生化反應(yīng)利用膠體金顆?；蜚y顆粒、或熒光染料、或其它產(chǎn)生可被光反射原理檢測(cè)的光密度的材料作為標(biāo)記物，使生化反應(yīng)的結(jié)果可通過(guò)待檢物和對(duì)照物產(chǎn)生的光密度之比被測(cè)定。
本發(fā)明方法的生化反應(yīng)是基于免疫學(xué)原理的，但不限于免疫學(xué)原理的大分子間結(jié)合關(guān)系的檢測(cè)，用于檢測(cè)人類(lèi)，但不限于人類(lèi)液態(tài)標(biāo)本中的大分子，如抗原、抗體、多糖、核酸、多肽、病原微生物等。
本發(fā)明還提供一種定量/定性的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，用生化反應(yīng)的平臺(tái)，實(shí)施對(duì)不限于人類(lèi)待檢的液態(tài)生物標(biāo)本作各種待檢項(xiàng)目，生化反應(yīng)的平臺(tái)由測(cè)試條和測(cè)試盒外殼組成，測(cè)試條的結(jié)構(gòu)具有兩端并以保證有效的細(xì)胞過(guò)濾、毛細(xì)管層析和生化反應(yīng)；生物標(biāo)本可加在外殼上兩端加樣口的任一端或兩端。
本發(fā)明系統(tǒng)的細(xì)胞過(guò)濾-層析-生化反應(yīng)結(jié)構(gòu)，各組之間按序部分或全部重疊；其重疊部分為0.1～20毫米。
本發(fā)明系統(tǒng)的細(xì)胞過(guò)濾-層析-生化反應(yīng)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞過(guò)濾膜為疏水性的玻璃纖維(但不限於玻璃纖維)或親水的混合纖維。
本發(fā)明系統(tǒng)的液態(tài)生物標(biāo)本經(jīng)過(guò)濾后的液體收集膜為疏水性玻璃纖維(但不限於玻璃纖維)或親水的混合纖維，并具有不小于細(xì)胞過(guò)濾膜的孔徑。
本發(fā)明系統(tǒng)的液態(tài)生物標(biāo)本經(jīng)過(guò)濾后的液體收集膜孔徑與過(guò)濾膜孔徑之比＞1。
本發(fā)明系統(tǒng)的生化反應(yīng)所需的標(biāo)記物如膠體金被預(yù)包被并干燥于疏水的玻璃纖維(但不限於玻璃纖維)上，位于層析條的一端；膠體金在層析條上所處位置的層析壓差在膠體金被溶解釋放時(shí)低于生化反應(yīng)的反應(yīng)區(qū)，故膠體金可以包被原點(diǎn)向生化反應(yīng)區(qū)定向移動(dòng)。
本發(fā)明系統(tǒng)的生化反應(yīng)區(qū)由親水性的硝基纖維素膜(但不限於硝基纖維素膜)組成，并具有在雙向水平測(cè)流的第一次液體流動(dòng)時(shí)，在本結(jié)構(gòu)中最高的毛細(xì)引力，使液體從加樣區(qū)或液體收集區(qū)向其反應(yīng)區(qū)定向移動(dòng)。
本發(fā)明系統(tǒng)的層析條的另一端，相對(duì)應(yīng)于化學(xué)偶合物墊的位置安裝有親水性的吸水墊片，其作用是在硝基纖維素膜已被浸濕，吸水能力下降膠體金溶解后，以其高度吸水能力提供促使液體從膠體金端向吸水墊片端定向移動(dòng)所需的毛細(xì)管層析壓差。
當(dāng)含細(xì)胞的液態(tài)生物標(biāo)本加樣在吸水墊片一端時(shí)，其細(xì)胞過(guò)濾膜與硝基纖維素膜直接接觸但不與吸水墊片接觸；當(dāng)含細(xì)胞的液態(tài)生物標(biāo)本加樣在膠體金一端時(shí)，其細(xì)胞過(guò)濾膜與液體收集膜部分與全部接觸，但不與化學(xué)偶合物墊直接接觸；當(dāng)含細(xì)胞液態(tài)生物標(biāo)本同時(shí)或分別加樣于兩端加樣口時(shí)，其細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)為分別加樣時(shí)的結(jié)合。
本發(fā)明系統(tǒng)的液態(tài)生物標(biāo)本經(jīng)過(guò)濾后的液體收集膜使同一種試紙條結(jié)構(gòu)既可用于免疫間接法檢測(cè)，又可用于免疫夾心法檢測(cè)。
本發(fā)明定量的快速水平側(cè)流方法與系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)相比，通過(guò)生化反應(yīng)平臺(tái)上的過(guò)濾結(jié)構(gòu)阻隔液態(tài)標(biāo)本中所含有的細(xì)胞以得到所需的體積，并形成有效的毛細(xì)管層析壓差，使待測(cè)物質(zhì)經(jīng)毛細(xì)管層析作用定向流動(dòng)；并根據(jù)待檢物質(zhì)和對(duì)照物質(zhì)所產(chǎn)生的可被檢測(cè)的光密度判斷檢測(cè)結(jié)果，從而本發(fā)明可用于對(duì)全血的，或其它含細(xì)胞生物標(biāo)本進(jìn)行定量/定性、快速的檢測(cè)，且實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)體積非依賴(lài)性，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明下面結(jié)合附圖，通過(guò)對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例的詳細(xì)描述，將使本發(fā)明的技術(shù)方案及其它有益效果顯而易見(jiàn)。
附圖中，

圖1是本發(fā)明的測(cè)試盒上蓋的俯視圖。
圖2是本發(fā)明的測(cè)試盒下蓋的立體圖。
圖3是本發(fā)明的測(cè)試條與測(cè)試盒工作原理俯視圖。
圖4是本發(fā)明的雙向水平側(cè)流測(cè)試條工作原理圖。
圖5是本發(fā)明的測(cè)試盒的端口1加樣時(shí)測(cè)試條結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖。
圖6是本發(fā)明的測(cè)試盒的端口2加樣時(shí)測(cè)試條結(jié)構(gòu)側(cè)視圖。
圖7是本發(fā)明的測(cè)試盒的端口1和端口2兩端加樣時(shí)測(cè)試條結(jié)構(gòu)側(cè)視圖。
圖8是本發(fā)明的測(cè)試盒的端口2加樣時(shí)測(cè)試條的毛細(xì)管壓差。
圖9是本發(fā)明過(guò)濾結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)圖(含有雙面膠)。
圖10是本發(fā)明過(guò)濾結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)圖(不含有雙面膠)。
具體實(shí)施例方式
下文，將詳細(xì)描述本發(fā)明。
本發(fā)明對(duì)待檢標(biāo)本中的紅細(xì)胞(或其它細(xì)胞)的分離是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的采用特殊結(jié)構(gòu)水平側(cè)流的測(cè)試盒作為生化平臺(tái)，實(shí)施對(duì)不限于人類(lèi)待檢的液態(tài)生物標(biāo)本(例如不限于人類(lèi)液態(tài)標(biāo)本中的大分子的抗原、抗體、多糖、核酸、多肽、病原微生物等)作各種待檢項(xiàng)目。該測(cè)試盒由測(cè)試條和外殼組成，如圖1至圖2所示，測(cè)試盒外殼由上蓋和下蓋組成，上蓋提供樣本/緩沖液加樣端口1和端口2以及用于觀察檢測(cè)結(jié)果的觀測(cè)窗3，其中端口1在雙向免疫層析檢測(cè)中用作樣本的加樣端口，端口2在雙向免疫層析檢測(cè)中用作樣本或緩沖液的加樣端口；下蓋提供測(cè)試條的承載平臺(tái)，以保證測(cè)試條物理結(jié)構(gòu)的固定及毛細(xì)管層析過(guò)程。測(cè)試盒的上、下蓋及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)可通過(guò)對(duì)塑膠模具設(shè)計(jì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，并用于規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明的測(cè)試條提供細(xì)胞過(guò)濾、毛細(xì)管層析及檢測(cè)所需的生化反應(yīng)的平臺(tái)。如圖3～4所示，該測(cè)試條的端口1處設(shè)有吸水墊片16；測(cè)試條的端口2處設(shè)有化學(xué)偶合物墊12，該化學(xué)偶合物墊12含有膠體金偶合的抗體或抗原，也可采用銀顆粒、或熒光染料、或其它產(chǎn)生可被光反射原理檢測(cè)的光密度的材料作為標(biāo)記物；測(cè)試條的中間處設(shè)有兩條對(duì)照帶4，兩條對(duì)照帶4中間設(shè)有一測(cè)試帶5，對(duì)照帶4和測(cè)試帶5的位置對(duì)應(yīng)于測(cè)試盒外殼的觀察窗3，以方便使用者觀察。
根據(jù)待檢項(xiàng)目的不同要求，含細(xì)胞的樣本(如全血)可加在加樣端口1或端口2，或按序加在端口1和端口2兩端，通過(guò)測(cè)試條的特殊過(guò)濾結(jié)構(gòu)，如圖5～7所示，使細(xì)胞(如紅細(xì)胞)因體積大于過(guò)濾孔徑而被阻擋在生化反應(yīng)區(qū)之外，利用具有特殊的過(guò)濾孔徑的膜(請(qǐng)見(jiàn)參考資料1和3)和可使細(xì)胞聚集(如抗紅細(xì)胞抗體)的化學(xué)物質(zhì)(請(qǐng)見(jiàn)參考資料2)，使待過(guò)濾細(xì)胞被有效地阻隔在加樣原點(diǎn)，而樣本中的小于該孔徑的物質(zhì)(如血漿或血清以及溶解在其中的待檢物質(zhì))可被有效濾過(guò)。
本發(fā)明對(duì)快速的(5～60分鐘)、在液態(tài)狀態(tài)完成的生化反應(yīng)是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的生化反應(yīng)在測(cè)試條上進(jìn)行。根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的要求，樣本可加在端口1或端口2的一端或端口1和端口2兩端。測(cè)試條的材料及特定結(jié)構(gòu)提供了有效的毛細(xì)管層析所需的壓差，使液態(tài)樣本可以在測(cè)試條上定向流動(dòng)。在本系統(tǒng)中當(dāng)含有細(xì)胞的樣本(如全血)加入端口1后，因過(guò)濾作用使細(xì)胞留在加樣原點(diǎn)，僅液體濾過(guò)。此時(shí)，如圖5所示，測(cè)試條的底部為支撐墊片14(5×60毫米)，其為一種塑料墊片，用以物理支撐測(cè)試條各層次之間的結(jié)構(gòu)；支撐墊片14上設(shè)有作為反應(yīng)平臺(tái)的硝基纖維素膜13(5×48毫米)，其為親水性，其上包被有對(duì)照試劑(即對(duì)照帶4)，以及與液態(tài)生物標(biāo)本中待檢物質(zhì)反應(yīng)的試劑(即測(cè)試帶5)，構(gòu)成測(cè)試條的生化反應(yīng)區(qū)；硝基纖維素膜13在端口2處設(shè)有化學(xué)偶合物墊12(5×13毫米)，其為疏水性玻璃纖維，膠體金包被其上，并與硝基纖維素膜13重疊3mm；化學(xué)偶合物墊12上設(shè)有緩沖液墊11(5×12毫米)，其為親水性混合纖維，用以吸收加入端口2的樣本或緩沖液；硝基纖維素膜13在端口1處設(shè)有吸水墊片16，其為親水性混合纖維，用于構(gòu)建雙向水平側(cè)流中第二次側(cè)流所需的毛細(xì)管層析壓差，并吸收多余的液體；硝基纖維素膜13上靠近吸水墊片16處用雙面膠17粘貼有過(guò)濾膜15(5×7.5毫米)，還可由單層或多層不同孔徑的過(guò)濾膜組成過(guò)濾結(jié)構(gòu)，過(guò)濾膜15由親水性混合纖維或親水性混合纖維制得，取代樣本墊，經(jīng)0.25毫克/毫升兔抗人紅細(xì)胞抗體或0.5毫克/毫升鼠抗人紅細(xì)胞抗體預(yù)處理，用于阻隔加樣于端口1的全血樣品中的紅細(xì)胞并過(guò)濾血漿/血清；雙面膠17(5×5毫米)，不具有通透性，在全血檢測(cè)中可促使濾過(guò)的血漿樣本向端口2流動(dòng)。其中，各結(jié)構(gòu)之間以按序部分/全部重疊的方式結(jié)合，其重疊部分為0.1～20毫米，并可以手工或機(jī)械化的過(guò)程實(shí)現(xiàn)。
由于將端口2的毛細(xì)管層析壓差設(shè)置為高于端口1，并且過(guò)濾膜15與做為反應(yīng)平臺(tái)的硝基纖維素膜13之間的雙面膠17部分破壞與之接觸的硝基纖維素膜13，因雙面膠17不具有通透性，當(dāng)粘貼到硝基纖維素膜13時(shí)，使硝基纖維素膜13與之接觸部位毛細(xì)管部分被破壞，從而使接觸部分的虹吸功能部分喪失，導(dǎo)致從硝基纖維素膜13與雙面膠17接觸部位開(kāi)始，硝基纖維素膜13的端口2端的虹吸力大于硝基纖維素膜13的吸水墊片16端的虹吸力，促使樣本更快、更多地向端口2端移動(dòng)。同時(shí)，雙面膠17的右端(靠吸水墊片16端)與過(guò)濾膜15的右端(靠吸水墊片16端)平齊，這樣阻斷了過(guò)濾膜15濾過(guò)的樣本直接流向吸水墊片16端，也促使濾過(guò)樣本向端口2端移動(dòng)。如圖4所示，液體樣本從端口1向端口2流動(dòng)；途經(jīng)預(yù)先包被在測(cè)試帶5上的可與待檢物質(zhì)產(chǎn)生生化反應(yīng)的抗原或抗體，形成免疫復(fù)合物(第一次水平側(cè)流A)。所述的測(cè)試條的端口2包被有以膠體金偶聯(lián)的，可與待檢物質(zhì)，或已在測(cè)試帶5上形成的免疫復(fù)合物產(chǎn)生生化反應(yīng)的抗原或抗體；以及已偶聯(lián)的，可與觀測(cè)窗3區(qū)預(yù)包被的對(duì)照物質(zhì)反應(yīng)的抗原或抗體。此時(shí)測(cè)試條已被第一次水平側(cè)流A的液體浸濕，安置在端口1的吸水墊片16使端口1的毛細(xì)管層析壓差高于端口2，當(dāng)液態(tài)樣本或緩沖液加入端口2，溶解化學(xué)偶合物12，通過(guò)毛細(xì)管壓差從端口2向端口1流動(dòng)(第二次水平側(cè)流B)，途經(jīng)觀察窗3；已溶解的端口2化學(xué)偶合物12中可與預(yù)包被的對(duì)照物質(zhì)和/或已形成的免疫復(fù)合物產(chǎn)生生化反應(yīng)而沉積在反應(yīng)原點(diǎn)。第二次水平側(cè)流B中生化反應(yīng)產(chǎn)生的沉積物中含有膠體金，膠體金的紅色在沉積入形成可見(jiàn)的條帶或區(qū)域；測(cè)試條的端口1的吸水墊片16吸收第二次水平側(cè)流B反應(yīng)中多余的液體。以上過(guò)程稱(chēng)為雙向水平側(cè)流。
如圖6所示，當(dāng)含有細(xì)胞的樣本(如全血)加入端口2時(shí)，因過(guò)濾作用使細(xì)胞留在加樣原點(diǎn)，僅液體及溶于液體的待檢物質(zhì)可以濾過(guò)。與圖5不同的是，化學(xué)偶合物墊12上設(shè)有具有過(guò)濾功能的液體收集墊18(5×10毫米)，該液體收集墊18上還設(shè)有過(guò)濾膜15。該液體收集墊18為疏水性玻璃纖維，但未包被膠體金標(biāo)記的試劑，經(jīng)0.25毫克/毫升兔抗人紅細(xì)胞抗體或0.5毫克/毫升鼠抗人紅細(xì)胞抗體預(yù)處理，用于收集加樣于端口2的經(jīng)過(guò)濾膜15過(guò)濾后的血漿/血清，且該液體收集墊18與化學(xué)偶合物墊12重迭3毫米?？稍诩訕忧耙跃彌_液加入端口1，以浸濕測(cè)試條。如前所述，端口2含有已預(yù)先包被并干燥的化學(xué)偶合物12，需要足夠量體積的液體對(duì)其進(jìn)行溶解。為減少樣本體積的損失，選擇疏水性膜材料進(jìn)行過(guò)濾(見(jiàn)參考資料3)。由于毛細(xì)管工作層析要求一定的壓差，故需保證過(guò)濾后液體集中處化學(xué)偶合物墊12與測(cè)試帶5上化學(xué)反應(yīng)處的硝基纖維素膜13之間的毛細(xì)管工作層析壓差化學(xué)偶合物墊＞硝基纖維素膜，才能使液體從端口2向端口1流動(dòng)，因此選用毛細(xì)管層析能力(Capillary Rise)低于硝基纖維素膜13的材料(見(jiàn)參考資料3)構(gòu)成端口2過(guò)濾結(jié)構(gòu)。如前所述，此時(shí)測(cè)試條已被緩沖液浸濕，端口1的吸水墊片16使端口1的毛細(xì)管層析壓差高于硝基纖維素膜13，從而形成測(cè)試條上毛細(xì)管工作層析壓差液體收集墊＞化學(xué)偶合物墊＞硝基纖維素膜的結(jié)構(gòu)，如圖8所示。又由于檢測(cè)要求在短時(shí)間內(nèi)完成，故需要液體高效地從端口2→端口1的流動(dòng)速率，故選用孔徑大于細(xì)胞過(guò)濾膜的材料作為液體收集墊以保證液體在過(guò)濾后有效地從化學(xué)偶合物墊12向硝基纖維素膜13方向?yàn)V過(guò)(見(jiàn)參考資料3)，因此，液體收集墊的膜孔徑與過(guò)濾膜孔徑之比要求＞1。
如圖7所示，當(dāng)含細(xì)胞的樣本(如全血)同時(shí)或相繼加入端口1和端口2時(shí)，其與圖5不同的是，化學(xué)偶合物墊12上設(shè)有具有過(guò)濾功能的液體收集墊18，且液體收集墊18上還設(shè)有過(guò)濾膜15。該結(jié)構(gòu)同時(shí)滿(mǎn)足當(dāng)含細(xì)胞樣本分離加入端口1和端口2時(shí)的條件有效過(guò)濾細(xì)胞；最少量的液體體積損失；有效的毛細(xì)管層析壓差；有效的液體流速。
本發(fā)明對(duì)保證特定檢測(cè)項(xiàng)目得到用不含細(xì)胞的樣本(如血清或血漿)同樣的靈敏度和特異性的要求是通過(guò)以下方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的靈敏度指某特定檢測(cè)項(xiàng)目的可被檢定的陽(yáng)性最低限閾值，代表出現(xiàn)漏診(假陰性)的可能性；特異性指某特定檢測(cè)項(xiàng)目按預(yù)設(shè)的陰性最高限閾值判斷，出現(xiàn)誤診(假陽(yáng)性)的機(jī)率。因此，可靠的檢測(cè)是在保證最低的漏診率(假陰性)條件下避免出現(xiàn)誤診(假陽(yáng)性)，即確定陽(yáng)性最低限閾值是關(guān)鍵。陽(yáng)性最低閾值的確定除了檢測(cè)技術(shù)本身的之外，最大的影響因素是檢測(cè)系統(tǒng)中的背景(本底)；在本系統(tǒng)毛細(xì)管層析的水平側(cè)流測(cè)試條上，則為樣本在檢測(cè)區(qū)形成的背景著色。在本系統(tǒng)中，采用了雙向水平側(cè)流方法，使樣本加在端口1時(shí)，流經(jīng)硝基纖維素膜13區(qū)形成的背景著色(例如紅細(xì)胞漏出或溶血造成的紅色)可被第二次水平側(cè)流時(shí)加入端口2的緩沖液洗滌而降低本底(見(jiàn)附圖4)。當(dāng)含細(xì)胞樣本(如全血)加樣在端口2，或同時(shí)或相繼加在端口1和端口2兩端時(shí)(見(jiàn)附圖6、7)，由于缺少了緩沖液洗滌步驟，需加強(qiáng)細(xì)胞過(guò)濾效率，以保證紅細(xì)胞(或其它細(xì)胞)不被濾過(guò)而流經(jīng)硝基纖維素膜13區(qū)。即當(dāng)含細(xì)胞樣本(如全血)加樣在端口2或端口1和端口2兩端時(shí)，需要①雙層過(guò)濾膜；②用促細(xì)胞聚集因子(如抗紅細(xì)胞抗體或植物蛋白凝集素)預(yù)處理過(guò)濾膜，使待過(guò)濾物(如紅細(xì)胞)體積增大以提高過(guò)濾效率。抗紅細(xì)胞抗體(針對(duì)紅細(xì)胞膜表面暴露的抗原決定簇可以是單克隆抗體或多克隆抗體)與紅細(xì)胞表面的膜結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，使紅細(xì)胞聚集而使過(guò)濾效率提高。由于過(guò)濾膜15的表面疏水性質(zhì)，使抗紅細(xì)胞抗體很難吸附在過(guò)濾膜15上，故需將所使用的疏水性過(guò)濾膜15經(jīng)表面活性劑(如Tween-20)預(yù)處理，使之具有部分親水性，以便抗紅細(xì)胞抗體可以吸附在過(guò)濾膜15表面(見(jiàn)參考資料2)。
如前所述，紅細(xì)胞比積的差異將造成同體積的全血得到不同體積的血漿/血清樣本，使檢測(cè)中所加的樣本體積出現(xiàn)差異。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須保證檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)體積非依賴(lài)性。本發(fā)明對(duì)檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)體積非依賴(lài)性是通過(guò)以下方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)的最低體積要求是為了滿(mǎn)足以下條件①浸透測(cè)試條以形成液態(tài)的生化反應(yīng)條件；②溶解端口2預(yù)包被并干燥的化學(xué)偶合物。即要求在滿(mǎn)足浸透膜和溶解化學(xué)偶合物的液體體積條件下，在一定的樣本體積變化范圍內(nèi)，其檢測(cè)結(jié)果應(yīng)無(wú)明顯差異。在本系統(tǒng)中先用不含細(xì)胞的樣本(如血漿或血清)，確定某一特定檢測(cè)項(xiàng)目的最低樣本(血清或血漿)用量；在保證有效的細(xì)胞過(guò)濾和液體流速(如上所述)前提下，可以通過(guò)計(jì)算待檢的含細(xì)胞樣本(如全血)可被過(guò)濾的液體(如血漿或血清)體積，判斷含細(xì)胞樣本的最低用量，以保證過(guò)濾后參與生化反應(yīng)的樣本體積不低于檢測(cè)所需最低量。另一方面，由于本系統(tǒng)采用待檢條帶與對(duì)照帶光密度的比值(相對(duì)光密度值，RI)來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果(US專(zhuān)利6,136,610)，即檢測(cè)過(guò)程中生化條件的誤差(如樣本體積)對(duì)待檢條帶和對(duì)照帶絕對(duì)光密度值(Dr)的影響將呈同比趨勢(shì)，但不影響RI的結(jié)果，從而降低了檢測(cè)對(duì)樣本體積的依賴(lài)性，使樣本中細(xì)胞的含量對(duì)檢測(cè)結(jié)果不造成明顯的影響。
例
即在因樣本體積變化，造成絕對(duì)光密度值誤差時(shí)，仍可根據(jù)同比趨勢(shì)原理，得到準(zhǔn)確的RI的判斷結(jié)果。
實(shí)施例1全血樣本端口1過(guò)濾膜的篩選及過(guò)濾結(jié)構(gòu)(附表1、2、3、4)。
材料1、過(guò)濾膜Ahlstron Filtration(美國(guó))Grade 111玻璃纖維Grade 141和Grade 142玻璃纖維Grade 1660，Grade 1661，Grade 1662和Grade 16632、兔抗人紅細(xì)胞抗體(中國(guó)瑞泰特思)3、使用抗人紅細(xì)胞抗體預(yù)處理的過(guò)濾膜(參照程序)4、HIV(-)全血和血漿樣本5、HIV(+)全血和血漿樣本6、HIV測(cè)試盒按附圖5結(jié)構(gòu)組裝HIV抗體檢測(cè)試紙盒。
比較1、用抗人紅細(xì)胞抗體處理不同過(guò)濾膜后分離紅細(xì)胞的效果。
2、濾出的血漿在NC膜上的遷移速度。
3、全血和血漿樣本檢測(cè)HIV(+)之S/CO的差異。
結(jié)果見(jiàn)附表1、2、3和4。
結(jié)論1、僅用過(guò)濾膜不足以有效過(guò)濾紅細(xì)胞，需要加入抗人紅細(xì)胞抗體預(yù)處理過(guò)濾膜。
2、端口1應(yīng)用經(jīng)抗人紅細(xì)胞抗體處理過(guò)的不同種類(lèi)的過(guò)濾膜，均可以很好的分離紅細(xì)胞。
3、人工合成纖維(Cytosep)1663膜因孔徑過(guò)小(2微米)浸濕速度過(guò)低(35毫升/分鐘)不能有效過(guò)濾血清。
4、通過(guò)HIV試紙盒檢測(cè)，加樣本端口1的全血和血漿樣本，其檢測(cè)結(jié)果(信噪比，S/CO)相同。
附表1 未經(jīng)抗人紅細(xì)胞抗體處理全血過(guò)濾膜濾過(guò)紅細(xì)胞的效果

附表2 經(jīng)抗人紅細(xì)胞抗體預(yù)處理后的過(guò)濾膜對(duì)紅細(xì)胞過(guò)濾的效果


附表3 不同過(guò)濾膜濾除紅細(xì)胞的效果比較

附表4 端口1加樣全血和血漿的測(cè)試結(jié)果比較

實(shí)施例2端口1處加與不加雙面膠對(duì)濾過(guò)樣本流向的影響目的1、觀察不同類(lèi)型硝基纖維素膜(NC膜)端口1處加與不加雙面膠對(duì)血漿樣本流向的影響2、觀察不同類(lèi)型NC膜端口1處加與不加雙面膠對(duì)全血濾過(guò)樣本流向的影響材料1、5毫米寬×100毫米長(zhǎng)的HF135NC膜 美國(guó)MILLIPORE2、5毫米寬×100毫米長(zhǎng)的HF90NC膜 美國(guó)MILLIPORE3、5毫米×5毫米雙面膠 中國(guó)4、用有0.2毫克/毫升鼠抗人紅細(xì)胞抗體處理過(guò)的141全血樣本過(guò)濾墊(5毫米寬×7.5毫米長(zhǎng))5、30cm長(zhǎng)鋼尺中國(guó)6、正常人全血和血漿樣本 臨床獻(xiàn)血員樣本設(shè)計(jì)加樣50ul------記時(shí)------測(cè)量過(guò)濾結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)圖見(jiàn)圖9、圖10所示。
步驟1、在樣本墊上加50微升血漿，10分鐘后觀察結(jié)果并用鋼尺測(cè)量樣本流動(dòng)距離2、在樣本墊上加50微升全血，10分鐘后觀察結(jié)果并用鋼尺測(cè)量樣本流動(dòng)距離實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5

實(shí)驗(yàn)分析1、樣本墊下加雙面膠后會(huì)促使樣本向左端優(yōu)勢(shì)流動(dòng)2、加全血樣本比加血漿樣本向左端優(yōu)勢(shì)流動(dòng)更明顯實(shí)施例3全血樣本端口2加樣時(shí)的過(guò)濾膜的選擇及過(guò)濾結(jié)構(gòu)(附表6A、6B、6C)。
目的建立全血適用于加樣於端口2的最佳全血過(guò)濾結(jié)構(gòu)，以便且血可以用于雙向水平側(cè)流檢測(cè)。
材料1、全血分離膜Ahlstrom Filtering，美國(guó)GRADE CYTOSEP 目錄號(hào)1661批號(hào)2050401GRADE CYTOSEP 目錄號(hào)1660批號(hào)2050401GRADE CYTOSEP 目錄號(hào)142 批號(hào)2050401GRADE CYTOSEP 目錄號(hào)141 批號(hào)2050401GRADE CYTOSEP 目錄號(hào)111 批號(hào)20504012、化學(xué)偶合墊(沒(méi)有包被膠體金)Millipore中國(guó)有限公司3、硝基纖維素膜Millipore中國(guó)有限公司4、鼠抗人紅細(xì)胞抗體(中國(guó)廈門(mén)波生)。
5、使用抗人紅細(xì)胞抗體預(yù)處理的過(guò)濾膜(參考資料2)。
6、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)測(cè)試盒蓋(需加樣在端口2進(jìn)行夾心法檢測(cè))。
7、正常人全血。
按附圖6組裝測(cè)試盒實(shí)驗(yàn)步驟
1、在HBsAg的測(cè)試盒上，用一層全血濾膜(未經(jīng)抗人紅細(xì)胞抗體處理)替換掉原緩沖液吸收墊，加全血樣本，測(cè)試全血濾膜的濾血效果。
2、若單層膜不能達(dá)到有關(guān)鍵所在的紅細(xì)胞和血漿的分離，則進(jìn)一步篩選用兩層未經(jīng)抗人紅細(xì)胞抗體處理的全血濾膜以期提高分率效率。
3、若上述兩步都不能達(dá)到有效分離紅細(xì)胞的目的，則上述材料中濾血效果相對(duì)最好的濾膜，經(jīng)抗人紅細(xì)胞抗體對(duì)膜進(jìn)行預(yù)處理后，比較其過(guò)濾紅細(xì)胞的效果。
結(jié)果；見(jiàn)附表6A、6B、6C。
附表6A 使用單一過(guò)濾膜的紅細(xì)胞過(guò)濾效果

注“-”是指沒(méi)有血漿濾出或?yàn)V出的血漿不足以遷移到硝基纖維素膜。
附表6B使用雙層過(guò)濾膜的紅細(xì)胞過(guò)濾效果

分析從附表6A和6B可以看出(1)僅僅依靠膜孔徑的物理過(guò)濾不能有效地濾去紅細(xì)胞，雙層過(guò)濾膜也不能提高過(guò)濾效果；(2)#111和1660因膜孔徑過(guò)小(1～3μm)，不能滿(mǎn)足液體有效流速而被淘汰；(3)141+141或141+142的組合因低血漿遷移而被溝汰；(4)在同時(shí)滿(mǎn)足過(guò)濾紅細(xì)胞和有效的血漿流速條件下，141#和142#全血過(guò)濾膜顯示較好過(guò)濾紅細(xì)胞及較高的遷移速率，因此，選擇141#和142#全血過(guò)濾膜，經(jīng)紅細(xì)胞抗體進(jìn)行預(yù)處理后(見(jiàn)參考資料2)，進(jìn)一步比較不同的雙層膜組合中紅細(xì)胞的過(guò)濾及血漿遷移效率，結(jié)果如表6C所示。
附表6C 不同過(guò)濾膜組合紅細(xì)胞過(guò)濾及血漿遷移速率比較

注“*”表示用0.5毫克/毫升的鼠抗人紅細(xì)胞抗體預(yù)處理。
“-”表示30分鐘內(nèi)無(wú)紅細(xì)胞濾出CP化學(xué)偶合物墊分析當(dāng)全血樣品用于夾心法端口2加樣口時(shí)，從附表6A～6C可以看出1.僅靠過(guò)濾膜的孔徑難以達(dá)到有關(guān)鍵所在地阻隔紅細(xì)胞的目的。
2.經(jīng)抗人紅細(xì)胞抗體對(duì)過(guò)濾膜的預(yù)處理能提高濾膜分離紅細(xì)胞的效果。
3.最佳的雙層濾膜結(jié)構(gòu)是142#膜下置疏水性的化學(xué)偶合物墊作為有過(guò)濾功能的液體收集墊，兩者均經(jīng)抗紅細(xì)胞抗體預(yù)處理。
4.有效的紅細(xì)胞過(guò)濾和有效的血漿濾出率并向端口1遷徙是滿(mǎn)足端口2加樣的前提條件，故有過(guò)濾功能的液體收集墊18的孔徑不能太小，且過(guò)濾結(jié)構(gòu)EA與化學(xué)偶合物墊12硝基纖維素膜13之間需形成有效的毛細(xì)管工作層析壓差，如圖8所示，在硝基纖維素膜13上靠近端口1端設(shè)有液體吸收墊19(5×18毫米)，該液體吸收墊19為親水性混合纖維，用于吸收加樣于端口2的液體。
實(shí)施例4抗凝劑對(duì)紅細(xì)胞過(guò)濾效果的影響(附表7A、7B)。
目的了解抗人紅細(xì)胞抗體全血過(guò)濾膜應(yīng)用于雙向水平側(cè)流的免疫層析檢測(cè)時(shí)，抗凝劑對(duì)血漿的過(guò)濾效率及過(guò)濾出的血漿在硝基纖維素膜上遷移速率是否有影響。
材料1、全血濾膜#142(Ahlstrom Filtration，USA)，0.25毫克/毫升鼠抗從紅細(xì)胞抗體預(yù)處理(見(jiàn)參考資料2)；2、經(jīng)不同抗凝劑處理過(guò)的142膜；3、加入不同的抗凝劑的全血樣品。
按附圖6組裝測(cè)試盒。
結(jié)果見(jiàn)附表7A和7B。
附表7A 未經(jīng)抗凝劑處理的#142膜過(guò)濾不同全血結(jié)果比較

附表7B 經(jīng)抗凝劑處理的#142膜過(guò)濾不同全血比較

由表7A和7B可以看出1、經(jīng)抗凝劑處理與否，對(duì)於相同體積的樣本#142膜對(duì)全血的過(guò)濾效果無(wú)明顯差異；即抗凝劑不影響當(dāng)當(dāng)血漿經(jīng)142膜的過(guò)濾效率；2、全血中是否加入抗凝劑，在相同體積和相同的過(guò)濾膜條件下，血漿的濾過(guò)效果無(wú)明顯差異。
提示非抗凝全血可用於本檢測(cè)系統(tǒng)。
實(shí)施例5紅細(xì)胞比積對(duì)定量檢測(cè)的影響(附表8A、8B)目的了解在雙向水平側(cè)流層析中，紅細(xì)胞比積是否影響定量檢測(cè)的結(jié)果。
材料1、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性抗凝全血標(biāo)本，經(jīng)溫氏法測(cè)定其紅細(xì)胞比積為44％，將其以1毫升/管分裝，取2ml全血離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)得到血漿。設(shè)44％的紅細(xì)胞比積為1，在此基礎(chǔ)上增加或減少全血中血漿的含量，則得到不同紅細(xì)胞比積的全血。
2、甲狀腺病患者抗凝全血，放射免疫法測(cè)得其TSH(促甲狀腺激素)值為28微國(guó)際單位/毫升。同1所述方法制備不同紅細(xì)胞比積的全血。
3、經(jīng)0.25毫克/毫升抗人紅細(xì)胞抗體處理的#142過(guò)濾膜(Ahlstrom Filtration)。
4、HBsAg測(cè)試盒，按附圖7組裝。
5、TSH測(cè)試盒，按附圖7組裝。
結(jié)果HBsAg測(cè)試結(jié)果見(jiàn)附表8A；TSH測(cè)試結(jié)果見(jiàn)附表8B。
從表8A和8B可以看出1、改變紅細(xì)胞比積后，對(duì)HBsAg的定量檢測(cè)結(jié)果顯示含不同紅細(xì)胞比積的全血與血漿檢測(cè)結(jié)果之間差異＜15％，為本系統(tǒng)可容盒間差范圍，提示對(duì)定量HBsAg檢測(cè)，紅細(xì)胞比積+30％或-40％范圍內(nèi)無(wú)明顯的體積依賴(lài)性。
2、改變紅細(xì)胞比積后對(duì)TSH的定量檢測(cè)結(jié)果顯示含不同紅細(xì)胞比積的全血和血漿檢測(cè)結(jié)果之間差異＜15％，為本系統(tǒng)可容許盒間差范圍。提示對(duì)定量的TSH檢測(cè)在紅細(xì)胞比積+30％或-40％范圍內(nèi)無(wú)明顯的體積依賴(lài)性。
附表8B紅細(xì)胞比積在HBsAg定量檢測(cè)中的影響


附表8B 紅細(xì)胞比積在TSH定量檢測(cè)中的影響


實(shí)施例6 紅細(xì)胞比積對(duì)定性檢測(cè)的影響(附表9)。
目的了解雙向水平側(cè)流層析檢測(cè)中，紅細(xì)胞比積對(duì)定性檢測(cè)結(jié)果的影響。
材料1、同一例HIV抗體陽(yáng)性抗凝全血，紅細(xì)胞比積為45.3％，分裝成8管，每管1毫升，4,000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，通過(guò)棄去或增加血漿改變紅細(xì)胞的比積。
2、經(jīng)0.25毫克/毫升的兔抗人紅細(xì)胞抗體處理的142過(guò)濾膜(美國(guó)Ahlstrom Filtration)。
3、HIV抗體測(cè)試盒，按附圖5組裝。
結(jié)果詳見(jiàn)附表9中變異系數(shù)S/CO和CV％。
注定性檢測(cè)以信噪比(S/CO)判斷檢測(cè)結(jié)果，以S/CO＞1為陽(yáng)性。
從附表9可以看出用抗HIV測(cè)試盒檢測(cè)同樣體積的全血和血漿樣本，全血紅細(xì)胞比積在+30％和-40％變化范圍內(nèi)，HIV定性檢測(cè)的結(jié)果無(wú)明顯的體積依賴(lài)性，樣本間S/CO值誤差在9.43％，屬本系統(tǒng)容許盒間差范圍。
附表9 紅細(xì)胞比積對(duì)HIV定性檢測(cè)的影響

實(shí)施例7全血加樣體積對(duì)定量或定性檢測(cè)結(jié)果的影響(附表10A、10B)目的了解全血加樣體積對(duì)雙向水平側(cè)流免疫層析檢測(cè)結(jié)果的影響。
材料1、經(jīng)0.25毫克/毫升的兔抗人紅細(xì)胞抗體預(yù)處理的142過(guò)濾膜(Ahlstrom Filtration，美國(guó))2、HIV抗體陽(yáng)性抗凝全血(紅細(xì)胞比積為45.3％)3、HBsAg陽(yáng)性抗凝全血(紅細(xì)胞比積為44％)4、按圖5組裝HIV抗體測(cè)試盒5、按圖6組裝HBsAg測(cè)試盒結(jié)果1、附表10A，為不同全血加樣體積對(duì)HIV抗體定性檢測(cè)結(jié)果2、附表10B，為不同全血加樣體積對(duì)HBsAg定量檢測(cè)結(jié)果注1、HIV定性檢測(cè)以信噪比(S/CO)判斷結(jié)果，以S/CO＞1為陽(yáng)性。
2、HBsAg定量檢測(cè)以濃度單位判斷結(jié)果，即毫克/毫升。
結(jié)論1、適用于HIV檢測(cè)的最小全血加親友體積為40微升。全血加樣量在40～70μl時(shí)，檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)(CV)值在5～20％范圍。
2、適用于HBsAg檢測(cè)的最佳全血加樣體積為200～250微升。檢測(cè)時(shí)間為30分鐘時(shí)，檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)(CV)＜10％。
表10A 不同加樣體積全血樣本的HIV檢測(cè)結(jié)果比較

附表10B 不同加樣體積全血樣本的HBsAg檢測(cè)結(jié)果比較

參考資料目錄參考資料-1 原材料供應(yīng)商清單1、硝基纖維素膜(親水性硝基化纖維，Millipore中國(guó)有限公司)，用以包被捕獲區(qū)和控制區(qū)的試劑，提供生化反應(yīng)的場(chǎng)所。
2、化學(xué)偶合墊(玻璃纖維，疏水性，Millipore中國(guó)有限公司)，用于包被膠體金偶合的試劑。
3、緩沖液吸收墊(親水性混合纖維，Cytosep，美國(guó)AhlstromFiltration公司)，吸收緩沖液或樣本。
4、樣本墊(親水性混合纖維，Cytosep，美國(guó)Ahlstrom Filtration公司)，吸收樣本。
5、液體吸收墊(親水性混合纖維，美國(guó)Whatman公司)，吸收層析的液體。
6、支撐墊(疏水性塑膠膜，美國(guó)G&L公司)，測(cè)試條的固體支撐結(jié)構(gòu)。
7、全血過(guò)濾膜(疏水性玻璃纖維或親水性混合纖維，美國(guó)Ahlstrom Filtration公司)，分離全血的紅細(xì)胞。
8、兔多克隆抗人紅細(xì)胞抗體(中國(guó)瑞泰特思)，用來(lái)預(yù)處理全血過(guò)濾膜和化學(xué)偶合墊。
9、鼠單克隆抗人紅細(xì)胞抗體(中國(guó)廈門(mén)波生)，用來(lái)預(yù)處理全血過(guò)濾膜和液體收集墊。
10、塑料測(cè)試盒(中國(guó)盛進(jìn)生物)，用作ReLIA免疫層析的構(gòu)架，提供免疫反應(yīng)的場(chǎng)所。
11、其它過(guò)濾膜CytoSep Grade 1660，1661，1662和1663(親水性，混合天然和人工合成纖維，美國(guó)Ahlstrom Filtration公司)；纖維素Grade111(100％純棉紙，親水性，美國(guó)Ahlstrom Filtration公司)。
參考資料-2 抗紅細(xì)胞抗體預(yù)處理過(guò)濾膜工藝流程A、配制10％的Tween-20溶液；B、配制終濃度為0.25～5毫克/毫升的兔(鼠)抗人紅細(xì)胞抗體溶液緩沖液三羥甲基氨基甲烷 50毫摩爾 (終濃度)EDTANa24.1毫摩爾 (終濃度)PH 8.5±1Tween-20 0.8％ (終濃度)C、用已配制的含抗紅細(xì)胞抗體的溶液處理過(guò)濾膜1、將一張過(guò)濾膜放入托盤(pán)。量取52毫升抗紅細(xì)胞處理溶液，倒入托盤(pán)。使溶液均勻滲入整個(gè)過(guò)濾膜。
2、用輥?zhàn)釉谀ど狭鳚L動(dòng)數(shù)次，以去除汽泡。
3、重復(fù)步驟1和2直至溶液均勻滲透整個(gè)膜。
4、將膜放置在紗網(wǎng)上，室溫條件下用電風(fēng)扇吹過(guò)夜。
5、將半干的已處理膜放入干燥器中干燥至少5小時(shí)。
6、將處理好的全血過(guò)濾膜放入含有干燥劑的鋁箔袋中，密封室溫保存。
參考資料-3 過(guò)濾膜理化特性

備注1、硝基纖維素膜的孔徑為不均勻分布，但其它過(guò)濾膜的孔徑是標(biāo)準(zhǔn)一致的，統(tǒng)稱(chēng)為“孔徑分布“。
2、硝基纖維素膜的液體流速用XX秒/毫升/平方厘米表示，其它均用ml/min表示。
3、硝基纖維素膜的毛細(xì)引力隨不同產(chǎn)品的液體而不同，用XX秒/4厘米表示，液體流速在很大程度上取決于孔徑，孔徑分布，膜的厚度。這些因素決定了硝基纖維素膜的多孔性狀(膜中包含有一定體積的空氣)，在所有膜的檢測(cè)當(dāng)中，硝基纖維素膜具有最大的毛細(xì)引力。
有關(guān)膜的流速和毛細(xì)流速的進(jìn)一步詳細(xì)理論描述，請(qǐng)參見(jiàn)“免疫層析試紙條簡(jiǎn)短指南”(Millipore)，P.7。
權(quán)利要求
1.一種定量的快速水平側(cè)流方法，用生化反應(yīng)的平臺(tái)，實(shí)施對(duì)不限于人類(lèi)待檢的液態(tài)生物標(biāo)本作各種待檢項(xiàng)目，其特征在于用過(guò)濾結(jié)構(gòu)阻隔液態(tài)標(biāo)本中所含的細(xì)胞，得到完成其生化反應(yīng)所需的液體體積；并通過(guò)該平臺(tái)結(jié)構(gòu)，形成有效的毛細(xì)管層析壓差，使已過(guò)濾的液體及溶解于其中的待檢物質(zhì)在該平臺(tái)上經(jīng)毛細(xì)管層析作用定向流動(dòng)；并根據(jù)生化反應(yīng)中待檢物質(zhì)和對(duì)照物質(zhì)所產(chǎn)生的可被檢測(cè)的光密度判斷檢測(cè)結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征在于所述的生化反應(yīng)的平臺(tái)由測(cè)試條和測(cè)試盒外殼組成，測(cè)試條的結(jié)構(gòu)具有兩端并以保證有效的細(xì)胞過(guò)濾、毛細(xì)管層析和生化反應(yīng)；以測(cè)試盒外殼保證液態(tài)生物標(biāo)本的加樣結(jié)果的觀察和測(cè)試條物理結(jié)構(gòu)的固定；其生物標(biāo)本可加在測(cè)試盒外殼上兩端加樣口的任一端或兩端。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征在于測(cè)試條的細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)由單層或多層不同孔徑的過(guò)濾膜組成，其直接與樣本中細(xì)胞接觸的過(guò)濾膜孔徑小于待阻隔的細(xì)胞直徑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征是所述的測(cè)試條的細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)使用了雙面膠，促使濾過(guò)液體朝預(yù)設(shè)方向呈優(yōu)勢(shì)流動(dòng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征是在于所述測(cè)試條的細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)與毛細(xì)管層析壓差要求保持一致，以保證有效的液體濾過(guò)及層析過(guò)程中的液體流速。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征是所述的細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)，與毛細(xì)管層析壓差要求一致，由具有不同孔徑、毛細(xì)引力的膜材料，組建細(xì)胞過(guò)濾——層析試紙條，使含細(xì)胞的液態(tài)待檢生物標(biāo)本在過(guò)濾中體積損失最少，并在被物理過(guò)濾后，液體在被收集原點(diǎn)處毛細(xì)管層析壓差小于生化反應(yīng)區(qū)，從而使過(guò)濾后的液體受毛細(xì)引力驅(qū)動(dòng)在測(cè)試層析條上定向移動(dòng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征是所述的細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)，可用使待過(guò)濾細(xì)胞聚集的化學(xué)試劑預(yù)處理過(guò)濾膜，使待過(guò)濾物因聚集而體積增大，而提高過(guò)濾膜對(duì)細(xì)胞的阻隔效果。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征是所述的使待過(guò)濾細(xì)胞聚集的化學(xué)試劑采用抗紅細(xì)胞抗體或植物蛋白凝集素，抗紅細(xì)胞抗體針對(duì)紅細(xì)胞膜表面暴露的抗原決定簇可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征是所述用抗紅細(xì)胞抗體預(yù)處理過(guò)濾膜是包括用表面活性劑Tween-20處理膜以增加抗體對(duì)過(guò)濾膜的吸附。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征在于所述測(cè)試條的毛細(xì)管層析壓差來(lái)自于組裝測(cè)試條的材料及其組裝結(jié)構(gòu)；根據(jù)生化檢測(cè)項(xiàng)目要求，含細(xì)胞的液態(tài)生物標(biāo)本可加樣在測(cè)試盒的任一端或兩端；不同的加樣方式有不同的細(xì)胞過(guò)濾-層析-生化反應(yīng)結(jié)構(gòu)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征在于測(cè)試條的毛細(xì)管層析壓差來(lái)自于組裝測(cè)試條的材料及其組裝結(jié)構(gòu)；根據(jù)生化檢測(cè)項(xiàng)目要求，含細(xì)胞的液態(tài)生物標(biāo)本可加樣在測(cè)試盒的任一端或兩端；不同的加樣方式有不同的細(xì)胞過(guò)濾-層析-生化反應(yīng)結(jié)構(gòu)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征在于待檢液態(tài)生物標(biāo)本是含細(xì)胞的全血，但不限于全血標(biāo)本；含細(xì)胞的待檢液態(tài)生物標(biāo)本可含抗凝劑或不含抗凝劑，在經(jīng)過(guò)反應(yīng)平臺(tái)的過(guò)濾結(jié)構(gòu)后得到的液體體積滿(mǎn)足生化反應(yīng)所需。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征是其生化反應(yīng)過(guò)程利用了雙向水平側(cè)流降低生化反應(yīng)中的背景；并以生化反應(yīng)中待檢物與對(duì)照物所產(chǎn)生的光密度值之比的相對(duì)光密度值RI分析檢測(cè)結(jié)果，而提高檢測(cè)的靈敏度，減少盒間差，使檢測(cè)結(jié)果為相對(duì)地非體積依賴(lài)性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征在于所述的生化反應(yīng)利用膠體金顆?；蜚y顆粒、或熒光染料、或其它產(chǎn)生可被光反射原理檢測(cè)的光密度的材料作為標(biāo)記物，使生化反應(yīng)的結(jié)果可通過(guò)待檢物和對(duì)照物產(chǎn)生的光密度之比被測(cè)定。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量的快速水平側(cè)流方法，其特征在于其生化反應(yīng)是基于免疫學(xué)原理的，但不限于免疫學(xué)原理的大分子間結(jié)合關(guān)系的檢測(cè)，用于檢測(cè)人類(lèi)，但不限于人類(lèi)液態(tài)標(biāo)本中的大分子，如抗原、抗體、多糖、核酸、多肽、病原微生物等。
16.一種定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，用生化反應(yīng)的平臺(tái)，實(shí)施對(duì)不限于人類(lèi)待檢的液態(tài)生物標(biāo)本作各種待檢項(xiàng)目，其特征在于生化反應(yīng)的平臺(tái)由測(cè)試條和測(cè)試盒外殼組成，測(cè)試條的結(jié)構(gòu)具有兩端并以保證有效的細(xì)胞過(guò)濾、毛細(xì)管層析和生化反應(yīng)；生物標(biāo)本可加在外殼上兩端加樣口的任一端或兩端。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，其特征在于細(xì)胞過(guò)濾-層析-生化反應(yīng)結(jié)構(gòu)，各組之間按序部分或全部重疊；其重疊部分為0.1～20毫米。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，其特征在于所述的細(xì)胞過(guò)濾-層析-生化反應(yīng)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞過(guò)濾膜為疏水性的玻璃纖維但不限於玻璃纖維，或親水的混合纖維。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，其特征在于其液態(tài)生物標(biāo)本經(jīng)過(guò)濾后的液體收集膜為疏水性玻璃纖維但不限於玻璃纖維，或親水的混合纖維，并具有不小于細(xì)胞過(guò)濾膜的孔徑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，其特征在于其液態(tài)生物標(biāo)本經(jīng)過(guò)濾后的液體收集膜孔徑與過(guò)濾膜孔徑之比＞1。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，其特征在于生化反應(yīng)所需的標(biāo)記物如膠體金被預(yù)包被并干燥于疏水的玻璃纖維上但不限於玻璃纖維，位于層析條的一端；膠體金在層析條上所處位置的層析壓差在膠體金被溶解釋放時(shí)低于生化反應(yīng)的反應(yīng)區(qū)，故膠體金可以包被原點(diǎn)向生化反應(yīng)區(qū)定向移動(dòng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，其特征在于生化反應(yīng)區(qū)由親水性的硝基纖維素膜但不限於硝基纖維素膜組成，并具有在雙向水平測(cè)流的第一次液體流動(dòng)時(shí)，在本結(jié)構(gòu)中最高的毛細(xì)引力，使液體從加樣區(qū)或液體收集區(qū)向其反應(yīng)區(qū)定向移動(dòng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，其特征是在層析條的另一端，相對(duì)應(yīng)于化學(xué)偶合物墊的位置安裝有親水性的吸水墊片，其作用是在硝基纖維素膜已被浸濕，吸水能力下降膠體金溶解后，以其高度吸水能力提供促使液體從膠體金端向吸水墊片端定向移動(dòng)所需的毛細(xì)管層析壓差。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，其特征在于當(dāng)含細(xì)胞的液態(tài)生物標(biāo)本加樣在吸水墊片一端時(shí)，其細(xì)胞過(guò)濾膜與硝基纖維素膜直接接觸但不與吸水墊片接觸；當(dāng)含細(xì)胞的液態(tài)生物標(biāo)本加樣在膠體金一端時(shí)，其細(xì)胞過(guò)濾膜與液體收集膜部分與全部接觸，但不與化學(xué)偶合物墊直接接觸；當(dāng)含細(xì)胞液態(tài)生物標(biāo)本同時(shí)或分別加樣于兩端加樣口時(shí)，其細(xì)胞過(guò)濾結(jié)構(gòu)為分別加樣時(shí)的結(jié)合。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的定量的快速水平側(cè)流系統(tǒng)，其特征在于其液態(tài)生物標(biāo)本經(jīng)過(guò)濾后的液體收集膜使同一種試紙條結(jié)構(gòu)既可用于免疫間接法檢測(cè)，又可用于免疫夾心法檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量的快速水平側(cè)流方法及系統(tǒng)，用生化反應(yīng)的平臺(tái)，實(shí)施對(duì)不限于人類(lèi)待檢的液態(tài)生物標(biāo)本作各種待檢項(xiàng)目，用過(guò)濾結(jié)構(gòu)阻隔液態(tài)標(biāo)本中所含的細(xì)胞，得到完成其生化反應(yīng)所需的液體體積；生化反應(yīng)的平臺(tái)由測(cè)試條和測(cè)試盒外殼組成，生物標(biāo)本可加在外殼上兩端加樣口的任一端或兩端；并通過(guò)該平臺(tái)結(jié)構(gòu)，形成有效的毛細(xì)管層析壓差，使已過(guò)濾的液體及溶解于其中的待檢物質(zhì)在該平臺(tái)上經(jīng)毛細(xì)管層析作用定向流動(dòng)；并根據(jù)生化反應(yīng)中待檢物質(zhì)和對(duì)照物質(zhì)所產(chǎn)生的可被檢測(cè)的光密度判斷檢測(cè)結(jié)果。借此，本發(fā)明可用于對(duì)全血的，或其它含細(xì)胞生物標(biāo)本進(jìn)行定量、快速的檢測(cè)，且實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)體積非依賴(lài)性，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1786712SQ20041007736
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月7日
發(fā)明者周思亮, 劉寧, 威廉·吉·羅特 申請(qǐng)人:盛進(jìn)生物工程(深圳)有限公司