專利名稱：一種轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的狹縫電轉(zhuǎn)印技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種條帶免疫印跡技術(shù)，尤其是涉及一種轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的狹縫電轉(zhuǎn)印技術(shù)。
背景技術(shù)：
狹逢印跡技術(shù)在基因工程領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛，主要應(yīng)用于膜雜交技術(shù)中，它利用狹縫點樣器將核酸分子(如核酸探針等)加載于膜(如硝酸纖維素膜、尼龍膜等)上，然后進行分子雜交檢測和分析。其優(yōu)點是簡單、迅速，可同時做多個樣品，該技術(shù)在一般核酸分子雜交應(yīng)用中基本可以獲得比較理想的試驗結(jié)果，但將其用于蛋白印跡往往不能達到理想的結(jié)果。主要缺點是由于蛋白分子對膜的吸附能力不如核酸分子，往往是吸附蛋白量不夠，檢測靈敏度不好；另一個問題是點樣器在固定膜時加壓較大常常留有痕跡，影響檢測結(jié)果的判斷。
而電轉(zhuǎn)印技術(shù)常應(yīng)用于蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)中，是通過電轉(zhuǎn)印跡法將蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到印跡膜(如硝酸纖維素膜、PVDF膜等)上的方法?，F(xiàn)在電轉(zhuǎn)印跡已成為了較為常用的蛋白印跡方法。其主要優(yōu)點是電轉(zhuǎn)印速度快、完全。電轉(zhuǎn)印跡技術(shù)有兩種方法一種是半干轉(zhuǎn)印法，即將凝膠-膜夾層組合置于兩個平板電極之間，通過電轉(zhuǎn)印方法將蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)印至印跡膜上；另一種是濕轉(zhuǎn)印法，即將凝膠-膜夾層組合完全浸入盛有大量轉(zhuǎn)印緩沖液的轉(zhuǎn)印槽內(nèi)，使電流從轉(zhuǎn)印槽的一側(cè)通向另一側(cè)，通過電轉(zhuǎn)印的方法可將蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)印至印跡膜上。載有蛋白質(zhì)的印跡膜用于蛋白檢測與分析，濕轉(zhuǎn)印法比半干轉(zhuǎn)印法稍費時，也需要用較多的緩沖液，但它的轉(zhuǎn)印效果較好。
上述兩種技術(shù)方案在實際應(yīng)用中存在著以下不足1)目前，國外較多的條帶免疫印跡試劑條制作均采用點膜機，是將蛋白質(zhì)通過微量噴嘴噴印于印跡膜上，大量實驗證明，容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，即檢測特異性不好，或需要設(shè)置臨界顯色條帶來濾去交叉反應(yīng)；2)狹縫印跡法制作的條帶免疫試劑條，一方面是由于蛋白吸附量不夠，檢測靈敏度不好；另一方面由于存留有狹縫的痕跡，影響檢測結(jié)果的判讀；3)電轉(zhuǎn)印技術(shù)是目前最好的蛋白印跡技術(shù)，特異性與靈敏性均佳，缺點是蛋白質(zhì)需要通過電泳分離后才能轉(zhuǎn)印于印跡膜上，如果蛋白質(zhì)分子量相近的蛋白不能用此法轉(zhuǎn)印，另由于電泳時不能進行人為控制蛋白泳動行為，轉(zhuǎn)印于膜時蛋白質(zhì)位置難以確定，對商品而言即為商品性能較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明結(jié)合狹縫印跡和濕轉(zhuǎn)印法的特點，提供了一種狹縫電轉(zhuǎn)印技術(shù)，在條帶免疫印跡技術(shù)中，本發(fā)明可以確保免疫檢測的特異性和靈敏性。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的用75％的酒精將狹縫模板擦洗干凈，自然干燥后，將0.45μm厚度的濾膜襯于模板下面，用刀在狹縫模板的狹縫中切割濾膜，在濾膜上切割出邊緣整齊的狹縫，該狹縫的長度小于電轉(zhuǎn)印用膜的寬度；濾膜的孔徑為0.45μm，所述狹縫的寬度為0.5-1.0mm，所述狹縫的間距為1.0-1.5cm；電轉(zhuǎn)印用膜可以選用硝酸纖維素膜，或聚偏二氟乙烯膜PVDF膜，或尼龍膜均可。
其操作方法是這樣的將海綿墊、濾紙和電轉(zhuǎn)印用膜分別浸泡在1×電轉(zhuǎn)緩沖液(40-50ml)中30-60分鐘，保證海綿墊、濾紙和電轉(zhuǎn)印用膜充分的濕潤；制備凝膠條，放入1×電轉(zhuǎn)緩沖液中漂洗1-2分鐘；準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)裝置將電轉(zhuǎn)印用膜、狹縫濾膜和凝膠條緊緊貼牢，并在電轉(zhuǎn)印用膜的外側(cè)和凝膠條的外側(cè)分別置放兩層濾紙和一層海綿墊，然后一起平放于電轉(zhuǎn)印裝置夾板上，凝膠條在陰極端，電轉(zhuǎn)印用膜在陽極端，構(gòu)成電轉(zhuǎn)印夾層組合；將電轉(zhuǎn)印夾層組合放入轉(zhuǎn)印槽中，電轉(zhuǎn)印用膜端緊靠正極；然后于1V/cm轉(zhuǎn)印60-70分鐘左右；
轉(zhuǎn)印結(jié)束后立即斷開電源，小心拆開裝置，在膜上做好所需的標(biāo)記。
采用上述技術(shù)方案，給本發(fā)明待來的有益效果是(1)蛋白質(zhì)可以定向定位地轉(zhuǎn)印至印跡膜上，提高該類產(chǎn)品的商品性能；(2)蛋白質(zhì)是通過電泳轉(zhuǎn)移到印跡膜上，提高了蛋白質(zhì)吸附量，從而解決了狹縫印跡技術(shù)不足，提高了免疫印跡檢測的靈敏度與特異性；(3)由于特異性好，免去了設(shè)置臨界顯色條帶，使檢測結(jié)果更易判讀；(4)無狹縫的壓痕，印跡膜表面平滑，避免檢測結(jié)果的錯判。


附圖1是本發(fā)明狹縫濾膜的一種結(jié)構(gòu)示意圖；附圖2是本發(fā)明電轉(zhuǎn)印夾層組合的一種結(jié)構(gòu)示意圖；附圖3是本發(fā)明轉(zhuǎn)印結(jié)果的一種結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
下面通過實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步具體的說明。
實施例以轉(zhuǎn)印兔抗人IgG為例1.1狹縫濾膜的制備1.1.1用75％的酒精將狹縫模板擦洗干凈，自然干燥后，將0.45μm厚度的濾膜襯于模板下面，用刀在狹縫模板的狹縫中切割濾膜，在濾膜上切割出狹縫，該狹縫的長度小于電轉(zhuǎn)印用膜的寬度。
參看圖1，濾膜的孔徑為0.45μm，所述狹縫的寬度為0.5-1.0mm，所述狹縫的間距為1.0-1.5cm。
1.2試劑的準(zhǔn)備1.2.1 1×TBS緩沖液Tris-HCl 0.02MNaCl 0.1M定容至1000ml，調(diào)PH至7.4(可配成10×儲存液)；1.2.2 1×PBS緩沖液
NaCl 8.0gKCl 0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g定容至1000ml，調(diào)PH至7.4(可配成10×儲存液)；1.2.3 1×電轉(zhuǎn)緩沖液Tris 3.0g甘氨酸 14.4g定容至1000ml，置4℃保存(可配成10×儲存液)；1.2.4 A液30％丙烯酰胺儲存液丙烯酰胺 29.2g雙丙烯酰胺 0.8g定容至100ml，置4℃密封保存；1.2.5 B液凝膠緩沖液1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.2.6 10％十二烷基磺酸鈉(SDS)將10gSDS溶解于100ml蒸餾水中，室溫保存；1.2.7 10％過硫酸銨(APS)將0.1g過硫酸銨溶于1ml蒸餾水中，4℃保存；1.2.8封閉緩沖液3％牛血清白蛋白BSA、0.1％Tween-20，用1×TBS溶液溶解；1.2.9印跡緩沖液1％牛血清白蛋白BSA、0.1％Tween-20，用1×TBS溶液溶解；1.2.10漂洗液0.1％Tween-20，用1×TBS溶液溶解；1.2.11顯色液儲存液5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽BCIP將0.5g BCIP(二價鈉鹽)溶于10ml 100％二甲基甲酰胺硝基四唑氮藍NBT將0.5g NBT溶于10ml 70％二甲基甲酰胺堿性磷酸酶緩沖液0.1M的NaCl、5mM的MgCl2和0.1M的Tris-HCl(PH9.5)；1.2.12顯色液66ul NBT溶液同10ml堿性磷酸酶緩沖液充分混勻后加入33ulBCIP溶液，置4℃的環(huán)境中，1小時內(nèi)使用；1.2.13兔抗人IgG 濃度1mg/ml1.2.14羊抗人IgG堿性磷酸酶標(biāo)記 濃度1mg/ml1.2.15正常人血清或血漿1.3操作方法1.3.1將海綿墊1、濾紙2和電轉(zhuǎn)印用膜3分別浸泡在1×電轉(zhuǎn)緩沖液(40-50ml)中30-60分鐘，保證海綿墊、濾紙和電轉(zhuǎn)印用膜充分的濕潤；1.3.2準(zhǔn)備好狹縫濾膜；1.3.3準(zhǔn)備好灌膠用的模具(國內(nèi)外廠家生產(chǎn)的電泳槽即可以用來制膠，凝膠厚度0.75mm)，模具要干燥；1.3.4按需要量配制凝膠溶液，10％凝膠溶液配制方法如下蒸餾水 3.9mlA液 3.4mlB液 2.5ml10％SDS 100ul10％APS 100ul將上述溶液在燒杯中配加好后，加入蛋白質(zhì)樣品(如1ml凝膠液中加兔抗人IgG 10ug)充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡，然后加入TEMED(10ul)溶液混勻，立即灌膠，操作要迅速，以免凝膠在灌膠時已聚合；1.3.5用移液器小心地吸取凝膠溶液緩慢的加入模具內(nèi)，避免凝膠內(nèi)產(chǎn)生氣泡；
1.3.6凝膠聚合后取出凝膠玻璃板，小心地撬開玻璃板，凝膠便會貼在其中的一塊板上；1.3.7用刀片將凝膠切成膠條或整膠，放入1×電轉(zhuǎn)緩沖液中漂洗1-2分鐘；1.3.8準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)裝置參看圖2，將電轉(zhuǎn)印用膜3、狹縫濾膜4和凝膠條5緊緊貼牢，并在電轉(zhuǎn)印用膜3的外側(cè)和凝膠條5的外側(cè)分別置放兩層濾紙2和一層海綿墊1，然后一起平放于電轉(zhuǎn)印裝置夾板上，凝膠條5在陰極端，電轉(zhuǎn)印用膜3在陽極端，構(gòu)成電轉(zhuǎn)印夾層組合；1.3.9將電轉(zhuǎn)印夾層組合放入轉(zhuǎn)印槽中，電轉(zhuǎn)印用膜端緊靠正極；1.3.10然后于1V/cm轉(zhuǎn)印60-70分鐘左右；1.3.11轉(zhuǎn)印結(jié)束后立即斷開電源，小心拆開裝置，在膜上做好所需的標(biāo)記。
1.4免疫檢測(間接法)1.4.1用鑷子取出電轉(zhuǎn)印用膜放入容器中，加入一定量封閉緩沖液(液面必須沒過膜)；1.4.2置搖床上搖動60分鐘，轉(zhuǎn)速50-60轉(zhuǎn)，充分封閉電轉(zhuǎn)印用膜；1.4.3搖動結(jié)束后，用漂洗液漂洗3次，5分鐘/次，吸棄漂洗液；1.4.4用鑷子取出電轉(zhuǎn)印用膜，自然干燥后切成0.3cm的電轉(zhuǎn)印用膜條；1.4.5用鑷子取電轉(zhuǎn)印用膜條放入反應(yīng)槽內(nèi)，每槽各一條；1.4.6每槽加1ml漂洗液，置搖床上漂洗5分鐘后，吸棄漂洗液；1.4.7每槽加1ml印跡緩沖液，再加入10ul正常人血清，置搖床上搖動60分鐘，搖動結(jié)束后，吸棄印跡緩沖液；1.4.8每槽加1ml漂洗液，漂洗3次，每次5分鐘，吸棄漂洗液；1.4.9將羊抗人IgG標(biāo)記堿性磷酸酶稀釋液(1∶1000)于印跡緩沖液中，加入反應(yīng)槽內(nèi)置搖床上搖動45分鐘，搖動結(jié)束后，吸棄印跡緩沖液；1.4.10每槽加1ml漂洗液，漂洗3次，每次5分鐘，洗好后吸盡余液；1.4.11每槽中加入1ml顯色液，置搖床上搖動10分鐘，顯色；1.4.12吸棄顯色液，每槽中加入1ml蒸餾水，置搖床上搖動5分鐘，終止反應(yīng)；1.4.13將抗原條小心地取出放在濾紙上，吸干水份后觀察結(jié)果，參看圖3。
最后，應(yīng)當(dāng)指出，以上實施例僅是本發(fā)明較有代表性的例子。顯然，本發(fā)明的技術(shù)方案并不限于上述實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的狹縫電轉(zhuǎn)印技術(shù)，其特征在于a.狹縫濾膜的制備用75％的酒精將狹縫模板擦洗干凈，自然干燥后，將0.45μm厚度的濾膜襯于模板下面，用刀在狹縫模板的狹縫中切割濾膜(4)，在濾膜上切割出狹縫(6)，該狹縫的長度小于電轉(zhuǎn)印用膜的寬度；b.操作方法將海綿墊(1)、濾紙(2)和電轉(zhuǎn)印用膜(3)分別浸泡在1×電轉(zhuǎn)緩沖液(40-50ml)中30-60分鐘，保證海綿墊、濾紙和電轉(zhuǎn)印用膜充分的濕潤；制備凝膠條，放入1×電轉(zhuǎn)緩沖液中漂洗1-2分鐘；準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)裝置將電轉(zhuǎn)印用膜(3)、狹縫濾膜(4)和凝膠條(5)緊緊貼牢，并在電轉(zhuǎn)印用膜(3)的外側(cè)和凝膠條(5)的外側(cè)分別置放兩層濾紙(2)和一層海綿墊(1)，然后一起平放于電轉(zhuǎn)印裝置夾板上，凝膠條(5)在陰極端，電轉(zhuǎn)印用膜(3)在陽極端，構(gòu)成電轉(zhuǎn)印夾層組合；將電轉(zhuǎn)印夾層組合放入轉(zhuǎn)印槽中，電轉(zhuǎn)印用膜端緊靠正極；然后于1V/cm轉(zhuǎn)印60-70分鐘左右；轉(zhuǎn)印結(jié)束后立即斷開電源，小心拆開裝置，在膜上做好所需的標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的狹縫電轉(zhuǎn)印技術(shù)，其特征在于濾膜的孔徑為0.45μm，所述狹縫的寬度為0.5-1.0mm，所述狹縫的間距為1.0-1.5cm，且所述狹縫濾膜上的狹縫邊緣整齊。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的狹縫電轉(zhuǎn)印技術(shù)，其特征在于所述的電轉(zhuǎn)印用膜是硝酸纖維素膜，或者是聚偏二氟乙烯膜PVDF膜，或者是尼龍膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的狹縫電轉(zhuǎn)印技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案是首先制備狹縫濾膜；在1×電轉(zhuǎn)緩沖液中浸泡海綿墊、濾紙和電轉(zhuǎn)印用膜到充分濕潤；制備凝膠條，并在1×電轉(zhuǎn)緩沖液中漂洗；將海綿墊、濾紙、凝膠條、狹縫濾膜、電轉(zhuǎn)印用膜、濾紙、海綿墊依次平放于電轉(zhuǎn)印裝置夾板上，凝膠條在陰極端，電轉(zhuǎn)印用膜在陽極端，組成夾層組合；將電轉(zhuǎn)印夾層組合放入轉(zhuǎn)印槽中，電轉(zhuǎn)印用膜端緊靠正極；然后于1V/cm轉(zhuǎn)印60－70分鐘左右；轉(zhuǎn)印結(jié)束后立即斷開電源，小心拆開裝置，在膜上做好所需的標(biāo)記。這樣蛋白質(zhì)定向定位得比較好，并提高了蛋白質(zhì)吸附量，提高了免疫印跡檢測的靈敏度與特異性，更易判讀檢測結(jié)果，還避免檢測結(jié)果的錯判。
文檔編號G01N33/00GK1645140SQ20041008943
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者黃云堅, 袁國亮, 項春梅, 王貽杰, 呂小玉, 張夢華, 朱旭輝, 鄒龍盛, 金妙堅 申請人:浙江澳亞生物工程研究院有限公司