專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)肝癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及對(duì)肝癌血清蛋白指紋圖譜檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率極高，嚴(yán)重危害人們的身體健康。中國(guó)每年約有11萬(wàn)人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。早期診斷和早期治療是提高患者成活率的關(guān)鍵。但目前的診斷方法敏感度和特異性均較低，已成為肝癌診療的一個(gè)瓶頸。肝癌的高發(fā)病率和高死亡率使得人們不斷地尋求一種有效的早期診斷方法，臨床上僅以AFP一種蛋白作為血清學(xué)診斷指標(biāo)在敏感性和特異性上是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足的，而超聲等影象學(xué)檢測(cè)一旦發(fā)現(xiàn)占位病變則已經(jīng)不是很早期了。能夠使疾病在發(fā)生的極早期就能夠得已發(fā)現(xiàn)，并得到控制和治療，進(jìn)而大大提高治愈率或明顯改善病人的預(yù)后和生活質(zhì)量。蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)的出現(xiàn)使這種需要成為可能。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)最先被用于臨床蛋白組學(xué)研究，但其對(duì)疏水性、強(qiáng)酸性和強(qiáng)鹼性蛋白的分辨率不夠，而且不能檢測(cè)低豐度蛋白，故實(shí)用價(jià)值受限。后來(lái)，2D-PAGE與質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合，已被成功地用于腫瘤研究。例如，王征等采用MALDI-TOF-MS肽質(zhì)指紋圖分析結(jié)合2D-PAGE對(duì)肝癌血清進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了15個(gè)有意義的蛋白點(diǎn)。但因其所采用方法學(xué)所限，該結(jié)果尚不具備臨床實(shí)用性和早期診斷價(jià)值。
近年來(lái)隨著臨床蛋白質(zhì)組學(xué)的開(kāi)展，使得肝癌的早期發(fā)現(xiàn)成為可能。表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface-enhanced laser-desorption/ionizationtime-of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技術(shù)是一項(xiàng)近年來(lái)新興的臨床蛋白組學(xué)實(shí)用技術(shù)，具有優(yōu)于二維電泳和其他質(zhì)譜方法的特點(diǎn)，已被廣泛地用于腫瘤標(biāo)記物的篩查等研究。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、可直接分析原始生物樣本(如血清、尿液、胸腹水等)、樣本用量小等特點(diǎn)，同時(shí)適合多樣品平行檢測(cè)和直接進(jìn)行蛋白質(zhì)全景式的搜索和分析，特別是對(duì)小分子量蛋白和低豐度蛋白具有較高的捕獲效果，可以與其他蛋白質(zhì)組學(xué)方法互補(bǔ)，目前已被廣泛地用于腫瘤標(biāo)記物的篩查和臨床檢測(cè)。Coombes等采用此技術(shù)從乳腺癌患者的乳頭分泌物中尋找特征蛋白，Schaub等用尿液檢查前列腺癌，Carrette等用腦脊液診斷老年性癡呆，以及Zhang等用于AIDS研究，并均已獲得很好的結(jié)果。但國(guó)內(nèi)迄今尚無(wú)采用SELDI-TOF-MS技術(shù)獲得檢測(cè)肝癌血清特征蛋白的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服已有對(duì)肝癌血清檢測(cè)技術(shù)的不足之處，提出一種檢測(cè)肝癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型及其制備方法，該模型為早期診斷肝癌提供了新的途徑和方法，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)記物提供了基礎(chǔ)。
本發(fā)明提出的檢測(cè)肝癌血清蛋白質(zhì)的質(zhì)譜模型，其特征在于從血清中篩選出6個(gè)上調(diào)蛋白和11個(gè)下調(diào)蛋白17個(gè)作為特征蛋白，選取所述17個(gè)蛋白中任意兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白，以該蛋白的臨界峰值建立兩級(jí)或兩級(jí)以上的分類(lèi)樹(shù)構(gòu)成用于檢測(cè)肝癌血清特征蛋白檢測(cè)模型；所述的6個(gè)上調(diào)蛋白(指在肝癌患者血清中含量高于正常人血清中含量)的分子量與臨界峰值分別為5073道爾頓(Da)、其臨界峰值為3.544，5317Da、其臨界峰值為4.652，5345Da、其臨界峰值為2.301，5806Da、其臨界峰值為4.810，11472Da、其臨界峰值為0.618和11696Da、其臨界峰值為0.983；所述11個(gè)下調(diào)蛋白(指在肝癌患者血清中含量低于正常人血清中含量)，分子量分別為6838Da、其臨界峰值為8.414，6879Da、其臨界峰值為2.252，8563Da、其臨界峰值為23.076，8687Da、其臨界峰值為2.252，8766Da、其臨界峰值為7.784，13752Da、其臨界峰值為9.752，13955Da、其臨界峰值為3.228，17498Da、其臨界峰值為0.968，28222Da、其臨界峰值為0.983，37415Da、其臨界峰值為0.715和80470Da、其臨界峰值為0.111。
本發(fā)明提出上述的檢測(cè)肝癌血清蛋白質(zhì)譜模型的制備方法，包括以下步驟1)收集多例經(jīng)病理明確診斷的肝癌患者血清及經(jīng)體檢確定為健康者的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行-70℃低溫冷凍備用；2)采用WCX2芯片對(duì)所述肝癌患者及正常人的兩組血清標(biāo)本的蛋白進(jìn)行吸附(吸附方法為常規(guī)通用方法)；3)(采用蛋白飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(ProteinChipBiology System)(Ciphergen公司生產(chǎn)，型號(hào)PBSII-型)對(duì)結(jié)合在弱陽(yáng)離子WCX2芯片上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，設(shè)定最高檢測(cè)分子量為200kD，優(yōu)化范圍為2kD-20kD，激光強(qiáng)度185-195，檢測(cè)敏感度為8-10，由此獲得兩組蛋白圖譜；4)(采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析軟件、Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System軟件)對(duì)所有肝癌患者和正常人血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)肝癌患者和正常人血清之間蛋白峰值的差異(認(rèn)定P值小于10-4時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共得到96個(gè)蛋白峰)，檢測(cè)出2組血清蛋白指紋圖譜之間有17個(gè)穩(wěn)定的差異蛋白，其中有6個(gè)差異蛋白穩(wěn)定上調(diào)，即在肝癌患者中高表達(dá)，分子量與臨界峰值分別為5073道爾頓(Da)、其臨界峰值為3.544，5317Da、其臨界峰值為4.652，5345Da、其臨界峰值為2.301，5806Da、其臨界峰值為4.810，11472Da、其臨界峰值為0.618和11696Da、其臨界峰值為0.983；11個(gè)差異蛋白穩(wěn)定下調(diào)，即在肝癌患者中低表達(dá)，分子量分別為6838Da、其臨界峰值為8.414，6879Da、其臨界峰值為2.252，8563Da、其臨界峰值為23.076，8687Da、其臨界峰值為2.252，8766Da、其臨界峰值為7.784，13752Da、其臨界峰值為9.752，13955Da、其臨界峰值為3.228，17498Da、其臨界峰值為0.968，28222Da、其臨界峰值為0.983，37415Da、其臨界峰值為0.715和80470Da、其臨界峰值為0.111，將所述17個(gè)差異蛋白作為肝癌蛋白質(zhì)譜診斷模型的特征蛋白；6)(由于多個(gè)特征蛋白組合起來(lái)才可將肝癌與正常人完全分開(kāi))選取上述17個(gè)特征蛋白中的任意兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白，以該蛋白的臨界峰值建立兩級(jí)或兩級(jí)以上的分類(lèi)樹(shù)構(gòu)成用于檢測(cè)肝癌血清特征蛋白檢測(cè)模型。
本發(fā)明采用上述分類(lèi)樹(shù)可用于肝癌早期檢測(cè)和篩查。
本發(fā)明的特點(diǎn)及效果本發(fā)明與其他肝癌的診斷方法比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)第一、本發(fā)明采用肝癌患者與正常人具有差異的多個(gè)特征蛋白組合起來(lái)進(jìn)行對(duì)肝癌血清的檢測(cè)，提供的質(zhì)譜模型是肝癌早期檢測(cè)和篩查的新方法和新途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的肝癌生物標(biāo)記物提供了基礎(chǔ)；第二、與以往的血清學(xué)檢測(cè)方法比較具有較高的敏感性和特異性，是一種在蛋白組學(xué)水平上的診斷，對(duì)肝癌的早期診斷提供了新標(biāo)準(zhǔn)；第三、本發(fā)明模型的構(gòu)建方法設(shè)計(jì)合理可行，為降低我國(guó)肝癌的病死率、提高肝癌的臨床治愈率提供了一種新的篩查方法。
第四、利用本發(fā)明用雙盲法分析了85份血清標(biāo)本(其中有肝癌患者、正常人和其他疾病)，結(jié)果顯示，79例劃分正確，6份劃分錯(cuò)誤。其中肝癌和正常人均劃分正確。陽(yáng)性檢出率(敏感性)達(dá)100％，特異性92％。因此本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌進(jìn)行早期預(yù)警、早期發(fā)現(xiàn)。


圖1為隨機(jī)抽取的4個(gè)蛋白指紋圖譜(2個(gè)肝癌和2個(gè)正常人)的曲線(xiàn)。
圖2為本發(fā)明的一種分類(lèi)樹(shù)模型圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提出的檢測(cè)肝癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型及其制備方法結(jié)合附圖及具體應(yīng)用實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明提出的檢測(cè)肝癌血清蛋白質(zhì)的質(zhì)譜模型，其特征在于從血清中篩選出6個(gè)上調(diào)蛋白和11個(gè)下調(diào)蛋白17個(gè)作為特征蛋白，選取所述17個(gè)蛋白中任意兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白，以該蛋白的臨界峰值建立兩級(jí)或兩級(jí)以上的分類(lèi)樹(shù)構(gòu)成用于檢測(cè)肝癌血清特征蛋白檢測(cè)模型；所述的6個(gè)上調(diào)蛋白(指在肝癌患者血清中含量高于正常人血清中含量)的分子量與臨界峰值分別為5073道爾頓、其臨界峰值為3.544，5317道爾頓、其臨界峰值為4.652，5345道爾頓、其臨界峰值為2.301，5806道爾頓、其臨界峰值為4.810，11472道爾頓、其臨界峰值為0.618和11696道爾頓、其臨界峰值為0.983；所述11個(gè)下調(diào)蛋白(指在肝癌患者血清中含量低于正常人血清中含量)，分子量分別為6838道爾頓(Da)、其臨界峰值為8.414，6879Da、其臨界峰值為2.252，8563Da、其臨界峰值為23.076，8687Da、其臨界峰值為2.252，8766Da、其臨界峰值為7.784，13752Da、其臨界峰值為9.752，13955Da、其臨界峰值為3.228，17498Da、其臨界峰值為0.968，28222Da、其臨界峰值為0.983，37415Da、其臨界峰值為0.715和80470Da、其臨界峰值為0.111。
本發(fā)明提出上述的檢測(cè)肝癌血清蛋白質(zhì)譜模型的產(chǎn)生方法，包括以下步驟1)收集多例經(jīng)病理明確診斷的肝癌患者血清及經(jīng)體檢確定為健康者的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行低溫(-70℃)冷凍備用；2)采用WCX2芯片對(duì)所述肝癌患者及正常人的兩組血清標(biāo)本的蛋白進(jìn)行吸附，吸附方法為常規(guī)通用方法，具體步驟如下從冰箱(-70C)中取出血清，于4℃，10000rpm離心2min；取3μl血清樣品，加6μl U9處理液(9M尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mM Tris-CL，pH9.0)，充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入108μl結(jié)合緩沖液(100mmol/LNaAc，PH4.0)，立即混勻；將WCX2芯片裝入bioprocessor中，每孔加入200μl結(jié)合緩沖液，室溫振蕩洗滌2次，每次5min，甩干；每孔分別加入100μl樣品混合液，振蕩孵育1h，甩去樣品，用200μl洗脫緩沖液(100mmol/LNaAc，PH4.0)室溫振蕩洗滌2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗滌一次，立即甩干；拆開(kāi)bioprocessor，取出芯片，晾干后，每點(diǎn)點(diǎn)加2次0.5μl SPA，晾干后即可上機(jī)測(cè)量。
3)(采用蛋白飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(ProteinChipBiology System)(Ciphergen公司生產(chǎn)，型號(hào)PBSII-型)對(duì)結(jié)合在弱陽(yáng)離子WCX2芯片上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，設(shè)定最高檢測(cè)分子量為200kD，優(yōu)化范圍為2kD-20kD，激光強(qiáng)度185-195，檢測(cè)敏感度為8-10，由此獲得兩組蛋白圖譜，圖1顯示隨機(jī)抽取的4個(gè)蛋白指紋圖譜(2個(gè)肝癌和2個(gè)正常人)，箭頭所示為分子量在11kD-17kD范圍內(nèi)的幾個(gè)特征蛋白，其中11472Da、11696Da為上調(diào)蛋白，13752Da、13955Da為下調(diào)蛋白；4)(采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析軟件、Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System軟件)對(duì)所有肝癌患者和正常人血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)肝癌患者和正常人血清之間蛋白峰值的差異(認(rèn)定P值小于10-4時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共得到96個(gè)蛋白峰)，檢測(cè)出2組血清蛋白指紋圖譜之間有17個(gè)穩(wěn)定的差異蛋白，其中有6個(gè)差異蛋白穩(wěn)定上調(diào)，即在肝癌患者中高表達(dá)；11個(gè)差異蛋白穩(wěn)定下調(diào)，即在肝癌患者中低表達(dá)，如表1所示表1肝癌患者血清中的特征蛋白

表中向上箭頭“↑”為在患者血清中高表達(dá)的上調(diào)特征蛋白；向下箭頭“↓”為在患者血清中低表達(dá)的下調(diào)特征蛋白；將所述17個(gè)差異蛋白作為肝癌蛋白質(zhì)譜診斷模型的特征蛋白；6)(由于多個(gè)特征蛋白組合起來(lái)才可將肝癌與正常人完全分開(kāi))本方法選取上述17個(gè)特征蛋白中的任意兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白，以該蛋白的臨界峰值建立兩級(jí)或兩級(jí)以上的分類(lèi)樹(shù)構(gòu)成用于檢測(cè)肝癌血清特征蛋白檢測(cè)模型。
圖2為本發(fā)明的一種兩級(jí)分類(lèi)樹(shù)模型圖，是選取各種分類(lèi)樹(shù)模型中的一個(gè)模型對(duì)血清進(jìn)行檢測(cè)。圖中，以13752Da特征蛋白為母節(jié)點(diǎn)l，可將所有樣品分成兩組，峰值≤9.752的樣本劃分到左邊的子節(jié)點(diǎn)2中，診斷為肝癌患者；峰值＞9.752的樣本劃分到右邊的終節(jié)點(diǎn)3.1中，診斷為正常人。子節(jié)點(diǎn)2中的樣本繼續(xù)以11472Da特征蛋白劃分，峰值≤0.618的樣本被劃入左邊的終節(jié)點(diǎn)3.2中，重新診斷為正常人；峰值＞0.618的樣本被劃入右邊的終節(jié)點(diǎn)3.3中，診斷為肝癌患者。最終的分析結(jié)果以表格方式表示，見(jiàn)表2。
表2 蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)評(píng)價(jià)表病理診斷結(jié)果肝癌 正常人合計(jì)蛋白指紋 肝癌 311 32圖譜技術(shù) 正常人3 3336合計(jì) 343468利用本發(fā)明的檢測(cè)肝癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型及其制備方法構(gòu)成的各種分類(lèi)樹(shù)檢測(cè)肝癌血清的實(shí)施例說(shuō)明如下實(shí)施例1
抽取待測(cè)患者靜脈血2mL，不抗凝。室溫放置30min至1h，于室溫2500轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，取血清等量分裝后-70℃冰箱中凍存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，從-70℃冰箱中取出標(biāo)本，冰中融化，于4℃10000轉(zhuǎn)/min離心2min。取離心后血清樣品3μL，加6μL U9處理液(9M尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mM Tris-CL，pH9.0)，充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入108μl結(jié)合緩沖液(100mmol/LNaAc，PH4.0)，立即混勻。將WCX2芯片裝入bioprocessor中，每孔加入200μl結(jié)合緩沖液，室溫振蕩洗滌2次，每次5min，甩干。每孔分別加入100μl樣品混合液，振蕩孵育1h，甩去樣品，用200μl洗脫緩沖液(100mmol/LNaAc，PH4.0)室溫振蕩洗滌2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗滌一次，立即甩干。拆開(kāi)bioprocessor，取出芯片，晾干后，每點(diǎn)點(diǎn)加2次0.5μl SPA，晾干后即可采用蛋白飛行質(zhì)譜儀(PBSII-C型)對(duì)結(jié)合在弱陽(yáng)離子WCX2芯片上的血清蛋白進(jìn)行讀取分析。參數(shù)設(shè)定如下最高檢測(cè)分子量為200kD，優(yōu)化范圍為2kD-20kD，激光強(qiáng)度185，檢測(cè)敏感度為9。考慮到基質(zhì)峰的存在，將1kD以下的峰濾去，以免基質(zhì)峰對(duì)結(jié)果造成干擾。采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，分析軟件的參數(shù)設(shè)置如下信噪比為5，收集閾值為10％，聚集質(zhì)量為2％。采用Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System軟件分析待測(cè)患者血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜，用13752Da及11472Da特征蛋白及其臨界峰值構(gòu)成兩級(jí)分類(lèi)樹(shù)，查得數(shù)據(jù)中13752Da及11472Da的峰值分別為2.780及4.335，判斷為肝癌患者。
實(shí)施例2抽取待測(cè)患者靜脈血2mL，不抗凝。室溫放置30min至1h，于室溫2500轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，取血清等量分裝后-70℃冰箱中凍存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，從-70℃冰箱中取出標(biāo)本，冰中融化，于4℃10000轉(zhuǎn)/min離心2min。取離心后血清樣品3μL，加6μL U9處理液(9M尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mM Tris-CL，pH9.0)，充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入108μl結(jié)合緩沖液(100mmol/LNaAc，PH4.0)，立即混勻。將WCX2芯片裝入bioprocessor中，每孔加入200μl結(jié)合緩沖液，室溫振蕩洗滌2次，每次5min，甩干。每孔分別加入100μl樣品混合液，振蕩孵育1h，甩去樣品，用200μl洗脫緩沖液(100mmol/LNaAc，PH4.0)室溫振蕩洗滌2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗滌一次，立即甩干。拆開(kāi)bioprocessor，取出芯片，晾干后，每點(diǎn)點(diǎn)加2次0.5μl SPA，晾干后即可采用蛋白飛行質(zhì)譜儀(PBSII-C型)對(duì)結(jié)合在弱陽(yáng)離子WCX2芯片上的血清蛋白進(jìn)行讀取分析。參數(shù)設(shè)定如下最高檢測(cè)分子量為200kD，優(yōu)化范圍為2kD-20kD，激光強(qiáng)度185，檢測(cè)敏感度為9?？紤]到基質(zhì)峰的存在，將1kD以下的峰濾去，以免基質(zhì)峰對(duì)結(jié)果造成干擾。采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，分析軟件的參數(shù)設(shè)置如下信噪比為5，收集閾值為10％，聚集質(zhì)量為2％。采用Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System軟件分析待測(cè)患者血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜，用13752Da、11472Da及5806Da特征蛋白及其臨界峰值構(gòu)成三級(jí)分類(lèi)樹(shù)，所獲得的數(shù)據(jù)中13752Da、11472Da及5806Da的峰值分別為9.642、0.256及3.135，判斷為正常人。
實(shí)施例3抽取待測(cè)患者靜脈血2mL，不抗凝。37℃孵育20-30min，于室溫2500轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，取血清等量分裝后-70℃冰箱中凍存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，從-70℃冰箱中取出標(biāo)本，冰中融化，于4℃10000轉(zhuǎn)/min離心2min。取離心后血清樣品3μL，加6μL U9處理液(9M尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mM Tris-CL，pH9.0)，充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入108μl結(jié)合緩沖液(100mmol/LNaAc，PH4.0)，立即混勻。將WCX2芯片裝入bioprocessor中，每孔加入200μl結(jié)合緩沖液，室溫振蕩洗滌2次，每次5min，甩干。每孔分別加入100μl樣品混合液，振蕩孵育1h，甩去樣品，用200μl洗脫緩沖液(100mmol/LNaAc，PH4.0)室溫振蕩洗滌2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗滌一次，立即甩干。拆開(kāi)bioprocessor，取出芯片，晾干后，每點(diǎn)點(diǎn)加2次0.5μl SPA，晾干后即可采用蛋白飛行質(zhì)譜儀(PBSII-C型)對(duì)結(jié)合在弱陽(yáng)離子WCX2芯片上的血清蛋白進(jìn)行讀取分析。參數(shù)設(shè)定如下最高檢測(cè)分子量為200kD，優(yōu)化范圍為2kD-20kD，激光強(qiáng)度185，檢測(cè)敏感度為9?？紤]到基質(zhì)峰的存在，將1kD以下的峰濾去，以免基質(zhì)峰對(duì)結(jié)果造成干擾。采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，分析軟件的參數(shù)設(shè)置如下信噪比為5，收集閾值為10％，聚集質(zhì)量為2％。采用Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System軟件分析待測(cè)患者血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜，用11472Da、11696Da、13955Da及8563Da特征蛋白及其臨界峰值構(gòu)成四級(jí)分類(lèi)樹(shù)，查得數(shù)據(jù)中11472Da、11696Da、13955Da及8563Da的峰值分別為2.677、3.115、2.069及28.026，判斷為肝癌患者。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)肝癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型，其特征在于從血清中篩選出6個(gè)上調(diào)蛋白和11個(gè)下調(diào)蛋白17個(gè)作為特征蛋白，選取所述17個(gè)蛋白中任意兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白，以該蛋白的臨界峰值建立兩級(jí)或兩級(jí)以上的分類(lèi)樹(shù)構(gòu)成用于檢測(cè)肝癌血清特征蛋白檢測(cè)模型；所述的6個(gè)上調(diào)蛋白的分子量與臨界峰值分別為5073道爾頓、其臨界峰值為3.544，5317道爾頓、其臨界峰值為4.652，5345道爾頓、其臨界峰值為2.301，5806道爾頓、其臨界峰值為4.810，11472道爾頓、其臨界峰值為0.618和11696道爾頓、其臨界峰值為0.983；所述11個(gè)下調(diào)蛋白，分子量分別為6838道爾頓、其臨界峰值為8.414，6879道爾頓、其臨界峰值為2.252，8563道爾頓、其臨界峰值為23.076，8687道爾頓、其臨界峰值為2.252，、8766道爾頓、其臨界峰值為7.784，13752道爾頓、其臨界峰值為9.752，13955道爾頓、其臨界峰值為3.228，17498道爾頓、其臨界峰值為0.968，28222道爾頓、其臨界峰值為0.983，37415道爾頓、其臨界峰值為0.715和80470道爾頓、其臨界峰值為0.111。
2.一種檢測(cè)肝癌血清蛋白質(zhì)譜模型的制備方法，包括以下步驟1)收集多例經(jīng)病理明確診斷的肝癌患者血清及經(jīng)體檢確定為健康者的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行低溫冷凍備用；2)采用WCX2芯片對(duì)所述肝癌患者及正常人的兩組血清標(biāo)本的蛋白進(jìn)行吸附；3)對(duì)結(jié)合在弱陽(yáng)離子WCX2芯片上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，獲得兩組蛋白圖譜；4)對(duì)所有肝癌患者和正常人血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)肝癌患者和正常人血清之間蛋白峰值的差異，檢測(cè)出2組血清蛋白指紋圖譜之間有17個(gè)穩(wěn)定的差異蛋白及其臨界峰值，其中有6個(gè)差異蛋白穩(wěn)定上調(diào)，其分子量與臨界峰值分別為5073道爾頓、其臨界峰值為3.544，5317道爾頓、其臨界峰值為4.652，5345道爾頓、其臨界峰值為2.301，5806道爾頓、其臨界峰值為4.810，11472道爾頓、其臨界峰值為0.618和11696道爾頓、其臨界峰值為0.983；11個(gè)差異蛋白穩(wěn)定下調(diào)分子量分別為6838道爾頓、其臨界峰值為8.414，6879道爾頓、其臨界峰值為2.252，8563道爾頓、其臨界峰值為23.076，8687道爾頓、其臨界峰值為2.252，、8766道爾頓、其臨界峰值為7.784，13752道爾頓、其臨界峰值為9.752，13955道爾頓、其臨界峰值為3.228，17498道爾頓、其臨界峰值為0.968，28222道爾頓、其臨界峰值為0.983，37415道爾頓、其臨界峰值為0.715和80470道爾頓、其臨界峰值為0.111；將所述17個(gè)差異蛋白作為肝癌蛋白質(zhì)譜診斷模型的特征蛋白；6)選取所述17個(gè)蛋白中任意兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白，以該蛋白的臨界峰值建立兩級(jí)或兩級(jí)以上的分類(lèi)樹(shù)構(gòu)成用于檢測(cè)肝癌血清特征蛋白檢測(cè)模型。
3.一種選取血清17個(gè)蛋白中任意兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白，以該蛋白的臨界峰值建立兩級(jí)或兩級(jí)以上的分類(lèi)樹(shù)用于肝癌早期檢測(cè)和篩查。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)肝癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型及其制備方法，屬于蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從血清中篩選出6個(gè)上調(diào)蛋白和11個(gè)下調(diào)蛋白17個(gè)作為特征蛋白，選取所述17個(gè)蛋白中任意兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白，以該蛋白的臨界峰值建立兩級(jí)或兩級(jí)以上的分類(lèi)樹(shù)構(gòu)成用于檢測(cè)肝癌血清特征蛋白檢測(cè)模型；本發(fā)明為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的肝癌生物標(biāo)記物提供了基礎(chǔ)；利用該模型對(duì)肝癌診斷的特異性、靈敏度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)率均在 90％以上。本發(fā)明對(duì)于肝癌的診斷優(yōu)于目前所采用的任何單一診斷方法，為肝癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供有一種非侵入性技術(shù)，從而為降低肝癌的病死率、提高肝癌的治愈率，并進(jìn)一步為高危人群篩查肝癌提供一種新方法。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1621829SQ20041010356
公開(kāi)日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2004年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者張建中, 鄭燕華, 馮凱, 鄒德威 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第306醫(yī)院