專利名稱：：測定mtp活性的熒光分析方法與相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2003年6月27日提交的美國臨時申請No.60/483321的優(yōu)先權(quán)，該申請在此引為參考。關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究或開發(fā)的陳述本發(fā)明部分由國立衛(wèi)生研究院基金DK-46900和HL-64272資助。因此政府可能對發(fā)明擁有特定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
：微粒體的甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTP)是載脂蛋白B(apoB)脂蛋白裝配所需的一個專用的伴侶蛋白[有關(guān)綜述參見參考文獻(xiàn)(1-6)]。據(jù)信MTP將脂類轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中初生的apoB上，通過形成原生的脂蛋白微粒賦予它分泌的能力[有關(guān)綜述參見參考文獻(xiàn)(1-9)]。MTP的脂轉(zhuǎn)移活性在apoB分泌中的重要性已經(jīng)通過三個獨立的方法而建立。首先，已經(jīng)將MTP的突變與無β脂蛋白血癥中apoB脂蛋白的缺失關(guān)聯(lián)起來(10，11)。其次，在體外能夠抑制MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的拮抗物已經(jīng)被顯示能夠在體內(nèi)減少apoB的分泌(12-14)。第三，已經(jīng)證實MTP和apoB的共表達(dá)在不表達(dá)apoB和MTP的細(xì)胞中促進(jìn)了apoB的分泌(15，16)。除了脂轉(zhuǎn)移活性之外，已知MTP物質(zhì)上還與apoB相互作用(1，2)。最近發(fā)現(xiàn)MTP還涉及了三酰基甘油(TGAs)從胞液向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔輸入的過程(17-19)。因此，MTP顯然是一種多功能的蛋白(2)，在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器中TGA的運(yùn)輸及其向細(xì)胞外的分泌中發(fā)揮重要功能。MTP已經(jīng)被Wetterau和Zilversmit在一種放射性同位素分析方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了鑒定和純化(20，21)。在這種分析方法中，放射性標(biāo)記的TAGs被整合到由磷脂酰膽堿(PC)和心磷脂組成的供體泡中。這些泡與受體泡在存在MTP的條件下保溫。保溫1-3小時后，將含有心磷脂的供體泡與DE52結(jié)合，通過離心除去。殘留在上清液中的放射性活性通過閃爍計數(shù)進(jìn)行定量。這個過程費時費力。已知帶負(fù)電荷的脂類例如心磷脂能抑制MTP的脂轉(zhuǎn)移活性(22)。由于在這個過程中包括了多個步驟，它難以進(jìn)行自動化。因此，一種簡單的、一個步驟的測量MTP活性的方法將具有優(yōu)勢。這樣的方法將可以用來例如鑒定能夠部分抑制MTP活性從而減少了脂蛋白的裝配和分泌的化合物。被鑒定的化合物非常有希望作為減少血漿膽固醇和細(xì)胞中甘油三酯水平的藥物。幾家制藥公司已經(jīng)鑒定出了抑制MTP活性的拮抗物(12-14，23)。這些公司所采用的普遍方法是鑒定能夠減少HepG2細(xì)胞分泌apoB的化合物，然后測定它們抑制MTP活性的能力(3，23)。對apoB分泌的抑制的初篩的主要困難在于使用多步驟的放射性活性分析方法評估大量化合物對MTP的抑制(20，21)。這個兩步的篩選導(dǎo)致鑒定了能夠抑制MTP活性并減少apoB分泌的化合物。令人吃驚的是，不同的公司鑒定出的不同化合物在結(jié)構(gòu)上非常相似(23)。不幸的是，這些化合物引起TAG在細(xì)胞中的大量積累，這提高了這些被選的化合物是apoB分泌的潛在抑制劑的可能性。在理想的情況下，尋求的是能抑制MTP的活性但對脂蛋白的分泌有部分影響的化合物。出于這個目的，需要去開發(fā)能夠篩選其主要能力是抑制MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物的方法。本發(fā)明提供了簡單、快速和靈敏的分析MTP活性的方法，可以自動化并用于高通量篩選。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了測量MTP活性的方法和組合物。在本發(fā)明的一個方面，提供了測量MTP水平的方法，包括下列步驟(a)制備其中整合了熒光標(biāo)記的脂的供體泡；(b)制備受體泡；(c)將含有MTP的細(xì)胞勻漿或分離的MTP與受體泡和標(biāo)記的供體泡，在足夠允許熒光標(biāo)記的脂與MTP在標(biāo)記的脂從供體向受體泡轉(zhuǎn)移的過程中結(jié)合的條件下，保溫一段時間；以及(d)測量與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光。細(xì)胞勻漿可以包括肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、心臟細(xì)胞或任何其它表達(dá)MTP的細(xì)胞，包括但不限于動物(包括人)、昆蟲和微生物細(xì)胞。用于本發(fā)明的熒光標(biāo)記的脂包括但不限于甘油三酯、膽固醇酯(CE)或磷脂。熒光標(biāo)記的甘油三酯的例子是1，2-二油酰-3-NBD-甘油(NBD-TAG)。泡優(yōu)選為小的單層泡、多層泡、apoB-脂蛋白泡、其它脂蛋白或磷脂酰膽堿(PC)泡。本發(fā)明還提供了鑒定能夠調(diào)節(jié)MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物的方法。方法包括下列步驟(a)將熒光標(biāo)記的脂整合到供體泡中；(b)制備受體泡；(c)將受體泡和標(biāo)記的供體泡的等份試樣與測試化合物混合，測試化合物是已知的或未知的MTP的調(diào)節(jié)物；(d)將含有MTP的細(xì)胞勻漿或分離的MTP加入到含有供體泡、受體泡和測試化合物的混合物中；(e)在足夠允許熒光標(biāo)記的脂與MTP在標(biāo)記的脂從供體向受體泡轉(zhuǎn)移的過程中結(jié)合的條件下，將受體泡、標(biāo)記的供體泡、測試化合物和MTP的第一個等份試樣保溫一段時間；(f)在足夠允許熒光標(biāo)記的脂與MTP在標(biāo)記的脂從供體向受體泡轉(zhuǎn)移的過程中結(jié)合的條件下，將受體泡、標(biāo)記的供體泡和MTP的第二個等份試樣保溫一段時間；(g)測量在步驟(e)和(f)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光；以及(h)在步驟(e)中獲得的熒光與步驟(f)中獲得的熒光相比增加時，就鑒定到了增加MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物，而在步驟(e)中獲得的熒光與步驟(f)中獲得的熒光相比減少時，就鑒定到了降低MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物。本發(fā)明還提供了測量MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的試劑盒。試劑盒包括受體泡和熒光標(biāo)記的供體泡。在優(yōu)選情況下，試劑盒的熒光標(biāo)記的供體泡由甘油三酯、膽固醇酯或磷脂組成。試劑盒中包含的泡可以是小的單層泡、多層泡、apoB-脂蛋白泡或磷脂酰膽堿(PC)泡。在優(yōu)選情況下，包含在試劑盒中的泡與適當(dāng)?shù)木彌_液混合，也可以含有穩(wěn)定劑如BSA。附圖簡述圖1A-1D圖示了不同量的供體和受體泡對微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTP)轉(zhuǎn)移三?；视?TAG)的影響。線圖和誤差條線代表平均值±SD(n＝3)。圖2A-2C圖示了時間、溫度和NaCl對MTP的TAG轉(zhuǎn)移活性的影響。線圖和誤差條線代表平均值±SD。圖3A-3C圖示了TAG轉(zhuǎn)移活性的特異性。圖4A和4B圖示了受體泡在MTP脂轉(zhuǎn)移中的作用。線圖和誤差條線代表平均值±SD。圖5A-5I圖示了在存在不同受體的情況下各種不同脂的轉(zhuǎn)移。線圖和誤差條線代表平均值±SD。圖6A和6B是兩種方法測定細(xì)胞勻漿中MTP活性的比較圖。線圖和誤差條線代表平均值±SD。圖7A和7B圖示了BMS200150對MTP活性的抑制。線圖和誤差條線代表平均值±SD。圖8是一個單層泡的示意圖，在雙脂膜中包埋了一個標(biāo)記的甘油三酯NBD-TAG。發(fā)明詳述經(jīng)典的測量MTP活性的方法是將純化的MTP或細(xì)胞勻漿與含有放射性標(biāo)記的脂的供體泡保溫1-3小時，將供體泡沉淀，然后測量轉(zhuǎn)移到受體泡中的放射性活性。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種新的簡單快速靈敏的MTP熒光分析方法。在這種分析方法中，分離的和/或純化的MTP或細(xì)胞勻漿與含有猝滅的熒光標(biāo)記的脂(例如甘油三酯、膽固醇酯和/或磷脂)的供體泡和不同類型的受體泡一起保溫。細(xì)胞勻漿可以從任何表達(dá)MTP的細(xì)胞制備。優(yōu)選情況下，細(xì)胞是動物的肝細(xì)胞、腸細(xì)胞或心臟細(xì)胞。優(yōu)選情況下，動物細(xì)胞來自哺乳動物例如大鼠、小鼠、猴子或人。細(xì)胞勻漿也可以包含來自昆蟲或微生物的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，熒光標(biāo)記的脂可以包括但不限于甘油三酯、膽固醇酯(CE)或磷脂。用于本發(fā)明的甘油三酯的例子是三?；视?TAG)。用于本發(fā)明的磷脂的例子是磷脂酰乙醇胺。不同類型的可用于標(biāo)記脂類的熒光化合物的例子包括但不限于7-硝基苯并-2--1，3-二唑(NBD)、嵌二萘或BODIPY。用這些熒光化合物標(biāo)記脂的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)是廣為人知的，制備好的熒光標(biāo)記脂也可以方便地購買到。為了在本發(fā)明中使用，脂可以在任何位置包含至少一個熒光標(biāo)記。例如，一個三?；视涂梢栽谌魏挝恢煤兄辽僖粋€NBD，而在其它位置含有脂肪酸。嵌二萘標(biāo)記的脂的例子包括下列可以從MolecularProbes，Inc(Eugene，OR)公司獲得、并且列表于他們的在線目錄上的脂B-37821，2-雙-(1-嵌二萘癸?；?-sn-甘油基-3-磷酸膽堿C-212膽固醇基-1-嵌二萘丁酸酯D-65621，2-二油酰-3-(1-嵌二萘癸?；?-ras-甘油H-3611-十六烷酰-2-(1-嵌二萘癸酰基)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(β-py-C10-HPC)H-37841-十六烷酰-2-(1-嵌二萘癸?；?-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(β-py-C10-HPE)H-38091-十六烷酰-2-(1-嵌二萘癸?；?-sn-甘油基-3-磷酸甘油，銨鹽(β-py-C10-PG)H-38101-十六烷酰-2-(1-嵌二萘癸?；?-sn-甘油基-3-磷酸甲醇，鈉鹽(β-py-C10-HPM)H-38181-十六烷酰-2-(1-嵌二萘己?；?-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(β-py-C6-HPC)P-58N-(1-嵌二萘磺酰基)-1，2-雙十六烷?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，三乙銨鹽(pySDHPE)BODIPY標(biāo)記的脂的例子包括下列可以從MolecularProbes，Inc.公司獲得、并且列表于他們的在線目錄上的脂B-77011，2-雙-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-十一烷酰)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(雙-BODIPYFLC11-PC)B-37942-(5-丁基-4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-壬酰)-1-十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(β-C4-BODIPY500/510C9-HPC)C-3927膽固醇基-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-十二烷酸酯(膽固醇基BODIPYFLC12)C-12680膽固醇基-4，4-二氟-5-(4-甲氧基苯基)-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-十一烷酸(膽固醇基BODIPY542/563C11)C-12681膽固醇基-4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-十一烷酸酯(膽固醇基BODIPY576/589C11)D-37922-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-十二烷基)-1-十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(β-BODIPYFLC12-HPC)D-38032-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-戊烷基)-1-十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(β-BODIPYFLC5-HPC)D-3800N-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙?；?-1，2-雙十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，三乙銨鹽(BODIPYFLDHPE)D-12656N-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酰基)-1，2-雙己酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，三乙銨鹽(BODIPYFLdicaproylPE)D-38132-(4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-十二?；?-1-十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(β-BODIPY530/550C12-HPE)D-38152-(4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-戊酰基)-1-十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(β-BODIPY530/550C5-HPC)D-3799N-(4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙?；?-1，2-雙十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，三乙銨鹽(BODIPY530/550DHPE)D-37932-(4，4-二氟-5-甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-十二?；?-1-十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(β-BODIPY500/510C12-HPC)D-37952-(4，4-二氟-5-辛基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-戊?；?-1-十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(β-C8-BODIPY500/510C5-HPC)D-38062-(4，4-二氟-5-(4-苯基-1，3-丁間二烯基)-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-戊?；?-1-十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(β-BODIPY581/591C5-HPC)NBD標(biāo)記的脂也可以從MolecularProbes，Inc.公司定制合成，例如D-16408定制合成的1，3-甘油二油酸，2-NBD-X酯或B-1800定制合成的NBD標(biāo)記的膽固醇油酸酯(膽固醇酯)。此外，下列的化合物也可以從MolecularProbes，Inc.公司獲得，不需要定制合成N-00360(NBD-PE)N-(7-硝基苯并-2--1，3-二唑-4-基)-1，2-雙十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，三乙銨鹽；N-03786(NBDC6-HPC)2-(6-(7-硝基苯并-2--1，3-二唑-4-基)氨基)己酰基-1-十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；以及N-03787(NBDC12-HPC)2-(12-(7-硝基苯并-2--1，3-二唑-4-基)氨基)十二?；?1-十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿?？捎糜诒景l(fā)明的泡的例子包括小的單層泡、多層泡、apoB-脂蛋白泡或磷脂酰膽堿(PC)泡。在本文中使用的以及與本領(lǐng)域的專業(yè)人員的理解一致的“單層泡”是指具有一個磷脂雙層的泡(脂質(zhì)體)?！岸鄬优荨笔侵妇哂袔讉€磷脂雙層的泡(脂質(zhì)體)。圖8是單層泡的示意圖，在雙脂膜中包埋了標(biāo)記的甘油三酯NBD-TG。制備受體泡的方法是現(xiàn)成的，參見例如參考文獻(xiàn)20、21和30-32。制備供體泡的方法也是廣為人知的，參見例如參考文獻(xiàn)20、21和30-32。根據(jù)本發(fā)明，在制備目的供體泡時，心磷脂可以被省略，用熒光標(biāo)記的TAGs代替放射性標(biāo)記的TAGs。優(yōu)選情況下供體和受體泡都應(yīng)該與適當(dāng)?shù)木彌_液混合，例如pH在7.4左右的Tris-HCl緩沖液。供體和受體泡可以分開儲存。此外，泡也可以儲存在一起，以便供體/受體泡混合物可以直接用于本發(fā)明的分析或試劑盒中。當(dāng)供體和受體泡在一起儲存時，供體與受體泡的比率優(yōu)選為從大約1∶4(供體∶受體)到大約1∶10(供體∶受體)的范圍內(nèi)。在最優(yōu)選的情況下，供體與受體泡的比率是大約1∶6。泡的制備液還可以通過加入NaCl和BSA分別到終濃度為大約150mM和1mg/ml來進(jìn)一步穩(wěn)定化。MTP可以使用現(xiàn)有的方法從不同的來源分離和純化。參見例如參考文獻(xiàn)20和21。例如，MTP可以象以前描述的那樣從牛肝中分離(參考文獻(xiàn)20和21)。人的MTP可以象參考文獻(xiàn)15描述的那樣通過用含有MTP編碼序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞來制備。這些參考文獻(xiàn)以及所有其它引用的文獻(xiàn)參考的公開內(nèi)容，在此引為參考。根據(jù)本發(fā)明，由MTP介導(dǎo)的脂的轉(zhuǎn)移所引起的熒光的增加可以在一個短的時間后測量到。此處提供的方法已經(jīng)被成功地用來測量用MTP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2、Caco-2細(xì)胞和COS細(xì)胞中的MTP活性。此外，本發(fā)明提供的方法可用于研究細(xì)胞中的以及純化的MTP被它的拮抗物的抑制。該方法可以進(jìn)行自動化，可以容易地使用在大規(guī)模高通量篩選中。此外，本發(fā)明提供的方法可以用來分析任何樣品中的MTP，可用于各種目的例如鑒定、調(diào)節(jié)、診斷等。例如，該方法可用于分析純化的MTP樣品、細(xì)胞株、組織等中存在的MTP的活性。本發(fā)明提供的分析方法是非常通用的，可以測量MTP對任何含有熒光標(biāo)記的脂的轉(zhuǎn)移。此外，此處提供的測量MTP活性的方法簡單、快速。它們的基礎(chǔ)是測定由于在供體和受體泡之間轉(zhuǎn)移脂的過程中發(fā)生的MTP與熒光團(tuán)的結(jié)合而導(dǎo)致的熒光的增加。本發(fā)明的方法忠實地測量了已知能表達(dá)MTP的細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)活性，不能測量不表達(dá)MTP的細(xì)胞中的活性(表1)。此外，該方法顯示了使用現(xiàn)有的放射性同位素分析方法鑒定的拮抗物的同樣的抑制性質(zhì)(圖7)。在存在受體泡的情況下MTP顯示出明顯高的活性(圖4)。在不存在受體泡時MTP的低的脂結(jié)合活性為了解不同的受體泡在脂轉(zhuǎn)移過程中的功能提供了一個獨一無二的機(jī)會。因此，本發(fā)明提供了簡單快速的測量MTP活性的熒光分析方法。新方法的優(yōu)點包括簡易、快速、靈敏、避免使用帶負(fù)電的脂、在研究純化的和細(xì)胞內(nèi)的MTP對不同脂的轉(zhuǎn)移活性中的通用性、測量拮抗物抑制活性的能力、以及取消了放射性的使用。本發(fā)明提供的熒光分析方法可以容易地自動化，用于大規(guī)模高通量的篩選。本方法可用于鑒定能夠部分抑制MTP活性的化合物，從而可能使與TAG在細(xì)胞內(nèi)積累相關(guān)的不需要的副作用得到最小化。MTP是一種多功能的蛋白，它可能還具有除了作為專用的脂蛋白裝配伴侶蛋白之外的其它功能，這一點正變得越來越清楚。通過基于本文提供得熒光分析方法篩選而鑒定的化合物，可用來鑒定MTP與脂蛋白裝配和分泌無關(guān)的其它功能。根據(jù)本發(fā)明，MTP的分析主要由三種成分組成供體泡、受體泡和MTP。本發(fā)明提供的方法對分析混合物的所有三種成分和時間都顯示出了線性關(guān)系(圖1-4)。典型的分析可以按照下述的大綱進(jìn)行。下面列出的不同成分的量當(dāng)然可以改變，只要不同化合物之間的比率保持相同。對每個分析推薦4個不同的條件(空白、完全、陽性對照和測試)。在所有的分析中，反應(yīng)通過在最后加入MTP源而開始。每種受體和供體泡大約3μl被吸到熒光微量滴定板(黑色)上。加入大約10μl10mMTris，pH7.4，其中含有2mMEDTA和10μl1％BSA儲液的1.5MNaCl。用于本文描述的分析中的泡的精確的數(shù)量難以進(jìn)行常規(guī)的定量。但是一種較容易的對泡進(jìn)行定量的方法是測量在不同的泡制備液中的磷脂和甘油三酯。因此，3μl的供體泡相當(dāng)于每毫升大約450nmol磷脂酰膽堿(PC)和大約14nmol甘油三酯。供體泡的濃度可以在一個范圍內(nèi)選擇。優(yōu)選的范圍例如從大約200到大約600nmol磷脂酰膽堿(PC)和7-20nmol甘油三酯。3μl的受體泡相當(dāng)于每毫升大約2400nmolPC。但是受體泡的濃度可以在一個范圍內(nèi)選擇，例如從每毫升大約1400到大約3400nmolPC。在空白對照中，加入所需量的對照緩沖液(在陽性對照和測試樣品中對照緩沖液中含有MTP源)，然后加入水到體積為大約100μl。在陽性對照中，加入已知量的MTP源，然后加入水到體積為大約100μl。在測試樣品中，加入未知樣品，并添水至最終分析體積。在完全分析中，只加入大約3μl供體泡和大約97μl異丙醇?；旌衔镌诖蠹s37℃保溫大約30分鐘。使用分別為460-470和530-550nm的激發(fā)和發(fā)射波長測量熒光單位。在低轉(zhuǎn)移活性的情況下，保溫時間可以增加。實際上，同樣的滴定板可以使用幾次以測量熒光隨時間的增加。但是熒光在異丙醇中經(jīng)過長的時間后不穩(wěn)定。因此，對于長于30分鐘的時間，使用在30分鐘或較早的時間測定的讀數(shù)值。分析使用的成分，包括泡和陽性對照，可以按照本文的描述制作，也可以從Chylos，Inc.(Woodbury，NY)公司購買。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，供體和受體泡可以如上述那樣一起儲存和使用。在這個實施方案中，當(dāng)進(jìn)行分析時，只需要一個吸取泡(供體泡和受體泡一起)的步驟。在優(yōu)選情況下泡于適當(dāng)?shù)木彌_液混合，例如pH大約7.4的TrisHCl緩沖液。其它的緩沖液也可以使用，例如磷酸緩沖液和HEPES。在一個優(yōu)選實施方案中，NaCl被加到終濃度大約150mM?？梢耘渲芅aCl儲存溶液(例如3M)，然后稀釋到終濃度。其它的鹽例如KCl和MgCl2也可以使用。在優(yōu)選情況下，為了穩(wěn)定泡，加入BSA到終濃度大約1mg/ml?？梢耘渲艬SA儲存溶液(例如20mgBSA/ml)，然后稀釋到終濃度。在另一個實施方案中，保溫步驟可以在室溫下進(jìn)行。含有熒光標(biāo)記的脂的供體泡和受體泡可以按照實施例1的描述來制備。在一個優(yōu)選實施方案中，可以混合等量的供體泡和受體泡。典型的分析步驟描述如下i.如下表描述的那樣吸取三份泡到熒光微量滴定板(黑色)中。ii.加入水、樣品等。等待5分鐘以使成分達(dá)到室溫。iii.通過在對照和測試中加入MTP啟始反應(yīng)，在完全測試中加入異丙醇。iv.在室溫保溫30分鐘。MTP活性的測量使用分別460-470和530-550nm的激發(fā)和發(fā)射波長測量熒光單位(FU)。MTP活性的計算對照(C)中的轉(zhuǎn)移％(對照FU-空白FU)/(完全FU-空白FU)×100測試樣品(D)中的轉(zhuǎn)移％(測試FU-空白FU)/(完全FU-空白FU)×100本發(fā)明還提供了一種鑒定能夠調(diào)節(jié)MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物的方法。該方法包括下列步驟(a)將熒光標(biāo)記的脂整合到供體泡中；(b)制備受體泡；(c)將受體泡和標(biāo)記的供體泡的等份試樣與測試化合物混合，測試化合物是已知的或未知的MTP的調(diào)節(jié)物；(d)將含有MTP的細(xì)胞勻漿或分離的MTP加入到含有供體泡、受體泡和測試化合物的混合物中；(e)在足夠允許熒光標(biāo)記的脂與MTP在標(biāo)記的脂從供體向受體泡轉(zhuǎn)移的過程中結(jié)合的條件下，將受體泡、標(biāo)記的供體泡、測試化合物和MTP的第一個等份試樣保溫一段時間；(f)在足夠允許熒光標(biāo)記的脂與MTP在標(biāo)記的脂從供體向受體泡轉(zhuǎn)移的過程中結(jié)合的條件下，將受體泡、標(biāo)記的供體泡和MTP的第二個等份試樣保溫一段時間；(g)測量在步驟(e)和(f)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光；以及(h)當(dāng)在步驟(e)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光與步驟(f)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光相比增加時，就鑒定到了增加MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物，而在步驟(e)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光與步驟f)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光相比減少時，就鑒定到了降低MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物。在本發(fā)明的另一方面，提供了測量MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的試劑盒。試劑盒包括了前面描述的受體泡和熒光標(biāo)記的供體泡。在優(yōu)選情況下，熒光標(biāo)記的供體泡含有甘油三酯、膽固醇酯或磷脂。在另一個優(yōu)選實施方案中，甘油三酯是任何含有NBD標(biāo)記的三?；视?，例如1，2-二油酰-3-NBD-甘油(NBD-TAG)。在另一個優(yōu)選實施方案中，磷脂是磷脂酰乙醇胺。在優(yōu)選情況下泡與適當(dāng)?shù)木彌_液混合，例如pH大約7.4的TrisHCl緩沖液。其它的緩沖液也可以使用，例如磷酸緩沖液和HEPES。構(gòu)成了試劑盒的一部分的受體和/或供體泡可以包括小的單層泡、多層泡、apoB-脂蛋白泡或磷脂酰膽堿(PC)泡。泡可以通過加入BSA來穩(wěn)定化。下面的實施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，但是并不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1材料與方法材料MTP是使用放射性分析方法從牛肝中純化的(20，21)，在以前的工作中已經(jīng)使用過(24-29)。PC和TAG來自AvantiLipids(Alabaster，AL)公司。熒光(硝基苯并二唑)-標(biāo)記的TAG來自MolecularProbes(Eugene，OR)公司。含有熒光標(biāo)記的膽固醇酯(CE)和磷脂(PL)的泡分別來自RoarBiomedical，Inc.(NewYork，NY)公司和CardiovascularTarget，Inc.(NewYork，NY)公司。異丙醇和其它化學(xué)試劑來自SigmaChemicalCo.(St.Louis，MO)。受體泡按照Wetterau及其同事描述的方法制備(20，21，30-32)。供體泡也按照他們的方法制備，只是在其中省略了心磷脂，并用熒光標(biāo)記的TAGs代替了放射性標(biāo)記的TAGs。已知量的熒光脂在異丙醇中稀釋，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，在將泡用異丙醇破壞后測定泡中的標(biāo)記的脂的量。泡中的甘油三油酸酯的量通過比色法分析定量(InfinityTM甘油三酯試劑盒；Sigma)。MTP抑制劑BMS200150(二苯基-丙基-哌啶基二氫-異吲哚)以前已經(jīng)描述(12)，由Bristol-MyersSquibb(Princeton，NJ)的HarisJamil博士惠贈。轉(zhuǎn)運(yùn)分析分析在Microfiuor2黑色的“U”型底Micro-titer板(ThermoLabsystems，F(xiàn)ranklin，MA)中進(jìn)行。在每個孔中加入3μl供體泡(每毫升450nmolPC和14nmolTAG)、3μl受體泡(每毫升2400nmolPC)、10μl10mMpH7.4的Tris-HCl緩沖液、2mMEDTA、150mMNaCl，用蒸餾水加到終體積100μl，加入純化的MTP(0.1-0.5μg)，做三份平行試驗。在某些實驗中，NaCl和BSA被加到終濃度分別為150mM和1mg/ml。板在37℃或室溫保溫不同的時間，然后用熒光讀板機(jī)(7620MicroplateFluorimeter；CambridgeTechnology，Watertown，MA)讀板，使用460nm激發(fā)波長和530nm發(fā)射波長。在確定空白值時，從孔中省略掉MTP。供體泡中的總的熒光通過在3μl供體泡中加入97μl異丙醇來測定。為了研究MTP的抑制，在加入MTP之前在反應(yīng)混合物中加入不同濃度的BMS200150。MTP的活性(轉(zhuǎn)移百分?jǐn)?shù))使用下面的公式計算轉(zhuǎn)移百分?jǐn)?shù)＝(分析孔中的任意熒光單位空白值)/(總的熒光單位空白值)×100。比活力被表示為每小時每微克蛋白的轉(zhuǎn)移百分?jǐn)?shù)。Cos-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞在含有10％胎牛血清和1％抗生素抗霉菌素(LifeTechnologies，Rockville，MD)的DMEM(CellgroMediatech，Inc.，Herndon，VA)中培養(yǎng)(37℃，5％CO2，加濕的培養(yǎng)箱)。在轉(zhuǎn)染前24小時將細(xì)胞(1×106)鋪在75cm2瓶中。在轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞大約為50-60％滿板。使用21μlFuGENE-6轉(zhuǎn)染試劑(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)將MTP表達(dá)載體(15)pRc-hMTP(7μg；在巨細(xì)胞病毒啟動子的控制下表達(dá)人MTP)導(dǎo)入Cos-7細(xì)胞。細(xì)胞在7ml培養(yǎng)基中在37℃和5％CO2下維持大約72小時。Cos-7細(xì)胞也用FuGENE-6單獨處理(假轉(zhuǎn)染)以用做對照。細(xì)胞勻漿中MTP活性的測定細(xì)胞勻漿中MTP的活性按照J(rèn)amil等的描述(12)進(jìn)行測定。滿底的細(xì)胞單層用冰冷的無菌的pH7.4的PBS洗滌，刮到5mlPBS中，轉(zhuǎn)移到15ml錐形管中，通過離心進(jìn)行沉淀(2500rpm，10分鐘，室溫)。此時，細(xì)胞沉淀可以在-70℃儲存。在勻漿時，在細(xì)胞沉淀中加入750μl勻漿緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.4，50mMKCl，和5mMEDTA)和7.5μl蛋白酶抑制劑混合物(Sigma目錄號P2714)。通過用連接到3ml注射器的針(29G，11/2英寸)反復(fù)吹吸將細(xì)胞懸浮，在冰上在一個帶有球的勻漿器中進(jìn)行勻漿(間隙0.253英寸，10次)。細(xì)胞勻漿液儲存在冰中，通過Bradford的方法(33)測定蛋白濃度，使用CoomassiePlus試劑(Pierce，Rockford，IL)，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)。用勻漿緩沖液將細(xì)胞勻漿液稀釋到蛋白濃度為1.5mg/ml。通過脫氧膽酸處理(12)將MTP從微粒體中釋放出來。為此目的，加入十分之一體積的0.54％pH7.4的脫氧膽酸鈉將細(xì)胞勻漿液的脫氧膽酸濃度調(diào)整到0.054％，在冰上放置30分鐘，不時混合。然后在10℃下在SW55Ti轉(zhuǎn)頭中以50000rpm離心1小時以除去細(xì)胞膜。上清液裝在截留分子量12-14kDa的透析袋中，用15mMpH7.4的Tris-HCl、40mMNaCl、1mMEDTA和0.02％NaN3溶液進(jìn)行透析，1小時后更換透析液，2小時后再更換透析液，然后透析過夜。從透析袋中中取出細(xì)胞勻漿液，用于蛋白測定和MTP分析。對于抑制研究來說，HepG2細(xì)胞與不同濃度的MTP抑制劑BMS200150保溫24小時，從細(xì)胞獲得的細(xì)胞勻漿液被用來進(jìn)行MTP分析。為了發(fā)展一種更快速的分析細(xì)胞內(nèi)MTP的方法，對Chang，Limanek和Chang描述的(34)細(xì)胞破碎方法進(jìn)行了評估。在該方法中，細(xì)胞首先暴露到低滲的緩沖液中，然后從板上刮離。暴露到低滲的緩沖液中導(dǎo)致細(xì)胞的膨脹，刮離使這些細(xì)胞破碎。細(xì)胞單層用冰冷的PBS洗兩次，用5mlpH7.6的Tris-HCl、1mMEGTA和1mMMgCl2在4℃洗1次。然后將細(xì)胞在室溫于5ml冰冷的pH7.6的Tris-HCl、1mMEGTA和1mMMgCl2中保溫2分鐘。將緩沖液吸出，在細(xì)胞中加入0.5ml同樣的緩沖液。細(xì)胞被刮下，收集在冰冷的管中，震蕩，離心(SW55Ti轉(zhuǎn)頭，50000rpm，10℃，1小時)，上清液被用于MTP分析和蛋白測定。測定大鼠肝微粒體中的MTP活性大鼠肝微粒體按照Wetterau和Zilversmit描述的(20，21)方法制備，進(jìn)行了輕微的修改。簡單地說，2g大鼠肝臟被切成小片，用冰冷的PBS洗2次。然后在2ml50mMpH7.4的Tris-HCl，5mMEDTA，250mM蔗糖和0.02％疊氮鈉溶液中使用Polytron勻漿器將小片進(jìn)行勻漿，離心(Beckman微量離心機(jī)，10900rpm，30分鐘，4℃)。保留上清液，用濃鹽酸將pH調(diào)整到5.1，在低溫攪動30分鐘，離心(Beckman微量離心機(jī)，13000rpm，30分鐘，4℃)。沉淀懸浮在2ml1mMpH7.6的Tris-HCl，1mMEGTA和1mMMgCl2中，震蕩，然后超速離心(SW55Ti轉(zhuǎn)頭，50000rpm，10℃，1小時)，上清液被用于MTP分析和蛋白測定。實施例II分析條件的最適化為了對MTP的熒光分析進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將TAGs整合到小的單層PC泡(供體泡)中。預(yù)計封裝將導(dǎo)致熒光團(tuán)的猝滅。事實上，用異丙醇破壞增加數(shù)量的供體泡導(dǎo)致可測量的熒光的增加(圖1A，完全)。這代表了泡中存在的熒光團(tuán)的總量。在破碎前，該熒光不能被檢測到，因為它在泡中猝滅了。還可以看出，供體泡是穩(wěn)定的，在不存在MTP時不將釋放出熒光團(tuán)。為了測定穩(wěn)定性，將供體泡與受體泡混合，在不存在MTP的情況下在30分鐘后測量熒光(圖1A，空白)?？瞻谉晒庵档姆秶谕耆档?3％到19％之間[15.7±2.7％(平均SD；n＝3)]?？瞻字悼赡艽砹藷晒鈭F(tuán)的少量泄露。然后假設(shè)轉(zhuǎn)運(yùn)用MTP從供體泡中提取TAG將隨著可檢測的熒光的增加而出現(xiàn)。將恒定量的MTP和受體泡與增加量的供體泡保溫，導(dǎo)致了熒光檢測的增加，表明了MTP對TAG的轉(zhuǎn)運(yùn)(圖1A，轉(zhuǎn)運(yùn))?！稗D(zhuǎn)運(yùn)”代表被MTP在泡之間轉(zhuǎn)運(yùn)的TAG的量。在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，MTP結(jié)合的熒光團(tuán)更可能暴露到水性環(huán)境中，現(xiàn)在可以被熒光光度計檢測到。熒光單位比空白值高40-47％。接下來，數(shù)據(jù)被用來計算TAG轉(zhuǎn)運(yùn)的百分?jǐn)?shù)(圖1B)。轉(zhuǎn)運(yùn)活性百分?jǐn)?shù)的增加持續(xù)到2μl供體泡(28pmolTAG)，在其后顯示出飽和。接下來研究了不同濃度的受體泡的影響。在這些實驗中，恒定量的MTP和供體泡與不同體積的受體泡保溫(圖1C)。被轉(zhuǎn)移的TAG的量隨著受體泡的量的增加而增加，在2μl時達(dá)到飽和。在較低濃度的受體泡時轉(zhuǎn)移的增加表明這些泡在分析條件下是有限的。但是，在2μl以上時，分析變得不依賴于受體泡的濃度。注意隨著受體泡濃度的增加可檢測的熒光沒有減少。這表明MTP在泡之間轉(zhuǎn)移脂，不引起脂在受體泡中單方向的沉積。在這些條件下，MTP在此過程中轉(zhuǎn)運(yùn)了20％存在于供體泡中的總TAG(圖1D)。在后面的研究中，使用了3μl的受體泡。為了確定分析內(nèi)的變異系數(shù)(CV)，在10個管中使用0.5gMTP、3μl供體泡和3μl受體泡進(jìn)行了轉(zhuǎn)移分析。觀察到的轉(zhuǎn)移百分?jǐn)?shù)是19.9±1.8(平均值±SD；n＝10)，分析內(nèi)的CV是0.09。同樣地，估計了分析間的偏差。對使用1μgMTP各3個平行樣進(jìn)行的7個獨立的測定的比較表明分析間的CV是0.19。在這些實驗中觀察到的轉(zhuǎn)移百分?jǐn)?shù)是34.5±3.0。圖1顯示了不同量的供體和受體泡對微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)介導(dǎo)的三?；视?TAG)的轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。A完全不同體積的供體泡通過加入100μl的異丙醇破碎，立即測定熒光單位。注意該值代表了泡中存在的熒光團(tuán)的總量，不是“空白”和“轉(zhuǎn)移”值的簡單的和。空白不同體積的供體泡與3μl受體泡按照實施例1的材料與方法中的描述在分析緩沖液(100μl)中保溫，在37℃保溫30分鐘后測量熒光單位。轉(zhuǎn)移保溫按照與空白相同的步驟進(jìn)行，除了在樣品中還包含0.5g純化的MTP之外。這代表了在給定時間內(nèi)被MTP轉(zhuǎn)運(yùn)的脂的量。在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，MTP結(jié)合的熒光脂最可能暴露到水性環(huán)境中，通過熒光光度計檢測。B按照材料與方法中的描述使用來自A的數(shù)據(jù)計算TAG轉(zhuǎn)移的百分?jǐn)?shù)。供體泡中TAG的濃度是14pmol/ml。C供體泡(3μl)與不同體積的受體泡和0.5g純化的MTP一起保溫(30分鐘，37℃)。用分析管中觀察到的熒光單位減去空白的熒光單位得到熒光單位。D按照實施例1材料與方法中的描述使用C獲得的數(shù)據(jù)計算轉(zhuǎn)移百分?jǐn)?shù)。出于這個目的，按照實施例1材料和方法中的描述將空白和完全的熒光單位同時測定三份。線圖和誤差條線代表平均值±SD(n＝3)。然后進(jìn)行實驗確定MTP活性所需的時間、溫度和NaCl濃度的影響(圖2)。按照實施例1材料與方法中的描述將不同量的MTP與供體和受體泡保溫。象實施例1材料與方法所描述的那樣包含了適當(dāng)?shù)耐耆涂瞻讟?。使用微孔板讀板器在指定的時間測量熒光讀數(shù)，每個測量三份。以TAG的轉(zhuǎn)運(yùn)百分?jǐn)?shù)對時間作圖。B溫度。實驗在兩個不同的微量滴定板上進(jìn)行。純化的MTP(0.25g/孔)與供體和受體泡保溫，進(jìn)行三份實驗。一塊板在37℃保溫，另一塊板留在室溫(RT)。在室溫(22℃)在不同的時間點讀取熒光讀數(shù)。CNaCl的影響。供體泡(3μl)、受體泡(3μl)和MTP(1μg)在1mMpH7.4的Tris-HCl和2mMEDTA中在存在不同指示濃度的NaCl的情況下保溫30分鐘，進(jìn)行三份實驗。線圖和誤差條線代表平均值±SD。在使用的所有不同的MTP濃度中，TAG轉(zhuǎn)移活性隨著時間增加直到30分鐘時(圖2A)。30分鐘后，轉(zhuǎn)移活性開始飽和。研究了溫度對轉(zhuǎn)移活性的影響(圖2B)。MTP的脂轉(zhuǎn)移活性同樣在室溫(22℃)和37℃下進(jìn)行，表明溫度對活性沒有明顯的影響。這些結(jié)果可能表明MTP的最適活性是在22℃下。NaCl對MTP活性的影響(圖2C)也被測定。加入增加濃度的NaCl直到150mM導(dǎo)致MTP活性的增加。更高濃度的NaCl表現(xiàn)出對轉(zhuǎn)移活性的抑制。因此可以推論，30分鐘的保溫和150mM的NaCl對測定MTP的活性是最適的。接下來，使用了不同濃度的純化的MTP和BSA研究了TAG轉(zhuǎn)移的特異性(圖3)。圖3A顯示的結(jié)果是在供體泡[3μl；每毫升450nmol磷脂酰膽堿(PC)和14nmolTAG]和受體泡(3μl；2400nmolPC/ml)與不同指定量的MTP或BSA保溫30分鐘后獲得的，進(jìn)行了三份平行實驗。在減去分析管的空白后得到熒光單位。從這些MTP結(jié)果獲得的數(shù)據(jù)(圖3A)被用來確定轉(zhuǎn)移活性百分?jǐn)?shù)。對于BSA來說，這些值是負(fù)數(shù)，沒有作圖。分析也在缺乏或存在BSA(0.1％)的情況下使用不同的指定量的純化MTP進(jìn)行(圖3C)。線圖和誤差條線代表平均值±SD。加入增加量的MTP導(dǎo)致可檢測的熒光的增加(圖3A)。相反，BSA的存在減少了可檢測的熒光的量，可能表示釋放的熒光被BSA猝滅了，或BSA對供體泡有穩(wěn)定作用，阻止了基本的熒光團(tuán)的泄露。在圖3B中，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換以計算在泡間經(jīng)歷了轉(zhuǎn)移的TAG的百分?jǐn)?shù)。在實驗條件下，被轉(zhuǎn)移的TAG的量在2μgMTP時達(dá)到飽和。在飽和時，40％的總TAG處于轉(zhuǎn)移的過程中，可能代表了MTP的最大結(jié)合能力。因為在空白樣品中BSA降低了熒光單位，據(jù)推理它可能對MTP分析有正的影響。此外，BSA的存在可以減少MTP和泡被試管表面吸附所引起的損失。為了試驗這個假說，在分析中使用了1mg/ml的BSA。如圖3C所示，在存在BSA的情況下測量的活性幾乎是在不存在BSA的情況下觀察到的活性的兩倍。這主要歸因于在存在BSA的情況下空白值的減少。在存在和不存在BSA時的空白值是總值的12.5±0.7％和18.5±0.5％(n＝3)。因此，BSA的加入提高了分析靈敏度，這最可能是通過防止熒光團(tuán)從供體泡中泄露而達(dá)成的。隨后，對用放射性標(biāo)記和熒光分析方法測定的MTP的比活性進(jìn)行了比較。使用放射性標(biāo)記分析方法測定的不同制備液中的比活性(每小時每毫克蛋白的轉(zhuǎn)移百分?jǐn)?shù))是12.5±2.4(n＝27)。在不存在BSA的情況下使用熒光分析方法測定的比活性是92.6±19.7(n＝20)，而在存在BSA的情況下測定的比活性是204.4±33.1(n＝7)。因此，熒光分析方法測定的比活性比使用放射性標(biāo)記分析方法觀察到的高。較高的比活性可能歸因于分析方法的較高靈敏度。造成不同的另一個原因可能是在這兩種分析方法中使用的參數(shù)不同。在放射性標(biāo)記分析方法中，測量的是轉(zhuǎn)移到受體泡的TAG的量。相反，本實施例中描述的熒光分析方法測量的是被MTP轉(zhuǎn)移的TAG的量。表1使用脫氧膽酸方法測定細(xì)胞中的MTP活性MTP微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。aCos-7細(xì)胞用MTP表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染。受體泡的功能MTP分析由三個成分組成供體泡、受體泡和MTP。顯然，供體泡和MTP是必需的。推測MTP能夠在供體泡之間轉(zhuǎn)移脂，受體泡對于活性測量來說可能不是必需的。為了試驗這個假說，不同量的供體泡(每毫升450nmolPC和14nmolTAG)在分析緩沖液(100μl)中保溫，分別為不含受體泡和MTP(只有DV)、含有0.5g純化的MTP(DV+MTP)、含有3μl受體泡(DV+AV)或含有3μl受體泡(2400nmolPC/ml)和0.5μg純化的MTP(DV+AV+MTP)。在37℃保溫30分鐘測量熒光單位。數(shù)據(jù)作圖于圖4A中。圖4A顯示的數(shù)據(jù)按照材料和方法中的描述被用來計算轉(zhuǎn)移百分?jǐn)?shù)。線圖和誤差條線代表平均值±SD。增加量的供體泡與(DV+AV)或不與(只有DV)受體泡保溫給出同樣的熒光讀數(shù)，表明在不存在MTP時幾乎沒有TAG的轉(zhuǎn)運(yùn)(圖4A)。這些數(shù)據(jù)與圖1A中的空白一致。增加量的供體泡與MTP(DV+MTP)保溫導(dǎo)致了熒光的一定增加，表明脂的一定轉(zhuǎn)運(yùn)。相反，當(dāng)受體泡被包含在反應(yīng)混合物中(DV+AV+MTP)時觀察到了熒光的極大增加。這些數(shù)據(jù)然后被用來計算TAG轉(zhuǎn)運(yùn)的百分?jǐn)?shù)(圖4B)。在不存在受體泡的情況下(DV+MTP)，TAG的轉(zhuǎn)運(yùn)在4％到16％的范圍內(nèi)。但是在存在受體泡的情況下(DV+AV+MTP)，MTP能夠轉(zhuǎn)運(yùn)供體泡中存在的TAG的大約40％。這些數(shù)據(jù)證明受體泡的存在極大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)運(yùn)過程。MTP轉(zhuǎn)運(yùn)不同的脂到不同的受體不同類型的受體泡對MTP轉(zhuǎn)運(yùn)不同的脂的影響被研究。首先，PC或PC/TAG泡被用做受體。在使用這些受體的三份平行實驗中觀察到的轉(zhuǎn)運(yùn)百分?jǐn)?shù)分別是33±2.6和30.9±1.3，表明在受體泡中TAG的缺乏對轉(zhuǎn)移活性沒有任何明顯的影響。已知除了TAG之外MTP還能轉(zhuǎn)運(yùn)其它脂類(20)。因此，進(jìn)行了實驗以評估用這種分析方法研究TAG之外CEs和PLs轉(zhuǎn)運(yùn)的適合性(圖5)。在該實驗中，小的單層泡(PC/TAG泡)、apoB-脂蛋白(含有VLDL和LDL)和HDL被用做受體，在4個小時的時間段中研究了轉(zhuǎn)運(yùn)。本實驗是在研究圖2描述的最適化條件之前進(jìn)行的。在這些早期的實驗中，在測量轉(zhuǎn)移活性之前保溫進(jìn)行了較長的時間。使用了三種不同類型的供體泡(3μl)，分別含有TAG(A-C)、膽固醇酯(D-F)或磷脂(G-I)。受體泡(3μl；2400nmolPC/ml)是小的單層泡(PC/TAG泡；A、D和G)、載脂蛋白B(apoB)脂蛋白(VLDL和LDL；B、E和H)以及HDLs(10mg蛋白/ml；C、F和I)。將供體泡和受體泡在不存在(對照)和存在1μg純化的MTP(MTP)的情況下保溫指定的時間，進(jìn)行三份平行實驗，按照材料與方法的描述測量熒光。線圖和誤差條線代表平均值±SD。結(jié)果表明當(dāng)供體泡與小的單層PC/TAG泡(圖5A)和apoB脂蛋白(圖5B)保溫時MTP轉(zhuǎn)運(yùn)了TAG，但是與HDL保溫時(圖5C)不能轉(zhuǎn)運(yùn)。在保溫4小時后轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致熒光單位增加了109-172％(圖5A、B)。同樣地，在存在PC/TAG泡(圖5D)和apoB脂蛋白(圖5E)時MTP轉(zhuǎn)運(yùn)CE，但在存在HDL時(圖5F)不能轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)供體泡與PC/TAG泡保溫時，MTP能夠轉(zhuǎn)運(yùn)PLs；在4小時時熒光增加了186％(圖5G)。但是，在存在apoB脂蛋白作為受體時MTP轉(zhuǎn)運(yùn)PL的研究難以解釋(圖5H)。這是由于當(dāng)供體泡與apoB脂蛋白在不存在MTP的情況下保溫時背景熒光有極大的增加(比較圖5G、H中的對照；也注意這些圖中不同的y值)。同樣地，當(dāng)HDL用做受體時MTP不轉(zhuǎn)運(yùn)PL(圖5I)。這些研究顯示出當(dāng)小的單層泡和apoB脂蛋白用做受體時，MTP的活性能夠轉(zhuǎn)運(yùn)中性脂TAG和CE。測量細(xì)胞內(nèi)的MTP活性下一個問題是確定本分析方法是否能夠用于測量細(xì)胞內(nèi)的MTP活性(表1)。微粒體的MTP按照J(rèn)amil等的描述(12)用脫氧膽酸處理而釋放。用或不用MTP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞，以確定MTP分析的特異性(表1)。正如預(yù)期的那樣，在假轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞中沒有檢測到MTP。但是，用MTP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)致了Cos-7細(xì)胞中MTP活性的增加，這與其它的研究一致(15，29)。同樣地，在HepG2和分化的Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞勻漿中可以測量到MTP活性。這些結(jié)果表明這種新方法可以用來測定細(xì)胞內(nèi)的MTP活性。脫氧膽酸的方法煩瑣，包括了幾個步驟，需要至少兩天時間。為了簡化這個步驟，對Chang，Limanek和Chang的方法(34)進(jìn)行了評估，這種方法中包括了用低滲緩沖液破碎細(xì)胞，制備分析用的細(xì)胞提取液所需的時間要少得多。大鼠肝臟微粒體用低滲緩沖液處理，釋放出的成分被用于MTP活性的測定。肝臟微粒體成分中的MTP比活性(每小時每毫克的轉(zhuǎn)移百分?jǐn)?shù))是0.498±0.09(平均值±SD，n＝9)。對于轉(zhuǎn)運(yùn)分析，使用了40-50g細(xì)胞蛋白，進(jìn)行了三份平行實驗，活性被測量到1小時。如圖6和10所示，兩種方法得到了同樣的MTP活性。因此，由于需要較少的時間的較少的操作，在測量細(xì)胞內(nèi)MTP活性時低滲處理是較好的步驟。MTP活性的抑制然后進(jìn)行了測量MTP拮抗物對它的活性的影響的實驗(圖7)。出于這個目的，使用了Jamil等描述的(12)MTP抑制劑BMS200150。純化的MTP(1g)與供體和受體泡在存在指定濃度的MTP抑制劑BMS200150的情況下保溫30分鐘。如圖7A所示，BSM200150濃度的增加導(dǎo)致純化的MTP活性的劑量依賴性抑制。IC50是0.08M，位于其他人報道(12)的范圍之內(nèi)。接下來，HepG2細(xì)胞與不同濃度的抑制劑保溫24小時，使用脫氧膽酸方法(12)制備勻漿液，分析MTP的活性。細(xì)胞被洗滌，使用材料和方法中描述的脫氧膽酸方法制備裂解液。對于轉(zhuǎn)運(yùn)分析，使用了40-50g細(xì)胞蛋白，進(jìn)行了三份平行實驗。如圖7B所示，BMS200150濃度的增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MTP活性的降低?！?.3M的IC50值與發(fā)表的研究(12)一致。用純化的MTP和細(xì)胞裂解液獲得的IC50值的差別可能是由于在細(xì)胞裂解液中存在其它能夠與抑制劑相互作用的蛋白，從而降低了它的效用。這些研究表明本分析方法在測量MTP活性及其被拮抗劑的抑制方面是有用的。參考文獻(xiàn)1.Hussain，M.M.，J.Shi，和P.Dreizen.2003.Microsomaltriglyceridetransferproteinanditsroleinapolipoprotein-B-lipoproteinassembly.(微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其在載脂蛋白B-脂蛋白裝配中的作用。)J.LipidRes.4422-32.2.Hussain，M.M.，J.Iqbal，K.Anwar，P.Rava，和K.Dai.2003.Microsomaltriglyceridetransferproteinamultifunctionalprotein.(微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一種多功能的蛋白。)Front.Biosci.8S500-S506.3.Bakillah，A.，和A.EIAbbouyi.2003.Theroleofmicrosomaltriglyceridetransferproteininlipoproteinassemblyanupdate.(微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在脂蛋白裝配中的作用更新。)Front.Biosci.8D294-D305.4.Shelness，G.S.，和J.A.Sellers.2001.Very-low-densitylipoproteinassemblyandsecretion.(極低密度脂蛋白的裝配和分泌。)Curr.Opin.Lipidol.12151-157.5.Gordon，D.A.，和H.Jamil.2000.Progresstowardsunderstandingtheroleofmicrosomaltriglyceridetransferproteininapolipo-protein-Blipoproteinassembly.(在理解微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在載脂蛋白B脂蛋白裝配中的功能方面的進(jìn)展)Biochim.Biophys.Acta.148672-83.6.Wetterau，J.R.，M.C.M.Lin，和H.Jamil.1997.Microsomaltriglyceridetransferprotein.(微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)Biochim.Biophys.Acta.1345136-150.7.Hussain，M.M.2000.Aproposedmodelfortheassemblyofchylomicrons.(乳糜微粒裝配的建議模型)Atherosclerosis.1481-15.8.Davis，R.A.1999.CellandmolecularbiologyoftheassemblyandsecretionofapolipoproteinB-containinglipoproteinsbytheliver.(肝臟裝配和分泌含有載脂蛋白B的脂蛋白的細(xì)胞和分子生物學(xué))Biochim.Biophys.Acta.14401-31.9.Fisher，E.A.，和H.N.Ginsberg.2002.ComplexityinthesecretorypathwaytheassemblyandsecretionofapolipoproteinB-containinglipoproteins.(分泌途徑中的復(fù)雜性含有載脂蛋白B的脂蛋白的裝配和分泌)J.Biol.Chem.27717377-17380.10.Wetterau，J.R.，L.P.Aggerbeck，M-E.Bouma，C.Eisenberg，A.Munck，M.Hermier，J.Schmitz，G.Gay，D.J.Rader，和R.E.Gregg.1992.Absenceofmicrosomaltriglyceridetransferproteininindividualswithabetalipoproteinemia.(在患有無β脂蛋白血癥的個體中缺少微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)Science.258999-1001.11.Shoulders，C.C.，D.J.Brett，J.D.Bayliss，T.M.E.Narcisi，A.Jarmuz，T.T.Grantham，P.R.D.Leoni，S.Bhattacharya，R.J.Pease，P.M.Cullen，S.Levi，P.G.H.Byfield，P.Purkiss，和J.Scott.1993.Abetalipoproteinemiaiscausedbydefectsofthegeneencodingthe97kDasubunitofamicrosomaltriglyceridetransferprotein.(無β脂蛋白血癥是由于編碼微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白97kDa亞基的基因缺陷引起的)Hum.Mol.Genet.22109-2116.12.Jamil，H.，D.A.Gordon，D.C.Eustice，C.M.Brooks，J.K.Dickson，J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.R.McLean.1991.Structuralpropertiesofthemicrosomaltriglyceride-transferproteincomplex.(微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì))Biochemistry.304406-4412.31.Atzel，A.，和J.R.Wetterau.1993.Mechanismofmicrosomaltriglyceridetransferproteincatalyzedlipidtransport.(微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白催化的脂運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制)Biochemistry.3210444-10450.32.Atzel，A.，和J.R.Wetterau.1994.Identificationoftwoclassesoflipidmoleculebindingsitesonthemicrosomaltriglyceridetransferprotein.(兩類脂分子結(jié)合位點在微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上的鑒定)Biochemistry.3315382-15388.33.Bradford，M.M.1976.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.(一種利用蛋白-染料結(jié)合的原理快速靈敏地對微克量級蛋白進(jìn)行定量的方法)Anal.Biochem.72248-254.34.Chang，T.Y.，J.S.Limanek，和C.C.Chang.1981.Asimpleandefficientprocedurefortherapidhomogenizationofculturedanimalcellsgrowninmonolayer.(一種簡單有效的對單層生長的培養(yǎng)的動物細(xì)胞進(jìn)行快速勻漿的方法)Anal.Biochem.116298-302.權(quán)利要求1.一種測量微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTP)水平的方法，該方法包括(a)制備其中整合了熒光標(biāo)記的脂的供體泡；(b)制備受體泡；(c)將含有MTP的細(xì)胞勻漿或分離的MTP與受體泡和標(biāo)記的供體泡，在足夠允許熒光標(biāo)記的脂與MTP在標(biāo)記的脂從供體向受體泡轉(zhuǎn)移的過程中結(jié)合的條件下，保溫一段時間；以及(d)測量與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光。2.權(quán)利要求1的方法，其中的細(xì)胞勻漿包括表達(dá)MTP的動物細(xì)胞。3.權(quán)利要求1的方法，其中的細(xì)胞勻漿包括來自表達(dá)MTP的昆蟲或微生物的細(xì)胞。4.權(quán)利要求1的方法，其中的熒光標(biāo)記的脂是甘油三酯、膽固醇酯(CE)或磷脂。5.權(quán)利要求4的方法，其中的甘油三酯是三酰基甘油(TAG)。6.權(quán)利要求5的方法，其中的熒光標(biāo)記的TAG含有至少一個NBD在TAG的任何位置，以及脂肪酸在其它的位置上。7.權(quán)利要求5的方法，其中的熒光標(biāo)記的三?；视褪?，2-二油?；?3-NBD甘油(NBD-TAG)。8.權(quán)利要求4的方法，其中的熒光標(biāo)記的CE是NBD-CE。9.權(quán)利要求4的方法，其中的磷脂含有至少一個NBD。10.權(quán)利要求1的方法，其中的受體泡是小的單層泡、多層泡、apoB-脂蛋白泡或磷脂酰膽堿(PC)泡。11.權(quán)利要求1的方法，其中的供體泡是含有NBD標(biāo)記的脂的磷脂酰膽堿(PC)泡。12.一種鑒定能夠調(diào)節(jié)MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物的方法，該方法包括(a)將熒光標(biāo)記的脂整合到供體泡中；(b)制備受體泡；(c)將受體泡和標(biāo)記的供體泡的等份試樣與測試化合物混合，該測試化合物是已知的或未知的MTP的調(diào)節(jié)物；(d)將含有MTP的細(xì)胞勻漿或分離的MTP加入到含有供體泡、受體泡和測試化合物的混合物中；(e)在足夠允許熒光標(biāo)記的脂與MTP在標(biāo)記的脂從供體向受體泡轉(zhuǎn)移的過程中結(jié)合的條件下，將受體泡、標(biāo)記的供體泡、測試化合物和MTP的第一個等份試樣保溫一段時間；(f)在足夠允許熒光標(biāo)記的脂與MTP在標(biāo)記的脂從供體向受體泡轉(zhuǎn)移的過程中結(jié)合的條件下，將受體泡、標(biāo)記的供體泡和MTP的第二個等份試樣保溫一段時間；(g)測量在步驟(e)和(f)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光；以及(h)在步驟(e)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光與步驟(f)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光相比增加時，就鑒定到了增加MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物，而在步驟(e)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光與步驟(f)中獲得的與MTP結(jié)合的熒光標(biāo)記的脂的熒光相比減少時，就鑒定到了降低MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物。13.權(quán)利要求4和5的方法，其中的甘油三酯是含有NBD的三酰基甘油(TAG)。14.權(quán)利要求4的方法，其中的磷脂是任何含有NBD的磷脂。15.權(quán)利要求1的方法，其中的受體泡是小的單層泡、apoB-脂蛋白泡或磷脂酰膽堿(PC)泡。16.權(quán)利要求1的方法，其中的供體泡是含有NBD標(biāo)記的脂的小單層泡。17.權(quán)利要求12的方法，其中的細(xì)胞勻漿包含表達(dá)MTP的動物細(xì)胞。18.權(quán)利要求12的方法，其中的細(xì)胞勻漿含有來自表達(dá)MTP的昆蟲和微生物的細(xì)胞。19.權(quán)利要求12的方法，其中的熒光標(biāo)記的脂是甘油三酯、膽固醇酯或磷脂。20.權(quán)利要求12的方法，其中的甘油三酯是任何NBD標(biāo)記的三?；视?。21.權(quán)利要求18的方法，其中的磷脂是磷脂酰乙醇胺。22.權(quán)利要求12的方法，其中的受體泡是小的單層泡、多層泡、apoB-脂蛋白泡或磷脂酰膽堿(PC)泡。23.權(quán)利要求12的方法，其中的供體泡是磷脂酰膽堿(PC)泡、小的單層泡或多層泡。24.一種測量MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的試劑盒，該試劑盒含有受體泡和熒光標(biāo)記的供體泡。25.權(quán)利要求24的試劑盒，其中的熒光標(biāo)記的供體泡含有甘油三酯、膽固醇酯或磷脂。26.權(quán)利要求25的試劑盒，其中的甘油三酯是任何含有NBD標(biāo)記的三?；视汀?7.權(quán)利要求26的試劑盒，其中的三酰基甘油是1，2-二油?；?3-NBD甘油(NBD-TAG)。28.權(quán)利要求25的試劑盒，其中的磷脂是磷脂酰乙醇胺。29.權(quán)利要求24的試劑盒，其中的受體泡是小的單層泡、多層泡、apoB-脂蛋白泡或磷脂酰膽堿(PC)泡。30.權(quán)利要求24的試劑盒，其中的供體泡是小的單層泡、多層泡、apoB-脂蛋白泡或磷脂酰膽堿(PC)泡。31.權(quán)利要求24的試劑盒，其中的泡通過加入BSA而穩(wěn)定。全文摘要本發(fā)明針對可以自動化和高通量篩選的分析微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTP)的方法。該分析方法可以用來測量細(xì)胞和組織勻漿中的MTP活性以及純化的MTP的MTP活性。本發(fā)明提供的方法具有簡易、快速、靈敏、不使用帶負(fù)電荷的脂、可廣泛用于研究純化的和細(xì)胞內(nèi)的MTP的不同的脂轉(zhuǎn)移活性以及能夠測量抑制活性的優(yōu)點。此外，還提供了鑒定能夠調(diào)節(jié)MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的化合物的方法。本發(fā)明還提供了測量MTP的脂轉(zhuǎn)移活性的試劑盒。文檔編號G01N21/64GK1894419SQ200480001499公開日2007年1月10日申請日期2004年6月25日優(yōu)先權(quán)日2003年6月27日發(fā)明者馬哈茂德·M·侯賽因,胡姆蘭·阿塔爾,賈漢吉爾·伊克巴勒申請人:紐約州立大學(xué)研究基金會