專利名稱：微芯片、用于提取核酸的試劑盒以及核酸的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微芯片、用于提取核酸的試劑盒以及核酸的提取方法。
本申請要求以于2003年3月24日在日本提交的日本專利申請2003-081605為優(yōu)先權(quán)，通過參考將其應(yīng)用于本申請。
背景技術(shù)：
通常，已知微芯片技術(shù)采用微細(xì)加工技術(shù)如平板蝕刻(lithography)等，在基底如玻璃的表面上形成深100μm且寬約500μm或更小的溝槽，該溝槽被用作液體或氣體的微通道，以便進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)、生化反應(yīng)、溶劑萃取、氣液分離，以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行微量組分化學(xué)分析或非接觸式光學(xué)分析。
就微芯片技術(shù)而言，本申請的發(fā)明人也提出一種測量方法，將作為反應(yīng)載體的微珠插入微通道，并在微通道中設(shè)有壩型檢測部(文獻(xiàn)1)。
隨著分子遺傳學(xué)或分子生物學(xué)的最新進(jìn)展，以及其應(yīng)用擴(kuò)展到醫(yī)療保健領(lǐng)域，從液體樣品中提取核酸已成為一個非常重要的問題。因此，已經(jīng)研究采用微芯片技術(shù)來提取核酸。迄今，已提出采用二氧化硅珠的方法、采用二氧化硅微柱的方法或采用二氧化硅膜的方法(文獻(xiàn)2-4)。
然而，在常規(guī)的微芯片技術(shù)中，例如通過采用二氧化硅微柱或二氧化硅過濾器來提取核酸的方法，都具有這樣的的基本問題，即不期望的高成本，并且當(dāng)二氧化硅微柱或二氧化硅過濾器被污染時，它們不能用新的微柱或新的二氧化硅膜來代替。此外，在現(xiàn)有的采用微珠諸如二氧化硅等的方法中，高壓是必需的，以便將微珠注入微通道。因此，微通道不能輕易地用珠填滿。
在采用壩型檢測部攔截微珠的常規(guī)方法中，在液體樣品的流動過程中容易引起停滯，因而難以平穩(wěn)方便地輸送諸如二氧化硅等的微珠。
此外，通常情況下，當(dāng)通過采用以玻璃或石英作為微芯片的基底而形成微通道時，在通道中容易產(chǎn)生灰塵，并且特別難以清除灰塵。
下面顯示了相關(guān)的文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)作為參考應(yīng)用于本申請。
1K.Sato et al.，Anal.Chem.72，1144-1147(2000)。
2L.Ceriotti et al.，(2002)Proceedings of the micro TAS 2002 symposiumNara，pp.175-177。
3J.Kim et.al.，(2002)Proceedings of the micro TAS 2002 symposium，Nara，pp.224-226。
4Q.Wu et al.，(2002)Proceedings of the micro TAS 2002 symposium，Nara，pp.198-200。

發(fā)明內(nèi)容
因此，為了解決相關(guān)領(lǐng)域的上述問題，本發(fā)明的一個目的就是提供一種新技術(shù)的微芯片，以及一種采用該微芯片的核酸提取新方法，其中所述新技術(shù)作為采用微珠的微芯片技術(shù)可以以低成本進(jìn)行生產(chǎn)和制備，可以抑制在液體樣品流動過程中的停滯(stagnation)產(chǎn)生，可以平穩(wěn)簡單地注射、填充和輸送微珠，并且也可以抑制灰塵的產(chǎn)生，其中所述微珠不僅能有效地用于提取核酸，而且也可用作各種類型的反應(yīng)載體。
為實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的微芯片具有由設(shè)在上下基底的連接面中的溝槽部形成的微通道，該微通道設(shè)有間隙部，所述間隙部使得在截面的上下、左右以及上下左右的中間部的通道截面減小。該間隙部可由溝槽部中的凸出部形成。此外，該間隙部可以由分別設(shè)在上下基底內(nèi)的溝槽部中的對向設(shè)置的凸出部形成。而且，間隙部可以通過將一個基底的凸出部插入到另一基底的溝槽部中而形成。此外，間隙部的截面尺寸可以通過上下基底的至少一個可移動凸出部而改變。
更進(jìn)一步，間隙部的截面尺寸為可以攔截插入微通道中的微珠所需的尺寸。微通道的內(nèi)壁表面可以用表面處理劑修飾。
更進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的用于提取核酸的試劑盒包括上述微芯片和具有表面羥基的微珠。具有表面羥基的微珠為直徑10μm或更小的二氧化硅微珠、中空的二氧化硅微珠和樹脂微珠中的至少一種。在內(nèi)壁表面上具有表面羥基的微芯片的微通道中，表面羥基可以通過表面處理劑進(jìn)行被覆處理。該表面處理劑為一種硅烷偶聯(lián)劑(coupling agent)，其含有三烷基鹵代硅烷作為一種主要組分。
此外，一種用于核酸的提取方法采用了用于提取核酸的上述試劑盒。待處理液體中的核酸被吸附到微芯片的微通道中的微珠表面上。更進(jìn)一步，在存在離液序列高的離子的條件下，核酸可以被吸附到微珠表面上。


圖1的分解透視圖，示意性地顯示了一個微芯片。
圖2A和2B為從圖1中的方向A和B所觀察到的間隙部31的截面圖。
圖3A-3C的截面圖顯示了其它實例的間隙部31。
圖4A和4B的截面圖顯示了另一間隙部31的一個實例。
圖5為光學(xué)顯微鏡照片的示意圖，其示例作為一種實施例的DNA的吸附。
具體實施例方式
現(xiàn)在將參照附圖描述根據(jù)本發(fā)明的微芯片、用于提取核酸的試劑盒以及核酸提取方法的一種實施式。
圖1和2示意性地顯示了根據(jù)本發(fā)明的微芯片的局部結(jié)構(gòu)。圖1顯示了下基底1與上基底2分開的狀態(tài)。圖2顯示了從圖1所示的箭頭A和B標(biāo)記的方向觀察，間隙部31的局部截面圖，其中當(dāng)上下基底1和2連接在一起時，該間隙部設(shè)在微通道3中。
例如，在圖1和2所示的微芯片中，微通道3由設(shè)在上下基底1和2的連接面中的溝槽部11和21形成。在微通道3中，設(shè)有使得截面的上下的中央部的通道截面減小的間隙部31。
更具體地，在圖1和2所示的實施例中，上下基底1和2的溝槽部11和21相互對向設(shè)置以形成微通道3。分別設(shè)在溝槽部11和21中的凸出部12和22相互對向設(shè)置以形成間隙部31。
間隙部31可以位于微通道3截面的中間部分，所述間隙部不僅可以位于截面上下的中間部分，如同圖2所示的狹縫型孔，而且也可以位于截面左右的中間部分，例如，如圖3A示意性地顯示的那樣，或者在截面上下左右的中間部分，如圖3B所示。應(yīng)當(dāng)理解，間隙部31的截面可以為各種形狀。例如，如圖3C所示，間隙部的截面可以為圓形。通過用于形成微芯片的溝槽部11和21以及其凸出部12和22的微細(xì)加工方法或其條件，以及注入微通道等中的微珠的種類或尺寸，可以確定這些形狀。
間隙部31可以不由分別設(shè)在上下基底1、2的各溝槽部中11和21中的凸出部12和22形成。例如，如圖4所示，微通道3本身例如由設(shè)在下基底1中的溝槽部11形成。上基底2設(shè)置成一個蓋板。在微通道3的結(jié)構(gòu)中，設(shè)在上基底2中的凸出部23插入溝槽部11中。凸出部23與溝槽11中的凸出部12相互對向以形成間隙部31。
應(yīng)當(dāng)理解，除了由上述凸出部12、22和23組成的結(jié)構(gòu)外，間隙部31可以具有各種結(jié)構(gòu)。
而且，這些凸出部12、22和23不僅可采用微細(xì)加工方法通過對基底1和2進(jìn)行平板蝕刻(lithography etching)形成，而且也可以例如通過聚合物的硬化而形成。此外，可以由相對于微通道3在外部的微型元件的作用，或者可以將微通道3本身變形來形成間隙部31。
在任一種情況下，在根據(jù)本發(fā)明的微芯片中，微通道3或間隙部31可以簡單地以低成本來生產(chǎn)和制備。而且，由于間隙部31設(shè)在微通道3截面的中間部分，當(dāng)將微珠注入微通道3時，可以抑制在流體如液體或氣體的流動過程中產(chǎn)生停滯，可以平穩(wěn)簡單地注射微珠，并且也可以攔截微珠。
當(dāng)如上所述使用微珠時，設(shè)在微通道3中的間隙部31具有可攔截注入微通道3的微珠的截面尺寸。此外，例如可考慮移動上述凸出部或與凸出部具有相同功能的元件，從而可以改變間隙部的截面尺寸31。在其截面尺寸發(fā)生改變的間隙部31中，攔截微通道3中的微珠后，截面可大大增加，從而微珠可以移動到下游區(qū)域。通常，為了排出微珠，需要從與注射方向相反的方向排出微珠。然而，在其截面可改變的間隙部31中，可以在與注射方向相同的前進(jìn)方向排出微珠。
例如，在如上所述的根據(jù)本發(fā)明的微芯片中，根據(jù)其使用目的、物體的類型或性能，內(nèi)壁表面可以采用表面處理劑修飾，從而使得樣品原料、雜質(zhì)、灰塵等不粘附到微通道3。例如，在由玻璃或石英制成的微芯片的情況下，表面羥基通常存在于微通道3的內(nèi)壁表面上。因此，表面羥基有可能連接到核酸，從而使原料諸如核酸等很難被提取和分離。在這種情況下，將表面羥基用表面處理劑有效地被覆，以使表面羥基失活。根據(jù)本發(fā)明的微芯片與微珠結(jié)合以獲得一種特別有用的試劑盒，所述試劑盒可用于常見的化學(xué)合成或分析。具體是，在本發(fā)明中，提供了一種這樣的試劑盒，其為用于提取核酸的試劑盒，該試劑盒包括上述微芯片和具有表面羥基的微珠。
在這種情況下，對于具有表面羥基的微珠，優(yōu)選直徑為10μm或更小的二氧化硅微珠、中空的二氧化硅微珠以及由樹脂諸如表面上添加有羥基的聚苯乙烯等制成的珠。根據(jù)其比重水平，直徑為10μm或更大的二氧化硅微珠幾乎不能在微通道3中得以輸送。
而且，在根據(jù)本發(fā)明的用于提取核酸的試劑盒中，對于具有表面羥基的微通道內(nèi)壁表面，表面羥基優(yōu)選用硅烷偶聯(lián)劑被覆處理。
最優(yōu)選帶有一個鹵素原子的三烷基鹵代硅烷，其為一種硅烷偶聯(lián)劑，采用了由下述通式所代表的一種化合物。
通式 在這里，公式中的R1、R2和R3代表相同或不同的烷基。X代表鹵素原子，如氯原子。在硅烷化合物具有兩個或多個鹵素原子諸如氯原子等的情況下，有可能產(chǎn)生灰塵，不僅是由于鹵素原子作為反應(yīng)基團(tuán)與內(nèi)壁表面上的羥基發(fā)生反應(yīng)，而且由于分子的聚合反應(yīng)。因此，制約著上述硅烷化合物的用途。
作為一種核酸提取方法，例如，在圖1和2所示的微芯片的實例中，從液體導(dǎo)入部4注射包含微珠的液體。在微通道3中，在間隙部31中攔截包含微珠的液體。隨后，從液體導(dǎo)入部5導(dǎo)入樣品以允許微珠吸附核酸。殘留的液體從排放部6排出，通過吸附使核酸得以提取。通過導(dǎo)入解吸液，可以使被吸附的核酸從微珠解吸。隨后，優(yōu)選在存在離液序列高的離子的條件下提取核酸。
根據(jù)本發(fā)明，可以簡單高效地提取核酸。
現(xiàn)在，下面顯示了實施例并進(jìn)行了更具體地描述。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不局限于下述實施例。
(實施例1)輸送微珠準(zhǔn)備一個由玻璃制成的微芯片(圖1)，其具有直徑為50μm且長60mm的微通道，并在中間部分含有一個檢測結(jié)構(gòu)。由微通道的上部和下部中的凸出部形成具有壩型攔截結(jié)構(gòu)的間隙部。位于微通道中間部分的該間隙部形成垂直長度為2μm、水平長度為50μm的狹縫形狀。微通道的一部分用作注射部，并且另一部分用作排放部。在注射部設(shè)置一個液體容器，并且將一個微量管連接到排放部。組裝一個實驗系統(tǒng)，其中，注射泵連接到排放部的微量管，并且注入液體容器中的液體可以通過操作注射泵而吸出并注入微通道。在這里，將懸浮在純水中的微珠注入液體容器，并采用光學(xué)顯微鏡觀察微珠在微通道中的輸送。制備了二氧化硅微珠(直徑為10μm或更小)、二氧化硅微珠(直徑為10μm或更大)、中空的二氧化硅微珠(直徑為2-20μm)和表面添加有羥基的聚苯乙烯微珠(直徑為20μm)作為微珠。以10μl/分的流速吸取包含微珠的液體。除二氧化硅微珠(直徑為10μm或更大)之外，所有微珠都令人滿意地在微通道中輸送并且可以在緊接攔截結(jié)構(gòu)的間隙部前方的部分中形成珠柱。另一方面，當(dāng)采用直徑為10μm或更大的二氧化硅微珠進(jìn)行相同實驗時，輸送在微通道的半途中停止，從而不能充分地形成柱。特別是，中空的二氧化硅微珠和表面添加有羥基的聚苯乙烯微珠可以令人滿意地得以輸送，如同二氧化硅納米珠(珠直徑為1μm或更小)那樣。
當(dāng)將純水放入液體容器并注入微通道時，除二氧化硅微珠(直徑為10μm或更大)之外，所述微珠可以在微通道中輸送并排放到注射泵。
(實施例2)微通道內(nèi)壁的表面修飾處理過程由玻璃或石英制作的微芯片的情況下，為防止核酸粘附到微通道的內(nèi)壁表面，微通道內(nèi)壁上的表面羥基需要被被覆。為了被覆表面羥基，廣泛采用一種通過具有可與烷基反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)的硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行的表面修飾處理方法。因此，在微通道內(nèi)壁的處理過程中，可通過采用硅烷偶聯(lián)劑實現(xiàn)表面修飾過程。然而，常用的十八烷基三氯硅烷具有三個氯原子作為用于修飾表面的反應(yīng)基團(tuán)，而且其不僅與微通道內(nèi)壁上的表面羥基反應(yīng)，還通過分子聚合形成聚合物。因此，十八烷基三氯硅烷分子相互反應(yīng)形成聚合物，從而產(chǎn)生灰塵。不是在微通道而是在平的基底如幻燈片玻璃的表面修飾過程中產(chǎn)生的灰塵可采用溶劑沖洗，不會產(chǎn)生問題。然而，在微通道內(nèi)壁的修飾過程中產(chǎn)生的灰塵不能輕易地被洗掉。當(dāng)將攔截結(jié)構(gòu)設(shè)在微通道中時，灰塵特別難清除。在微通道中殘留的灰塵不僅阻礙在微通道中輸送液體或珠，而且在核酸的吸附過程中引起麻煩。此外，也廣泛采用了二氯二甲基硅烷，其具有兩個氯原子作為反應(yīng)基團(tuán)。然而，二氯二甲基硅烷具有低沸點(70℃)和高揮發(fā)性，因而其安全性很低。而且，由于二氯二甲基硅烷具有兩個反應(yīng)基團(tuán)，不能完全防止由于分子聚合而產(chǎn)生聚合物。
因此，研究了一種含有單個反應(yīng)基團(tuán)的表面修飾劑，原則上不產(chǎn)生聚合物，沸點高且揮發(fā)性低，具有高安全性，并且該液體在常溫下可輕易地被處理。例如，三乙基氯硅烷具有一個氯作為反應(yīng)基團(tuán)部分，并且原則上不產(chǎn)生聚合物。此外，由于三乙基氯硅烷的沸點為145℃且熔點為-50℃，在常溫下，三乙基氯硅烷具有低揮發(fā)性。而且，由于三乙基氯硅烷為液體，三乙基氯硅烷很容易用溶劑如甲苯稀釋，并且很容易被處理。
采用三乙基氯硅烷或十八烷基三氯硅烷進(jìn)行了微通道內(nèi)壁的表面修飾過程。以無水甲苯作為溶劑，分別制備它們的5％溶液。采用實施例1中描述的實驗系統(tǒng)，比較兩種溶液。將制備的溶液注入液體容器中并由注射泵抽吸，以便將溶液注入微通道。流動速率設(shè)10μl/分，并且注射50μl溶液以進(jìn)行表面修飾。隨后，在表面處理后，注射50μl或更多的無水甲苯以洗滌微通道。洗滌期間，采用光學(xué)顯微鏡觀察微通道。在十八烷基三氯硅烷中，微通道內(nèi)生產(chǎn)灰塵，然而，在三乙基氯硅烷中，不生產(chǎn)灰塵。在三乙基氯硅烷中，將濃度進(jìn)一步增加到10％并進(jìn)行相同的過程。隨后，未產(chǎn)生灰塵。
(實施例3)在微通道中提取核酸在實施例1中描述的實驗系統(tǒng)被用于設(shè)法吸附核酸。以與實施例2中描述的相同方式，采用10％三乙基氯硅烷處理微通道內(nèi)壁的表面。ColE1 DNA被用作核酸。飽和碘化鈉溶液被用作離液序列高的離子溶液。使0.2g在實施例1中描述的微珠懸浮在1升碘化鈉溶液中。從液體容器中將25μl獲得的溶液注入微通道以形成一個柱。作為一種溶劑，用碘化鈉制備1％DNA溶液，并且從液體容器將DNA溶液注入微通道。接著，將SYBRGreen I溶液作為DNA的熒光燃料，從液體容器注入微通道。當(dāng)采用光學(xué)顯微鏡觀察微通道時，辨認(rèn)出僅二氧化硅微珠41的柱部分42發(fā)射熒光，如圖5所示。辨認(rèn)出DNA被實施例1中使用的二氧化硅微珠41吸附。除柱部分42之外，在微通道中未發(fā)現(xiàn)熒光，并且確定DNA未吸附到微通道的內(nèi)壁表面上。
采用在實施例1中描述的實驗系統(tǒng)檢測了核酸的吸附和解吸。該實驗系統(tǒng)和如上所述的相同。將在實施例1中描述的微珠注入微通道以形成柱，并隨后注射核酸。將Lambda DNA用作核酸。采用光學(xué)顯微鏡確定LambdaDNA到微珠的吸附。準(zhǔn)備60℃或更高溫度的熱純水，并從液體容器注入微通道。隨后確定Lambda DNA從微珠解吸。
如上所述，由于確定核酸可吸附到微珠并從微珠解吸，發(fā)現(xiàn)可以在微通道中實現(xiàn)核酸的提取。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不局限于上述參照附圖描述的實施例和例子，并且在不背離附屬的權(quán)利要求及其主旨的前提下，可以進(jìn)行各種改變、替代或等同實驗。
工業(yè)實用性如上詳細(xì)描述的，根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種新的技術(shù)手段，其可以作為采用微珠的微芯片技術(shù)以低成本進(jìn)行生產(chǎn)和制備，所述微珠不僅有效地用于提取核酸，而且可用作各種反應(yīng)載體，并且所述新的技術(shù)方法可以抑制在液體樣品的流動過程中產(chǎn)生停滯，可以平穩(wěn)簡單地注射、填充和輸送微珠，并且也可以抑制產(chǎn)生灰塵。此外，可以提供一種采用該新技術(shù)手段的新的核酸提取方法。
權(quán)利要求
1.一種微芯片，其含有一個微通道，所述微通道由設(shè)在上下基底的連接面中的溝槽部形成，其中，所述微通道設(shè)有一個間隙部，其使得截面的上下、左右或上下左右的中間部的通道截面減小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的微芯片，其中，所述間隙部由所述溝槽部中的凸出部形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的微芯片，其中，所述間隙部由分別設(shè)在上下基底內(nèi)的溝槽部中的對向凸出部形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的微芯片，其中，所述間隙部是通過將一個基底的凸出部插入另一基底的溝槽部中而形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的微芯片，所述間隙部的截面尺寸可通過上下基底的至少一個可移動凸出部而改變。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的微芯片，其中，所述間隙部的截面尺寸為攔截插入微通道的微珠所需的尺寸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的微芯片，其中，微通道的內(nèi)壁表面用表面處理劑修飾。
8.一種用于提取核酸的試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的微芯片；以及具有表面羥基的微珠。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用于提取核酸的試劑盒，其中，具有表面羥基的微珠為直徑為10μm或更小的二氧化硅微珠、中空的二氧化硅微珠和樹脂微珠中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的用于提取核酸的試劑盒，其中，在內(nèi)壁表面上具有表面羥基的微芯片的微通道中，所述表面羥基被覆有表面處理劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用于提取核酸的試劑盒，其中，所述表面處理劑為一種硅烷偶聯(lián)劑，該硅烷偶聯(lián)劑含有三烷基鹵代硅烷作為一種主要組分。
12.一種核酸提取方法，采用了根據(jù)權(quán)利要求8-11中任一項的用于提取核酸的試劑盒，其中，待處理液體中的核酸被吸附到微芯片的微通道中的微珠表面。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的核酸提取方法，其中，在存在離液序列高的離子的條件下，核酸被吸附到微珠表面。
全文摘要
提供了一種新的技術(shù)手段，其可以以低成本進(jìn)行生產(chǎn)和制備，并且，其中，可以抑制在液體樣品的流動過程中產(chǎn)生停滯，可以平穩(wěn)簡單地注射、填充和輸送微珠，并且也可以抑制灰塵產(chǎn)生；并提供了一種新的核酸提取方法，其采用了所述的新技術(shù)手段。微芯片具有一個微通道(3)，由在上下基底(1，2)的連接面中形成的溝槽部(11，21)界定。在微通道(3)中，設(shè)有使得在截面的上下、左右或上下左右的中間部的使通道截面減小的間隙部(31)，從而攔截了微珠。
文檔編號G01N37/00GK1764842SQ20048000828
公開日2006年4月26日 申請日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月24日
發(fā)明者大西通博, 森島圭佑, 北森武彥 申請人:索尼株式會社, 財團(tuán)法人神奈川科學(xué)技術(shù)研究院