專利名稱：巴氏染色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物樣品染色中所使用的方法、物品和組合物。
背景技術(shù)：
醫(yī)學診斷性檢測方法對于病理狀況的早期檢測是非常重要的篩查工具。早期檢測可以使在更有可能治療成功的階段鑒別出這樣的狀況(病癥)。早期治療往往還伴隨更小的損傷或更少的侵入性治療方法，從而減少對患者的影響。除了常規(guī)篩查之外，診斷性檢測也用于多種其它應(yīng)用中，包括活組織檢查分析以及監(jiān)測正在進行的醫(yī)學治療的效果。
診斷性檢測中的一種特別有用的工具是巴氏(Papanicolau)染色過程。這個過程最初被研制開發(fā)用于婦產(chǎn)科樣品的染色，并且已經(jīng)導致了子宮頸癌病死率的顯著降低。目前巴氏染色用于診斷多種不同組織和器官的多種病理狀況。
然而，巴氏染色易受人為假象(artifact)的影響，這種人為假象可以對技術(shù)人員或機器成功讀取經(jīng)處理的樣品的能力產(chǎn)生不利的影響。這些人為假象包括假性非特異性的細胞質(zhì)染色，人為假象如細胞質(zhì)分裂、玉米片狀染色(cornflaking)、被污染的細胞核詳圖(smudged nuclear detail)、淡染的染色和濃染的染色。這樣的人為假象最低限度減少了部分可被評估的樣品，可以產(chǎn)生干擾正確診斷的假性染色圖案(pattern)，還可以使樣品無法讀取。對于這種樣品的分析困難導致了病人焦慮、重新篩查費用及診斷延誤的增加，并且更重要的是導致了可能的誤診的增加。
在本領(lǐng)域中，需要用于診斷樣品染色的經(jīng)改進的方法以及在該方法中所使用的組合物及物品的制造。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用巴氏染色過程來處理生物樣品的經(jīng)改進的方法。所述方法包括將去污劑處理結(jié)合入該染色過程的多個步驟的任何一個步驟。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該方法有利地減少了巴氏染色過程中產(chǎn)生的人為假象的數(shù)量。本發(fā)明還提供了用該方法染色的樣品。
具體實施例方式
本發(fā)明已經(jīng)有利地發(fā)現(xiàn)將去污劑處理結(jié)合到易受人為假象影響的巴氏染色過程中減少了人為假象的出現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用去污劑可以清除來自經(jīng)該過程染色的細胞胞質(zhì)的多余染色斑，使得增強了對比度并且提高了對于細胞、細胞核及染色質(zhì)形態(tài)的檢測能力。另外，將來自細胞質(zhì)的多余染色斑去除可以提高對于與異常相關(guān)的染色過深的檢測能力。
術(shù)語“巴氏染色過程”、“巴氏染色斑”、“巴氏早期癌變探查試驗”等等，指的是經(jīng)改進或未改進的巴氏染色過程，該巴氏染色過程差別性地對樣品中的細胞核與細胞質(zhì)進行染色，例如在婦產(chǎn)科篩查性檢查(如陰道抹片檢查)中得到的樣品。
這種檢測依賴于對樣品中不同細胞類型的細胞核和細胞質(zhì)的染色圖案、染色強度及大小和形狀的區(qū)分能力。有利的是巴氏染色過程提供了經(jīng)深染的細胞核和透明的細胞質(zhì)，這在檢測由某些采樣技術(shù)包括陰道抹片檢查所提供的多層樣品中的異常細胞時是特別有用的。
可用的檢測依賴于對該樣品中細胞的有效百分比的讀取能力，否則的話，檢測的準確性可能有問題，并且樣品會變得不可使用，從而導致了額外的重新篩查費用并且增加了病人的焦慮。
因此，染色人為假象會降低對樣品中細胞的真染色圖案的識別能力，能夠顯著削弱巴氏早期癌變探查試驗的有用性。人為假象可以降低對細胞核與細胞質(zhì)的染色圖案的區(qū)分能力，可以提高細胞或樣品區(qū)中無法讀取的百分比，并且可以增加細胞質(zhì)濃染，從而降低了作為巴氏早期癌變探查試驗的主要優(yōu)點之一的透明度，由此使得區(qū)分樣品中的異常細胞變得更加困難。
在進一步詳細描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解本發(fā)明不限于所描述的特定方法、技術(shù)方案或裝置，當然是因為這些方法、技術(shù)方案或裝置可以變化。還應(yīng)當理解本文中所使用的術(shù)語的目的僅為了描述具體實施例，并不是要限制本發(fā)明的保護范圍。
單數(shù)形式“一”“一種/一個”和“該”的使用包括復(fù)數(shù)的含義，除非上下文明確表示另外的含義。因此，例如，提及“(一)樣品”包括多個樣品，提及“(一種)去污劑”包括多種這樣的去污劑，提及“(一種)復(fù)染劑(counterstain)”包括多種復(fù)染劑，等等。另外，特定的復(fù)數(shù)含義，如“二”“三”等的使用，應(yīng)理解為包括同樣對象的更多的數(shù)量，除非上下文明確表示另外的含義。
術(shù)語如“連接”“附著”和“鍵合”在本文中是可以替換使用的，并且包括直接和間接的連接、附著、鍵合或接合，除非上下文明確表示另外的含義。在提及數(shù)值范圍時，可以理解為在該范圍所提及的上限和下限之間的每一個介于其間的整數(shù)值及其分數(shù)都是特定公開的，連同在這些數(shù)值之間的每個子范圍也是特定公開的。任何范圍的上限和下限可以獨立的被包括在或排除出該范圍，并且包括一個邊界值、不包括邊界值或者包括兩個邊界值的每個范圍也都包括在本發(fā)明中。當被討論的值具有固有的邊界時，如一種組合物可以以從0到100％的濃度存在，或者水溶液的pH可以從1到14變化，這些固有的邊界是特定公開的。當明確提及一個數(shù)值時，可以理解為那些與所提及的數(shù)值大約是同樣數(shù)量或量的值也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，其范圍也是基于同樣的原則。當公開一種組合時，該組合的各成分的每個子組合也是特定公開的，并且也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。與之相反，當公開不同成分或成分的集合時，其組合也是公開的。當本發(fā)明的任何成分在具有多種替代物的狀態(tài)下被公開時，本發(fā)明的其中每種替代物以單獨或與任何其它替代物結(jié)合的方式被排除在本發(fā)明的實施例中的實例也由此被公開；本發(fā)明的多于一種的成分可以有這樣的排除，并且具有這種排除性的成分的所有組合也由此被公開。
除非使用另外的含義定義或者上下文明確表示另外的含義，本文所使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所通常理解的具有相同的含義。盡管與本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可以用于本發(fā)明的實施或檢測中，但是這里只描述優(yōu)選的方法和材料。
術(shù)語“可選的”或“可選地”意味著隨后描述的事件或情況可以發(fā)生或者也可以不發(fā)生，并且包括該事件或情況發(fā)生時的實例以及該事件或情況不發(fā)生時的實例。
巴氏染色巴氏染色方法(過程)包括至少蘇木精染色步驟、橘黃G細胞質(zhì)復(fù)染步驟、以及伊紅Y-亮綠/固綠復(fù)染步驟。該方法可以包括“著藍(bluing)”步驟。有利地，巴氏染色產(chǎn)生帶有透明細胞胞質(zhì)的樣品，這對于分析覆蓋了多層的細胞諸如來自陰道抹片檢查的細胞是特別有用的。
在開始巴氏染色過程之前，樣品必需經(jīng)固定?？梢允褂萌魏慰梢援a(chǎn)生滿意效果的固定方法。醇固定法通常用于巴氏染色，如95％的乙醇、100％的甲醇、80％的丙醇或95％的乙醇/醚(1∶1)。也可以使用商品化的噴霧固定劑。
典型的巴氏染色過程包括與金屬媒染劑結(jié)合使用的蘇木精染色步驟，以使細胞的染色質(zhì)染色，可以遞增或遞減地進行。染色質(zhì)染色是這種檢測的關(guān)鍵部分，因為染色質(zhì)的大小、染色強度和染色圖案是分析樣品中的異常細胞的關(guān)鍵要素。任何形式的蘇木精均可使用，包括Harris’s、Gill’s、Delafield’s、Ehrlich’s或Mayer’s蘇木精。也可以使用蘇木精應(yīng)用染料的替代物如，勞氏紫、維多利亞藍B、天青B等。
如果以遞減的方式進行，先將該樣品過染，然后用試劑(如，稀HCl)使之區(qū)分開，該試劑可以將染色強度降至所希望的水平。這引起所著染的顏色從藍色/紫色到淺橙色/紅色的變化?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的試劑(如，Scott’s自來水替代物、氨水、碳酸鋰)利用“著藍”步驟重新建立藍色。該著藍溶液可以在沒有區(qū)分步驟的情況下加入。
在巴氏染色中使用了多種細胞質(zhì)復(fù)染劑，以便能夠鑒別樣品中的多種細胞類型、它們的形態(tài)以及它們的頻度。
細胞質(zhì)染色劑橘黃G以及伊紅Y-亮綠/固綠是在醇中制備的。橘黃G是單色染色劑，其在角蛋白存在時將細胞胞質(zhì)著染成黃色或橙色，能夠使成熟或正在成熟的產(chǎn)生角蛋白的惡性細胞與較小的明顯良性細胞區(qū)分開來。橘黃G可以以細胞染色領(lǐng)域中已知的溶液形式使用，如以O(shè)G-6的形式。
按照慣例，伊紅Y-亮綠/固綠是以三種染色劑，即伊紅Y、亮綠SF和/或固綠FCF、以及俾斯麥棕的混合物形式制備的。典型的混合物包括EA36、EA50及EA65。伊紅Y在核仁、纖毛、紅細胞及成熟的鱗狀細胞的細胞質(zhì)中產(chǎn)生粉紅色。亮綠SF淡黃(LightGreen SF Yellowish)和固綠FCF在代謝活躍的副基(parabasal)鱗狀細胞、中間鱗狀細胞及柱狀細胞的細胞質(zhì)中產(chǎn)生藍色/綠色。俾斯麥棕在巴氏染色中不產(chǎn)生有用的染色圖案，并且可以在本方法的多種變化形式中被排除。還可以使用亮綠SF淡黃的替代物，如固綠FCF。細胞質(zhì)復(fù)染劑還可以是在單一溶液中產(chǎn)生的OG與伊紅Y-亮綠/固綠的混合物，用作復(fù)染劑。
這些細胞質(zhì)復(fù)染劑是在醇中制備的，該醇所導致的透明細胞質(zhì)在分析通過巴氏過程染色的樣品時非常重要。
在適當?shù)臅r候，如在水溶液和非水溶液之間轉(zhuǎn)換時的水合/脫水過程，將清洗步驟結(jié)合到該染色過程中。該染色過程完成后，可以如在本領(lǐng)域所公知的對樣品進行清洗和封固?？梢栽谶M行巴氏過程之前或之后在樣品上進行另外的操作。隨后可以人工和/或借助于合適的裝置，如自動成像系統(tǒng)，來對該樣品進行分析。自動成像系統(tǒng)的實例包括Cytyc公司的ThinPrep成像系統(tǒng)、TriPath FocalPointTM斷面儀、ChromaVision Acis系統(tǒng)、CompuCyt iCyte成像系統(tǒng)、應(yīng)用成像CytoVisionTM系統(tǒng)以及Veracel Verasys成像系統(tǒng)。
可以對巴氏染色過程進行多種改變，這在本領(lǐng)域是公知的。例如，可以將該過程改變成如同美國專利第5,168,066號和第6,348,325號(分別于1992年12月1日和2002年2月19日出版，并轉(zhuǎn)讓給Cytyc公司)那樣，以便結(jié)合使用勞氏紫。也能夠使用其它的噻嗪染料和三芳甲烷染料。
樣品將要分析的樣品部分可以是任何來源的生物材料，該生物材料可以從活的有機體直接或間接得到，包括細胞、組織或體液。樣品的非限制性的實例包括血、尿、精液、奶、痰液、粘液、胸膜液、骨盆液、關(guān)節(jié)液、腹水液、體腔洗液、眼沖洗液、皮膚刮下物、口腔拭抹物、陰道拭抹物、陰道抹片檢查物、直腸拭抹物、抽出物、穿刺活檢物、獲得的組織切片(例如通過手術(shù)或尸體剖檢得到的)、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、(皮膚、呼吸、腸以及泌尿生殖道的)外分泌物、淚液、唾液、腫瘤、器官以及體外細胞培養(yǎng)成分的樣品。典型的樣品是陰道抹片檢查物，其是在婦產(chǎn)科檢查或懷疑包含異常細胞的活組織檢查中常規(guī)得到的。
樣品可以是已知包含異常細胞的陽性對照樣品。也可以用陰性對照樣品，該陰性對照樣品用于確定一組給定的染色條件是否會產(chǎn)生假陽性(即使樣品中不存在異常細胞時也存在的陽性信號)。
通常，樣品在載玻片或類似的玻璃表面上染色，例如管瓶、蓋玻片、或其它用于分析樣品的對入射光透光的表面。
去污劑任何可檢測到減少巴氏染色過程中產(chǎn)生的人為假象的去污劑均可使用。以適于可檢測到減少人為假象的量和時間來使用去污劑。通過結(jié)合如本文中所述的去污劑清洗，至少一種這樣的人為假象的百分比可以令人滿意地被減少至少約10％、20％、30％、40％、50％、70％、90％、95％、98％或更多。當被用在選擇載玻片的某些區(qū)域(“感興趣的區(qū)域”)的成像系統(tǒng)中，用以對基于本領(lǐng)域公知的多種參數(shù)中的任意參數(shù)進行分析時，本發(fā)明可以令人滿意地減少假性被選區(qū)域的數(shù)目(假性被選區(qū)域是基于染色的人為假象而被假性選擇用于分析的區(qū)域，該染色人為假象符合成像系統(tǒng)的選擇標準)至少約10％、20％、30％、40％、50％、70％、90％、95％、98％或更多。這提高了所選擇的用于分析的有效區(qū)域的百分比。
去污劑可以是非離子的、陽離子的、陰離子的或兩性離子的。也可以使用去污劑的混合物。去污劑的典型類別包括醇醚硫酸鹽、醇硫酸鹽、烷醇酰胺、烷基磺酸鹽、氧化胺、兩性去污劑、陰離子去污劑、甜菜堿衍生物、陽離子去污劑、二磺酸鹽、十二烷基苯磺酸、乙氧基化醇類、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯水溶助劑、十二烷基硫酸鹽、單酸甘油酯和甘油二酯、非離子去污劑、磷酸酯、季銨鹽類去污劑以及失水山梨糖醇衍生物。
典型的非離子性去污劑包括BigCHAP(N，N-雙[3-(D-葡糖酰胺)丙基]膽酰胺)、二(聚乙二醇二[咪唑基羰基])、Brij30(聚氧乙烯4月桂基醚)、Brij35(聚氧乙烯23月桂基醚)、Brij52(聚氧乙烯2鯨蠟基醚)、Brij56(聚氧乙烯10鯨蠟基醚)、Brij58(聚氧乙烯20鯨蠟基醚)、Brij72(聚氧乙烯2硬脂基醚)、Brij76(聚氧乙烯10硬脂基醚)、Brij78(聚氧乙烯20硬脂基醚)、Brij92(聚氧乙烯2油基醚)、Brij97(聚氧乙烯10油基醚)、Brij98(聚氧乙烯20油基醚)、Brij700(聚氧乙烯100硬脂基醚)、CremophorEL(蓖麻油/環(huán)氧乙烷聚醚)、十(乙二醇)單十二烷基醚、辛?；?N-甲基葡糖酰胺(MECA-8)、癸?；?N-甲基葡糖酰胺(MECA-10)、正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、異十三烷基-聚(乙二醇醚)n、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、正癸基α-D-吡喃葡糖苷、癸基β-D-麥芽糖吡喃糖苷、正十二烷酰-N-甲基葡糖酰胺、正十二烷基α-D-麥芽糖苷、正十二烷基β-D-麥芽糖苷、七(乙二醇)單癸基醚、七(乙二醇)單十四烷基醚、正十六烷基β-D-麥芽糖苷、六(乙二醇)單十二烷基醚、六(乙二醇)單十六烷基醚、六(乙二醇)單十八烷基醚、六(乙二醇)單十四烷基醚、Igepal CA-630(辛苯基-聚乙二醇)、IgepalCA-210(聚氧乙烯(2)異辛苯基醚)、IgepalCA-520(聚氧乙烯(5)異辛基苯基醚)、IgepalCO-630(聚氧乙烯(9)壬基苯基醚)、IgepalCO-720(聚氧乙烯(12)壬基苯基醚)、IgepalCO-890(聚氧乙烯(40)壬基苯基醚)、IgepalCO-990(聚氧乙烯(100)壬基苯基醚)、IgepalDM-970(聚氧乙烯(150)二壬基苯基醚)、甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡糖苷、九(乙二醇)單十二烷基醚、N-壬?；?N-甲基葡糖胺、八(乙二醇)單癸基醚、八(乙二醇)單十二烷基醚、八(乙二醇)單十六烷基醚、八(乙二醇)單十八烷基醚、八(乙二醇)單十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃葡糖苷、五(乙二醇)單癸基醚、五(乙二醇)單十二烷基醚、五(乙二醇)單十六烷基醚、五(乙二醇)單己基醚、五(乙二醇)單十八烷基醚、五(乙二醇)單辛基醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20異十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯二(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、皂角甙、Span20(失水山梨糖醇單月桂酸酯)、Span40(失水山梨糖醇單棕櫚酸酯)、Span60(失水山梨糖醇單硬脂酸酯)、Span65(失水山梨糖醇三硬脂酸酯)、Span80(失水山梨糖醇單油酸酯)、Span85(失水山梨糖醇三油酸酯)、任何形式的潤濕劑(包括的類型有15-S-5、15-S-7、15-S-9、15-S-12、15-S-30、NP-4、NP-7、NP-9、NP-10、NP-40、NPX(Imbentin-N/63)、TMN-3(聚乙二醇三甲基壬基醚)、TMN-6(聚乙二醇三甲基壬基醚)、TMN-10(聚乙二醇三甲基壬基醚)、MIN FORM 1x以及MINFORM 2x)、十四烷基-β-D-麥芽糖苷、四(乙二醇)單癸基醚、四(乙二醇)單十二烷基醚、四(乙二醇)單十四烷基醚、三(乙二醇)單癸基醚、三(乙二醇)單十二烷基醚、三(乙二醇)單十六烷基醚、三(乙二醇)單辛基醚、三(乙二醇)單十四烷基醚、TritonCF-21、TritonCF-32、TritonDF-12、TritonDF-16、TritonGR-5M、TritonN-101(聚氧乙烯支鏈的壬基苯基醚)、TritonQS-15、TritonQS-44、TritonRW-75(聚乙二醇260單(十六烷基/十八烷基)醚和1-十八烷醇)、TritonX-100(聚乙二醇叔-辛基苯基醚)、TritonX-102、TritonX-15、TritonX-151、TritonX-200、TritonX-207、TritonX-114、TritonX-165、TritonX-305、Triton-405(聚氧乙烯(40)異辛基苯基醚)、還原的TritonX-405(聚氧乙烯(40)異辛基環(huán)己基醚)、TritonX-45(聚乙二醇4-叔辛基苯基醚)、TritonX-705-70、任何形式的TWEEN(包括TWEEN20(聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯)、TWEEN21(聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯)、TWEEN40(聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單棕櫚酸酯)、TWEEN60(聚乙二醇失水山梨糖醇單硬脂酸酯)、TWEEN61(聚乙二醇失水山梨糖醇單硬脂酸酯)、TWEEN65(聚氧乙烯失水山梨糖醇三硬脂酸酯)、TWEEN80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)、TWEEN81(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)以及TWEEN85(聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇三油酸酯))、四丁酚醛(帶有甲醛和環(huán)氧乙烷的4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯酚聚合物)以及正十一烷基β-D-吡喃葡糖苷。
典型的陰離子去污劑包括鵝脫氧膽酸、膽酸、脫氫膽酸、脫氧膽酸、毛地黃皂苷、毛地黃毒苷配基、N，N-二甲基十二烷胺-N-氧化物、多庫酯鈉、甘氨鵝脫氧膽酸鈉、甘氨膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸-3-硫酸二鈉鹽、甘氨石膽酸乙基酯、N-月桂酰基肌氨酸、十二烷基硫酸鋰、Lugol(碘-碘化鉀)、Niaproof(2-乙基己基硫酸鈉鹽)、Niaproof 4(7-乙基-2-甲基-4-十一烷基硫酸鈉鹽)、可選取代的烷基磺酸鹽(包括1-丁磺酸鹽、戊磺酸鹽、己磺酸鹽、1-辛磺酸鹽、1-癸磺酸鹽、1-十二烷磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1-壬磺酸鹽、1-丙磺酸鹽以及2-溴乙磺酸鹽，尤其是鈉鹽)、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、可選取代的十二烷基硫酸鈉、辛基硫酸鈉、?；悄懰徕c、?；蛆Z脫氧膽酸鈉、牛磺豬脫氧膽酸鈉、牛磺石膽酸-3-硫酸二鈉鹽、牛磺熊脫氧膽酸鈉鹽、Trizma十二烷基硫酸鹽、熊脫氧膽酸。該陰離子去污劑可以以酸或鹽、或者兩者均有的形式提供。
典型的陽離子去污劑包括烷基三甲基溴化銨、苯扎氯銨、芐基二甲基十六烷基氯化銨、芐基二甲基十四烷基氯化銨、芐基十二烷基二甲基溴化銨、芐基三甲基四氯碘酸銨、二甲基雙(十八烷基)溴化銨、十二烷基乙基二甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、乙基十六烷基二甲基溴化銨、吉拉德(Girard’s)試劑T、十六烷基三甲基溴化銨、N，N’，N’-聚氧乙烯(10)-N-牛油-1，3-二氨基丙烷、通佐溴銨以及三甲基(十四烷基)溴化銨。
典型的兩性離子去污劑包括CHAPS(3-{(3-膽酰胺基丙基)二甲氨基}-1-丙磺酸鹽)、CHAPSO(3-{(3-膽酰胺基丙基)二甲氨基}-2-羥基-1-丙磺酸鹽)、3-(癸基二甲氨基)丙磺酸鹽、3-(十二烷基二甲氨基)丙磺酸鹽、3-(N，N-二甲基十四烷基氨基)丙磺酸鹽、3-(N，N-二甲基十八烷基氨基)丙磺酸鹽、3-(N，N-二甲基辛基氨基)丙磺酸鹽以及3-(N，N-二甲基棕櫚基氨基)丙磺酸鹽。
去污劑包括那些本領(lǐng)域已知的或發(fā)現(xiàn)的去污劑。去污劑可以合成或從許多廠商中的任何一個(如Sigma-Aldrich公司，St.Louis，MO，USA，www.simmaaldrich.com)商業(yè)獲得。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)苯扎氯銨和CHAPS對于減少巴氏染色過程中的人為假象特別有用。
可以將給定的去污劑通過在巴氏染色過程中結(jié)合到清洗步驟來檢測其減少人為假象的能力，該巴氏染色過程可以在已知產(chǎn)生染色的人為假象的條件下進行。然后可以通過與未經(jīng)去污劑處理的樣品進行對照，并且與用苯扎氯銨處理或其它已知的減少染色人為假象的陽性對照處理的樣品進行對照，來評估用試驗去污劑處理的樣品。
通常，所使用的去污劑的量是使用去污劑的溶液的至少約0.0001％并可高達約10％，并且去污劑的量可以是溶液的至少約0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、或1％或更多；去污劑的量可以是溶液的約5％或更少、約2.5％或更少、約2％或更少、約1％或更少、約0.5％或更少、約0.2％或更少、約0.1％或更少、約0.05％或更少、或其間的任何范圍或子范圍。
去污劑處理可以在任何能夠使人為假象減少同時不會對分析樣品的能力有不利影響的pH下進行。因此去污劑處理可以在pH約為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或其間的任何范圍或子范圍內(nèi)進行。通常該處理在pH約為2到約為8之間進行。
去污劑可以在巴氏染色過程的任何時刻使用。例如，去污劑可以在蘇木精染色前使用、與蘇木精染色混合使用、在蘇木精染色后使用、與著藍溶液結(jié)合使用、在著藍溶液之后使用、或者與橘黃G、伊紅Y-亮綠/固綠或其它復(fù)染溶液結(jié)合使用。
實施例闡述下面的實施例的目的是給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供怎樣制備和使用本發(fā)明的完整描述，而不是用來限制本發(fā)明的保護范圍的。雖然已經(jīng)盡力確保所使用的相關(guān)數(shù)目(如數(shù)量、溫度等)的準確性，但應(yīng)該對一些實驗誤差和偏差加以考慮。除非指明另外的情況，份是按照重量份、溫度是攝氏度以及壓力是處于或接近大氣壓、并且所有的材料都是可商業(yè)獲得的。
實施例1在陰道抹片檢查的載玻片上可以非常明顯地發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)分裂，該載玻片是在檢測條件即巴氏染色條件下處理的。為了對用于減少細胞質(zhì)分裂的方法進行試驗，獲得了4種不同的陰道抹片檢查物樣品，由樣品制作載玻片，固定，使其干燥一天，然后根據(jù)下面的步驟利用改進的巴氏染色方法進行染色步驟1開啟工作臺2 試驗清洗步驟3 5分鐘50％的試劑乙醇4 5分鐘鹽溶液(50％的乙醇中的10％的NaCl)5 5分鐘鹽溶液(50％的乙醇中的10％的NaCl)6 1分鐘95％的試劑乙醇7 1分鐘95％的試劑乙醇8-22 1分鐘細胞核染色(15分鐘)23 20秒 異丙醇24 20秒 異丙醇25 30秒 異丙醇26 20秒 異丙醇27-34 1分鐘復(fù)染劑(橘黃G和伊紅-固綠/亮綠的混合物)(8分鐘)35 30秒 100％的試劑乙醇36 3分鐘異丙醇37 3分鐘異丙醇38 1分鐘二甲苯39 3分鐘二甲苯40 結(jié)束 二甲苯將載玻片移到最后的二甲苯中利用封固劑(Permount)人工封固蓋玻片四種樣品均產(chǎn)生了細胞質(zhì)分裂，并且進行試驗清洗步驟以確定可以減少人為假象的條件。由每個樣品制備十個載玻片。在來自每個樣品的十個載玻片上分別進行五分鐘水洗、十五分鐘水洗、以及利用FC120表面活性劑(3M公司)的十五分鐘清洗和利用FC170表面活性劑(3M公司)的十五分鐘清洗。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些清洗條件均不能顯著減少細胞質(zhì)分裂的染色的人為假象。
十個另外的載玻片是由四種樣品中的每一個制備的，并且進行了更多的試驗清洗步驟，包括在下述任何一種溶液中進行十五分鐘的清洗0.1％的FC170 pH為6.9、0.1％的Tween80 pH為6.9、0.1％的Igepal CA-630 pH為7.0、0.1％的CHAPS pH為7.7、0.1％的ZEPHIRAN pH為7.2、水、鹽溶液步驟之前沒有50％乙醇步驟的水、沒有鹽溶液步驟的水、以及在鹽溶液步驟和沒有鹽溶液步驟之前沒有50％的乙醇步驟的水。
ZEPHIRAN(苯扎氯銨)顯著減少了假性藍色細胞質(zhì)染色，并且減少了細胞質(zhì)分裂。CHAPS在這個濃度也將兩種人為假象減少到一定程度。其它處理在給定的濃度對這些染色的人為假象幾乎沒有影響。
實施例2結(jié)合去污劑清洗步驟的巴氏染色方案的實施例如下

權(quán)利要求
1.一種將經(jīng)固定的生物樣品染色的方法，包括將所述樣品與蘇木精染色劑接觸；將所述樣品與橘黃G復(fù)染劑接觸；將所述樣品與伊紅Y-亮綠/固綠復(fù)染劑接觸；將所述樣品與一種類型的去污劑以足以減少染色的人為假象的量相接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述去污劑選自醇醚硫酸鹽、醇硫酸鹽、烷醇酰胺、烷基磺酸鹽、氧化胺、兩性去污劑、陰離子去污劑、甜菜堿衍生物、陽離子去污劑、二磺酸鹽、十二烷基苯磺酸、乙氧基化醇類、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯水溶助劑、十二烷基硫酸鹽、單酸甘油酯和甘油二酯、非離子去污劑、磷酸酯、季銨鹽類去污劑以及失水山梨糖醇衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述去污劑是非離子去污劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述去污劑選自BigCHAP(N，N-雙[3-(D-葡糖酰胺)丙基]膽酰胺)、二(聚乙二醇二[咪唑基羰基])、Brij30(聚氧乙烯4月桂基醚)、Brij35(聚氧乙烯23月桂基醚)、Brij52(聚氧乙烯2鯨蠟基醚)、Brij56(聚氧乙烯10鯨蠟基醚)、Brij58(聚氧乙烯20鯨蠟基醚)、Brij72(聚氧乙烯2硬脂基醚)、Brij76(聚氧乙烯10硬脂基醚)、Brij78(聚氧乙烯20硬脂基醚)、Brij92(聚氧乙烯2油基醚)、Brij97(聚氧乙烯10油基醚)、Brij98(聚氧乙烯20油基醚)、Brij700(聚氧乙烯100硬脂基醚)、CremophorEL(蓖麻油/環(huán)氧乙烷聚醚)、十(乙二醇)單十二烷基醚、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(MECA-8)、癸?；?N-甲基葡糖酰胺(MECA-10)、正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、異十三烷基-聚(乙二醇醚)n、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、正癸基α-D-吡喃葡糖苷、癸基β-D-麥芽糖吡喃糖苷、正十二烷酰-N-甲基葡糖酰胺、正十二烷基α-D-麥芽糖苷、正十二烷基β-D-麥芽糖苷、七(乙二醇)單癸基醚、七(乙二醇)單十四烷基醚、正十六烷基β-D-麥芽糖苷、六(乙二醇)單十二烷基醚、六(乙二醇)單十六烷基醚、六(乙二醇)單十八烷基醚、六(乙二醇)單十四烷基醚、Igepal CA-630(辛苯基-聚乙二醇)、IgepalCA-210(聚氧乙烯(2)異辛苯基醚)、IgepalCA-520(聚氧乙烯(5)異辛基苯基醚)、IgepalCO-630(聚氧乙烯(9)壬基苯基醚)、IgepalCO-720(聚氧乙烯(12)壬基苯基醚)、IgepalCO-890(聚氧乙烯(40)壬基苯基醚)、IgepalCO-990(聚氧乙烯(100)壬基苯基醚)、IgepalDM-970(聚氧乙烯(150)二壬基苯基醚)、甲基-6-O-(N-庚基氨基甲?；?-α-D-吡喃葡糖苷、九(乙二醇)單十二烷基醚、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、八(乙二醇)單癸基醚、八(乙二醇)單十二烷基醚、八(乙二醇)單十六烷基醚、八(乙二醇)單十八烷基醚、八(乙二醇)單十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃葡糖苷、五(乙二醇)單癸基醚、五(乙二醇)單十二烷基醚、五(乙二醇)單十六烷基醚、五(乙二醇)單己基醚、五(乙二醇)單十八烷基醚、五(乙二醇)單辛基醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20異十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯二(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、皂角甙、Span20(失水山梨糖醇單月桂酸酯)、Span40(失水山梨糖醇單棕櫚酸酯)、Span60(失水山梨糖醇單硬脂酸酯)、Span65(失水山梨糖醇三硬脂酸酯)、Span80(失水山梨糖醇單油酸酯)、Span85(失水山梨糖醇三油酸酯)、潤濕劑、十四烷基-β-D-麥芽糖苷、四(乙二醇)單癸基醚、四(乙二醇)單十二烷基醚、四(乙二醇)單十四烷基醚、三(乙二醇)單癸基醚、三(乙二醇)單十二烷基醚、三(乙二醇)單十六烷基醚、三(乙二醇)單辛基醚、三(乙二醇)單十四烷基醚、TritonCF-21、TritonCF-32、TritonDF-12、TritonDF-16、TritonGR-5M、TritonN-101(聚氧乙烯支鏈的壬基苯基醚)、TritonQS-15、TritonQS-44、TritonRW-75(聚乙二醇260單(十六烷基/十八烷基)醚和1-十八烷醇)、TritonX-100(聚乙二醇叔-辛基苯基醚)、TritonX-102、TritonX-15、TritonX-151、TritonX-200、TritonX-207、TritonX-114、TritonX-165、TritonX-305、TritonX-405(聚氧乙烯(40)異辛基苯基醚)、還原的TritonX-405(聚氧乙烯(40)異辛基環(huán)己基醚)、TritonX-45(聚乙二醇4-叔辛基苯基醚)、TritonX-705-70、TWEEN20(聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯)、TWEEN21(聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯)、TWEEN40(聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單棕櫚酸酯)、TWEEN60(聚乙二醇失水山梨糖醇單硬脂酸酯)、TWEEN61(聚乙二醇失水山梨糖醇單硬脂酸酯)、TWEEN65(聚氧乙烯失水山梨糖醇三硬脂酸酯)、TWEEN80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)、TWEEN81(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)、TWEEN85(聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇三油酸酯)、四丁酚醛(帶有甲醛和環(huán)氧乙烷的4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯酚聚合物)以及正十一烷基β-D-吡喃葡糖苷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述去污劑是陰離子去污劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述去污劑選自鵝脫氧膽酸、膽酸、脫氫膽酸、脫氧膽酸、毛地黃皂苷、毛地黃毒苷配基、N，N-二甲基十二烷胺-N-氧化物、多庫酯鈉、甘氨鵝脫氧膽酸鈉、甘氨膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸-3-硫酸二鈉鹽、甘氨石膽酸乙基酯、N-月桂?；“彼?、十二烷基硫酸鋰、Lugol(碘-碘化鉀)、Niaproof(2-乙基己基硫酸鈉鹽)、Niaproof 4(7-乙基-2-甲基-4-十一烷基硫酸鈉鹽)、可選取代的烷基磺酸鹽(包括1-丁磺酸鹽、戊磺酸鹽、己磺酸鹽、1-辛磺酸鹽、1-癸磺酸鹽、1-十二烷磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1-壬磺酸鹽、1-丙磺酸鹽以及2-溴乙磺酸鹽，尤其是鈉鹽)、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、可選取代的十二烷基硫酸鈉、辛基硫酸鈉、?；悄懰徕c、牛磺鵝脫氧膽酸鈉、牛磺豬脫氧膽酸鈉、牛磺石膽酸-3-硫酸二鈉鹽、牛磺熊脫氧膽酸鈉鹽、Trizma十二烷基硫酸鹽、熊脫氧膽酸，其中任一種的鹽以及其中任一種的酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述去污劑是陽離子去污劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述去污劑選自烷基三甲基溴化銨、苯扎氯銨、芐基二甲基十六烷基氯化銨、芐基二甲基十四烷基氯化銨、芐基十二烷基二甲基溴化銨、芐基三甲基四氯碘酸銨、二甲基雙(十八烷基)溴化銨、十二烷基乙基二甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、乙基十六烷基二甲基溴化銨、吉拉德(Girard’s)試劑T、十六烷基三甲基溴化銨、N，N’，N’-聚氧乙烯(10)-N-牛油-1，3-二氨基丙烷、通佐溴銨以及三甲基(十四烷基)溴化銨。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述去污劑是苯扎氯銨。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述去污劑是兩性離子去污劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述去污劑選自CHAPS(3-{(3-膽酰胺基丙基)二甲氨基}-1-丙磺酸鹽)、CHAPSO(3-{(3-膽酰胺基丙基)二甲氨基}-2-羥基-1-丙磺酸鹽)、3-(癸基二甲氨基)丙磺酸鹽、3-(十二烷基二甲氨基)丙磺酸鹽、3-(N，N-二甲基十四烷基氨基)丙磺酸鹽、3-(N，N-二甲基十八烷基氨基)丙磺酸鹽、3-(N，N-二甲基辛基氨基)丙磺酸鹽以及3-(N，N-二甲基棕櫚基氨基)丙磺酸鹽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述去污劑是CHAPS。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中可以使用去污劑的混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述樣品在所述蘇木精染色之前與所述去污劑接觸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述去污劑與所述蘇木精染色劑混合。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述樣品在所述蘇木精染色之后與所述去污劑接觸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括將樣品與結(jié)合有著藍溶液的去污劑接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述樣品在所述橘黃G復(fù)染之前與所述去污劑接觸。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述樣品在所述伊紅Y-亮綠/固綠復(fù)染之前與所述去污劑接觸。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述樣品與結(jié)合有復(fù)染劑的所述去污劑接觸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述復(fù)染劑是橘黃G。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述復(fù)染劑是伊紅Y-亮綠/固綠。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法是自動操作的。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法是人工操作的。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述樣品與溶液中濃度為溶液的至少約0.0001％并小于約10％的去污劑接觸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述去污劑為所述溶液的至少約0.01％。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述去污劑為所述溶液的至少約0.1％。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述去污劑為所述溶液的至少約0.5％。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述去污劑不低于所述溶液的約1％。
30.一種具有水平降低的染色人為假象的經(jīng)固定的生物樣品，所述樣品包括用蘇木精、橘黃G和伊紅Y-亮綠/固綠處理的細胞，其中所述樣品已經(jīng)與可以減少樣品中染色的人為假象的數(shù)量的去污劑接觸過。
31.去污劑在降低經(jīng)固定的通過巴氏染色過程染色的生物樣品中的染色人為假象中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用巴氏染色過程來處理生物樣品的方法。該方法包括在多個步驟的任何一個步驟中將去污劑處理結(jié)合到該染色過程中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該方法有利地減少了巴氏染色過程中產(chǎn)生的人為假象的數(shù)量。本發(fā)明還提供了用該方法染色的樣品。
文檔編號G01N33/53GK1764469SQ200480008309
公開日2006年4月26日 申請日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月31日
發(fā)明者丹尼爾·拉彭, 諾曼·索爾, 索姆圖克·利姆 申請人:西泰克公司