專利名稱：胃泌素激素免疫測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在生物液樣品中檢測(cè)和/或定量生物活性肽，尤其是胃泌素肽，的ELISA測(cè)定法。本發(fā)明特別涉及用于在生物液樣品中檢測(cè)和/或定量游離肽和總肽(包括與抗體結(jié)合的肽)的方法。
背景技術(shù)：
雖然胃泌素激素早在一百年前就已被首次發(fā)現(xiàn)，在二十世紀(jì)60年代首次分離純化，但是它在正?；蚧疾〗M織的不同組織的功效仍未被完全認(rèn)識(shí)。造成對(duì)胃泌素系統(tǒng)認(rèn)識(shí)空白的一個(gè)主要原因是，對(duì)于多種胃泌素激素形式中的每一種進(jìn)行分別檢測(cè)和定量存在困難。
在哺乳動(dòng)物中，胃泌素這一肽激素以多種形式存在，根據(jù)肽鏈中氨基酸殘基的數(shù)量，可以被劃分為兩個(gè)主要的類別“小”胃泌素和“大”胃泌素?！靶　蔽该谒匕ǔ墒斓奈该谒?7(G17)和甘氨酸-G17(G17-Gly)；“大”胃泌素包括胃泌素34(G34)和甘氨酸-G34(G34-Gly)。G17的成熟形式是胃酸分泌中的一種主要效應(yīng)因子，且據(jù)估計(jì)，其在這方面的功效要比G34強(qiáng)6倍。各類不同形式的胃泌素在體內(nèi)通過(guò)一種叫“前胃泌素”的前體肽進(jìn)行切割所產(chǎn)生的，在某些情況下還對(duì)切割后的肽進(jìn)行了修飾。人G34的C端具有完整的G17的17氨基酸序列，由此可以推測(cè)其會(huì)與G17發(fā)生免疫交叉反應(yīng)。
成熟的G17對(duì)氨基端和羧基端殘基都進(jìn)行修飾N-端谷氨酸環(huán)化形成焦谷氨酸(pGlu)；C端苯丙氨酸的游離羧基被肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶(PAM)酰胺化，形成了C端酰胺化苯丙氨酸Phe-NH2。(參見(jiàn)Dockray等，Ann.Rev.Physiol.(2001)63119-139)。
成熟G17是人體內(nèi)“小”胃泌素的主要形式，具有氨基酸序列pEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO1)。G17-Gly是胃泌素的一種不完全加工形式，是健康人體內(nèi)“小”胃泌素的次要組份，，具有氨基酸序列pEGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO2)。
胃泌素34是人體內(nèi)“大”胃泌素的主要形式，具有氨基酸序列pEGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO3)、谷氨酸-胃泌素34(G34-Gly)，帶有一個(gè)附加的C端甘氨酸殘基，其氨基酸序列為pELGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO4)。
胃泌素是由胃的幽門(mén)竇G細(xì)胞在胃泌素釋放肽(GRP)的刺激下所分泌的。胃泌素的分泌，會(huì)被胃酸和多種多肽激素(尤其是促生長(zhǎng)素抑制素)的旁分泌效應(yīng)所抑制。長(zhǎng)期以來(lái)，認(rèn)為胃泌素肽的功能在于刺激健康個(gè)體的胃部酸分泌，直到最近，有研究表明這些肽還能控制腸胃系統(tǒng)(GI system)中不同細(xì)胞類型的增殖、分化和成熟。
除了它們?cè)谀c胃系統(tǒng)的區(qū)域性作用外，G17和G17-Gly(后者程度稍小)還被釋放入血液；已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在如胃癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等腸胃紊亂和疾病的患者血清中，胃泌素濃度是升高的。最近還發(fā)現(xiàn)，這些胃泌素還同其它與腸胃道無(wú)關(guān)的疾病有關(guān)，包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和轉(zhuǎn)移性的肝臟腫瘤。。參見(jiàn)以下文獻(xiàn)中的實(shí)施例”Gastrin and Colon Cancera unifying hypothesis”S.N.Joshi等，Digestive Diseases(1996)14334-344；和”Gastrin andcolorectal cancer”Smith，A.M.和Watson，S.A.Alimentary Pharmacologyand Therapeutics(2000)14(10)1231-1247。
抗體是許多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和其它領(lǐng)域的檢測(cè)技術(shù)中的關(guān)鍵試劑。。這類測(cè)定包括許多常規(guī)使用的免疫測(cè)定技術(shù)，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、免疫組織化學(xué)(IHC)和免疫熒光(IF)測(cè)定。
當(dāng)用于許多上述檢測(cè)法時(shí)，單克隆抗體(MAb)具有在很多方面都優(yōu)于多克隆抗血清、和從多克隆抗血清中純化得到的抗體的獨(dú)特特性。這些包括對(duì)于靶抗原的單一抗原決定簇的特異性(即對(duì)于單個(gè)表位的特異性)；不同抗體制備方法得到的抗體，都具有長(zhǎng)時(shí)間不變的特異性、以及恒定親和力和化學(xué)成分。此外，單克隆抗體可以用體外方法無(wú)限期、不限量的生產(chǎn)。這些特性同多克隆抗體的特性呈鮮明對(duì)比。后者需要采用體內(nèi)免疫的方法，該方法不可避免地受到生物差異的影響、而且在免疫動(dòng)物的生命周期內(nèi)產(chǎn)生抗體的能力是有限的。
雖然具有這些優(yōu)點(diǎn)，各個(gè)單克隆抗體之間仍存有差異，即使它們是特異性地針對(duì)同一抗原表位的。例如，通過(guò)用一個(gè)單抗原表位區(qū)段來(lái)進(jìn)行免疫，其誘導(dǎo)獲得的各種單克隆抗體之間會(huì)呈現(xiàn)出任一或所有下列特性的差異1)對(duì)分子組成和表位三級(jí)結(jié)構(gòu)的良好特異性；2)抗體獨(dú)特型；3)抗體親和力；4)抗體同種異型；和5)抗體同種型。這些特性差異會(huì)影響單克隆抗體(Mab)在特定免疫檢測(cè)中的功效，以至于在特定測(cè)定中抗同一抗原區(qū)段的不同Mab株表現(xiàn)出不同的功效。因此，在作為特定免疫測(cè)定中的試劑時(shí)，一些MAb要優(yōu)于另一些與相同表位結(jié)合的Mab。
免疫測(cè)定法可以是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、以及如ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定)、狹線印跡和western印跡等的免疫檢測(cè)試驗(yàn)。這些技術(shù)的一般指導(dǎo)，參見(jiàn)Ausubel等(eds)(1987)的”CurrentProtocols in Molecular Biology”John Wiley and Sons，New York，N.Y.。另外，免疫測(cè)定也可是一種用來(lái)觀測(cè)組織樣品中的胃泌素激素的免疫組織化學(xué)(IHC)染色或免疫熒光(IF)方法。參見(jiàn)”P(pán)rinciples and Practice ofImmunoassay”(1991)Christopher P.Price和David J.Neoman(eds)，Stockton Press，New York，N.Y.。
特異性針對(duì)G17的N端區(qū)域和C端區(qū)域的單克隆抗體也已有報(bào)道。。參見(jiàn)Azuma等，Gastroenterologica Japnica(1986)21(4)319-324；Ohning等，Peptides(1994)15(3)417-423；Fuerle等，Pancreas(1995)10(3)281-286；Kovacs等，Peptides(1996)17(4)583-587；Ohning等，Am J.Physiol.(1996)271(3 Pt 1)G470-476；Sipponen等，(2002)Scand.J.Gastroenterol.37(7)785-791。然而，所述的這些抗體，無(wú)論以單獨(dú)或以組合形式，都不具備對(duì)正?；虿±頎顟B(tài)生物液中每種形式的胃泌素進(jìn)行區(qū)分和定量的能力。
抗胃泌素多克隆抗體已被報(bào)道能有效地抑制胃泌素活性(”Inhibition ofgastrin activity by incubation with antibodies to the C-terminaltetrapeptide of gastrin”Jaffe等，Surgery(1969)65(4)633-639)；非人源抗胃泌素多克隆抗體已被用于治療患有卓艾二氏綜合癥(混合型非胰島細(xì)胞分泌腺瘤)的患者，該病理?xiàng)l件中未經(jīng)攝食刺激即產(chǎn)生過(guò)量胃泌素。參考Hughes等，”Therapy with Gastrin Antibody in the Zollinger-Ellison Syndrome”；Hughes等，Digestive Diseases(1976)21(3)201-204。但這些兔源的抗胃泌素抗體“最多只在患者身上取得了短期療效”(Hugh at p.204)。
近來(lái)認(rèn)為，血清中?；?非?；该谒丶に氐谋壤芴峁┮粋€(gè)用作個(gè)體患十二指腸潰瘍或胃萎縮的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的指標(biāo)。參考已公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0049689，名為”Diagnosis and Treatment of gastrointestinalDisease”，發(fā)明人T.C.Wang。
至今為止，未能得到能夠靈敏檢測(cè)并準(zhǔn)確區(qū)分G17、G17-Gly、G34和G34-Gly等各個(gè)形式的胃泌素激素的MAb。此外，直至本發(fā)明前，還無(wú)法精確測(cè)量生物液樣品中每一種形式的胃泌素的量。仍未能精確測(cè)量生物液樣品中的每種胃泌素形式。在臨床試驗(yàn)的測(cè)定中使用本發(fā)明的單克隆抗體(Mab)，能更精確地確定了胃泌素在正?；虿±砬闆r下的生物活性，并提供了用于制藥的MAb組合物以及預(yù)防和治療胃泌素相關(guān)疾病和病況的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用以測(cè)定生物液樣品中的胃泌素激素(包括結(jié)合抗體的和游離的)總量的方法。所述方法包含以下步驟(a)從患者身上獲取含有胃泌素的生物液樣品；(b)提供一種能選擇性地結(jié)合于胃泌素的C端表位的固定化抗體；(c)在能使樣品中的胃泌肽激素與所述抗體結(jié)合的適合條件下，將樣品與帶N端序列的胃泌素肽一起保溫，從而產(chǎn)生一種該抗體與胃泌素結(jié)合的固定化復(fù)合物；(d)洗滌固定化復(fù)合物，以去除帶N端序列的胃泌素肽，將復(fù)合物與一個(gè)能選擇性地結(jié)合于胃泌素激素N端表位的、合適的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)抗體一起保溫，以形成一種固定化的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)的抗體復(fù)合物；(e)洗滌該固定化的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)的抗體復(fù)合物，并將其與顯色劑一起保溫；和(f)測(cè)量顯色后的試劑，以確定在生物液樣品中的胃泌素激素總量。
本發(fā)明還提供了一種用以測(cè)定生物液樣品中游離胃泌素含量的方法。所述方法包括以下步驟(a)從患者身上獲取含有胃泌素的生物液樣品；(b)提供一種能選擇性地與胃泌素N端表位結(jié)合的固定化抗體；(c)在能使樣品中的胃泌素與所述抗體相結(jié)合的合適條件下，保溫樣品，以產(chǎn)生所述抗體與胃泌素結(jié)合的固定化復(fù)合物；(d)洗滌固定化復(fù)合物以去除未結(jié)合的成分，將復(fù)合物與一個(gè)能選擇性地結(jié)合于胃泌素激素C端表位的、合適的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)抗體進(jìn)行反應(yīng)；(e)洗滌該固定化的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)的抗體復(fù)合物，并將其與顯色劑一起保溫；和(f)測(cè)量顯色后的試劑，以確定在生物液樣品中的游離胃泌素激素的量。
本發(fā)明還提供了一種用以測(cè)定生物液中結(jié)合的以及游離的多肽的總量的方法，其特征在于，所述多肽至少有一部分能與第一結(jié)合序列發(fā)生可逆地結(jié)合。所述方法包括以下步驟(a)從患者身上獲取含有該多肽的生物液樣品；(b)提供一種包被有一種抗體的固相基質(zhì)，所述抗體能選擇性地結(jié)合于多肽首要表位，這個(gè)首要表位是在第一結(jié)合序列中沒(méi)有出現(xiàn)的；(c)在能使多肽與所述抗體結(jié)合的適合條件下，將樣品與帶第一結(jié)合序列、而不帶首要表位的肽段一起保溫，從而產(chǎn)生一種所述抗體與多肽的復(fù)合物；(d)洗滌反應(yīng)孔，以去除未結(jié)合的抗體和肽段，將復(fù)合物與一個(gè)能選擇性地結(jié)合于多肽次要表位的、合適的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)抗體進(jìn)行反應(yīng)；(e)洗滌反應(yīng)孔，向孔中加入顯色劑；和(f)測(cè)量顯色后的試劑，以確定在生物液樣品中結(jié)合的以及游離的多肽的總量。
本發(fā)明還提供了一種對(duì)患有胃泌素激素引起的疾病或病況的患者的胃泌素激素封閉治療情況進(jìn)行評(píng)估的方法。所述方法包括以下步驟(a)在治療前或治療的早期階段，從患者身上獲取第一份含有胃泌素的生物液樣品；(b)用免疫測(cè)定法測(cè)定第一份樣品中的胃泌素激素水平；(c)根據(jù)所要治療的疾病或病況、以及第一份樣品中的胃泌素激素水平，進(jìn)行診斷；(d)對(duì)患者實(shí)施治療，包括第一試劑或能產(chǎn)生第一試劑的物質(zhì)，所述第一試劑能與胃泌素激素結(jié)合、從而能在體內(nèi)調(diào)控胃泌素與其靶受體的結(jié)合；(e)在一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間之后(在此期間治療已應(yīng)產(chǎn)生了一定效果)，從患者身上提取第二份生物液樣品；(f)用免疫測(cè)定法，測(cè)定第二份樣品的第一部分樣本中的總胃泌素水平(包括結(jié)合的和游離的胃泌素)，其中，所述第二份樣品中的第一部分樣本是與以下物質(zhì)一起保溫的(i)一種能取代任何被第一試劑結(jié)合的胃泌素的第二試劑；和(ii)一種固定化的抗胃泌素激素抗體，其中，所述固定化抗體不結(jié)合第二試劑；洗滌以除去第二試劑，并加入能同胃泌素激素結(jié)合、且不與固定化抗體競(jìng)爭(zhēng)的可檢測(cè)抗體，以形成一種免疫復(fù)合物，所述免疫復(fù)合物中固定化抗體結(jié)合到胃泌素激素上、該胃泌素激素接著又被可檢測(cè)抗體所結(jié)合；(g)檢測(cè)免疫復(fù)合物中可檢測(cè)抗體的量，從而可以測(cè)定第二份樣品中總胃泌素激素的量；(h)通過(guò)重復(fù)進(jìn)行步驟(f)和(g)，來(lái)測(cè)定第二份樣品的第二部分樣本中游離胃泌素激素水平，其中(f)步驟的保溫是在沒(méi)有第二試劑的條件下進(jìn)行的；和(j)比較所測(cè)定的第一份樣品中的游離胃泌素激素量和第二份樣品中的游離胃泌素和總胃泌素量，從而確定胃泌素激素封閉治療對(duì)于患者的療效。


圖l顯示了在經(jīng)過(guò)以N-四甲聯(lián)苯胺磺酸鹽(TMBS)為發(fā)色底物的酶促顯色反應(yīng)后，以胃泌素濃度(皮摩爾，10-12摩爾)對(duì)450納米(A450)吸光度作圖所得的總胃泌素17的校正曲線示意圖。
圖2顯示了同上法，以胃泌素濃度(皮摩爾，10-12摩爾)對(duì)450納米(A450)吸光度作圖所得的游離胃泌素17的校正曲線示意圖。。
具體實(shí)施例方式
下面提供了本發(fā)明中所用術(shù)語(yǔ)和詞組的定義如本文中所互換使用的“胃泌素激素”或“胃泌素激素形式”，是指任何有生物活性的和/或有免疫交叉反應(yīng)活性的胃泌素激素肽。胃泌素激素的主要形式包括、但不局限于胃泌素17(G17)，無(wú)論是C端酰胺化的或具有游離C端的；甘氨酸-胃泌素17(G17-Gly)；胃泌素34(G34)，包括C端酰胺化形式或具有游離C端的形式；和甘氨酸-胃泌素34(G34-Gly)。
如本文所用，對(duì)于某一特定形式的胃泌素激素的“選擇性”，是指該抗體對(duì)某一特定形式的胃泌素上的某一特定靶抗原決定簇具有特異性，并能與含有該靶抗原決定簇的任何一種胃泌素形式相結(jié)合。例如，成熟的(酰胺化的)G17的C端，與成熟的G17和G34相同。所以，特異性針對(duì)成熟G17 C端上的C端靶抗原決定簇的MAb，也能選擇性的識(shí)別G17(和G34)。
如本文所用，樣品中一種胃泌素形式的“總量”，是指游離的(未結(jié)合的)胃泌素激素形式量加上復(fù)合的(結(jié)合的)胃泌素激素形式量的總和。復(fù)合的胃泌素，可以是被抗體所結(jié)合的、或是被樣品中其它胃泌素結(jié)合的組分所結(jié)合的。
如本文所用，“生物液”是指任何含有生物來(lái)源的材料的液體。本發(fā)明使用的優(yōu)選生物液，包括動(dòng)物(尤其是哺乳動(dòng)物)體液，，優(yōu)選為人。所述體液可以是任何體液，包括但不局限于，血漿、血清、淋巴液、腦脊液(CSF)和其它類似物質(zhì)。
如本文所用，“防腐劑”是指能夠減少生物液樣品或帶有生物成分的液體樣品中胃泌素的時(shí)間依賴性降解作用的任何反應(yīng)劑、補(bǔ)充劑或添加劑。在本發(fā)明實(shí)踐中所使用的防腐劑包括本領(lǐng)域所熟知的眾多眾多防腐劑中的中任一種，包括但不局限于，如疊氮化鈉、EDTA等普通化學(xué)防腐劑，和如PMSF(苯甲基磺?；?、抑蛋白酶肽(如抑肽酶)等蛋白酶類抑制劑，或如肝素等生物防腐劑。
如本文所用，“試驗(yàn)平板”是指能用本發(fā)明的方法在其上對(duì)多個(gè)液體樣品進(jìn)行分別檢驗(yàn)的任何固體基質(zhì)。如本文所用，試驗(yàn)平板的“反應(yīng)孔”是指試驗(yàn)板上作為平板樣品接受區(qū)的范圍。典型的試驗(yàn)平板的反應(yīng)孔，是通過(guò)在平板表面形成凹陷來(lái)得到的，該凹陷足夠接收并容納樣品體積和檢測(cè)過(guò)程中任一步中所加入的緩沖液或洗滌液的體積。
如本文所用，對(duì)于靶分子的“測(cè)量”，是指檢測(cè)、定量或者測(cè)定某一分析物或靶分子的量。
本發(fā)明詳細(xì)公布了特別適用于免疫酶分析法(通常稱為“ELISA”或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)的MAb，所述測(cè)定旨在測(cè)量生物液中特定形式的胃泌素。
在本發(fā)明試驗(yàn)中所使用的Mab，包括選擇性地在氨基酸序列pEGPWLE(SEQID NO5)的表位、同胃泌素17(G17)N端相結(jié)合的MAb。
在本發(fā)明試驗(yàn)中所使用的Mab，還包括選擇性地在氨基酸序列EEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO6)的表位、同胃泌素17(G17)或胃泌素34(G34)相結(jié)合的MAb。
另一方面，在本發(fā)明試驗(yàn)中所使用的Mab，包括選擇性地在氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO7)的表位、同人胃泌素34(G34)N端相結(jié)合的MAb。
另一方面，本發(fā)明試驗(yàn)中所使用的Mab，包括選擇性地在氨基酸序列YGWMDFG(SEQ ID NO8)的表位、同甘氨酸-胃泌素17(G17-Gly)和甘氨酸-胃泌素34(G34-Gly)相結(jié)合的MAb。
在本發(fā)明的試驗(yàn)中所使用的Mab，優(yōu)選能與胃泌素激素形式結(jié)合、且其選擇性結(jié)合的結(jié)合常數(shù)(Ka)為約106-107LM-1的Mab；優(yōu)選能與胃泌素激素形式結(jié)合、且Ka為約107-108LM-1的Mab，而更優(yōu)選Ka為約109-1010LM-1的，且進(jìn)一步優(yōu)選Ka為1010-1011LM-1，最優(yōu)選的是Ka為1011-1012LM-1。
按照本發(fā)明的方法，用于分析的樣品優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物生物液的樣品。所述樣品包含、或懷疑含有一定量的待檢測(cè)、定量或測(cè)定的肽。優(yōu)選地是，樣品含有以至少一種胃泌素形式存在的胃泌素激素。更優(yōu)地是，樣品中已被加入防腐劑以形成一種樣品混合物，且該樣品混合物在從哺乳動(dòng)物體取樣后的約1-15分鐘以內(nèi)就進(jìn)行了冷凍處理。
如本文所用，用于結(jié)合的“適合條件”，是一種溫度、pH和離子強(qiáng)度的條件，所述條件允許抗體與其同源抗原結(jié)合、并允許進(jìn)行將酶標(biāo)記物偶聯(lián)到抗體上來(lái)作為偵測(cè)劑的酶標(biāo)記反應(yīng)的進(jìn)行。這種適合于抗體-抗原結(jié)合和各種標(biāo)記酶反應(yīng)的條件是為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，并且無(wú)需多余實(shí)驗(yàn)、通過(guò)常規(guī)手段即可來(lái)確定對(duì)于每個(gè)反應(yīng)的特定合適條件。
如本文所用，“可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)抗體”是指任何標(biāo)記抗體，其中，所述標(biāo)記物提供了一種如酶標(biāo)記物的可檢測(cè)信號(hào)；或是可被另一種試劑(如標(biāo)記的二抗)所檢測(cè)，標(biāo)記的二抗本身，可通過(guò)提供如放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、熒光或發(fā)光標(biāo)記物、或者如可被偶聯(lián)了親和素的組分檢測(cè)到的生物素標(biāo)記等可被單獨(dú)檢測(cè)的組分等這些檢測(cè)信號(hào)而被探測(cè)到。
如本文所用，“可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)的抗體復(fù)合物”是指一種復(fù)合物，所述復(fù)合物具有一種偶聯(lián)了可檢測(cè)標(biāo)記物的抗體，所述抗體結(jié)合至其同源抗原上，該抗原可以是胃泌素激素。這種胃泌素激素-抗體復(fù)合物提供了一種能被測(cè)量的、且與所測(cè)的抗體濃度直接相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)。在優(yōu)選濃度范圍中，信號(hào)與可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)的抗體復(fù)合物的濃度呈正比。
如本文所用，“顯色劑”是指一種能被抗體偶聯(lián)酶顯色的試劑。例如堿性磷酸酯酶的顯色劑可以是對(duì)硝基苯磷酸(pNPP)。
本發(fā)明提出一種用于測(cè)量總胃泌素(結(jié)合的和游離的)量的測(cè)定方法和一種用于評(píng)價(jià)胃泌素封閉治療情況的方法。該測(cè)定方法如下所述。評(píng)價(jià)患者的胃泌素封閉治療情況的方法在臨床實(shí)踐中特別有價(jià)值，確定何時(shí)著手進(jìn)行一個(gè)或是另一個(gè)治療方案，對(duì)于患者的治療效果起到了關(guān)鍵作用。本發(fā)明的方法提供了作出這些關(guān)鍵決定所依據(jù)的信息。本方法提供了一種在治療前或治療早期(如在美國(guó)專利5622702中所述，在用胃泌素激素肽偶聯(lián)的疫苗免疫患者后不久)的胃泌素測(cè)量方法，并提供一種或一種以上，在一段根據(jù)預(yù)期治療已經(jīng)開(kāi)始產(chǎn)生效果的時(shí)期之后，對(duì)于總的和/或游離的胃泌素量的測(cè)量方法。
分析方法以下是對(duì)本發(fā)明的分析方法(免疫酶分析法)的詳細(xì)說(shuō)明，所述分析方法通過(guò)使用針對(duì)待測(cè)的特定分子形式的胃泌素激素的C端或N端有特異性的單克隆和/或多克隆抗體，來(lái)測(cè)定如人血漿等的生物液中總的(非復(fù)合的加上與抗體復(fù)合的)或游離的(非復(fù)合的)人胃泌素激素(G17，G17-Gly，G34或G34-Gly)量。另外，針對(duì)分子C端或針對(duì)分子N端的多克隆抗體組合物也可分別同針對(duì)分子N端或針對(duì)分子C端的單克隆抗體組合使用。
在下述的檢測(cè)中，使用了NUNC Maxisorp，F(xiàn) 96 ELISA plate(目錄號(hào)439454)試驗(yàn)平板，抗體包被溶液為硼酸緩沖溶液(20mM，pH 8.0，含有0.1％疊氮化鈉)。
1.平板包被用選擇性地識(shí)別特定的待測(cè)人胃泌素分子形式的抗體，以最佳濃度包被于試驗(yàn)平板的反應(yīng)孔的表面。
最佳抗體濃度是通過(guò)用已知濃度的待測(cè)胃泌素形式繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定的，該曲線在所要求的有效濃度范圍中具有所要求的靈敏度和精確度。對(duì)于G17，檢測(cè)的有效G17濃度范圍一般是從背景濃度(約4pM或更低)至25pM，或至50pM。然而，患有胃泌素瘤的患者中，血漿胃泌素的水平可以高達(dá)800pM或甚至1000pM(1.0微摩)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，可以方便地確定在所要求范圍內(nèi)是否具有合適靈敏度和精確度，而無(wú)須進(jìn)行多余的實(shí)驗(yàn)。
2.平板洗滌將包被溶液倒去，加入洗滌緩沖液(每孔大約400微升)然后倒去。按要求將這個(gè)洗滌循環(huán)重復(fù)多次。洗滌緩沖液為0.010M磷酸緩沖液(0.0027M氯化鉀，0.137M氯化鈉，pH7.4，含有0.01％w/v Triton X-100)。平板洗滌可以是自動(dòng)化的(下述測(cè)定中所使用的儀器為L(zhǎng)absystems Wellwash4Mk 2，Life Sciences International(UK)Ltd，Basingstoke，UK)。
3.平板封閉將含有蛋白質(zhì)和去垢劑封閉緩沖液(含1％BSA/0.1％TritonX-100的包被緩沖溶液)加入反應(yīng)孔。平板可以此形式儲(chǔ)存。
4.樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的加入平板按上述方式進(jìn)行洗滌。將含有兔IgG(400微克/毫升)和EDTA(3.4mM)的檢測(cè)緩沖劑(在洗滌緩沖液中加入1％BSA，0.1％牛丙種球蛋白和200KIU/毫升抑蛋白酶肽制成)加入每個(gè)孔(100微升/孔)。將檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品(如在去除了胃泌素的血漿中加入了遞增量的胃泌素激素)和測(cè)試血漿樣品加入反應(yīng)孔內(nèi)(20微升/孔)。該反應(yīng)在4℃下過(guò)夜進(jìn)行。可以通過(guò)將樣品在室溫下放置過(guò)夜，來(lái)方便地達(dá)到去除血清樣品中胃泌素的目的。
這些用于檢測(cè)總胃泌素激素的測(cè)定法中，所使用的檢測(cè)緩沖液、兔IgG和EDTA混合液里含有解離肽G17(1-9)(100微克/毫升)。
5.偶聯(lián)物的加入洗滌后，每孔中加入檢測(cè)緩沖液，所述檢測(cè)緩沖液含有對(duì)待測(cè)的胃泌素激素形式N端有特異性的、偶聯(lián)了酶標(biāo)記物的單克隆或多克隆抗體以及兔IgG(100微克/毫升)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行(+22℃)，用微板搖床進(jìn)行振蕩。用于偵測(cè)復(fù)合物顯色的合適酶底物的例子有用于堿性磷酸酯酶的硝基-苯磷酸，或用于辣根過(guò)氧化物的四甲基聯(lián)苯胺磺酸鹽(TMBS)。顯色的程度可通過(guò)吸光度單位(AU，如果是對(duì)硝基酚，讀取405nm的吸光度；如果是TMBS，讀取450nm的吸光度)讀出，可以作為測(cè)試樣品中G17的含量的指標(biāo)，其確切濃度可以通過(guò)讀取測(cè)試樣品的吸光度、再參考由已知濃度胃泌素激素所作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)?yè)Q算得出。
7.讀數(shù)當(dāng)?shù)玫阶銐驒z測(cè)信號(hào)時(shí)，使用如全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀或熒光酶標(biāo)儀等儀器對(duì)信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。
8.數(shù)據(jù)處理用已知濃度的胃泌素的標(biāo)準(zhǔn)溶液所獲得的檢測(cè)信號(hào)，來(lái)建立一條校正曲線(信號(hào)-濃度)。該校正曲線用于換算出試驗(yàn)樣品中胃泌素形式的濃度。
用于測(cè)定總的和游離的胃泌素激素形式的量的詳細(xì)檢測(cè)方法描述如下總G17的測(cè)定在本檢測(cè)中，把對(duì)人胃泌素17C端具特異性的抗體，包被于試驗(yàn)平板反應(yīng)孔的表面。平板洗滌和平板封閉按照上述常規(guī)方法進(jìn)行。用所述方法洗滌平板。每孔加入含有兔IgG(400微克/毫升)、解離肽G17(1-9)(100微克/毫升)和EDTA(3.4mM)的檢測(cè)緩沖劑(100微升/孔)。再將檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品(在去除了胃泌素的血漿中加入0-4.1-10.2-26.6-64-160-400-1000pM的G17)和測(cè)試血漿樣品加入孔內(nèi)(20微升/孔)。反應(yīng)在冰箱內(nèi)4℃過(guò)夜進(jìn)行。洗滌后，在每孔中加入檢測(cè)緩沖液，該檢測(cè)緩沖液含有對(duì)G17的N端有特異性的、偶聯(lián)了堿性磷酸酯酶的單克隆抗體以及兔IgG(100微克/毫升)。洗滌后，加入發(fā)色底物pNPP，保溫平板并使其進(jìn)行顯色，用上述酶標(biāo)儀讀取吸光度。用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)G17溶液所獲得的檢測(cè)信號(hào)，來(lái)建立一條校正曲線(信號(hào)-濃度)。該校正曲線用于換算出測(cè)試樣品中G17的濃度。圖1顯示了一條校正曲線的示意圖。
游離G17的測(cè)定把對(duì)人胃泌素17的N端具特異性的抗體，包被于試驗(yàn)平板反應(yīng)孔的表面。平板洗滌和平板封閉按照上述常規(guī)方法進(jìn)行。用所述方法洗滌平板。每孔加入含有兔IgG(400微克/毫升)的檢測(cè)緩沖劑(在洗滌緩沖液中加入1％BSA，0.1％牛丙種球蛋白和200KIU/毫升的抑蛋白酶肽配成)，反應(yīng)在室溫下(+22℃)進(jìn)行，用微板搖床進(jìn)行振蕩。洗滌后，在每孔中加入檢測(cè)緩沖液，該檢測(cè)緩沖液含有對(duì)G17的C端有特異性的、偶聯(lián)了堿性磷酸酯酶作為酶標(biāo)記物的單克隆抗體以及兔IgG(100微克/毫升)。反應(yīng)在室溫下(+22℃)進(jìn)行，用微板搖床進(jìn)行振蕩。洗滌后，加入發(fā)色底物pNPP，保溫平板并使其進(jìn)行顯色，用上述酶標(biāo)儀讀取吸光度。用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)G17溶液所獲得的檢測(cè)信號(hào)，來(lái)建立一條如總G17測(cè)定中所述的校正曲線(信號(hào)-濃度)。該校正曲線用于換算出測(cè)試樣品中G17的濃度。圖2顯示了一條校正曲線的示意圖。
總G17-Gly的測(cè)定把對(duì)人甘氨酸-胃泌素17分子的C端具特異性的抗體，按上述方法包被于試驗(yàn)平板反應(yīng)孔的表面。平板洗滌和平板封閉按照上述常規(guī)方法進(jìn)行。用所述方法洗滌平板。每孔加入含有兔IgG(400微克/毫升)、解離肽G17(1-9)(100微克/毫升)和EDTA(3.4mM)的檢測(cè)緩沖劑(在洗滌緩沖液中加入1％BSA，0.1％牛丙種球蛋白和200KIU/毫升的抑蛋白酶肽配成)(100微升/孔)。再將檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品(在去除了胃泌素的血漿中加入0-4.1-10.2-26.6-64-160-400-1000pM的G17-Gly)和測(cè)試血漿樣品加入孔內(nèi)(如，20微升/孔)。反應(yīng)在4℃過(guò)夜進(jìn)行。后續(xù)步驟同前面總G17的測(cè)定中所述。
游離G17-Gly的測(cè)定把對(duì)G17-Gly分子N端具特異性的抗體，包被于試驗(yàn)平板反應(yīng)孔的表面。平板洗滌和平板封閉按照上述常規(guī)方法進(jìn)行。用所述方法洗滌平板。每孔加入含有兔IgG(400微克/毫升)的檢測(cè)緩沖劑(在洗滌緩沖液中加入1％BSA，0.1％牛丙種球蛋白和200KIU/毫升的抑蛋白酶肽配成)(如，100微升/孔)，接著加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品(如，50微升/孔)，反應(yīng)在室溫下(+22℃)進(jìn)行，用微板搖床進(jìn)行振蕩。洗滌后，在每孔中加入檢測(cè)緩沖液，該檢測(cè)緩沖液含有對(duì)G17-Gly的C端有特異性的、偶聯(lián)了堿性磷酸酯酶的單克隆抗體和兔IgG(100微克/毫升)。反應(yīng)在室溫下(+22℃)進(jìn)行，用微板搖床進(jìn)行振蕩。后續(xù)步驟同前面游離G17的測(cè)定中所述。
G34的測(cè)定把對(duì)人胃泌素34的N端具特異性的抗體，包被于試驗(yàn)平板反應(yīng)孔的表面。平板洗滌和平板封閉按照上述常規(guī)方法進(jìn)行。用所述方法洗滌平板。每孔加入含有兔IgG(400微克/毫升)的檢測(cè)緩沖劑(在洗滌緩沖液中加入1％BSA，0.1％牛丙種球蛋白和200KIU/毫升的抑蛋白酶肽配成)(如，100微升/孔)，接著加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品(如，50微升/孔)，反應(yīng)在室溫下(+22℃)進(jìn)行，用微板搖床進(jìn)行振蕩。洗滌后，在每孔中加入檢測(cè)緩沖液，該檢測(cè)緩沖液含有對(duì)G34的C端有特異性的、偶聯(lián)了堿性磷酸酯酶的單克隆抗體和兔IgG(100微克/毫升)，反應(yīng)在室溫下(+22℃)進(jìn)行，用微板搖床進(jìn)行振蕩。加入發(fā)色底物pNPP，用酶標(biāo)儀讀取平板反應(yīng)孔中的樣品信號(hào)，后續(xù)的數(shù)據(jù)處理同上所述。用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)G34溶液所獲得的檢測(cè)信號(hào)，來(lái)建立一條校正曲線(信號(hào)-濃度)。該校正曲線用于換算出測(cè)試樣品中G34的濃度實(shí)施例實(shí)施例1去除了胃泌素的血清樣品(其中已加入已知量的胃泌素17)中總胃泌素17的測(cè)定。
通過(guò)將血清在室溫下放置過(guò)夜，使內(nèi)源性蛋白酶能徹底降解現(xiàn)存的胃泌素，從而去除血清中的胃泌素激素。
為了確定批內(nèi)分析的精密度和準(zhǔn)確性，在去除了胃泌素的血清樣品的重復(fù)抽取樣本中加入已知量的胃泌素17(G17)，以達(dá)到表1所示的額定濃度。采取與檢測(cè)含抗胃泌素激素抗體的血清樣品同樣的方法，使用N端胃泌素肽進(jìn)行總G17的測(cè)定。在上述樣品/標(biāo)準(zhǔn)品加入的步驟中，N端胃泌素肽G17(1-9)以100微克/毫升的濃度進(jìn)行添加。表1中所給出的結(jié)果表明，在ELISA法的公認(rèn)限度內(nèi)，該檢測(cè)法準(zhǔn)確地定量了G17，所述ELISA限度相對(duì)誤差為±20％。更為重要的是，在G17濃度等于和小于100pM(上述濃度即為通常在患者中所測(cè)得的濃度)時(shí)，該測(cè)定法及其準(zhǔn)確。
表1總胃泌素17測(cè)定

n＝6測(cè)定6個(gè)重復(fù)抽取樣本sd標(biāo)準(zhǔn)差CV變異系數(shù)(四舍五入前計(jì)算)RE相對(duì)誤差(四舍五入后計(jì)算)實(shí)施例2去除了胃泌素的血清樣品(其中已加入已知量的胃泌素17)中游離胃泌素17的測(cè)定。
本測(cè)定是按照前面“測(cè)定方法”中所描述的游離胃泌素17(G17)測(cè)定的方法進(jìn)行操作。表2中所給出的結(jié)果表明，在ELISA法的公認(rèn)限度內(nèi)，該檢測(cè)法準(zhǔn)確地定量了游離的G17。更為重要的是，在G17濃度等于和小于100pM(上述濃度即為通常在患者中所測(cè)得的濃度)時(shí)，該測(cè)定法及其準(zhǔn)確。
表2游離胃泌素17的測(cè)定批內(nèi)分析的精密度和準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)

n＝9測(cè)定9個(gè)重復(fù)抽取樣本sd標(biāo)準(zhǔn)差CV變異系數(shù)(四舍五入前計(jì)算)RE相對(duì)誤差(四舍五入后計(jì)算)實(shí)施例3胃泌素17的穩(wěn)定性室溫下(約22℃)胃泌素的穩(wěn)定性，可以通過(guò)用上述的總胃泌素的測(cè)定法來(lái)評(píng)估，即在樣品剛準(zhǔn)備好時(shí)(0小時(shí)樣品)和室溫下在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置2小時(shí)后兩個(gè)時(shí)段，測(cè)量已知G17濃度為15，100和600pM的樣品中的總G17量。結(jié)果如下方表3所示，表明每個(gè)樣品中的G17濃度都大幅度降低。這證明了在使用本發(fā)明的檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定樣品的胃泌素激素量時(shí)，正確的樣品處理技術(shù)對(duì)于獲得準(zhǔn)確的胃泌素?cái)?shù)值是很重要的，所述正確的樣品處理技術(shù)包括從病人血液樣品中制備血漿時(shí)要盡可能少地暴露于較高的溫度。
表3總胃泌素17的測(cè)定室溫下的胃泌素17穩(wěn)定性(ca 22℃)

A以均值結(jié)果作為基準(zhǔn)sd標(biāo)準(zhǔn)差CV變異系數(shù)(四舍五入前計(jì)算)
RE相對(duì)誤差(四舍五入后計(jì)算)參考在本發(fā)明中提及的所有專利和出版物都在此被整體引用作為參考。
雜交瘤細(xì)胞系的保存用于產(chǎn)生本發(fā)明中特定MAb的下列雜交瘤，自2004年3月25日起被保存于美國(guó)模式培養(yǎng)物收集中心(ATCC，Manassas，VA)。
1.產(chǎn)生MAb 400-1的雜交瘤400-1指定登記號(hào)為＿＿。
2.產(chǎn)生MAb 400-2的雜交瘤400-2指定登記號(hào)為＿＿。
3.產(chǎn)生MAb 400-3的雜交瘤400-3指定登記號(hào)為＿＿。
4.產(chǎn)生MAb 400-4的雜交瘤400-4指定登記號(hào)為＿＿。
5.產(chǎn)生MAb 401-2的雜交瘤401-2指定登記號(hào)為＿＿。
6.產(chǎn)生MAb 445-1的雜交瘤445-1指定登記號(hào)為＿＿。
7.產(chǎn)生MAb 445-2的雜交瘤445-2指定登記號(hào)為＿＿。
8.產(chǎn)生MAb 458-1的雜交瘤458-1指定登記號(hào)為＿＿。
權(quán)利要求
1.一種用以測(cè)定生物液樣品中的胃泌素激素總量的方法，所述方法包含以下步驟(a)從患者身上獲取含有胃泌素的生物液樣品；(b)提供一種能選擇性地結(jié)合于胃泌素的C端表位的固定化抗體；(c)在能使樣品中的胃泌肽激素與所述抗體結(jié)合的適合條件下，將樣品與帶N端序列的胃泌素肽一起保溫，從而產(chǎn)生該抗體與胃泌素結(jié)合的固定化復(fù)合物；(d)洗滌固定化復(fù)合物，以去除未結(jié)合的抗體和帶N端序列的胃泌素肽，將復(fù)合物與一個(gè)能選擇性地結(jié)合于胃泌素激素N端表位的、合適的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)抗體一起保溫，以形成一種固定化的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)的抗體復(fù)合物；(e)洗滌該固定化的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)的抗體復(fù)合物，并將其與顯色劑一起保溫；(f)測(cè)量顯色后的試劑，以確定在生物液樣品中的胃泌素激素總量。
2.一種用以測(cè)定生物液樣品中游離胃泌素含量的方法，所述方法包括以下步驟(a)從患者身上獲取含有胃泌素的生物液樣品；(b)提供一種能選擇性地與胃泌素C端表位結(jié)合的固定化抗體；(c)在能使樣品中的胃泌素與所述抗體結(jié)合的合適條件下，保溫樣品，以產(chǎn)生所述抗體與胃泌素結(jié)合的固定化復(fù)合物；(d)洗滌固定化復(fù)合物以去除未結(jié)合的抗體，將復(fù)合物與與合適可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)抗體進(jìn)行反應(yīng)，所述抗體能選擇性地與結(jié)合于胃泌素激素N端的表位結(jié)合；(e)洗滌該固定化的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)的抗體復(fù)合物，并將其與顯色劑一起保溫；和(f)測(cè)量顯色后的試劑，以確定在生物液樣品中的游離胃泌素激素的量。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述體液為血清
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述C端選擇性抗體和/或N端選擇性抗體是一種單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述胃泌素激素是G17或G17-Gly，所述C端選擇性抗體和N端選擇性抗體與G17結(jié)合。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述C端選擇性抗體是具有雜交瘤458-1所產(chǎn)生的單克隆抗體特征的單克隆抗體；或是具有雜交瘤445-1(ATCC登記號(hào)#)或雜交瘤445-2(ATCC登記號(hào)#)所產(chǎn)生單克隆抗體特征的單克隆抗體；和/或所述N端選擇性抗體是具有400-1，400-2，400-3或400-4中任一種雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體特征的單克隆抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述C端選擇性抗體是由雜交瘤458-1所產(chǎn)生的單克隆抗體；和/或所述N端選擇性抗體是由400-1，400-2，400-3或400-4中任一種雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述胃泌素激素為G34或G34-Gly，所述C端選擇性抗體和N端選擇性抗體與G34或G34-Gly相結(jié)合。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述C端選擇性抗體是是具有雜交瘤458-1所產(chǎn)生的單克隆抗體特征的單克隆抗體；或是具有雜交瘤445-1(ATCC登記號(hào)#)或雜交瘤445-2(ATCC登記號(hào)#)所產(chǎn)生的單克隆抗體特征的單克隆抗體；和/或所述N端選擇性抗體是具有雜交瘤401-2所制單克隆抗體的特征的單克隆抗體。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述C端選擇性抗體是由雜交瘤458-1所產(chǎn)生的單克隆抗體；且/或N端選擇性抗體是雜交瘤401-2所產(chǎn)生的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)和定量胃泌素激素的測(cè)定方法，包括樣品中的總胃泌素激素和游離的胃泌素激素。本發(fā)明提供了一種適用于如哺乳動(dòng)物(尤其是人)的血液、血漿或其它體液等生物液樣品的的異相酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA－type heterogeneous phase assay)。本方法提供了一種對(duì)生物液樣品中游離的和總的G17和G34量、以及游離的和總的甘氨酸－G17和甘氨酸－G34量的精確測(cè)定方法。本發(fā)明還提供了一種采用胃泌素激素免疫檢測(cè)法、來(lái)決定對(duì)患有胃泌素激素引起的疾病或病況的患者的適合治療方案的方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1781023SQ200480008479
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者S·格里姆斯, J·利特爾, L·麥克勞格林 申請(qǐng)人:埃弗頓有限公司