專利名稱：用于體外評估個體hiv病毒感染的進展狀態(tài)的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及個體感染屬于人類免疫缺陷病毒(HIV)家族病毒的進展狀態(tài)的體外診斷以及這種傳染病的治療性治療領域。
背景技術：
AIDS疾病主要由個體感染HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒而引起，因為迄今為止感染HIV病毒的個體估計約達4千萬人，所以AIDS疾病是目前在全世界最具破壞性的疾病。
僅在2001年間，就有5百萬個體感染HIV，而同時有3百萬個體死亡。自從1983年發(fā)現(xiàn)主要的AIDS病因物質(zhì)，即HIV病毒以來，為了解這種病毒的作用機制并研制正確的方法用于(i)可重復地診斷傳染病及(ii)對特定患者疾病進展的預測已做出了大量的努力。
為了監(jiān)視的目的，成人或13歲或以上年齡的青少年，在存在25個AIDS指征之一的疾病如KS、PCP或彌漫性MAC，美國疾病控制中心(CDC)現(xiàn)在將其定義為AIDS。13歲以下兒童，AIDS的定義與青少年和成人相似，但包括列入AIDS定義疾病目錄下的淋巴樣間質(zhì)性肺炎和復發(fā)性細菌感染(CDC，1987b)。1993年成人和青少年病例定義擴大到包括每立方毫米血中CD4+T細胞計數(shù)少于200個細胞的感染HIV病毒的個體(CDC，1992)。現(xiàn)在的監(jiān)視定義取代了1987年公布的基于臨床疾病和HIV感染證據(jù)而非CD4+T細胞測定的標準(CDC，1987)。
在臨床實踐中，癥狀學和免疫功能測量特別是CD4+T淋巴細胞水平測量常用于指導HIV感染患者的治療。
雖然為了在實驗室繁殖HIV，科學家們已經(jīng)建立了永生T細胞系(Popovic等人，1984；Zagury等人，1986；Garry，1989；Clark等人，1991)，但仍有HIV于體外感染并殺傷CD4+T淋巴細胞。在體外慢病毒系統(tǒng)中已經(jīng)觀察到幾種CD4+T細胞殺傷機制并可以解釋HIV感染個體中這些細胞進行性的丟失(Garry綜述，1989；Fauci，1993a；Pantaleo等人，1993a)。這些機制包括當HIV在細胞表面發(fā)芽或細胞內(nèi)不均一分散的RNAs和非整合DNA的積累使細胞膜破裂(Pauza等人，1990；Koga等人，1988)。證據(jù)也顯示細胞內(nèi)絡合的CD4和病毒包膜產(chǎn)物能導致細胞殺傷(Hoxie等人，1986)。
除了這些CD4+T細胞缺失的直接機制外，間接的機制也可導致未感染的CD4+T細胞死亡(Fauci綜述，1993a；Pantaleo等人，1993a)。未感染的細胞經(jīng)常與感染的細胞融合，導致稱為合胞體的巨大細胞，合胞體與體外HIV的致細胞病變效應有關(Sodroski等人，1986；Lifson等人，1986)。當游離的HIV包膜蛋白質(zhì)gp120結合到未感染細胞表面而使之易于受到抗體依賴性細胞介導的細胞毒反應時，未感染的細胞也可以受到殺傷(Lyerly等人，1987)。因HIV包膜蛋白質(zhì)與某些主要組織相容性復合體II類(MHC-II)分子有一定程度的同源性，其它自身免疫現(xiàn)象也導致了CD4+T細胞死亡(Golding等人，1989；Koenig等人，1988)。
許多研究者提出HIV編碼或源于無關因素的超抗原可以啟動大量刺激CD4+T細胞并使之擴充，最終導致這些細胞缺失或無反應性(Janeway，1991；Hugin等人，1991)。已經(jīng)提出不適時地誘導產(chǎn)生程序性細胞死亡即凋亡是HIV感染中CD4+T細胞丟失的又一種機制(Ameisen和Capron，1991；Terai等人，1991；Laurent-Crawford等人，1991)。最近的報導指出HIV感染個體外周血和淋巴結的細胞凋亡都比非HIV感染個體廣泛得多(Finkel等人，1995；Pantaleo和Fauci，1995b；Muro-Cacho等人，1995)。
還觀察到HIV感染骨髓和胸腺的CD4+T細胞前體并破壞這些器官中祖先細胞最佳營養(yǎng)和成熟所必需的微環(huán)境(Schnittman等人，1990b；Stanley等人，1992)。這些發(fā)現(xiàn)可有助于解釋AIDS患者CD4+T細胞群的缺乏(Fauci，1993a)。
近來的研究證明甚至在HIV感染初期外周血和胸腺組織中就有相當多的病毒負荷和活躍的病毒復制(Fox等人，1989；Coombs等人，1989；Ho等人，1989；Michael等人，1992；Bagnarelli等人，1992；Pantaleo等人，1993b；Embretson等人，1993；Piatak等人，1993)。一個小組已報道在疾病進程的早期HIV感染個體的淋巴結中25％CD4+T細胞內(nèi)潛伏有HIVDNA(Embretson等人，1993)。其它數(shù)據(jù)也提議HIV感染是每天新病毒感染、破壞及替換10億以上CD4+T細胞的連續(xù)巡回持續(xù)的動態(tài)過程(Wei等人，1995；Ho等人，1995)。
關于HIV感染患者病情進展的預測，當前第一種方法由評估患者全血樣本中HIV病毒數(shù)量的增加組成，例如用特異性地直接針對HIV蛋白的抗體、特別是針對HIV衣殼糖蛋白gp120的抗體進行常規(guī)免疫測定。
當前第二種AIDS患者進展預測的方法由測量患者全血樣本的HIV基因組拷貝數(shù)組成，例如通過采用與HIV基因組RNA特異性雜交的一種或幾種核酸引物進行該樣本核酸的定量PCR擴增。
上述這二種方法是有用的，因為眾多研究已顯示血流中擁有高水平HIV的人比擁有低病毒水平的個體更可能發(fā)展為AIDS相關癥狀或死亡。
當前的第三種針對AIDS患者進展的預測方法由測量感染患者(HIV+患者)全血中絕對CD4+T細胞水平組成，例如采用直接針對CD4抗原的抗體標記進行該患者血液樣本的流式細胞術分析。
上述所有預測方法可以重復使用但也有各自的技術局限性，例如在有關疾病進展與它們的生物學意義方面的技術局限性。
由于所用抗體的特異性，評估患者生物學樣本的HIV病毒粒子數(shù)量而使用抗體包括一些缺點，因為眾所周知產(chǎn)生于不同HIV病毒分離株的HIV結構蛋白質(zhì)的抗原特異性明顯不同并可由此產(chǎn)生假陰性結果。
測量患者生物樣本的HIV基因組拷貝數(shù)的確預示著已整合到感染個體細胞基因組內(nèi)的前病毒已經(jīng)進入了活躍的復制周期并且疾病在活躍地進展。然而，該技術不能同時反映患者針對病毒進展的免疫應答。
因為獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的發(fā)病機理大多歸因于具有CD4受體(CD4+)的T淋巴細胞減少，所以測量患者CD4+T細胞水平也預示疾病進展。進行性的CD4+T細胞缺失與臨床并發(fā)癥的增加有關。因為這種關聯(lián)，所以將測量CD4+T細胞水平用于建立監(jiān)測治療AIDS相關的決定點。CD4+T淋巴細胞水平也用做人類免疫缺陷病毒(HIV)疾病患者預測的標識。
然而，測量患者CD4+T細胞水平除了能得知免疫缺陷外，并不能直接反映患者的免疫狀態(tài)。特別是測量CD4+T細胞水平不能說明導致或介導觀測到的CD4+缺失的可能生物效應細胞狀態(tài)，并且不能說明導致所觀測到的患者免疫缺陷的可能生物效應細胞狀態(tài)。
的確，也可提到通過對患者細胞尤其是CD4+細胞表達的已知HIV共受體如CCR5共受體的氨基酸序列突變檢測，對特定HIV感染患者的AIDS進展進行預測，因為已經(jīng)觀察到，在編碼CCDR5共受體的兩個拷貝之一上攜帶有特異性突變的HIV感染人群比擁有該基因兩個正?？截惖娜巳壕哂休^慢的疾病過程。
然而，一旦考慮到AIDS疾病進展狀態(tài)，本領域仍需要另外的方法而允許本領域技術人員測定已感染HIV病毒患者的AIDS進展狀態(tài)，以便能夠更精確地預測疾病進展，包括許多熟知的AIDS相關疾病的發(fā)生或進展，并且也能夠更精確地監(jiān)視對于HIV感染患者更有益的治療性治療。例如，本領域需要能夠預示AIDS進展優(yōu)選地與HIV感染的生物學有生物學關聯(lián)的新的生物學標記，例如，與所檢測患者的免疫狀態(tài)相關聯(lián)的新的生物學標記。
的確，這些新的生物學標記可與上述一種或幾種已知的標記聯(lián)合使用。
此外，為了預防HIV病毒感染個體發(fā)生AIDS，或更通常地來說，為了治療HIV病毒感染的患者，本領域仍需要新的在治療上有用的化合物。特別是確定新的抗HIV多聯(lián)治療或HAART(“高度有用的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療”)，需要包括特異性針對除了HIV蛋白酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶以外的其它靶分子并將作用于疾病不同階段相關靶的新的藥學活性化合物。特別是，本領域需要在HIV已開始活躍復制的HIV感染患者中尤其是CD4+T細胞數(shù)量接近減少并且因此易感于免疫缺陷HIV感染患者中以及在其CD4+T細胞已開始缺失的HIV感染患者中具有生物學活性的新的目標藥物化合物。
發(fā)明概述首先，本發(fā)明涉及體外評估個體HIV病毒感染的進展狀態(tài)的方法，其中所述方法包括步驟(a)用特異性結合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物與所述生物樣本進行孵育；和(b)測量結合于CD4+T細胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的該結合配體化合物的數(shù)量預示著病毒感染的進展狀態(tài)。
本發(fā)明也涉及專為實施上述方法而設計的試劑盒。
本發(fā)明也涉及HIV感染患者治療性活性化合物的體外篩選方法。
特別地，本發(fā)明涉及用于預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的化合物的體外篩選方法，其中所述方法包括步驟(a)在待檢測的候選治療性化合物存在下將由人活化NK細胞組成的第一種細胞群和由表達NKp44L蛋白的人CD4+T細胞組成的第二種細胞群相接觸；(b)測量通過活化的NK細胞引起的CD4+T細胞溶解；(c)比較步驟(b)的細胞溶解值和在步驟(a)缺乏候選化合物時的細胞溶解值；(d)選擇抑制或阻斷NK介導的CD4+T細胞溶解的候選化合物。
本發(fā)明還涉及預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的藥物組合物，所述組合物包含有效量的配體化合物與至少一種生理可接受賦形劑的組合，其中所述配體化合物選自(i)特異性結合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物和(ii)特異性結合于SEQID NO2的NKp44蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物。
本發(fā)明也涉及到預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的藥物組合物，所述組合物包含與編碼SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特異性雜交的有效量反義多核苷酸與至少一種生理可接受賦形劑的組合。
本發(fā)明也涉及利用治療性活性化合物和在本說明書中進一步描述的藥物組合物治療HIV感染患者的方法。
另一方面，本發(fā)明涉及包含以下氨基酸序列的多肽X1X2X3X4X5X6SWSNKSX7X8X9X10X11(I)，其中X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10和X11是指相互獨立的任一氨基酸殘基，X4是指除了A和W以外的任一氨基酸殘基，并且其中X8是指除了E和S以外的任一氨基酸殘基。
本發(fā)明也涉及用于篩選預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的化合物的體外方法，其中所述方法包括步驟(i)將待測試候選化合物與上述多肽進行孵育；(ii)分析待測試候選化合物與上述多肽的結合。
本發(fā)明也涉及預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的藥物組合物，所述組合物包含有效量的特異性結合于式(I)多肽的配體化合物與至少一種生理可接受賦形劑的組合。
附圖簡述

圖1.HIV感類個體CD4+T細胞中NKp44L的表達與疾病階段相關1A)HIV-1感染患者CD4+T細胞上NKp44L的特異性表達。比較未感染(對照，空心符號)組和HIV感染(實心符號)組。水平線標志是指平均值。橫坐標檢測的血細胞表型。縱坐標檢測的NKp44L標記陽性的細胞百分比。
1B)在HIV感染患者中CD4+T細胞NKp44L表達與外周血CD4細胞數(shù)呈負相關。使用Sperman非參數(shù)等級相關性檢驗顯示相關性(r)和其統(tǒng)計學意義(P)。橫坐標患者全血樣本中每立方毫米CD4+T細胞的數(shù)量?？v坐標檢測的NKp44L標記陽性的CD4+細胞的百分比。
1C)CD4+T細胞中NKp44L表達和病毒載量的相關性。Sperman非參數(shù)等級相關性檢驗顯示相關性(r)和其統(tǒng)計學意義(P)。橫坐標病毒載量值，以每毫升患者全血樣本中HIV基因組拷貝數(shù)表示?？v坐標檢測的NKp44L標記陽性的CD4+細胞百分比。
1D)PHA活化后HIV感染個體CD4+T細胞中NKp44L過量表達。5個未感染(對照，空心符號)和5個HIV感染(實心符號)患者比較。NA非活化細胞；PHAPHA活化細胞。橫坐標分別在對照和HIV感染個體中非活化細胞和PHA活化的細胞?？v坐標檢測的NKp44L標記陽性的CD4+細胞百分比。
圖2.HIV感染患者CD3-CD56+NK細胞的NKp44表達在每立方毫米少于500個CD4+細胞的HIV感染個體中表達NKp44的NK細胞比例顯著地高于未感染細胞(對照)。
圖3.HIV感染患者表達NKP44L的CD4+T細胞具有較高的NK溶解敏感性3A)使用NK92 NK細胞系分析針對表達(圓形)或不表達(方形)NKp44L的兩種純化的CD4+T細胞的細胞毒活性。用抗NKp44L單克隆抗體(a44)處理后細胞毒活性受到部分阻斷。
3B)針對表達(圓形)或不表達(方形)NKp44L的純化CD4+T細胞的兩種IL-2激活的自體(auto)NK原代細胞和作為細胞毒活性陽性對照的K562(星形)的細胞毒活性。
3C)針對表達(圓形)或不表達(方形)NKp44L的兩種純化的CD4+T細胞的未激活自體(auto)NK原代細胞和作為細胞毒活性陽性對照的K562(星形)的細胞毒活性。
在圖3A、3B和3C中，左邊組和右邊組代表兩次獨立的分析并且顯示結果的可重復性。
圖4.用表達多種HIV蛋白的痘苗病毒處理純化的CD4+T細胞后NKp44L的過量表達用表達HIV蛋白的幾種重組痘苗病毒以20pfu/細胞感染純化的CD4+T細胞。兩天后，將細胞洗滌兩次并用抗NKp44L的單克隆抗體(灰色粗線)或用IgM同種型對照(黑細線)染色。通過流式細胞術分析細胞。UI未感染的細胞。WT用野生型痘苗病毒感染的細胞。Gag、Pol、gp160、gp120、gp41、Tat、Nef用分別表達Gag、Pol、gp160、gp120、gp41、Tat或Nef的痘苗病毒感染的細胞。每一小圖中對NKp44L表達的百分比加以注釋。橫坐標NKp44L表達，縱坐標細胞數(shù)。
圖5.用重組gp160 HIV蛋白處理純化的CD4+T細胞后NKp44L的過量表達在10μ/ml IL2存在條件下，在2天時間內(nèi)用5μg/ml對照蛋白質(zhì)(Ctl黑圓形)或重組gp160蛋白質(zhì)(gp160-A黑三角；gp160-B黑方形)或不用蛋白質(zhì)(UT未經(jīng)處理的細胞)孵育一百萬個細胞。
5A)洗滌細胞并以抗NKp44L的單克隆抗體和CD4單克隆抗體或同種型對照染色并通過流式細胞術進行分析。每一小圖中對CD4+T細胞內(nèi)NKp44L表達的百分比加以注釋。橫坐標CD4表達，縱坐標NKp44L表達。
5B)分析用重組gp160HIV蛋白孵育的CD4+T細胞的NK溶解敏感性以了解已激活的自體純化NK細胞的細胞毒活性。在不同效應細胞/靶細胞(E/T)比率(橫坐標)下進行NK溶解活性分析?？招牧庑渭犹摼€未處理的細胞；下方的實心蛋白質(zhì)處理的對照細胞；實心三角形gp160-A處理的細胞；實心方形gp160-B處理的細胞?？v坐標特異性的NK溶解(％)。
圖6.誘導NK溶解高敏感性和NKP44L過量表達的來自HIVgp41蛋白質(zhì)的肽庫用5μg/ml源于HIVgp41蛋白質(zhì)(記為從A到J)或作為對照的來源于qp120蛋白質(zhì)(qp120)肽庫處理一百萬個純化的CD4+T細胞。如材料和方法部分所描述，每個肽庫包含10種肽。在10U/ml IL2存在條件下將細胞孵育兩天，然后洗滌兩次。
6A)分析用不同肽庫孵育的CD4+T細胞的NK溶解敏感性以了解激活的自體純化NK細胞的細胞毒活性。在不同效應細胞/靶細胞(E/T)比率下進行NK溶解活性分析。縱坐標特異性NK溶解(％)。
6B)用抗NKp44L單克隆抗體和CD4單克隆抗體或同種型對照進行細胞染色并進行流式細胞術分析。在這組圖中，結果僅為未處理的細胞(無)或以源于gp120或p41肽庫(庫C和J)處理的細胞。對每組CD4+T細胞NKp44L表達的百分比進行了注釋。觀察到對于其它庫NKp44L低表達，從0.2％到1.3％。橫坐標NKp44L表達，縱坐標CD4表達。
圖7.分析源自HIVgp41蛋白質(zhì)的C庫的每種肽用5μg/ml C庫的肽(見圖6)(記為C141-C150)或作為對照的肽gp41-E162或gp120-87處理一百萬純化的CD4+T細胞。在10U/ml IL2存在條件下將細胞孵育兩天，然后洗滌兩次。
7A)對用不同肽孵育的CD4+T細胞的殺傷模式進行檢測以了解對NK的敏感性。數(shù)據(jù)顯示使用激活的自身純化NK效應細胞的E/T比率為40/1。縱坐標特異性NK溶解(％)。
7B)用抗-NKp44L單克隆抗體和CD4單克隆抗體或同種型對照進行細胞染色并進行流式細胞術分析。縱坐標NKp44L表達。
圖8.gp41 HIV蛋白所表達的NH2-SWSNKS-COOH基序的強烈作用8A)肽gp41-C147(野生型WT)序列和兩種不同的恰在“SWSNKS”基序(對照1Ctl1)內(nèi)或在全部15mer序列(對照2Ctl2)內(nèi)具有某些修飾的對照肽序列。
用1μg/ml高度純化的WT肽或兩種對照肽(Ctl1和Ctl2)處理一百萬純化的CD4+T細胞。在10μ/ml IL2存在條件下將細胞孵育兩天，然后洗滌兩次。
8B)分析用不同肽孵育的CD4+T細胞的NK溶解敏感以了解激活的自身純化NK細胞的細胞毒活性。在不同效應細胞/靶細胞(E/T)比率(橫坐標)下進行NK溶解活性分析。空心菱形加虛線未處理的細胞；下方的實心WT肽處理的細胞；實心方形Ctl1肽處理的細胞；實心三角形Ctl2肽處理的細胞?？v坐標特異性NK溶解(％)。
8C)用抗NKp44L單克隆抗體和CD4單克隆抗體或同種型對照進行細胞染色并進行流式細胞術分析。對每組CD4+T細胞NKp44L表達的百分比加以注釋。橫坐標NKp44L表達，縱坐標CD4表達。
圖9.加入“活性SWSNKS”肽后NK溶解活性和NKp44L表達的動力學研究在0-2880分鐘內(nèi)，用1μg/ml高度純化的野生型(WT)肽或兩種對照肽(Ctl1和Ctl2)處理一百萬個純化的CD4+T細胞數(shù)次。孵育后，將細胞洗滌兩次然后分析激活的自身純化NK細胞的細胞毒活性。在不同效應細胞/靶細胞(E/T)比率下進行NK溶解活性分析(A)。用10μg/ml抗NK44L單克隆抗體預處理細胞后進行NK細胞毒活性分析(B)。流式細胞術分析顯示NKp44L的細胞表面表達(A)和細胞內(nèi)表達(B)。空心菱形加虛線未處理的細胞；下方實心WT肽處理的細胞；實心方形Ctl1肽處理的細胞；實心三角形Ctl2肽處理的細胞；下方空心加虛線用抗NKp44L單克隆抗體預處理后WT肽處理的細胞；空心方形加虛線用抗NKp44L單克隆抗體預處理后Ctl1肽處理的細胞。
圖10.不同人類細胞NKp44L的細胞表面表達K562、Jurkat和靜息PBMC的NKp44L細胞表面表達。用1μg/ml抗NKp44L單克隆抗體(灰色粗線)或IgM同種型對照(黑色細線)孵育細胞，并進行流式細胞術分析。橫坐標NKp44L表達，縱坐標細胞數(shù)目。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIV感染個體的CD4+T細胞表達稱為NKp44L的特異性蛋白質(zhì)，而非HIV感染個體的CD4+T細胞不表達該蛋白質(zhì)。在(i)不表達CD3抗原的HIV感染患者的外周血單核細胞(PBMC)中、(ii)表達CD3抗原但不表達CD4抗原的HIV感染患者的PBMC中，或者(iii)表達CD8抗原的HIV感染患者的PBMC中都不表達NKp44L蛋白。特別是，在來自HIV感染個體的經(jīng)活化CD4+T細胞如經(jīng)PHA活化的CD4+T細胞中NKp44L蛋白的表達水平進一步增高。
此外，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)顯示NKp44L蛋白表達水平的增加與HIV感染患者CD4+T細胞數(shù)減少和因此而發(fā)生的AIDS進展有關。因而，NKp44L蛋白的表達水平預示著HIV感染患者的免疫狀態(tài)。
另外，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NKp44L蛋白表達的增加與所檢測患者的HIV病毒載量的增加有關。因此，NKp44L蛋白表達水平也預示著感染患者的HIV病毒的復制活性狀態(tài)。
另一方面，根據(jù)本發(fā)明還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIV感染患者的CD4+T細胞尤其是表達NKp44L蛋白的CD4+T細胞是由受自然殺傷(NK)細胞特別是激活的NK細胞和特別是源于同一患者的自身NK細胞作用而導致細胞溶解的特異性靶細胞組成。
重要的是，本發(fā)明人已經(jīng)顯示HIV感染個體的NK細胞是通過非MHC依賴的觸發(fā)機制由表達NKp44L蛋白的自身CD4+T細胞特異性激活的。
因而，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)明確HIV感染患者CD4+T細胞NKp44L表達與AIDS疾病進展，尤其是與多種AIDS相關疾病發(fā)生相關的免疫缺陷的進展具有較高的生物相關性。
換言之，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在HIV感染個體CD4+T細胞膜表面的NKp44L蛋白表達水平與感染疾病的進展或發(fā)展狀態(tài)，尤其是CD4+T細胞進行性缺失引起的患者免疫缺陷的進展之間有統(tǒng)計學意義上的相關性。
從本發(fā)明人上面簡述的PBMC的NKp44L蛋白表達水平，更加特別地是PBMC細胞群中CD4+T細胞的NKp44L蛋白表達水平的實驗結果中，顯示出它本身是由個體感染HIV病毒的進展狀態(tài)的準確的生物學標記組成。此外，NKp44L蛋白表達水平由賦予很高生物學意義的HIV感染進展狀態(tài)的新的生物學標記組成，因為發(fā)明者已經(jīng)顯示，通過激活的NK細胞進行的非MHC依賴的CD4+T細胞識別，CD4+T細胞的NKp44L表達觸發(fā)自身NK細胞并激活這些用于特異性CD4+T細胞溶解的NK細胞。在這個特定的上下關系中，通過NKp44L蛋白特異性地與其特異性表達于NK細胞膜表面的受體對應物，即已由Cantoni等人(1999)和Vitale等人(1998)描述的NKp44受體蛋白質(zhì)結合，HIV感染患者CD4+T細胞NKp44L蛋白的表達激活NK細胞。
此外，NKp44L蛋白質(zhì)以前已由另一發(fā)明實體分離而且已經(jīng)顯示多種腫瘤細胞系表達這種蛋白質(zhì)，此外，已經(jīng)表明某些腫瘤細胞表達的NKp44L是一種能特異性結合于上述NKp44受體蛋白質(zhì)的配體，其中受體蛋白質(zhì)由包括激活的NK細胞在內(nèi)的NK細胞表達。該發(fā)明實體以前表明由激活的NK細胞所表達的NKp44受體蛋白質(zhì)至少是由受激活的NK細胞導致部分腫瘤細胞溶解的部分原因(未發(fā)表的信息)。
總之，本發(fā)明人得到的結果已經(jīng)使得他們可利用NKp44L蛋白作為已診斷為HIV感染個體的疾病進展的新的生物學相關標記實施多種方法。
此外，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)源于HIV的gp41蛋白質(zhì)的特異性多肽顯著增強了CD4+T細胞膜上NKp44L蛋白的表達。
根據(jù)本發(fā)明也已確定HIV感染患者CD4+T細胞的NK細胞溶解依賴于特異性的HIV多肽。
HIV-1 gp41包含3個結構域，胞外域(外功能域)、跨膜結構域和胞內(nèi)結構域(內(nèi)功能域)。gp41外功能域含有3個主要功能區(qū)，即定位于gp41的N端的融合肽，隨后有2個緊鄰gp41外功能域N和C末端部分的4-3七次重復，分別命名為NHR(N末端七次重復)和CHR(C末端七次重復)。N和C末端重復也稱為“HR1”和“HR2”。
在HIV和CD4+T細胞之間的膜融合期間，作為必需結構而起作用的NHR和CHR區(qū)要求構象的改變。
令人驚訝地是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種源于gp41蛋白質(zhì)的短肽，它定位于已知的HR1和HR2區(qū)之間，誘導NKp44L在CD4+T細胞的表面表達。
換言之，本發(fā)明人已鑒定了一種源于HIV gp41蛋白質(zhì)的短肽，它是造成NKp44L表面表達并因此造成由內(nèi)源性NK細胞引起的CD4+T細胞溶解的原因。
本發(fā)明人獲得的這些結果使得他們可利用源于gp41的不同于已知HR1和HR2區(qū)的特異性肽作為治療劑新的靶實施篩選方法。
重要地是，本發(fā)明人也顯示腫瘤細胞表面表達蛋白質(zhì)NKp44L并且所述的源于gp41的短肽誘導或增強NKp44L的表達。
因此根據(jù)本發(fā)明，所述源于gp41的短肽可用于腫瘤細胞表面NKp44L的表達然后誘導NK細胞對它們的特異性溶解。
因此，本發(fā)明涉及治療方法和包含以上簡述的多肽的用于制造抗癌藥物組合物的藥物組合物。
在題為“本發(fā)明的其它方法和組合物”部分將詳細描述上述篩選方法和相關的組合物。
本發(fā)明的體外診斷方法本發(fā)明的第一個目的在于HIV病毒個體感染進展狀態(tài)的體外評估方法，其中所述方法包括步驟(a)用特異性結合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物與所述生物樣本進行孵育；和(b)測量結合于CD4+T細胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此測量的所述結合配體化合物的數(shù)量預示著病毒感染的進展狀態(tài)。
此處所用的“HIV”病毒由HIV-1或HIV2病毒并且特別是HIV-1或HIV-2病毒的任何病毒株或分離株組成。
如此處所使用的感染“進展狀態(tài)的評估”由預示著所檢測HIV感染患者免疫狀態(tài)的原始實驗數(shù)據(jù)組成，因為如上所述(A)CD4+T細胞的細胞膜表面NKp44L蛋白的表達與(B)(i)所述患者CD4+T細胞的比率或(ii)針對該患者CD4+T細胞的NK細胞溶解活性水平之間有統(tǒng)計學相關性。因此，根據(jù)本發(fā)明，CD4+T細胞表達NKp44L蛋白越多，該患者HIV疾病進展越快。的確，對于所檢測患者疾病進展狀態(tài)的總體正確的臨床診斷或預測來說，僅測量NKp44L蛋白表達水平也許是不夠充分的。因此測量NKp44L表達水平可通過或結合疾病的其它診斷或預測標記來完成，例如先前在本說明書中引用的現(xiàn)有技術標記之一。
如此處所使用的SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的“胞外域部分”由包含氨基酸序列SEQ ID NO1中928位氨基酸至1168位氨基酸的多肽組成。
如此處所使用的“配體化合物”由任何分子組成，或者為(i)已從其生物學環(huán)境中純化的天然存在或天然產(chǎn)生的分子，或者為(ii)經(jīng)部分生物或化學合成(半合成)制造的分子，或者為(iii)經(jīng)全部生物或化學合成制備的分子。所述配體化合物必須特異性地(選擇性地)結合于NKp44L蛋白，這在本發(fā)明上下文中是指當用含有人類細胞的生物樣本孵育時，該配體化合物唯一地結合于至少一部分這些人類細胞所表達的NKp44L，并且因此反過來不以可檢測的方式與這些細胞表達的、不同于NKp44L或不同于CD4+T細胞的膜表面所暴露的NKp44L蛋白部分的蛋白質(zhì)結合。最優(yōu)選地是，生物樣本選自(i)全血樣本、(ii)自全血樣本純化出來的外周單核細胞和多形核白細胞懸浮液、(iii)自全血樣本純化出來的外周血單核細胞(PBMC)懸浮液、(iv)自全血樣本純化出來的T細胞懸浮液、以及(v)自全血樣本純化出來的CD4+T細胞懸浮液。
如此處所用的結合于CD4+T細胞的配體化合物的“數(shù)量”主要是指在分析生物樣本中能夠與所述配體化合物結合的CD4+T細胞的比率或百分比，換言之，是在分析生物樣本中表達NKp44L蛋白的CD4+T細胞的比率。在另一個實施方案中，為了測定結合于CD4+T細胞的所述配體化合物的“數(shù)量”，也考慮配體化合物的數(shù)量，例如結合于表達NKp44L蛋白的每個細胞的配體化合物分子的數(shù)量。直觀地說，結合于CD4+T細胞的所述配體化合物的“數(shù)量”可以分析樣本中CD4+T細胞的比率，優(yōu)選的是以百分比表示，其中所述CD4+T細胞膜表面表達的NKp44L蛋白可以通過所述配體化合物與所表達的KNp44L蛋白質(zhì)的特異性結合而檢測到。
因為本發(fā)明人已經(jīng)顯示HIV感染患者CD4+T細胞的NKp44L蛋白表達水平與該患者的CD4+T細胞數(shù)量有關，所以本發(fā)明的另一個目的在于在包含HIV病毒感染患者的血細胞的生物樣本中存在的CD4+T細胞比率的體外測定方法，其中該方法包含步驟(a)用特異性結合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物與所述生物樣本進行孵育；和(b)測量結合于CD4+T細胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的該結合配體化合物的數(shù)量預示著該生物樣本中包含的CD4+T細胞比率。
如在此處所用的分析生物樣本中包含的CD4+T細胞的“比率”由制備分析生物樣本的初始體積全血細胞中的CD4+T細胞的數(shù)量組成。例如，CD4+T細胞的比率可以表示為用于制備該生物樣本的每立方毫米初始全血樣本中CD4+T細胞的數(shù)量。
根據(jù)上述方法，本領域技術人員可容易地確定所檢測患者的CD4+T細胞的比率，例如像文中實例所顯示的那樣，通過參照此前或同時測定所得到的、每個CD4+T細胞比率值對NKp44L表達水平值所繪出的標準對照曲線得到CD4+T細胞比率。在本實施方案中，本領域技術人員根據(jù)上述方法首先測定NKp44L表達水平，然后從標準對照曲線中確定相應的CD4+T細胞比率。例如本領域技術人員可以使用圖1B中顯示的標準曲線。
因為如上所公開成人和青少年AIDS病例的定義目前擴大為包括每立方毫米CD4+T細胞計數(shù)少于200個的HIV感染個體，并且HIV感染個體CD4+T細胞比率和所述CD4+T細胞的NKp44L蛋白表達水平有嚴格的相關性，因而通過測量所述NKp44L表達水平恰當?shù)卦u價HIV感染個體疾病的進展狀態(tài)，其中所述的NKp44L表達水平是通過使用上述第一種方法測量上述定義的結合于該個體CD4+T細胞的配體化合物數(shù)量而測定的。例如，像配體化合物特異性地結合于表達的NKp44L蛋白所揭示的那樣，如果NKp44L蛋白的表達水平值超過表達NKp44L蛋白的分析生物樣本的CD4+T細胞20％，所指定患者將包含于AIDS病例中，因為如圖1B所示20％的數(shù)量值對應每立方毫米少于200個CD4+T細胞。
因為已經(jīng)顯示，HIV感染患者的CD4+T細胞的NKp44L蛋白表達水平與該患者的HIV病毒載量相關，本發(fā)明的進一步的目的在于感染HIV病毒患者的血細胞生物樣本中HIV病毒載量的體外測定方法，其中該方法包括步驟(a)用特異性結合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域的配體化合物與所述生物樣本進行孵育；和(b)測量結合于CD4+T細胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的所述結合配體化合物的數(shù)量預示著該生物樣本的HIV病毒載量。
根據(jù)上述方法，本領域技術人員可容易地確定所檢測患者的HIV病毒載量，例如，像文中實例所示那樣，通過參照此前或同時測定所得到的、每個HIV病毒載量值對NKp44L表達水平值所繪出的標準對照曲線得到HIV病毒載量。在該實施方案中，本領域技術人員根據(jù)上述方法首先測定NKp44L表達水平，然后參考標準曲線中確定相應的HIV病毒載量。例如本領域技術人員可以使用圖1C中顯示的標準曲線。
在上述任何一種方法的優(yōu)選的實施方案中，生物樣本選自(i)全血樣本、(ii)自全血樣本純化出來的外周單核細胞和多形核白細胞懸浮液、(iii)自全血樣本純化出來的外周血單核細胞(PBMC)懸浮液、(iv)自全血樣本純化出來的T細胞懸浮液、以及(v)自全血樣本純化出來的CD4+T細胞懸浮液，例如根據(jù)文中實例所教導的方法。
在用于上述任何一種方法的配體化合物的第一個優(yōu)選的實施方案中，所述配體化合物由針對SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的抗體或針對其胞外結構域的抗體組成。根據(jù)該第一個優(yōu)選的實施方案，如先前所定義該配體化合物由通過部分或全部生物合成而產(chǎn)生的配體化合物組成。
所述抗NKp44L抗體可由以下過程獲得的多克隆抗體組成(i)給予動物免疫有效量的純化NKp44L蛋白，優(yōu)選的是與免疫佐劑如弗氏完全佐劑結合，(ii)然后收集已免疫動物的全血，和(iii)純化抗NKp44L的多克隆抗體，例如使用事先固定有純化NKp44L蛋白的免疫親和層析基質(zhì)。這些用于獲得純化多克隆抗體的技術對本領域技術人員是眾所周知的。
所述抗NKp44L抗體可由多克隆抗體組成，在該種情況下根據(jù)已知的Kohler和Milstein于1975年描述的技術，該抗NKp44L抗體可從由純化NKp44L蛋白免疫的動物B細胞和骨髓瘤細胞融合之后而得到的雜交瘤中制備。
所述抗NKp44L抗體也可由通過Kozbor等人于1983年描述的三源雜交瘤技術(trioma technique)或人類B細胞雜交瘤技術所產(chǎn)生的抗體組成。
所述抗NKp44L抗體也可由噬菌體展示文庫(Ridder等人，1995)獲得的抗體片段的單鏈Fv抗體片段(美國專利US4,946，778；Martineau等人，1998)或人源化抗體(Reinmann等人，1997；Leger等人，1997)組成。
最優(yōu)選地是，抗NKp44L抗體由以下步驟獲得的單克隆抗體組成(i)制備SEQ ID NO1的一批純化的重組NKp44L蛋白；(ii)用步驟(ii)提供的有效量的純化NKp44L蛋白免疫小鼠如BALB/c小鼠，例如以一個月的時間段為間隔，連續(xù)3次注射該純化蛋白質(zhì)；(iii)例如使用Clona Cell-HY雜交瘤克隆試劑盒根據(jù)制造商的技術說明書(StemCell Technologies Inc.，Vancouver，BC，Canada)，通過將步驟(ii)中免疫小鼠的純化B細胞進行融合制備雜交瘤細胞系；(iv)培養(yǎng)步驟(iii)制備的雜交瘤細胞系并選擇能夠分泌針對NKp44L的單克隆抗體的克?。缓?v)純化步驟(iv)中所選擇雜交瘤細胞克隆產(chǎn)生的單克隆抗體。
產(chǎn)生抗NKp44L單克隆抗體的最優(yōu)選的雜交瘤細胞克隆由雜交瘤細胞系NKp44L#7.1組成。像實例中所教導的那樣，優(yōu)選地制備抗NKp44和抗NKp44L單克隆抗體。
為了在上述方法的步驟(i)中制備SEQ ID NO1的一批純化的重組NKp44L蛋白，本領域技術人員可以采用包括以下步驟的方法(i)用已插入編碼SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的核酸優(yōu)選地是SEQ IDNO3的核酸的表達載體，或已插入編碼包含其胞外結構域的多肽的核酸的表達載體轉(zhuǎn)染受體宿主細胞，優(yōu)選地是哺乳動物細胞系如COS-7細胞，并且所述表達載體中該核酸有效地與至少包含在該受體宿主細胞中有功能的啟動子的表達信號相連接，從而當置于適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下時所得到的轉(zhuǎn)染宿主細胞實際上產(chǎn)生了NKp44L蛋白；(ii)在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細胞宿主，以便產(chǎn)生NKp44L蛋白或其胞外部分；(iii)從培養(yǎng)細胞的上清液或培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染宿主細胞的細胞裂解物中收集NKp44L蛋白或其胞外部分；(iv)純化步驟(iii)中收集的NKp44L蛋白或其胞外部分，例如通過先前已固定于免疫親和層析基質(zhì)上的抗NKp44L抗體或備選地純化的NKp44蛋白。
文中實例顯示了制備純化NKp44L的優(yōu)選方法。
在用于上述任何一種方法的配體化合物的第二個優(yōu)選的實施方案中，該配體化合物由SEQ ID NO2的純化NKp44蛋白或包含其胞外結構域部分的多肽組成。這第二個實施方案進一步闡明了其中通過完全生物合成產(chǎn)生配體化合物的實施方案。
如此處所使用，NKp44蛋白的胞外域部分定位于SEQ ID NO2的NKp44蛋白N末端而且由SEQ ID NO2的第22位氨基酸殘基始至第169位氨基酸殘基為止的氨基酸序列組成。
為了產(chǎn)生純化形式的NKp44蛋白或其胞外結構域部分，本領域技術人員可有利地參考Cantoni等人(1999)公開的方法。例如，可通過以下步驟制備純化形式的NKp44重組蛋白質(zhì)(i)用插入編碼SEQ ID NO2的NKp44的核酸優(yōu)選地是SEQ ID NO4的核酸的表達載體，或插入編碼其胞外結構域的多肽的核酸的表達載體轉(zhuǎn)染受體細胞宿主，優(yōu)選地是哺乳動物細胞系如COS-7細胞，所述表達載體中該核酸有效地與至少包含在所述受體宿主細胞中有功能的啟動子的表達信號相連接，從而當置于適當?shù)呐囵B(yǎng)基中時所得到的轉(zhuǎn)染宿主細胞實際上產(chǎn)生了NKp44蛋白；(ii)在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)所轉(zhuǎn)染的宿主細胞，以致于產(chǎn)生了NKp44蛋白或其胞外結構域；(iii)從細胞培養(yǎng)的上清液或所培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染宿主細胞的細胞裂解產(chǎn)物中收集NKp44蛋白或其胞外部分；(iv)純化步驟(iii)中收集的NKp44蛋白或其胞外部分，例如通過先前已固定于免疫親和層析基質(zhì)上的抗NKp44抗體或備選地純化的NKp44L蛋白。
為了測定結合于CD4+T細胞的所述配體化合物的數(shù)量，在上述任何一種方法中的步驟(b)中，最優(yōu)選的是用可檢測的分子標記該配體化合物，所以測定由檢測所述可檢測分子產(chǎn)生的物理信號組成，其中所獲得的該物理信號值反映結合于由最初從HIV感染患者收集的生物樣本中的CD4+T細胞所表達的NKp44L蛋白的配體化合物數(shù)量。
根據(jù)第一個優(yōu)選方面，所述可檢測的分子由放射性分子組成，例如當通過常規(guī)技術用放射性標記配體化合物本身或當配體化合物也結合于放射性標記的可檢測分子時。
根據(jù)該第一個優(yōu)選方面，用選自[32p]、[3H]和[35S]的放射性同位素標記所述放射性分子。
根據(jù)第二個優(yōu)選方面，所述可檢測的分子由熒光分子組成。
根據(jù)該第二個優(yōu)選方面，所述熒光分子最優(yōu)選地選自本領域技術人員都已知的綠色熒光蛋白(GFP)和黃色熒光蛋白(YFP)。作為例證的所述熒光分子由熒光報告子FITC蛋白質(zhì)組成并且標記可以使用MolecularProbes Inc(美國)投放市場的FITC標記試劑盒。
根據(jù)第三個優(yōu)選方面，所述可檢測分子由發(fā)光分子組成。
根據(jù)該第三個優(yōu)選的實施方案，所述發(fā)光分子最優(yōu)選地選自螢光素酶。
根據(jù)第四個優(yōu)選方面，所述可檢測分子由配體分子選擇性識別的受體組成。
根據(jù)該第四個優(yōu)選方面，所述可檢測分子由生物素組成，最優(yōu)選的是在生物素化的配體化合物形式時，此時配體分子由含有抗生物素蛋白或鏈親和素(streptavidin)分子組成，該配體分子可為(i)放射性標記的、(ii)發(fā)熒光的或(iii)發(fā)光的，以便產(chǎn)生能夠被檢測用于測量CD4+T細胞的NKp44L蛋白表達水平的物理信號。
根據(jù)本發(fā)明任何一種方法的步驟(b)，可以采用本領域技術人員掌握的任何一種允許測量化合物并且尤其是可檢測的化合物結合到細胞膜表面的技術，對能夠結合分析樣本中CD4+T細胞所表達的NKp44L蛋白的配體化合物的數(shù)量進行測量。
最優(yōu)選地是，采用多種可檢測的標記，最優(yōu)選地是多種熒光標記，包括可檢測的特異性結合于NKp44L蛋白的配體化合物，通過對生物樣本進行流式細胞術分析，實施上述任何一種方法的步驟(b)。
在優(yōu)選的實施方案中，分別用至少兩個可檢測的標記，最優(yōu)選地是兩個熒光標記(i)特異性結合于NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的可檢測的配體化合物；(ii)特異性結合于CD4抗原的可檢測標記最優(yōu)選的是針對CD4抗原的抗體標記進行流式細胞術分析。最優(yōu)選地是，(i)可檢測配體化合物是熒光標記的，以便在適當光激發(fā)下發(fā)射出第一個特定波長的熒光信號和(ii)結合到CD4抗原的可檢測標記是熒光標記的，以便在適當光激發(fā)下發(fā)射出不同于第一個特定波長的第二個特定波長的熒光信號。
當聯(lián)合使用上述兩個可檢測的標記時，(i)采用雙色流式細胞術分析，經(jīng)過計數(shù)確定分析生物樣本中CD4+T細胞的數(shù)量，能夠發(fā)射第二個特定波長的光的細胞數(shù)量對應著能夠結合CD4抗原的熒光標記的標記物，和(ii)采用雙色流式細胞術術，經(jīng)過計數(shù)確定分析生物樣本中表達NKp44L蛋白的細胞數(shù)量，能夠發(fā)射第1個特定波長的細胞的數(shù)量對應著能夠特異結合NKp44L蛋白的熒光標記的配體化合物，從而計算出樣本中表達NKp44L蛋白的CD4+T細胞的比率。
在上述雙色流式細胞術分析測量方法的第一個特定實施方案中，在(i)對應于熒光標記的能夠結合CD4抗原的標記物的第二個特定波長下和(ii)對應于能夠結合NKp44L蛋白的熒光標記化合物的第一個特定波長下同時檢測發(fā)射光來確定表達NKp44L蛋白的CD4+T細胞的比率，從而直接計算出樣本中表達NKp44L蛋白的CD4+T細胞的比率。
在本發(fā)明的任何一種方法的第二個優(yōu)選的實施方案中，測量結合于CD4+T細胞的所述配體化合物數(shù)量的步驟(b)由通過顯微鏡包括共焦顯微鏡測量的結合于該配體化合物的生物樣本的細胞計數(shù)組成。根據(jù)該第二個優(yōu)選的實施方案，進行測量的試劑優(yōu)選與上述的用于流式細胞術分析的試劑相同。
本發(fā)明的另一個目的在于HIV病毒個體感染進展狀態(tài)的體外評估試劑盒，其中該試劑盒包含(i)特異性結合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物；(ii)特異性結合于CD4抗原的標記物分子。
上述定義的試劑盒也分別用于(i)體外測定存在于包含HIV病毒感染患者血細胞的生物樣本的CD4+T細胞比率；和(ii)體外測定從HIV病毒感染患者收集的包含血細胞的生物樣本的HIV病毒載量。
在上述本發(fā)明的試劑盒中，配體化合物包含先前已在本說明書中描述過的多種優(yōu)選的實施方案中的配體化合物。
在上述本發(fā)明的試劑盒中，特異性結合于CD4抗原的標記物分子包含先前已在本說明書中描述過的多種優(yōu)選的實施方案中的標記物分子。
最優(yōu)選地是，如上所述(i)配體化合物和(ii)標記物分子是不同熒光標記的。
最優(yōu)選地是，標記的配體化合物由特異性結合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的標記的單克隆抗體組成。
最優(yōu)選地是，標記的標記物分子由抗CD4的單克隆抗體組成，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心可提供該抗體，保藏號為ATTC-CRL-8002。
正如下文將詳述的，根據(jù)本發(fā)明所獲得的實驗結果擴展到HIV病毒感染治療的治療領域，并且本發(fā)明因此也涉及治療性活性化合物的篩選方法、藥物組合物以及治療HIV感染患者的方法。
篩選方法、藥物組合物和本發(fā)明的治療方法根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)顯示，當CD4+T細胞表達的NKp44L蛋白和激活的NK細胞表達的NKp44受體蛋白質(zhì)之間的結合受到阻礙時，針對表達NKp44L蛋白的CD4+T細胞的非MHC依賴的NK細胞溶解受到阻斷。
更加具體而言，在實例中顯示，當將針對NKp44L蛋白的單克隆抗體加入到從HIV感染患者收集的全血細胞懸浮液中時，針對表達NKp44L蛋白的CD4+T細胞的非MHC依賴的NK細胞溶解受到阻斷。本發(fā)明人獲得的這些實驗結果意味著，上述單克隆抗體與表達于CD4+T細胞膜表面的NKp44L蛋白的結合阻止了HIV感染患者的CD4+T細胞被NK細胞通過NKp44L受體蛋白質(zhì)與NKp44L蛋白特異結合而發(fā)生的識別，從而有效地阻止了CD4+T細胞被NK細胞的細胞溶解作用，否則會發(fā)生該種細胞溶解，由此HIV感染患者的免疫缺陷得以進展。
因此，根據(jù)本發(fā)明顯示任何一種通過阻止NK細胞的NKp44受體蛋白質(zhì)與CD4+T細胞的NKp44L蛋白特異性結合而起生物學作用的化合物都可用于抑制或阻斷HIV病毒感染個體CD4+T細胞被NK細胞進行細胞溶解的治療劑。更加具體而言，任何(i)通過特異性結合于HIV感染患者NK細胞表達的NKp44受體蛋白質(zhì)，或(ii)通過特異性結合于HIV感染患者CD4+T細胞表達的NKp44L蛋白阻止NK細胞NKp44受體蛋白質(zhì)與CD4+T細胞NKp44L蛋白特異性結合的化合物都可用于抑制或阻斷HIV感染個體CD4+T細胞被NK細胞進行細胞溶解的治療劑。
因此，根據(jù)本發(fā)明，通過檢測NKp44受體蛋白質(zhì)和NKp44L蛋白之間存在結合或不存在結合的任何方法，可有效地篩選任何一種此類有用的治療劑或化合物。
本發(fā)明的篩選方法因此，本發(fā)明的另一個目的在于預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的化合物體外篩選方法，其中該方法包括步驟(a)將待檢測候選化合物與液體溶劑中的篩選系統(tǒng)孵育，其中所述篩選系統(tǒng)包含(i)暴露于溶劑中的第一配偶體(partner)，為多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子；(ii)暴露于溶劑中的第二配偶體，為多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子；其中(iii)一方面，多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子，(iv)另一方面，多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子，能夠彼此結合；(b)對(iii)多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子與(iv)多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子的結合進行定量；(c)對在步驟(b)中定量的結合與缺乏所述候選化合物而實施步驟(a)時所定量的結合進行比較；(d)當所述候選化合物抑制或阻斷(iii)多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子與(iv)多個SEQ IDNO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子結合時，選擇出呈現(xiàn)陽性的候選化合物作為治療劑。
在上述篩選系統(tǒng)中，液體溶液(其中所述液體溶液也可稱為“溶劑”)優(yōu)選水溶液，包括鹽水溶液，其中該鹽水溶液包括用于培養(yǎng)細胞優(yōu)選哺乳動物細胞最優(yōu)選地是人類細胞的任何合適的培養(yǎng)基。
在上述篩選方法所用篩選系統(tǒng)中，第一和第二“配偶體”獨立地選自(i)多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子，或備選地是多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子，或(ii)其上結合有多個SEQ IDNO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子的基質(zhì)物質(zhì)，或備選地其上結合有多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或其胞外結構域部分的多個多肽分子的基質(zhì)物質(zhì)，其中該基質(zhì)物質(zhì)包含以暴露于溶劑的方式在其膜表面表達多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子或備選地多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子的細胞。
根據(jù)上述篩選方法篩選的候選化合物可以屬于任一種類，包括但不限于天然存在或合成的化合物或生物分子如多肽。
在篩選方法的一個特定實施方案中，候選化合物由如Parmley和Smith(1988)所描述的包含于噬菌體載體內(nèi)的DNA插入片段的產(chǎn)物組成。具體而言是使用了隨機肽文庫。隨機DNA插入片段編碼8到20個氨基酸長度的肽(Oldenburg等，1992；Valadon等，1996；Lucas，1994；Westerink，1995；Felici等，1991)。根據(jù)該特定實施方案，表達特異性結合(i)SEQID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分，或(ii)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)或其胞外結構域部分的多肽的重組噬菌體上保留有用于上述篩選方法的候選化合物。
在上述篩選方法中使用的候選化合物也可以根據(jù)本領域技術人員眾所周知的技術，通過任何免疫親和層析技術篩選出來，其中免疫親和層析技術采用其上已事先固定有(i)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或包含其胞外結構域部分的多肽分子，或(ii)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)或包含其胞外結構域部分的多肽分子的色譜基質(zhì)。
在上述篩選方法的第一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(a)中使用的篩選系統(tǒng)包括使用如Edwards和Leatherbarrow(1997)或Szabo等(1995)描述的光學生物傳感器。這個技術允許實時檢測分子之間的相互作用，而不需要經(jīng)過標記的分子。這個技術基于表面胞質(zhì)共振(SPR)現(xiàn)象。簡單地說，第一蛋白質(zhì)配偶體(partner)分子(i)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或包含其胞外結構域部分的多肽或者(ii)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)或包含其胞外結構域部分的多肽分子連接到表面(如羧甲基葡聚糖基質(zhì))。然后，將第二蛋白質(zhì)配偶體分子(iii)SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)或包含其胞外結構域部分的多肽分子或者(iv)SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或包含其胞外結構域部分在待測試候選化合物存在或缺乏的條件下與所述基質(zhì)進行孵育，并且檢測第一配偶體和第二配偶體之間的結合，包括結合水平，或者不存在結合。為了該目的，將光束照向不含待檢測樣本的基質(zhì)的表面積那側(cè)并且光束由該基質(zhì)表面反射。因角度和波長的特定組合，SPR現(xiàn)象引起反射光強度下降。第一和第二蛋白質(zhì)配偶體分子結合引起基質(zhì)表面折射指數(shù)的改變，該種改變作為SRP信號變化而檢測到。
根據(jù)上述篩選方法的第一個優(yōu)選的實施方案，篩選系統(tǒng)的“第一配偶體”由固定有第一蛋白質(zhì)配偶體分子的基質(zhì)組成，篩選系統(tǒng)的“第二配偶體”由第二配偶體蛋白質(zhì)分子本身組成。
在上述篩選方法的第二個優(yōu)選的實施方案中，篩選系統(tǒng)的“第一配偶體”由在它們的膜表面表達多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子的細胞，有利地是哺乳動物細胞，優(yōu)選地是人類細胞并且最優(yōu)選地是NK細胞組成，篩選系統(tǒng)的“第二配偶體”由在它們的膜表面表達多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子的細胞，有利地是哺乳動物細胞，優(yōu)選地是人類細胞并且最優(yōu)選地是CD4+T細胞組成。
本發(fā)明也涉及預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的化合物的體外篩選試劑盒，其中該試劑盒包含篩選系統(tǒng)，該篩選系統(tǒng)包含(i)暴露于溶劑的多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子的第一個配偶體；(ii)暴露于溶劑的多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子的第二配偶體；
其中(iii)一方面，多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子，和(iv)第二方面，多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子，能夠彼此結合。
在上述篩選試劑盒中，像先前定義的那樣，第一和第二配偶體用于上述第一種篩選方法。
本發(fā)明還針對預防和治療與個體HIV病毒感染相關的疾病化合物的體外篩選方法，其中該方法包括步驟(a)在待檢測候選治療化合物存在的情況下，將由人活化NK細胞組成的第一細胞群和由表達NKp44L蛋白的人CD4+T細胞組成的第二細胞群相接觸；(b)測量經(jīng)活化NK細胞所導致的CD4+T細胞溶解；(c)將步驟(b)中獲得的細胞溶解值與步驟(a)中缺乏候選化合物時所得到的細胞溶解值相比較；(d)選擇能夠抑制或阻斷NK介導的CD4+T細胞溶解的候選化合物。
盡管上述的第二種方法由體外方法組成，但就預防活化的NK細胞溶解CD4+T細胞來說，上述第二種篩選方法通過直接證明所述候選化合物的生物學活性而對于直接反映候選化合物治療的潛力有技術上的優(yōu)勢。
活化的NK細胞可由來源于NK細胞系的細胞組成，如Gong等(1994)描述的NK92細胞系或可由原代培養(yǎng)的正常人類純化的NK細胞組成。
表達NKp44L蛋白的CD4+T細胞可由用載體轉(zhuǎn)染的以允許所述細胞表達NKp44L蛋白的最終以細胞系形式的CD4+T細胞組成，或可由最初從HIV感染患者血液樣本純化的CD4+T細胞組成。
在上述第二種篩選方法的特定實施方案中，活化的NK細胞和CD4+T細胞是自體的因為它們都來源于同一HIV感染患者。
優(yōu)選地是，細胞溶解的測量由常規(guī)技術組成，其中作為靶細胞的CD4+T細胞最初賦予了放射性51Cr，其中細胞溶解值是由通過細胞培養(yǎng)基中溶解的CD4+T細胞釋放的51Cr數(shù)量測量的細胞溶解百分比組成。
最優(yōu)選地，細胞溶解值可以通過分析增加的效應細胞(NK細胞)與靶細胞(CD4+T細胞)的比率例如效應細胞靶細胞比率從1∶1到50∶1時NK細胞的細胞溶解活性得到。
根據(jù)上述第二種篩選方法檢測的候選化合物與根據(jù)本說明書中先前描述的第一種篩選方法檢測的候選化合物相同。
本發(fā)明的藥物組合物和治療方法本發(fā)明進一步的目的在于預防或治療HIV家族病毒個體感染相關疾病的藥物組合物，它包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的配體化合物，所述的配體化合物選自(i)特異性結合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物和(ii)特異性結合于SEQID NO2的NKp44蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物。
在上述藥物組合物的第一個優(yōu)選的實施方案中，所述配體化合物由針對SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的抗體或針對其胞外結構域部分的抗體組成。
在上述藥物組合物的第二個優(yōu)選的實施方案中，所述配體化合物由SEQ ID NO2的NKp44蛋白或包括其胞外結構域的多肽組成。
在上述藥物組合物的第三個優(yōu)選的實施方案中，所述配體化合物由針對SEQ ID NO2的NKp44蛋白的抗體或針對其胞外結構域部分的抗體組成。
“生理可接受賦形劑或載體”是指可安全地全身或局部使用的固體或液體填充劑、稀釋劑或物質(zhì)。取決于特定的給藥途徑，許多種本領域已知的可藥用載體包括固體或液體填充劑、稀釋劑、助水溶物、表面活性劑和包封物質(zhì)。與F(ab)2片段結合的載體的量提供了每單位組合物劑量材料的實際量。
可摻入本發(fā)明組合物中的用于全身施用的可藥用載體包括糖、淀粉、纖維素、植物油、緩沖液、多元醇和藻酸。以下文件描述了特定的可藥用載體(此處全部引用作為參考)美國專利號4,401,663，Buckwalter等1983年8月30日出版；歐洲專利申請?zhí)?89710，LaHann等1983年9月28日發(fā)表；和歐洲專利申請?zhí)?068592，Buckwalter等1983年1月5日發(fā)表。用于腸胃外施用的優(yōu)選載體包括丙二醇、吡咯烷酮、油酸乙酯、含水乙醇及其組合。
代表性的載體包括金合歡膠、瓊脂、藻酸鹽、羥烷基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、角叉藻聚糖、粉末狀纖維素、瓜爾膠、膽固醇、明膠、樹膠瓊脂、阿拉伯樹膠、梧桐膠、印度樹膠、豆角膠、辛苯聚醇-9、油醇、果膠、聚(丙烯酸)和其同系物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、月桂基硫酸鈉、多聚(環(huán)氧乙烷)、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇單硬脂酸酯、1，2-丙二醇單硬脂酸酯、黃單胞菌膠、西黃蓍膠、脫水山梨糖醇酯、硬脂醇、淀粉和其變體。適宜的變化范圍在約0.5％到約1％。
為了配制本發(fā)明的藥物組合物，本領域技術人員將方便地參考最新版本的歐洲藥典或美國藥典。
優(yōu)選地，本領域技術人員可以參考第四版“2002”歐洲藥典或還可以參考USP 25-NF20版美國藥典。
包含于本發(fā)明每一劑量藥物組合物中的治療活性化合物的重量將取決于該治療活性化合物的分子量以及能夠阻斷感染患者CD4+T細胞被NK細胞進行細胞溶解的有效重量。
為了測定本發(fā)明劑量的藥物組合物中治療活性化合物的合適量，本領域技術人員首先測定多種重量或濃度的所述治療活性化合物的體外CD4+T細胞溶解抑制能力，例如通過進行與先前在此描述的本發(fā)明的第二種篩選方法一樣的步驟(a)和(b)，然后保留或選擇能夠阻斷細胞溶解的特定數(shù)量或濃度的所述治療活性化合物。然后，本領域技術人員再將該保留或選擇的數(shù)量或濃度轉(zhuǎn)換成人類體內(nèi)情況，以便使施以本發(fā)明的藥物組合物的患者血液中該治療活性化合物的濃度與體外阻斷細胞溶解的濃度相同。
本發(fā)明也針對選自(i)特異性結合于SEO ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物和(ii)特異性結合于SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物在制造用來預防或治療HIV家族病毒個體感染相關疾病的藥物組合物的用途。
本發(fā)明也涉及預防或治療HIV家族病毒個體感染相關疾病的方法，其中該方法包括給需要此種治療的患者施以有效劑量選自(i)特異性結合于SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物和(ii)特異性結合于SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物的步驟。
本發(fā)明的另一個目的在于預防或治療HIV家族病毒個體感染相關疾病的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的能夠與編碼SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特異性雜交的有效量反義多核苷酸。
優(yōu)選地，通過克隆反義方向的SEQ ID NO3的NKp44L片段(起始于SEQ ID NO3的位置1并終止于位置902)獲得所述反義多核苷酸。
因此，優(yōu)選的反義多聚核苷酸由與核苷酸序列SEQ ID NO3中起始于核苷酸1并終止于核苷酸902的核酸互補的核酸組成。
本發(fā)明也針對能夠與編碼SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA特異性雜交的反義多核苷酸在制造用于預防或治療HIV家族病毒個體感染相關疾病的藥物組合物中的用途。
本發(fā)明進一步的目的在于預防或治療HIV家族病毒個體感染相關疾病的方法，其中該方法包括對需要此種治療的患者施以有效量的能夠與編碼SEQ ID NO1的NKp441蛋白質(zhì)的mRNA分子特異性雜交的反義多核苷酸的步驟。
本發(fā)明的其它組合物和篩選方法本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)源于HIV gp41蛋白質(zhì)的特異性多肽顯著地增強CD4+T表面Nkp44L蛋白質(zhì)的表達(下文的實施例6-8)。
根據(jù)本發(fā)明，也確定了HIV感染患者CD4+T細胞被NK細胞進行細胞溶解與細胞表面NKp44L表達增加的同時CD4+T細胞上所述特異性多肽的結合直接相關。
因此，本發(fā)明的另一個目的是包含以下氨基酸序列的多肽X1X2X3X4X5X6SWSNKSX7X8X9X10X11(I)，其中X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10和X11是指相互獨立的任一氨基酸殘基，X4是指除了A和W外的任一氨基酸殘基，并且其中X8是指除了E和S外的任一氨基酸殘基。
本發(fā)明進一步包含含有以下氨基酸序列的多肽PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
如上述定義，多肽優(yōu)選地源于gp41蛋白質(zhì)并具有至少39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150個連續(xù)的HIV-1 gp41蛋白質(zhì)氨基酸，而且包含上述式(I)的氨基酸序列。
式(I)中的多肽可通過重組DNA技術產(chǎn)生，例如基于HIV gp41蛋白質(zhì)的DNA序列，或通過使用標準肽合成技術的化學合成產(chǎn)生。
優(yōu)選地，式(I)的多肽由以下氨基酸序列組成PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
下文實施例6-8說明了氨基酸序列(II)的多肽所誘導的CD4+T細胞表面NKp44L表達的誘導作用。
細胞表面NKp44L表達的誘導作用的高度動力學與預先合成的NKp44L細胞內(nèi)蛋白從細胞質(zhì)到細胞表面的易位的誘導作用一致。
本發(fā)明也涉及預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的化合物的第一種體外篩選方法，其包括步驟(i)用式(I)的多肽與待檢測的候選化合物進行孵育；(ii)分析式(I)的多肽與待檢測候選化合物的結合。
候選化合物與式(I)多肽的結合可以由本領域技術人員例如通過采用雙雜交系統(tǒng)來進行。本領域技術人員已知的其它方法可用于結合分析，如生物傳感器技術(Edwards和Leatherbarrow(1997)或Szabo等(1995))、親和層析或高通量篩選(HTS)(Leblanc等2002)。
根據(jù)上述篩選方法篩選的候選化合物可以是任何種類，包括但不限于天然存在或合成的化合物或生物分子如多肽。
優(yōu)選地，步驟(ii)由對步驟(i)最后獲得的混合物進行凝膠遷移分析和檢測候選化合物和式(I)多肽之間形成的復合體組成。
凝膠遷移分析可以像本領域技術人員已知的那樣進行。
通過測定對應于所分析蛋白質(zhì)的染色位置(蛋白質(zhì)帶)，很容易觀察到候選化合物和本發(fā)明多肽之間形成的復合體，因為如果所分析的蛋白質(zhì)為其與另一個蛋白質(zhì)組成的復合體的一部分時，蛋白質(zhì)的表觀分子量發(fā)生了改變。
一方面，通過特異的抗體或特異針對式(I)多肽的抗體可以檢測凝膠遷移分析的相應蛋白質(zhì)的染色(蛋白質(zhì)帶)。另一方面，為了更容易地檢測凝膠上的蛋白質(zhì)/候選化合物，可以對式(I)的多肽進行標記。例如，為了便于識別凝膠上的不同蛋白質(zhì)，本發(fā)明多肽可以與GST、HA、多聚組氨酸鏈或其它可檢測的分子融合。
本發(fā)明進一步涉及預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的化合物的第二種體外篩選方法，其包括步驟a)(i)將第一種CD4+T細胞培養(yǎng)物與候選化合物和HIV病毒相接觸；(ii)在缺乏所述候選化合物時，將第二種CD4+T細胞培養(yǎng)物與HIV病毒相接觸；b)檢測源自培養(yǎng)(i)和(ii)的CD4+T細胞表面NKp44L的存在。
像本領域技術人員已知的那樣，例如通過對應于實施例6中的材料和方法部分描述的細胞熒光測定分析，可以對CD4+T細胞表面NKp44L的存在進行檢測。
優(yōu)選地，當源自培養(yǎng)物(ii)的CD4+T細胞表面NKp44L表達水平比源自培養(yǎng)物(i)的CD4+T細胞表面NKp44L表達水平高時，上述方法包含由陽性選擇作為治療劑的候選化合物組成的附加步驟(c)。
如相應的材料方法部分所描述的那樣，通過采用熒光激活細胞分選儀(FACS)計數(shù)細胞表面表達NKp44L的CD4+T細胞的數(shù)量，來評估CD4+T細胞表面NKp44L表達水平的比較。
備選地，如對應于實施例7中的材料和方法部分描述的那樣，通過測量CD4+T細胞的NK溶解活性，可直接進行CD4+T細胞表面NKp44L存在的檢測。
雖然上述篩選方法的步驟(b)的具體實施方案是由體外方法組成的，但就預防CD4+T細胞被活化的NK細胞進行細胞裂解而言，該實施方案可以通過直接提供所述候選化合物具有生物活性的證據(jù)而直接反映候選化合物的治療效果具有技術上的優(yōu)勢。
活化的NK細胞可以由NK細胞系的細胞組成，如Gong等(1994)描述的NK92細胞系或由原代培養(yǎng)的正常人類純化的NK細胞組成。
表達NKp44L蛋白的CD4+T細胞可以由用載體轉(zhuǎn)染的以允許所述細胞表達NKp44L蛋白的最終以細胞系形式的CD4+T細胞組成，或由最初從HIV感染患者血液樣本中純化的CD4+T細胞組成。
在上述篩選方法的特定實施方案中，活化的NK細胞和CD4+T細胞是自體的，因為二者都來源于同一個HIV感染的患者。
優(yōu)選地，細胞溶解的測量由常規(guī)技術組成，其中作為靶細胞的CD4+T細胞最初賦予了放射性51Cr，其中細胞溶解的值是由通過細胞培養(yǎng)基中溶解的CD4+T細胞釋放的51Cr數(shù)量測量的細胞溶解的百分比組成。
最優(yōu)選地，細胞溶解值可以通過分析增加的效應細胞(NK細胞)與靶細胞(CD4+T細胞)之間比率例如效應細胞靶細胞比率為從1∶1到50∶1時，NK細胞的細胞溶解活性而得到。
在結合一種或幾種式(I)多肽的候選化合物中，可以選擇剛剛上述的用于篩選方法的候選化合物。
因此，本發(fā)明也涉及預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的化合物體外篩選方法，其包括步驟(i)將候選化合物用于上述第一種篩選方法；和(ii)將步驟(i)中選擇為陽性的候選化合物用于剛剛上述的第二種篩選方法。
本發(fā)明的另一個目的是預防或治療HIV家族病毒個體感染相關疾病的藥物組合物，它包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的特異性結合式(I)多肽的配體化合物。
優(yōu)選地，用于上述藥物組合物的生理可接受賦形劑與本說明書第一部分描述的關于NKp44L配體的賦形劑相同。
為了按藥方配制本發(fā)明的藥物組合物本領域技術人員將方便地參考最新版歐洲藥典和美國藥典。
為了測定本發(fā)明劑量的藥物組合物中治療活性化合物的合適量本領域技術人員首先測定多種重量或濃度的該治療活性化合物的體外CD4+T細胞溶解抑制能力，例如通過實施先前在此描述的本發(fā)明的篩選方法，然后保留或選擇能夠阻斷細胞溶解的特定數(shù)量或濃度的該治療活性化合物。
然后，本領域技術人員再將該保留或選擇的數(shù)量或濃度轉(zhuǎn)換成人類體內(nèi)情況，以便使施以本發(fā)明的該藥物組合物的患者血液中治療活性化合物的濃度與體外阻斷細胞溶解的濃度相同。
優(yōu)選地，配體化合物由針對本發(fā)明多肽的抗體組成。
優(yōu)選地，配體化合物或包含其的藥物組合物可與能夠抑制HIV和CD4+T細胞膜融合的化合物組合。此類化合物如源于gp41蛋白質(zhì)HR1或HR2區(qū)域的肽和更確切地稱為T20、T21的肽或美國專利申請6,623,741中描述的那些肽。
本發(fā)明也涉及特異性結合于式(I)多肽的配體化合物在制造用于預防或治療HIV家族病毒個體感染相關疾病的藥物組合物中的用途。
另外，本發(fā)明人也顯示蛋白質(zhì)NK44L在腫瘤細胞表面表達，如Jurkat細胞和K562細胞。
他們也顯示式(I)的多肽誘導腫瘤細胞進行NKp44L細胞表面表達，然后使這些多肽處理的腫瘤細胞易感于NK細胞的特異溶解。
因此，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法和包含式(I)多肽的藥物組合物。
本發(fā)明涉及治療癌癥的藥物組合物，其包括與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量式(I)多肽的藥物組合物。
優(yōu)選地，用于上述藥物組合物的生理可接受賦形劑與說明書的第一部分中關于配體NKp44L的所述賦形劑相同。
與此相似，為了配制本發(fā)明的藥物組合物，本領域技術人員可以參考關于NKp44L配體的說明書的第一部分。
本發(fā)明也涉及治療癌癥的藥物組合物，它包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的、與靶癌細胞融合的有效量式(I)的多肽。
優(yōu)選地，以癌細胞為靶的所述化合物由針對癌特異性抗原的抗體組成，其中所述抗原如美國專利6,338,947描述的乳腺癌特異性的SCP-1、NY-ESO-1或SSX-2，黑素瘤特異性的SSX-2、NY-ESO-1或MAGE-3；或如美國專利6,440,663描述的腎癌特異性的抗原；美國專利6,238,668描述的結腸癌特異性的KH-1和N3。
通過下面的實施例進一步闡明本發(fā)明，但這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例A.實施例1-5的材料和方法A.1HIV感染的供者在Hpital Pitié-Satpétrière，從同意的供者獲得25個HIV感染患者的血液樣本。生物-臨床檢查包括常規(guī)測定病毒載量、全血和CD4+T淋巴細胞計數(shù)。
通過血庫(Hpital Pitié-Salpétrière)的白細胞分離，從20個未感染的供者獲得血液樣本作為對照組。
A.2細胞熒光測定分析對新鮮收獲的PBMC進行三色FACS分析。用同種型匹配的免疫球蛋白作為陰性對照(BD)。用適當?shù)目贵w混合物于4℃孵育細胞1小時，即抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD56、抗NKp44、抗NKp46或抗NKp44L單克隆抗體。用FACS細胞溶解液(BD)溶解紅細胞。像先前描述的那樣，在FACScan上分析最小量20,000個白細胞。
為測定細胞表面活化標記物的表達，用PE或FITC綴合的抗HLA-DR、抗CD69、抗CD25或抗CD71(都來自BD)對PBMC染色并通過FACS進行分析。
A.3表達NKp44L的CD4+T細胞的純化用RosetteSep CD4+富集試劑盒(StemCell)進行CD4+T細胞亞群分選。通過兩步磁性分離，選擇出表達NKp44L的陽性CD4+T細胞，用10g/ml抗NKp44L抗體于室溫孵育CD4+T細胞1小時，隨后按照10∶1的珠與細胞的比率，用山羊抗小鼠IgM包被的Dynabead(Dynal)于室溫處理30分鐘。通過FACS分析測定細胞級分的純度。
A.4原代NK細胞的分離和NK細胞毒性分析NK細胞系產(chǎn)生于PBMC，然后用StemSep細胞分離系統(tǒng)和富集NK細胞的抗體混合物(StemCell technologies)進行純化。用添加100單位rhIL-2(Boheringer)的MyeloCult H5100培養(yǎng)基(StemCell technologies)培養(yǎng)純化的NK細胞。用抗CD3(BD)、抗CD56(BD)、抗NKp44、和抗NKp46單克隆抗體染色后，以流式細胞術分析法評價這些制品的純度。
如先前所描述，在4小時51Cr釋放分析中分析細胞溶解活性。簡單地說，用每106個細胞100μCi的Na51Cr(Amersham)于37℃標記靶細胞2小時，并用培養(yǎng)基洗滌兩次。然后將靶細胞分布于在圓底96孔微量培養(yǎng)板(每孔4×103個細胞)，并且以幾種E/T比率添加效應細胞。板子于37℃孵育4小時。然后收集懸浮液并以γ計數(shù)測量51Cr的釋放。在包括抗體的實驗中，以終濃度20μg/ml加入。根據(jù)常規(guī)方法計算相對特異性51Cr釋放。計算中所扣除的自發(fā)51Cr釋放值是總摻入放射活性的10-20％。減去從對照靶得到的非特異性溶解后即為結果。每個點代表三次數(shù)值的平均數(shù)。三次數(shù)值的范圍總是在平均值5％內(nèi)。
A.5統(tǒng)計學分析用Sperman′s非參數(shù)等級相關性分析法進行相關性分析。用GraphPadPrism進行所有的計算。
B.實施例6-10的材料和方法B.1 CD4+T細胞的純化用RosetteSep CD4+富集試劑盒(StemCell)進行CD4+T細胞亞群分選。通過FACS分析測定細胞級分純度。
B.2細胞熒光測定分析對純化的CD4+T細胞進行雙色FACS分析。同種型匹配的免疫球蛋白可用作陰性對照(BD)。用適當?shù)目贵w混合物，抗CD4或抗NKp44L抗體，于4℃孵育細胞1小時。如先前所述，用FACScan分析最小量20,000個CD4+T細胞。如先前所述，了解細胞內(nèi)NKp44L的表達。簡單地說，細胞于4％PFA緩沖液中孵育20分鐘，然后洗滌并在4℃下于0.1％皂甙/PBS/1％BSA緩沖液中染色，然后用FACS分析細胞。
B.3原代NK細胞分離和NK細胞毒性分析NK細胞系產(chǎn)生于PBMC，然后用StemSep細胞分離系統(tǒng)和富集NK細胞的抗體混合物(StemCell technologies)純化。在添加100單位rhIL-2(Boheringer)的MyeloCult H5100培養(yǎng)基(StemCell technologies)中培養(yǎng)純化的NK細胞。用抗CD3(BD)、抗CD56(BD)、抗NKp44和抗NKp46單克隆抗體染色后，通過流式細胞術分析法評價這些制品的純度。
如先前所描述，在4小時51Cr釋放分析中分析細胞溶解活性。簡單地說，用每106個細胞100μCi的Na51Cr(Amersham)于37℃標記靶細胞2小時，并用培養(yǎng)基洗滌兩次。然后將靶細胞分布于圓底96孔微量培養(yǎng)板(每孔4×103個細胞)，并且以幾種E/T比率添加效應細胞。板子于37℃孵育4小時。然后收集懸浮液并以γ計數(shù)測量51Cr的釋放。在包括抗體的實驗中，以終濃度20μg/ml加入。如先前所述，計算相對特異性51Cr釋放。計算中所扣除的自發(fā)51Cr釋放值是總摻入放射活性的10-20％。減去從對照靶得到的非特異性溶解后即為結果。每個點代表三次數(shù)值的平均數(shù)。三次數(shù)值的范圍總是在平均值5％內(nèi)。
B.4表達HIV-1蛋白的重組痘苗病毒使用野生野痘苗病毒(WT)或多種重組痘苗病毒以20PFU/細胞的感染復數(shù)感染純化的CD4+T細胞，將此種細胞用作靶細胞。由Transgène(Strasbourg，F(xiàn)rance)提供了HIV-1-LAI Gag、Pol、Env、Nef、Tat和Vif蛋白的重組痘苗病毒。
B.5肽和肽庫合成的15mer肽可從Epytop(Nmes，F(xiàn)rance)購買或由AgenceNationale de la Recherche sur le SIDA友好提供。HPLC譜顯示純度都超過80％。肽庫包括大約10種不同的肽并且每一肽與前面連續(xù)的肽重疊11個殘基。
C.結果實施例1全長和反義NKp44L載體和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的產(chǎn)生通過在pEF6載體(invitrogen)中連續(xù)亞克隆先前已克隆入PCR-Zero-blunt載體(Lnvitrogen)中的NKp44L的3個重疊RT-PCR片段得到全長載體(pEF6-NKp44L)；三個片段為片段A從1(從ATG翻譯位點編號；核苷酸1-3)到902；片段B從813到2066；和片段C從1983到3507(包括TGA終止翻譯位點)。根據(jù)操作說明書(STP3試劑盒，Novagen)，通過測序和體外轉(zhuǎn)錄/翻譯分析確認全長序列的完整性。
通過將上述片段A以反義方向克隆進入pEF6載體獲得RNA反義NKp44L載體(pEF6-NKp44L-AS5)。通過測序確認序列的方向和完整性。用pEF6-NKp44L-AS5載體通過電穿孔(230V，250μF)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1000萬個721.221細胞并用10μg/ml殺稻瘟素(lnvitrogen)在24孔板選擇。通過RT-PCR分析證實pEF6-NKp44L-AS5構建體在721.221細胞內(nèi)的表達。
實施例2.單克隆抗體的制備使用ClonaCell-HY雜交瘤克隆試劑盒，根據(jù)操作說明書(StemCellTechnologies Inc.)，分別以NKp44-Ig或NKp44L-(HIS)6標簽重組蛋白質(zhì)免疫BALB/c小鼠3次，以產(chǎn)生抗NKp44受體(44/8，IgG1)和抗NKp44L的單克隆抗體(7.1，7.7和7.13)。通過基于重組蛋白質(zhì)反應性的ELISA方法使用抗小鼠過氧化物酶雜交瘤篩選試劑(Roche)以及FACS分析對抗體進行選擇。COS-7細胞產(chǎn)生NKp44L-(HIS)6標簽重組蛋白質(zhì)。哺乳動物表達載體(pcDNA3/V5-HIS-tag；Invitrogen)編碼含有連續(xù)6個組氨酸殘基的通過酵母雙雜交得到的NKp44L 169個C-末端氨基酸的片段。在天然條件下，用鎳親和層析柱純化重組NKp44L蛋白(Xpress system proteinpurification，Invitrogen)。獲得幾種抗NKp44L單克隆抗體經(jīng)FACS分析有效的7.1(IgM)和能夠進行免疫沉淀、免疫印跡和免疫染色的7.7(IgM)和7.13(IgM)。在硫酸銨沉淀(50％飽和溶液)后，如先前描所述(Malik和Strominger，1999)在高壓灌流層析裝置(High Pressure Perfusionchromatography Station)內(nèi)以Poros G20 AL蛋白質(zhì)G柱純化抗NKp44單克隆抗體(44/8)，并且以甘露聚糖結合蛋白質(zhì)(MBP)柱(Pierce)純化IgM抗NKp44L單克隆抗體。使用SDS PAGE證實純化的單克隆抗體的純度。
實施例3.HIV感染個體CD4+T細胞NKp44L的表達與疾病階段相關圖1A)顯示HIV感染患者CD4+T細胞NKp44L的特異性表達。比較未感染組(對照，空心標志)和HIV感染組(實心標志)。水平線標記為平均值。
圖1B)顯示HIV感染患者CD4+T細胞NKp44L的表達和外周血CD4細胞計數(shù)之間呈負相關。顯示了用Sperman′s非參數(shù)等級相關性檢驗獲得的相關性(r)和其統(tǒng)計學意義(P)。
圖1C)顯示CD4+T細胞NKp44L表達與病毒載量之間的相關性。顯示了用Sperman′s非參數(shù)等級相關性檢驗獲得的相關性(r)和其統(tǒng)計學意義(P)。
圖1D)顯示PHA活化后HIV感染個體CD4+T細胞NKp44L過量表達。比較5個未感染的(對照，空心標志)和5個HIV感染(實心標志)患者。NA未活化的細胞；PHAPHA活化的細胞。
實施例4.HIV感染患者CD3-CD56+NK細胞的NKp44表達表達NKp44的NK細胞的比例在每立方毫米低于500個CD4+細胞的HIV感染個體中明顯高于未感染細胞(對照)。
實施例5.HIV感染患者表達NKp44L的CD4+T細胞具有較高的NK細胞溶解敏感性使用NK92 NK細胞系分析了針對表達(圓形)或不表達(方形)NKp44L的二種純化CD4+T細胞的細胞毒活性(圖3A)。用抗NKp44L單克隆抗體(a44)處理后，細胞毒活性受到部分阻斷。
使用2種IL-2活化的自體(auto)NK原代細胞分析了針對表達(圓形)或不表達(方形)NKp44L的純化CD4+T細胞和作為細胞毒活性陽性對照的K562(星形)的細胞毒活性(圖3B)。
使用未活化的自體(auto)NK原代細胞分析了針對表達(圓形)或不表達(方形)NKp44L的2種純化CD4+T細胞和作為細胞毒活性陽性對照的K562(星形)的細胞毒活性(圖3C)。
實施例6.幾種HIV病毒蛋白質(zhì)對NKp44L表達的影響使用表達HIV病毒蛋白質(zhì)的重組痘苗病毒進行感染來檢查HIV病毒蛋白質(zhì)對NKp44L表達的影響。如圖4所示，感染表達gp160(33.9％)或gp41HIV Env蛋白質(zhì)(35.6％)的痘苗病毒的CD4+T細胞的NKp44L表達明顯增強。相反，其它所檢測的HIV蛋白，如Gag、Pol、Tat、nef、vif或gp120，都不影響NKp44L蛋白的細胞表面表達。此外，在非病毒系統(tǒng)中證實了Env蛋白質(zhì)對于增強NKp44L表達的作用。用兩種不同來源的重組gp160蛋白質(zhì)處理純化的CD4+T細胞，并且如圖5A顯示這些gp160重組蛋白質(zhì)影響NKp44L的表達。的確，當分別用gp160-A和gp160-B處理后，10.7％和9.6％的CD4+T細胞表達了NKp44L。另一方面，在未處理的細胞或用對照蛋白質(zhì)孵育的細胞都中沒有觀察到影響?？傊@些結果表明重組gp160蛋白質(zhì)明顯增強在CD4+T細胞表面的NKp44L細胞表面表達。
實施例7.gp160誘導CD4+T細胞的NK細胞溶解對未處理細胞、用對照蛋白質(zhì)處理的細胞或用兩種重組gp160蛋白質(zhì)處理的NK細胞溶解活性的比較(圖5B)，顯示出在有重組gp160蛋白質(zhì)培養(yǎng)的CD4+T細胞存在下，靶細胞溶解增加。使用兩種不同類型的重組gp160蛋白質(zhì)表明用于誘導NKp44L過量表達和NK細胞溶解活性增高的方法對實驗的結果沒有影響?？傊?，這些結果表明，對于與NK細胞溶解活性顯著增高相關的NKp44L過量表達來說，gp41 HIV EnV蛋白質(zhì)是必需的。
實施例8.與NK細胞溶解活性增加有關的gp41 HIV Env蛋白質(zhì)的肽基序的鑒定如材料和方法部分描述的那樣，已經(jīng)檢測了所制備的包括所有gp41蛋白質(zhì)的重疊肽庫的影響。用5μg每一肽庫孵育CD4+T細胞并針對激活的NK細胞進行檢測。如圖6A所示，用gp41 C肽庫孵育的細胞，其NK細胞溶解增加了，而用所有其它肽庫孵育的則無增加。檢測了用每種肽庫處理的純化CD4+T細胞的NKp44L表達。該受體僅在gp41C庫處理的細胞中可以檢測到，并且陽性細胞的百分比是13.3％。在任何情況下，都檢測不到用其它的檢測肽庫孵育的細胞上的NKp44L。這表明包含于庫gp41C的一種或幾種肽基序與通過NK44L過量表達而引起的NK細胞溶解直接相關。然后，對包含于庫gp41C的所有肽進行重復實驗檢測。如圖7A所示，在肽gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147存在下，NK細胞毒活性顯著增高。相反，用其它所檢測肽實驗時NK細胞溶解活性仍很低，接近于背景值。同樣，用肽gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147預處理CD4+T細胞后，NKp44L表達增高，陽性細胞的百分比在22％-16％之間變化，但用其它肽預處理后沒有變化(陽性細胞低于7％)(圖7B)。這些結果預示著gp41 Env HIV蛋白的特異性肽能增加NK細胞溶解活性。對該結論額外的支持來自于包括共有肽基序NH2-SWSNKS-COOH的稱為gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147的連續(xù)肽。該gp41 HIV-1蛋白質(zhì)特異性基序高度保守。在已經(jīng)表明一些gp41連續(xù)的肽是NK細胞溶解的一些主要介導者后，評價肽基序NH2-SWSNKS-COOH是否與CD4+T細胞的NK細胞溶解直接相關是重要的。使用6mer肽進行的初步實驗顯示了細胞表面NKp44L表達或NK細胞毒活性略微增加，提示該序列太小或被一些肽酶攻擊太快。然而，為了證實這一假設，已經(jīng)構建了源于gp41-C146(WT)的在NH2-SWSNKS-COOH基序(Ctl1)或所有15mer序列(Ctl2)內(nèi)有一些突變的兩個15mer肽(圖8A)。如圖8B所示，在WT肽存在下，NK細胞毒活性顯著增加。未處理的細胞(無處理)或用兩種對照肽處理的細胞則相反。關于細胞表面NKp44L的表達也觀察到類似情況，的確，用WT肽處理的細胞內(nèi)大約17.4％的CD4+T細胞表達此標記物。相反，未處理的或以對照肽處理的細胞中NKp44L+細胞的百分比低于4％。這些結果顯示包含于gp41蛋白質(zhì)的NH2-SWSNKS-COOH基序與CD4+T細胞的NK細胞溶解非常相關。
gp41蛋白質(zhì)的作用是時間依賴性的(圖9)。用WT肽孵育30分鐘后，啟動NK細胞溶解活性，并在近4天時接近最大值。另一方面，用未處理的細胞或?qū)φ针奶幚淼募毎幚砗?，未觀察到明顯的影響。此外，在WT肽處理的細胞中，用抗NKp44L單克隆抗體預處理細胞后，NK細胞溶解活性增加受到強烈抑制，證實NK活性與細胞表面NKp44L表達的增加直接相關(圖9C)。然而，對細胞表面NKp44L表達的動力學研究顯示確實在WT肽處理10分鐘后該受體在細胞表面迅速表達，約10％CD4+T細胞表達該蛋白質(zhì)，并且于處理后4天達到表達的最大量(大約30％)。非?？焖俚腘Kp44L細胞表面表達提示缺乏新的NKp44L合成，并且提示該蛋白質(zhì)存在于IL2培養(yǎng)的CD4+T細胞內(nèi)。通過NKp44L的細胞內(nèi)染色證實了該假設。如圖9D所示，在細胞內(nèi)可檢測到NKp44L的高表達并且與肽的存在無關。
實施例9.不同人類細胞NKp44L的細胞表面表達如圖10所示，檢測K562、Jurkat和靜息PBMC的NKp44L細胞表面表達。用1μg/ml抗NKp44L單克隆抗體(灰色粗線)或IgM同種型對照(黑色細線)孵育細胞，并用流式細胞術進行分析。結果清楚地顯示，與PBMC相反，腫瘤細胞如jurkat和K562細胞在其表面表達NKp44L。
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<160>4<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>1168<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Ser Ile Val Ile Pro Leu Gly Val Asp Thr Ala Glu Thr Ser Tyr1 5 10 15Leu Glu Met Ala Ala Gly Ser Glu Pro Glu Ser Val Glu Ala Ser Pro20 25 30Val Val Val Glu Lys Ser Asn Ser Tyr Pro His Gln Leu Tyr Thr Ser35 40 45Ser Ser His His Ser His Ser Tyr Ile Gly Leu Pro Tyr Ala Asp His50 55 60Asn Tyr Gly Ala Arg Pro Pro Pro Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro Pro65 70 75 80Ser Val Leu Ile Ser Lys Asn Glu Val Gly Ile Phe Thr Thr Pro Asn85 90 95Phe Asp Glu Thr Ser Ser Ala Thr Thr Ile Ser Thr Ser Glu Asp Gly100 105 110Ser Tyr Gly Thr Asp Val Thr Arg Cys Ile Cys Gly Phe Thr His Asp
115 120 125Asp Gly Tyr Met Ile Cys Cys Asp Lys Cys Ser Val Trp Gln His Ile130 135 140Asp Cys Met Gly Ile Asp Arg Gln His Ile Pro Asp Thr Tyr Leu Cys145 150 155 160Glu Arg Cys Gln Pro Arg Asn Leu Asp Lys Glu Arg Ala Val Leu Leu165 170 175Gln Arg Arg Lys Arg Glu Asn Met Ser Asp Gly Asp Thr Ser Ala Thr180 185 190Glu Ser Gly Asp Glu Val Pro Val Glu Leu Tyr Thr Ala Phe Gln His195 200 205Thr Pro Thr Ser Ile Thr Leu Thr Ala Ser Arg Val Ser Lys Val Asn210 215 220Asp Lys Arg Arg Lys Lys Ser Gly Glu Lys Glu Gln His Ile Ser Lys225 230 235 240Cys Lys Lys Ala Phe Arg Glu Gly Ser Arg Lys Ser Ser Arg Val Lys245 250 255Gly Ser Ala Pro Glu Ile Asp Pro Ser Ser Asp Gly Ser Asn Phe Gly260 265 270Trp Glu Thr Lys Ile Lys Ala Trp Met Asp Arg Tyr Glu Glu Ala Asn275 280 285Asn Asn Gln Tyr Ser Glu Gly Val Gln Arg Glu Ala Gln Arg Ile Ala290 295 300Leu Arg Leu Gly Asn Gly Asn Asp Lys Lys Glu Met Asn Lys Ser Asp305 310 315 320Leu Asn Thr Asn Asn Leu Leu Phe Lys Pro Pro Val Glu Ser His Ile325 330 335Gln Lys Asn Lys Lys Ile Leu Lys Ser Ala Lys Asp Leu Pro Pro Asp340 345 350
Ala Leu Ile Ile Glu Tyr Arg Gly Lys Phe Met Leu Arg Glu Gln Phe355 360 365Glu Ala Asn Gly Tyr Phe Phe Lys Arg Pro Tyr Pro Phe Val Leu Phe370 375 380Tyr Ser Lys Phe His Gly Leu Glu Met Cys Val Asp Ala Arg Thr Phe385 390 395 400Gly Asn Glu Ala Arg Phe Ile Arg Arg Ser Cys Thr Pro Asn Ala Glu405 410 415Val Arg His Glu Ile Gln Asp Gly Thr Ile His Leu Tyr Ile Tyr Ser420 425 430Ile His Ser Ile Pro Lys Gly Thr Glu Ile Thr Ile Ala Phe Asp Phe435 440 445Asp Tyr Gly Asn Cys Lys Tyr Lys Val Asp Cys Ala Cys Leu Lys Glu450 455 460Asn Pro Glu Cys Pro Val Leu Lys Arg Ser Ser Glu Ser Met Glu Asn465 470 475 480Ile Asn Ser Gly Tyr Glu Thr Arg Arg Lys Lys Gly Lys Lys Asp Glu485 490 495Asp Ile Ser Lys Glu Lys Asp Thr Gln Asn Gln Asn Ile Thr Leu Asp500 505 510Cys Glu Gly Ala Thr Asn Lys Met Lys Ser Pro Glu Thr Lys Gln Arg515 520 525Lys Leu Ser Pro Leu Arg Leu Ser Val Ser Asn Asn Gln Glu Pro Asp530 535 540Phe Ile Asp Asp Ile Glu Glu Lys Thr Pro Ile Ser Asn Glu Val Glu545 550 555 560Met Glu Ser Glu Glu Gln Ile Ala Glu Arg Lys Arg Lys Met Thr Arg565 570 575Glu Glu Arg Lys Met Glu Ala Ile Leu Gln Ala Phe Ala Arg Leu Glu580 585 590
Lys Arg Glu Lys Arg Arg Glu Gln Ala Leu Glu Arg Ile Ser Thr Ala595 600 605Lys Thr Glu Val Lys Thr Glu Cys Lys Asp Thr Gln Ile Val Ser Asp610 615 620Ala Glu Val Ile Gln Glu Gln Ala Lys Glu Glu Asn Ala Ser Lys Pro625 630 635 640Thr Pro Ala Lys Val Asn Arg Thr Lys Gln Arg Lys Ser Phe Ser Arg645 650 655Ser Arg Thr His Ile Gly GLn Gln Arg Arg Arg His Arg Thr Val Ser660 665 670Met Cys Ser Asp Ile Gln Pro Ser Ser Pro Asp Ile Glu Val Thr Ser675 680 685Gln Gln Asn Asp Ile Glu Asn Thr Val Leu Thr Ile Glu Pro Glu Thr690 695 700Glu Thr Ala Leu Ala Glu Ile Ile Thr Glu Thr Glu Val Pro Ala Leu705 710 715 720Asn Lys Cys Pro Thr Lys Tyr Pro Lys Thr Lys Lys His Leu Val Asn725 730 735Glu Trp Leu Ser Glu Lys Asn Glu Lys Thr Gly Lys Pro Ser Asp Gly740 745 750Leu Ser Glu Arg Pro Leu Arg Ile Thr Thr Asp Pro Glu Val Leu Ala755 760 765Thr Gln Leu Asn Ser Leu Pro Gly Leu Thr Tyr Ser Pro His Val Tyr770 775 780Ser Thr Pro Lys His Tyr Ile Arg Phe Thr Ser Pro Phe Leu Ser Glu785 790 795 800Lys Arg Arg Arg Lys Glu Pro Thr Glu Asn Ile Ser Gly Ser Cys Lys805 810 815Lys Arg Trp Leu Lys Gln Ala Leu Glu Glu Glu Asn Ser Ala Ile Leu
820 825 830His Arg Phe Asn Ser Pro Cys Gln Glu Arg Ser Arg Ser Pro Ala Val835 840 845Asn Gly Glu Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Asn Asp Ser Cys Ser Leu850 855 860Pro Asp Leu Thr Thr Pro Leu Lys Lys Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Leu865 870 875 880Asp Ser Val Tyr Ser Glu Thr Ser Thr Pro Thr Pro Ser Pro Tyr Ala885 890 895Thr Pro Thr His Thr Asp Ile Thr Pro Met Asp Pro Ser Phe Ala Thr900 905 910Pro Pro Arg Ile Lys Ser Asp Asp Glu Thr Cys Arg Asn Gly Tyr Lys915 920 925Pro Ile Tyr Ser Pro Val Thr Pro Val Thr Pro Gly Thr Pro Gly Asn930 935 940Thr Met His Phe Glu Asn Ile Ser Ser Pro Glu Ser Ser Pro Glu Ile945 950 955 960Lys Arg Arg Thr Tyr Ser Gln Glu Gly Tyr Asp Arg Ser Ser Thr Met965 970 975Leu Thr Leu Gly Pro Phe Arg Asn Ser Asn Leu Thr Glu Leu Gly Leu980 985 990Gln Glu Ile Lys Thr Ile Gly Tyr Thr Ser Pro Arg Ser Arg Thr Glu99510001005Val Asn Arg Gln Cys Pro Gly Glu Lys Glu Pro Val Ser Asp Leu Gln101010151020Leu Gly Leu Asp Ala Val Glu Pro Thr Ala Leu His Lys Thr Leu Glu1025 103010351040Thr Pro Ala His Asp Arg Ala Glu Pro Asn Ser Gln Leu Asp Ser Thr104510501055
His Ser Gly Arg Gly Thr Met Tyr Ser Ser Trp Val Lys Ser Pro Asp106010651070Arg Thr Gly Val Asn Phe Ser Val Asn Ser Asn Leu Arg Asp Leu Thr107510801085Pro Ser His Gln Leu Glu Val Gly Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Ser109010951100Lys Cys Leu Met Gln Asp Asp Thr Arg Gly Met Phe Met Glu Thr Thr1105 111011151120Val Phe Cys Thr Ser Glu Asp Gly Leu Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr112511301135Val Asn Asp Asn Leu Ile Asp Gly Asn Cys Thr Pro Gln Asn Pro Pro114011451150Gln Lys Lys Lys Ser Pro Val Gly Asn Phe Val Gly Ser Asn Val Val115511601165<210>2<211>262<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Trp Arg Ala Leu His His Trp Leu Leu Leu Leu Leu Phe Pro1 5 10 15Gly Ser Gln Ala Gln Ser Lys Ala Gln Val Leu Gln Ser Val Ala Gly20 25 30Gln Thr Leu Thr Val Arg Cys Gln Tyr Pro Pro Thr Gly Ser Leu Tyr35 40 45Glu Lys Lys Gly Trp Cys Lys Glu Ala Ser Ala Leu Val Cys Ile Arg50 55 60
Leu Val Thr Ser Ser Lys Pro Arg Thr Met Ala Trp Thr Ser Arg Phe65 70 75 80Thr Ile Trp Asp Asp Pro Asp Ala Gly Phe Phe Thr Val Thr Met Thr85 90 95Asp Leu Arg Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Trp Cys Arg Ile Tyr Arg100 105 110Pro Ser Asp Asn Ser Val Ser Lys Ser Val Arg Phe Tyr Leu Val Val115 120 125Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Gln Thr Pro Trp Thr Pro Arg Asp Leu130 135 140Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala Gly145 150 155 160Ala Arg Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser Thr Ile Pro Val Pro Ser Gln165 170 175Pro Gln Asn Ser Thr Leu Arg Pro Gly Pro Ala Ala Pro Ile Ala Leu180 185 190Val Pro Val Phe Cys Gly Leu Leu Val Ala Lys Ser Leu Val Leu Ser195 200 205Ala Leu Leu Val Trp Trp Gly Asp Ile Trp Trp Lys Thr Val Met Glu210 215 220Leu Arg Ser Leu Asp Thr Gln Lys Ala Thr Cys His Leu Gln Gln Val225 230 235 240Thr Asp Leu Pro Trp Thr Ser Val Ser Ser Pro Val Glu Arg Glu Ile245 250 255Leu Tyr Hi s Thr Val Ala260<210>3<211>3507<212>DNA
<213>人<400>3atgagcatag tgatcccatt gggggttgat acagcagaga cgtcatactt ggaaatggct 60gcaggttcag aaccagaatc cgtagaagct agccctgtgg tagttgagaa atccaacagt 120tatccccacc agttatatac cagcagctca catcattcac acagttacat tggtttgccc 180tatgcggacc ataattatgg tgctcgtcct cctccgacac ctccggcttc ccctcctcca 240tcagtcctta ttagcaaaaa tgaagtaggc atatttacca ctcctaattt tgatgaaact 300tccagtgcta ctacaatcag cacatctgag gatggaagtt atggtactga tgtaaccagg 360tgcatatgtg gttttacaca tgatgatgga tacatgatct gttgtgacaa atgcagcgtt 420tggcaacata ttgactgcat ggggattgat aggcagcata ttcctgatac atatctatgt 480gaacgttgtc agcctaggaa tttggataaa gagagggcag tgctactaca acgccggaaa 540agggaaaata tgtcagatgg tgataccagt gcaactgaga gtggtgatga ggttcctgtg 600gaattatata ctgcatttca gcatactcca acatcaatta ctttaactgc ttcaagagtt 660tccaaagtta atgataaaag aaggaaaaaa agcggggaga aagaacaaca catttcaaaa 720tgtaaaaagg catttcgtga aggatctagg aagtcatcaa gagttaaggg ttcagctcca 780gagattgatc cttcatctga tggttcaaat tttggatggg agacaaagat caaagcatgg 840atggatcgat atgaagaagc aaataacaac cagtatagtg agggtgttca gagggaggca 900caaagaatag ctctgagatt aggcaatgga aatgacaaaa aagagatgaa taaatccgat 960ttgaatacca acaatttgct cttcaaacct cctgtagaga gccatataca aaagaataag 1020aaaattctta aatctgcaaa agatttgcct cctgatgcac ttatcattga atacagaggg 1080aagtttatgc tgagagaaca gtttgaagca aatgggtatt tctttaaaag accataccct 1140tttgtgttat tctactctaa atttcatggg ctagaaatgt gtgttgatgc aaggactttt 1200gggaatgagg ctcgattcat caggcggtct tgtacaccca atgcagaggt gaggcatgaa 1260attcaagatg gaaccataca tctttatatt tattctatac acagtattcc aaagggaact 1320gaaattacta ttgcctttga ttttgactat ggaaattgta agtacaaggt ggactgtgca 1380tgcctcaaag aaaacccaga gtgccctgtt ctaaaacgta gttctgaatc catggaaaat 1440atcaatagtg gttatgagac cagacggaaa aaaggaaaaa aagacgaaga tatttcaaaa 1500gaaaaagata cacaaaatca gaatattact ttggattgtg aaggagcgac caacaaaatg 1560aagagcccag aaactaaaca aagaaagctt tctccactga gactatcagt atcaaataat 1620caggaaccag attttattga tgatatagaa gaaaaaactc ctattagtaa tgaagtagaa 1680atggaatcag aggagcagat tgcagaaagg aaaaggaaga tgacaagaga agaaagaaaa 1740atggaagcaa ttttgcaagc ttttgccaga cttgaaaaaa gagagaaaag aagagaacaa 1800gctttggaaa ggatcagcac agccaaaact gaagttaaaa ctgaatgtaa agatacacag 1860attgtcagtg atgctgaagt tattcaggaa caagcaaaag aagaaaatgc tagcaagcca 1920acccctgcca aagtaaatag aactaaacag agaaaaagtt tttctcggag taggactcac 1980attggacagc agcgtcggag acacagaact gtcagcatgt gttcagatat ccagccatct 2040tctcctgata tagaagttac ttcacaacaa aatgatattg aaaatactgt acttacaata 2100gaaccagaaa ctgaaactgc actagcagaa ataattactg aaactgaagt tccagcactt 2160aataaatgtc ctaccaagta ccccaaaaca aagaagcact tggttaatga atggttaagt 2220gagaagaatg agaagacagg aaaaccttca gatggccttt cagaaaggcc tctacgcata 2280actacagatc ctgaagtgtt agctacacaa ctcaattctt taccaggtct cacttacagc 2340ccccatgtat actccactcc taagcattat attagattta cttcaccatt cctttcagaa 2400aaaaggagaa gaaaagaacc tactgaaaac atttctggtt catgcaagaa gcgatggttg 2460
aaacaagctc tggaagaaga aaattcagca attttacata gatttaattc accctgtcaa 2520gaaagatcca gaagtcctgc agtcaatggt gaaaataaaa gtccactact attaaatgac 2580agctgttccc ttccagattt aactacacca ctaaaaaaac gaagatttta tcagttgcta 2640gattcggttt actcagaaac ctccacacct actccttccc cgtatgctac accaactcac 2700accgatatta ctcctatgga cccatctttt gccacgcctc cacggataaa atcagatgat 2760gaaacttgta gaaatggtta taaacccata tattcaccag ttaccccagt aactcctggt 2820acaccaggaa ataccatgca ctttgagaat atttcttccc cagaaagttc tccagaaata 2880aagagacgca cttatagtca agagggatat gacagatctt caaccatgtt aacattgggg 2940cettttagaa attctaattt aactgaactg ggtctgcaag aaataaagac tattggttat 3000acgagcccta ggagtaggac tgaagtcaac aggcagtgtc ctggagaaaa ggaacctgtg 3060tcagaccttc agctaggact cgatgcagtt gagccaactg ccctacataa aaccctggaa 3120acgcctgcac atgacagggc tgagcccaac agccaactgg actcgactca ctctggacgg 3180ggcacaatgt attcttcctg ggtaaagagc cctgacagaa caggagttaa cttctcagtg 3240aactccaact tgagggacct gacaccctcg catcagttgg aggttggagg aggcttccga 3300ataagtgagt caaagtgcct gatgcaggat gatactagag gcatgtttat ggaaacaact 3360gtgttttgta cttccgaaga tgggcttgta tctggtttcg gacggactgt taatgacaat 3420ttgatcgacg ggaattgcac accccagaat ccaccacaaa agaaaaagag tccagttggc 3480aactttgtgg gaagcaatgt agtatag 3507<210>4<211>787<212>DNA<213>人<400>4atggcctggc gagccctaca ccactggcta ctgctgctgc tgttcccagg ctctcaggca 60caatccaagg ctcaggtact tcaaagtgtg gcagggcaga cgctaaccgt gagatgccag 120tacccgccca cgggcagtct ctacgagaag aaaggctggt gtaaggaggc ttcagcactt 180gtgtgcatca ggttagtcac cagctccaag cccaggacga tggcttggac ctctcgattc 240acaatctggg acgaccctga tgctggcttc ttcactgtca ccatgactga tctaagagag 300gaagactcag gacattactg gtgtagaatc taccgccctt ctgacaactc tgtctctaag 360tccgtcagat tctatctggt ggtatctcca gcctctgcct ccacacagac cccctggact 420ccccgcgacc tggtctcttc acagacccag acccagagct gtgtgcctcc cactgcagga 480gccagacaag cccctgagtc tccatctacc atccctgtcc cttctcagcc acagaactcc 540acgctccgcc ctggccctgc agcccccatt gccctggtgc ctgtgttctg tggactcctc 600gtagccaaga gcctggtgct gtcagccctg ctcgtctggt ggggggacat atggtggaaa 660accgtgatgg agctcaggag cctggatacc caaaaagcca cctgccacct tcaacaggtc 720acggaccttc cctggacctc agtttcctca cctgtagaga gagaaatatt atatcacact 780gttgcaa78權利要求
1.用于體外評估個體HIV病毒感染的進展狀態(tài)的方法，其中所述方法包括步驟(a)將所述生物樣本與特異結合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物進行孵育；和(b)測量結合至CD4+T細胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的所述結合的配體化合物數(shù)量預示病毒感染的進展狀態(tài)。
2.體外測定收集自HIV病毒感染患者的含有血細胞的生物樣本中CD4+T細胞比率的方法，其中所述方法包括步驟(a)將所述生物樣本與特異結合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物進行孵育；和(b)測量結合于CD4+T細胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的所述結合的配體化合物數(shù)量預示所述生物樣本中含有的CD4+T細胞比率。
3.用于體外測定收集自HIV病毒感染患者的含有血細胞的生物樣本中HIV病毒載量的方法，其中該方法包括步驟(a)將所述生物樣本與特異結合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物進行孵育；和(b)測量結合于CD4+T細胞的所述配體化合物的數(shù)量，由此所測量的所述結合的配體化合物數(shù)量預示所述生物樣本的HIV病毒載量。
4.根據(jù)權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中所述生物樣本選自(i)全血樣本、(ii)自全血樣本純化的外周單核細胞和多形核細胞的懸浮液、(iii)自全血樣本純化的外周血單核細胞(PBMC)懸浮液、(iv)自全血樣本純化的T細胞懸浮液、以及(v)自全血樣本純化的CD4+T細胞懸浮液。
5.根據(jù)權利要求1-4中任意一項所述的方法，其中所述配體化合物由針對SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的抗體或針對其胞外結構域部分的抗體組成。
6.根據(jù)權利要求1-4中任意一項所述的方法，其中所述配體化合物由SEQ ID NO2的NKp44蛋白或包含其胞外結構域部分的多肽組成。
7.權利要求1-6中任意一項所述的方法，其中所述配體化合物用可檢測的分子標記。
8.權利要求7所述的方法，其中所述可檢測的分子選自(i)放射性分子、(ii)熒光分子、(iii)發(fā)光分子、以及(iv)配體分子選擇性識別的受體分子。
9.權利要求8所述的方法，其中所述放射性分子是用選自[32P]、[3H]和[35S]的放射性同位素標記的。
10.權利要求8所述的方法，其中所述熒光分子選自綠色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
11.權利要求8所述的方法，其中所述發(fā)光分子由螢光素酶組成。
12.權利要求8所述的方法，其中所述受體分子由含有抗生物素蛋白或鏈親和素的分子組成。
13.根據(jù)權利要求1-12中任意一項所述的方法，其中測量結合于CD4+T細胞的所述配體化合物數(shù)量的步驟(b)由細胞熒光光度分析該方法步驟(a)中已與所述配體化合物孵育的所述生物樣本組成。
14.根據(jù)權利要求1-12中任意一項所述的方法，其中測量結合于CD4+T細胞的所述配體化合物數(shù)量的步驟(b)由通過顯微鏡包括共焦顯微鏡計數(shù)所述生物樣本中含有的其上結合有所述配體化合物的細胞組成。
15.體外評估個體HIV病毒感染的進展狀態(tài)的試劑盒，其中所述試劑盒包含(i)特異結合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物；(ii)特異結合CD4抗原的標記物分子，上述試劑盒也可以分別用于(i)體外測定收集自HIV病毒感染患者的含有血細胞的生物樣本中的CD4+T細胞比率；和(ii)體外測定收集自HIV病毒感染患者的含有血細胞的生物樣本中的HIV病毒載量。
16.權利要求15所述的試劑盒，其中(i)配體化合物和(ii)標記物分子用不同的熒光標記。
17.根據(jù)權利要求15或16所述的試劑盒，其中配體化合物由特異結合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的經(jīng)標記單克隆抗體組成。
18.根據(jù)權利要求15-17中任意一項所述的試劑盒，其中經(jīng)標記的標記物分子由抗CD4單克隆抗體組成。
19.體外篩選化合物的方法，所述化合物用于預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病，其中該方法包括步驟(a)將待檢測候選化合物與液體溶劑中的篩選系統(tǒng)孵育，其中所述篩選系統(tǒng)包含(i)暴露于溶劑中的第一配偶體，為多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子；(ii)暴露于溶劑中的第二配偶體，為多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子；其中(iii)一方面，多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子，和(iv)另一方面，多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子，能夠彼此結合；(b)對(iii)多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子與(iv)多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子的結合進行定量；(c)對在步驟(b)中定量的結合與缺乏所述候選化合物而實施步驟(a)時所定量的結合進行比較；(d)當所述候選化合物抑制或阻斷(iii)多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子與(iv)多個SEQ IDNO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子結合時，選擇出呈現(xiàn)陽性的候選化合物作為治療劑。
20.體外篩選化合物的試劑盒，所述化合物用于預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病，其中該試劑盒所包含的篩選系統(tǒng)含有(i)暴露于溶劑中的第一配偶體，為多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子；(ii)暴露于溶劑中的第二配偶體，為多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子；其中(iii)一方面，多個SEQ ID NO1的NKp44L蛋白分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子，和(iv)另一方面，多個SEQ ID NO2的NKp44受體蛋白質(zhì)分子或包含其胞外結構域部分的多個多肽分子，能夠彼此結合。
21.體外篩選化合物的方法，所述化合物用于預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病，其中該方法包括步驟(a)在待檢測的候選治療化合物存在的情況下，將由人活化NK細胞組成的第一細胞群和由表達NKp44L蛋白的人CD4+T細胞組成的第二細胞群相接觸；(b)測量活化的NK細胞所導致的CD4+T細胞溶解；(c)將步驟(b)中獲得的細胞溶解值與當步驟(a)中缺乏候選化合物時所得到的細胞溶解值相比較；(d)選擇抑制或阻斷NK介導的CD4+T細胞溶解的候選化合物。
22.權利要求21所述的方法，其中活化的NK細胞可由來自NK細胞系的細胞組成，或由正常人類的經(jīng)純化NK細胞的原代培養(yǎng)物組成。
23.權利要求21所述的方法，其中表達NKp44L蛋白的CD4+T細胞由用載體轉(zhuǎn)染以允許所述細胞表達NKp44L蛋白的最終處于細胞系形式的CD4+T細胞組成，或由最初從HIV感染患者的血液樣本純化的CD4+T細胞組成。
24.權利要求21所述的方法，其中活化的NK細胞和CD4+T細胞是自體的并且均來源于同一HIV感染患者。
25.預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的選自(i)特異結合SEQ IDNO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物和(ii)特異結合SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物。
26.權利要求25所述的藥物組合物，其中所述配體化合物由針對SEQID NO1的NKp44L蛋白的抗體或針對其胞外結構域部分的抗體組成。
27.權利要求25所述的藥物組合物，其中所述配體化合物由SEQ IDNO2的NKp44蛋白或包含其胞外結構域的多肽組成。
28.權利要求25所述的藥物組合物，其中所述配體化合物由針對SEQID NO2的NKp44蛋白的抗體或針對其胞外結構域的抗體組成。
29.選自(i)特異結合SEQ ID NO1的NKp44L蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物和(ii)特異結合SEQ ID NO2的NKp44蛋白或其胞外結構域部分的配體化合物的用途，用于制備預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的藥物組合物。
30.用于預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的能夠與編碼SEQ IDNO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特異性雜交的反義多核苷酸。
31.權利要求30所述的藥物組合物，其中所述反義多核苷酸由與核苷酸序列SEQ ID NO3的起始于第1位核苷酸并終止于第902位核苷酸的核酸互補的核酸組成。
32.與編碼SEQ ID NO1的NKp44L蛋白的mRNA分子特異性雜交的反義多核苷酸的用途，用于制備預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的藥物組合物。
33.包含以下氨基酸序列的多肽X1X2X3X4X5X6SWSNKSX7X8X9X10X11(I)，其中X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10和X11是指相互獨立的任一氨基酸殘基，X4是指除了A和W外的任一氨基酸殘基，并且其中X8是指除了E和S外的任一氨基酸殘基。
34.根據(jù)權利要求33所述的多肽，其包含以下氨基酸序列PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
35.根據(jù)權利要求33所述的多肽，其由以下氨基酸序列組成PWASNASWSNKSLDDIW(II)。
36.體外篩選化合物的方法，所述化合物用于預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病，其中該方法包括步驟(i)將待檢測候選化合物與權利要求33-35中任意一項所述的多肽孵育；(ii)分析待檢測候選化合物與權利要求33-35中任意一項所述多肽的結合。
37.根據(jù)權利要求36所述的方法，其中步驟(ii)由對步驟(i)最后獲得的混合物進行凝膠遷移分析并對候選化合物和權利要求33-35中任意一項所述多肽之間形成的復合體進行檢測組成。
38.體外篩選化合物的方法，所述化合物用于預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病，其中該方法包括步驟a)(i)將第一種CD4+T細胞培養(yǎng)物與候選化合物和HIV病毒相接觸；(ii)在缺乏所述候選化合物的情況下，將第二種CD4+T細胞培養(yǎng)物與HIV病毒接觸；和b)檢測源于培養(yǎng)物(i)和培養(yǎng)物(ii)的CD4+T細胞表面NKp44L的存在。
39.根據(jù)權利要求38所述的方法，其包括額外的步驟(c)，該步驟由當源自培養(yǎng)物(ii)的CD4+T細胞表面NKp44L的表達水平高于源自培養(yǎng)物(i)的CD4+T細胞表面NKp44L的表達水平時，選擇呈陽性的候選化合物作為治療劑組成。
40.體外篩選化合物的方法，所述化合物用于預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病，其中該方法包括步驟(i)將候選化合物用于權利要求36或37所述的篩選方法；和(ii)將在步驟(i)中選擇的呈陽性候選化合物用于權利要求38或39的篩選方法。
41.用于預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的特異結合權利要求33-35中任意一項所述多肽的配體化合物。
42.權利要求41所述的藥物組合物，其中所述配體化合物由針對權利要求33-35中任意一項所述多肽的抗體組成。
43.特異結合權利要求33-35中任意一項所述多肽的配體化合物的用途，用于制備預防或治療與個體HIV病毒感染相關的疾病的藥物組合物。
44.用于治療癌癥的藥物組合物，其包含與至少一種生理可接受賦形劑組合的有效量的權利要求33-35中任意一項所述的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及個體感染屬于人類免疫缺陷病毒(HIV)家族病毒的進展狀態(tài)的體外診斷以及這種傳染病治療性治療的領域。
文檔編號G01N33/50GK1777810SQ200480009114
公開日2006年5月24日 申請日期2004年2月6日 優(yōu)先權日2003年2月6日
發(fā)明者V·維埃拉德, P·德布雷 申請人:健康和醫(yī)學國家研究院, 巴黎醫(yī)療事業(yè)救助局