專利名稱：消旋酶的鑒別和鑒定、蛋白質(zhì)特征的確定、及用于檢測 d －氨基酸和篩選能抑制消旋酶 ...的制作方法
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背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及消旋酶(racemase)的鑒別和鑒定及這些消旋酶的蛋白質(zhì)特征的確定。更特別地，本發(fā)明涉及編碼由所述蛋白質(zhì)特征特有的基序組成的肽的核酸分子的鑒別，及涉及由這些基序組成的肽。本發(fā)明還涉及特異于所述肽的抗體及涉及這些抗體與肽的免疫復(fù)合物。另外，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的核酸分子檢測消旋酶的方法和試劑盒，以及所述基序組成的肽及這些肽的抗體。
長久以來D-氨基酸被描述為存在于革蘭氏陽性細(xì)菌、尤其是革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中，在細(xì)胞壁中它們組成肽聚糖的必要基本元件及作為細(xì)胞壁磷壁酸的替代物(1)。另外，在由多種微生物通過非核糖體蛋白質(zhì)合成而產(chǎn)生的許多小肽中發(fā)現(xiàn)了各種類型的D-氨基酸(2)，其主要作為抗生素制劑。然而，據(jù)認(rèn)為這些實(shí)例是同手型(homochirality)規(guī)則及堅(jiān)持除了來自由于陳化(aging)而自發(fā)外消旋的極低水平的D-氨基酸之外只有L-氨基酸對映異構(gòu)體存在于真核細(xì)胞中的教導(dǎo)的例外(3)。
近年來，越來越多的研究報(bào)道了在眾多的生物體包括哺乳動物中存在D-氨基酸(D-aa)，以蛋白質(zhì)結(jié)合的形式(4)或游離形式(5)存在。游離D-aa的來源與蛋白質(zhì)結(jié)合的D-aa的來源相比還不太清楚。例如，在哺乳動物中，游離D-aa也許源于外源(如(6)中所述)，但近來在真核細(xì)胞中氨基酸消旋酶的發(fā)現(xiàn)也已經(jīng)揭示了D-aa的內(nèi)源產(chǎn)生，需要了解其特異性功能。D-天冬氨酸的水平在大鼠胚胎中經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)(7)；D-絲氨酸與NMDA小鼠腦受體的結(jié)合促進(jìn)了神經(jīng)調(diào)節(jié)(8)、(9)，及D-天冬氨酸看起來參與內(nèi)分泌組織中激素調(diào)節(jié)(10)。
所有氨基酸消旋酶均需要吡哆醛磷酸作為輔因子(cofactor)，除了輔因子非依賴性酶脯氨酸和羥脯氨酸消旋酶之外。例如，有兩篇報(bào)告已經(jīng)公布了來自革蘭氏陽性菌斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)的脯氨酸消旋酶的生物化學(xué)和酶學(xué)特性(11，12)。一種反應(yīng)機(jī)制提出，活性位點(diǎn)Cys256與有活性的同源二聚體酶中其它單體的相應(yīng)半胱氨酸形成半反應(yīng)位點(diǎn)(half-reaction site)。
盡管在細(xì)菌和真菌中論證了多種消旋酶和差向異構(gòu)酶(epimerase)，但最近描述了分離自感染性后錐蟲體形式的寄生的原生動物枯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)的第一種真核生物氨基酸(脯氨酸)消旋酶，枯氏錐蟲是導(dǎo)致人體南美錐蟲病(Chagas’disease)的因素(13)。這種寄生蟲分泌的脯氨酸消旋酶(TcPRAC)被顯示出是宿主B細(xì)胞的強(qiáng)力促分裂原，并且在枯氏錐蟲通過多克隆淋巴細(xì)胞激活進(jìn)行的免疫逃避和持續(xù)(persistence)中起重要作用(13)。這種蛋白質(zhì)先前稱為TcPA45，單體大小為45kDa，其僅通過寄生蟲的感染性后錐蟲體形式表達(dá)和釋放(13)。
TcPRAC脯氨酸消旋酶基因的基因組組構(gòu)和轉(zhuǎn)錄表明每個單倍型基因組存在兩個同源的基因(TcPRACA和TcPRACB)。另外，使用45kDa-TcPRAC蛋白質(zhì)的特異性抗體進(jìn)行的定位研究表明一種單體大小為39kDa的胞內(nèi)和/或膜結(jié)合的同工型(isoform)在非感染性短膜蟲期形式的寄生蟲中表達(dá)。
對TcPRACA基因序列的計(jì)算機(jī)輔助分析提示其通過可變反式剪接(alternative trans-splicing)機(jī)制可以產(chǎn)生寄生蟲脯氨酸消旋酶的這兩種同工型(45kDa和39kDa)，其中之一可含有信號肽(13)。另外，對推定的TcPRACB基因序列進(jìn)行初步分析表明了一些不同，包括與TcPRACA相比的點(diǎn)突變，但也提示TcPRACB基因僅可以編碼所述酶的胞內(nèi)同工型，因?yàn)樵摶蛉狈敵鲂盘栃蛄?。任何這些分子機(jī)制實(shí)質(zhì)上確保了在枯氏錐蟲的不同發(fā)育階段產(chǎn)生的脯氨酸消旋酶的胞內(nèi)和胞外同工型的不同表達(dá)。
通過使用L-氨基酸源生產(chǎn)D-氨基酸的方法包括使用特異于感興趣的氨基酸的氨基酸消旋酶，所述消旋酶從含有具有編碼所述酶的多核苷酸序列的一個載體的重組表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。在原核生物宿主中，已知消旋酶參與D-氨基酸的合成和/或參與L-氨基酸的代謝。例如，腫瘤中及進(jìn)行性自身免疫和退化疾病中游離D-氨基酸的存在提示真核生物氨基酸消旋酶的生物學(xué)重要性。含有D-氨基酸的蛋白質(zhì)或肽對宿主酶的蛋白酶解抗性是所熟知的。另外，含有D-氨基酸，至少一個D-氨基酸殘基的這種蛋白質(zhì)可表現(xiàn)抗生素或免疫原性質(zhì)。
人們對D-氨基酸在人體腦、腫瘤、抗微生物和神經(jīng)肽中作為游離分子或在多肽鏈內(nèi)的生物學(xué)作用越來越感興趣，提示其具有廣泛的生物學(xué)關(guān)聯(lián)性。對活的生物體中D-氨基酸的研究受到其難以檢測的限制?，F(xiàn)有技術(shù)需要對消旋酶的鑒別及對其酶學(xué)性質(zhì)和對其它化合物的特異性的鑒別。
盡管對南美錐蟲病的預(yù)防特別是載體鏟除已經(jīng)有許多進(jìn)展，但在全世界每天仍發(fā)生新增的感染和疾病發(fā)生情況。盡管過去在拉丁美洲地區(qū)感染主要限于載體傳遞，但是其在先天性和血液傳遞、移植和免疫抑制狀態(tài)之后復(fù)發(fā)方面的影響在增加。在拉丁美洲南美錐蟲病的流行也許達(dá)到人口的25％(如在玻利維亞)或者仍為1％(如在墨西哥)。在已經(jīng)感染寄生蟲枯氏錐蟲的1.8-2千萬的人中，60％以上生活在巴西，WHO估計(jì)在南美洲和中美洲有9千萬人處于危險(xiǎn)中。
例如，得自美國最近的人口普查的一些數(shù)字表明來自墨西哥的凈移民數(shù)為大約1000人/天，其中有5-10人感染南美錐蟲病。這種疾病可潛伏10-30年，并且作為許多其它進(jìn)展性慢性病變的實(shí)例，其特征是“無癥狀的”。盡管在二十世紀(jì)九十年代，血庫對西班牙裔的要求提高(50％的玻利維亞血液被污染)，食品及藥物管理局(FDA)專門小組已經(jīng)建議所有捐贈的血液均要進(jìn)行南美錐蟲病篩選。但現(xiàn)今，F(xiàn)DA尚未批準(zhǔn)“精確的”血液測試以篩選供體血樣。這種主張與地區(qū)性國家使用的超過30種的可用測試形成鮮明對照。另外，最近關(guān)于適合這種寄生蟲的新的昆蟲載體和在發(fā)達(dá)國家如美國被感染的家畜的報(bào)道及基于Genetic Algorithm for Rule-set Prediction模型的分布預(yù)測表明這些物種的潛在廣泛分布，并提示在這些已經(jīng)報(bào)道的區(qū)域之外的另外危險(xiǎn)區(qū)域，強(qiáng)調(diào)了持續(xù)的世界范圍的公眾健康問題。
迄今為止，有兩種藥物特別用于治療枯氏錐蟲感染。硝呋替莫(Nifurtimox，3-甲基-4-5′-硝基亞糠基-氨基四氫-4H-1，4-噻嗪-1，1-二氧化物)是自1967年使用的第一種藥物，這是由Bayer公司生產(chǎn)的一種硝基呋喃，稱作Lampit。1973年以后，一種硝基咪唑(nitroimidazol)衍生物芐硝唑(Benznidazol)，稱作Rochagan或Radanyl(N-芐基-2-硝基-1-咪唑乙酰胺)，由Hoffman-La-Roche生產(chǎn)，并且是一致同意選擇的藥物。這兩種藥物均是殺錐蟲劑并對抗寄生蟲的胞內(nèi)或胞外形式。不利的副作用包括局部或一般化過敏性皮膚病變、周圍敏感性多發(fā)神經(jīng)病變(peripheral sensitive polyneuropathy)、白細(xì)胞減少、厭食、消化異常(digestive manifestations)及罕見的抽搐，這可通過中斷治療而逆轉(zhuǎn)。最嚴(yán)重的并發(fā)癥包括粒細(xì)胞缺乏癥和血小板減少性紫癜。
毫無疑問地，治療是有效的并且應(yīng)該應(yīng)用于感染的急性階段、兒童、及在用免疫抑制劑治療或器官移植程序后觀測到寄生蟲血癥再激活的情況中。一些專家建議處于不確定階段及慢性階段的患者也應(yīng)被治療。然而，在發(fā)現(xiàn)了感染及其繼發(fā)疾病之后的近百年來，研究人員對疾病慢性階段的治療始終保持分歧的觀點(diǎn)。治愈的標(biāo)準(zhǔn)之一是基于血液中無寄生蟲，這非常難以評價不確定階段或慢性階段的治療效力。因?yàn)椴淮_定形式是無癥狀的，因此不可能在臨床評價治愈。進(jìn)一步地，需要血清學(xué)及更靈敏和先進(jìn)的分子技術(shù)組合并仍可能不確定。然后必須對患者隨訪幾年以必然客觀地確定治愈。
最近認(rèn)為南美錐蟲病是被忽視的一種疾病，DND-initiative(Drugfor Neglected Diseases Initiative，DNDi)希望支持發(fā)展針對錐蟲病的有效、安全及買得起的新藥物的藥物開發(fā)項(xiàng)目。由于目前的治療有爭議，在一些情況中也許不適當(dāng)，甚至是毒性的，以及也許效力有限，因此絕對需要能激發(fā)保護(hù)性免疫的新配制品的鑒定及寄生蟲分子的揭示，并且必須被優(yōu)先考慮。
發(fā)明概述本發(fā)明有助于滿足本領(lǐng)域這些需要。已經(jīng)揭示了枯氏錐蟲中TcPRAC基因編碼功能性胞內(nèi)形式或分泌形式的酶，這些酶呈現(xiàn)出可能與其相對催化效率有關(guān)的獨(dú)特的動力學(xué)性質(zhì)。而所述酶的同工型的K0M是相似的數(shù)量級(29-75mM)，Vmax在2×10-4至5.3×10-5mol L-脯氨酸/秒/0.125μM同源二聚體重組蛋白質(zhì)之間變化。使用酶特異性抑制劑進(jìn)行的研究及通過定點(diǎn)誘變活性位點(diǎn)Cys330殘基進(jìn)行的酶活性消除研究支持了脯氨酸消旋酶作為開發(fā)抗南美錐蟲病藥物關(guān)鍵靶點(diǎn)的潛力。
本發(fā)明提供了一種純化的核酸分子，其編碼由選自SEQ ID NO1、2、3或4的基序組成的肽。
本發(fā)明還提供了一種純化的核酸分子，其在中等嚴(yán)格條件下與包含這個核酸分子的變性的、雙鏈DNA的任一鏈雜交。
另外，本發(fā)明提供了一種重組載體，其指導(dǎo)選自這些純化的核酸分子的核酸分子的表達(dá)。
再者，本發(fā)明提供了一種純化的多肽，其由選自編碼如下多肽的純化的核酸分子組成的一組的核酸分子編碼(a)由基序I(SEQ ID NO1)組成的一種純化的多肽；(b)由基序II(SEQ ID NO2)組成的一種純化的多肽；(c)由基序III(SEQ ID NO3)組成的一種純化的多肽；(d)由基序III*(SEQ ID NO4)組成的一種純化的多肽。
本發(fā)明提供了與這些多肽結(jié)合的純化的抗體。純化的抗體可以是單克隆抗體。一種免疫復(fù)合物包含本發(fā)明的多肽及特異性識別此多肽的抗體。
本發(fā)明提供了用本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種宿主細(xì)胞。
一種生產(chǎn)由SEQ ID NO1、2、3、或4組成的多肽的方法，包括在促進(jìn)表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，并從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收多肽。所述宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、寄生蟲細(xì)胞，或真核細(xì)胞。
本發(fā)明的一種檢測由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的亞序列的核苷酸序列編碼的消旋酶的方法，包括(a)將所述核苷酸序列與和本發(fā)明的核酸分子雜交的一種引物或探針接觸；(b)使用所述引物或探針擴(kuò)增所述核苷酸序列；(c)檢測在引物或探針與核苷酸序列之間形成的雜交復(fù)合物。
本發(fā)明提供了一種檢測由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的亞序列的核苷酸序列編碼的消旋酶的方法，包括(a)將所述消旋酶與本發(fā)明的抗體接觸；(b)檢測所得免疫復(fù)合物。
一種檢測由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的亞序列核苷酸序列編碼的消旋酶的試劑盒，其包含(a)一種多核苷酸探針或引物，其與本發(fā)明的多核苷酸雜交；(b)進(jìn)行核酸雜交反應(yīng)的試劑。
本發(fā)明還提供了一種檢測由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的亞序列的核苷酸序列編碼的消旋酶的試劑盒。該試劑盒包含(a)純化的本發(fā)明抗體；(b)純化形式的標(biāo)準(zhǔn)試劑；(c)檢測試劑。
一種在體外篩選能抑制由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的亞序列的核苷酸序列編碼的消旋酶的活性分子的方法，包括(a)將所述活性分子與所述消旋酶接觸；(b)測試在各種濃度的所述活性分子抑制所述消旋酶活性的能力；(c)選擇對任何脯氨酸消旋酶的活性有至少80％抑制作用的活性分子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述消旋酶是脯氨酸消旋酶。
本發(fā)明的一種免疫組合物含有能在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種本發(fā)明的純化的多肽，及一種藥物載體。
附圖簡述參考附圖以更好地理解本發(fā)明。


圖1枯氏錐蟲TcPRACA和TcPRACB脯氨酸消旋酶同工型的序列對比分析。
A.TcPRACA(Tc-A)和TcPRACB(Tc-B)核苷酸序列對比非編碼序列以斜體字母表示；反式剪接信號以下劃線表示，推定的剪接前導(dǎo)序列受體位點(diǎn)以雙下劃線表示；編碼計(jì)算機(jī)預(yù)測的信號肽的區(qū)域以雙向箭頭表示；TcPRACA和TcPRACB的翻譯起始以單向箭頭表示；亮和暗灰色陰影中的核苷酸分別代表沉默突變或點(diǎn)突變；框是脯氨酸消旋酶活性位點(diǎn)；UUA三聯(lián)體以粗下劃線表示，位于雙下劃線的聚腺苷酸化位點(diǎn)的前面。
B.枯氏錐蟲TcPRACA(Tc-A)、TcPRACB(Tc-B)脯氨酸消旋酶的氨基酸序列對比的圖示。共同的數(shù)值是沿著線性排列的氨基酸殘基位置，并分別代表TcPRACA和TcPRACB蛋白的初始密碼子；V代表可變TcPRACA推定的起始密碼子；氨基酸的差異在垂直線的上方和下方表示，其在序列中的位置在括號內(nèi)顯示。SP信號肽；TcPRACA的N末端結(jié)構(gòu)域從第1位延伸至第69位；SPCGTTcPRACA和TcPRACB脯氨酸消旋酶的保守的活性位點(diǎn)；N末端和C末端均是指這兩種蛋白質(zhì)而言。
C.TcPRACA的疏水性圖示。虛線表示通過Von Heijne的方法預(yù)測的切割位點(diǎn)(第31-32位氨基酸)。
D.枯氏錐蟲CL Brener克隆的染色體條帶在通過PFGE分離(泳道1)及與TcPRAC探針Southern印跡雜交后(泳道2)的溴化乙啶染色的凝膠。指出了染色體條帶的大小(Mb)，以及用羅馬數(shù)字表示區(qū)域染色體編號。
圖2枯氏錐蟲脯氨酸消旋酶同工型和底物特異性的生物化學(xué)鑒定。
A.純化的rTcPRACA(泳道1)和rTcPRACB(泳道2)重組蛋白的SDS-PAGE分析。8％聚丙烯酰胺凝膠用考馬斯藍(lán)染色。右邊緣是分子量標(biāo)記。
B.與rTcPRACA(實(shí)心條形)相對比，rTcPRACB(空心條形)對L-脯氨酸、D-脯氨酸，L-羥基(OH)脯氨酸和D-羥基(OH)脯氨酸底物外消旋作用的百分比。消旋酶活性用pH6.0的乙酸鈉緩沖液中的0.25μM脯氨酸消旋酶的每種同工型和40mM底物確定。
C.以pH消旋酶的函數(shù)表示的外消旋作用的百分比分析在含有0.2M Tris-HCl(正方形)、乙酸鈉(三角形)和磷酸鈉(圓形)，40mM L-脯氨酸和0.25μM純化的rTcPRACA(實(shí)心符號)和rTcPRACB(空心符號)的緩沖液中進(jìn)行。在37℃進(jìn)行30分鐘后，反應(yīng)通過熱滅活和冷凍而中止。
D.39kDa的胞內(nèi)同工型分離自非感染性短膜蟲期形式的寄生蟲的可溶(Ese)提取物。將可溶懸浮液的系列稀釋液的Western印跡與已知量的rTcPRACB蛋白對比，并用于使用Quantity One_軟件進(jìn)行的蛋白質(zhì)定量。消旋酶分析在pH6的乙酸鈉緩沖液中進(jìn)行，使用40mM L-脯氨酸及包含于Ese提取物中相應(yīng)于所描述量的39kDa(ng)。
圖3通過rTcPRACA和rTcPRACB脯氨酸消旋酶同工型催化的L-脯氨酸外消旋作用的動力學(xué)參數(shù)。外消旋反應(yīng)的行進(jìn)如先前所述經(jīng)旋光測量而監(jiān)測(13)。
A.曲線的線性部分的確定在37℃在含有0.2M乙酸鈉(pH 6.0)，0.25μM純化的酶和40mM L-脯氨酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行。rTcPRACA反應(yīng)由黑方塊表示，rTcPRACB反應(yīng)由白方塊表示。
B.消旋酶活性的初始速率在37℃在含有0.2M乙酸鈉(pH 6.0)，0.125μM的rTcPRACA(實(shí)心方塊)或rTcPRACB(空心方塊)的純化的酶和不同濃度的L-脯氨酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行。使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法(double reciprocal plots)確定KM和Vmax數(shù)值，其中1/V以1/[S]的函數(shù)作圖，曲線的斜率代表KM/Vmax。獲得的數(shù)值通過使用 程序和米氏方程(Michaelis-Menten equation)而證實(shí)。數(shù)值用不同的酶制品的6次實(shí)驗(yàn)代表。
C.0.125μM rTcPRACA脯氨酸消旋酶同工型在有(空心方塊)或無(實(shí)心方塊)6.7μM PAC競爭抑制劑的情況中的雙倒數(shù)作圖動力學(xué)，以L-脯氨酸濃度的函數(shù)表示。為進(jìn)行對比，斯氏梭菌的脯氨酸消旋酶報(bào)道的KM為2.3mM；使用得自可溶的短膜蟲期級分的天然蛋白質(zhì)的動力學(xué)分析揭示了10.7mM的KM和1.15μM的Ki。
圖4使用Superdex 75柱進(jìn)行的rTcPRACA蛋白的大小排阻層析。級分通過HPLC在pH6.0洗脫，B2和B4峰分別相應(yīng)于rTcPRACA二聚體和單體。將B1和B5洗脫的級分使用相同的條件再加樣于該柱中(粗體，見插入)并與先前洗脫圖對比(非粗體)。
圖5TcPRACA脯氨酸消旋酶的定點(diǎn)誘變。TcPRACA基因的脯氨酸消旋酶的活性位點(diǎn)誘變的示意圖。
圖6使用基序I、II和III通過篩選SWISS-PROT和TrEMBL數(shù)據(jù)庫獲得的蛋白質(zhì)(Clustal X)的序列對比。MI，MII和M1II中包含的氨基酸以暗灰色和淺灰色圖案陰影顯示，第13-14位非特異性氨基酸包含在MII中。序列的SWISS-PROT登記號(accession number)在表4中顯示。
圖7通過T-coffee對比放射樹(T-coffee alignment radial tree)獲得的蛋白質(zhì)序列進(jìn)化樹。SWISS-PROT蛋白質(zhì)登記號在表4中示出。
圖8顯示與使用旋光測量的常規(guī)監(jiān)測方法(Pol/L-)對比，使用D-AAO(D-AAO/L-)微量測試測定的不同濃度(10-40mM)的L-脯氨酸的外消旋抑制百分比。
圖9顯示單獨(dú)使用D-脯氨酸或者D-和L-脯氨酸等摩爾混合物作標(biāo)準(zhǔn)的D-AAO/HRP反應(yīng)的對比。
圖10顯示在如下條件下在490nm處光密度與D-脯氨酸濃度的函數(shù)關(guān)系。
圖11是用D-脯氨酸的系列稀釋液獲得的曲線圖，作為陽性反應(yīng)對照。注陰性孔(well(-))OD是得自空白孔的OD的平均值。
圖12顯示在殘基Cys160或殘基Cys330誘變后，脯氨酸消旋酶的酶活性的喪失。
發(fā)明詳述脯氨酸消旋酶催化L-和D-脯氨酸對映體的互變，迄今為止僅在兩個物種中被描述。最初是在細(xì)菌斯氏梭菌中發(fā)現(xiàn)，其在活性位點(diǎn)含有半胱氨酸，并且不需要輔因子或其它已知輔酶。第一種真核生物氨基酸(脯氨酸)消旋酶在從病原性人體寄生蟲枯氏錐蟲的基因中分離和克隆后已經(jīng)被描述。這個酶在胞內(nèi)位于復(fù)制的非感染性形式的枯氏錐蟲中，膜結(jié)合形式和分泌形式的酶基于寄生蟲分化為非分裂的感染形式而存在。脯氨酸消旋酶的分泌的同工型是強(qiáng)力的宿主B細(xì)胞促分裂原，支持寄生蟲的特異性免疫應(yīng)答的逃避。
首先必須闡明TcPRACB基因是否編碼功能性脯氨酸消旋酶。為回答這個問題，將TcPRACA和TcPRACB共生同源基因在大腸桿菌中表達(dá)并對重組蛋白的生物化學(xué)和酶學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)研究。本發(fā)明論證了TcPRACB確實(shí)編碼功能性脯氨酸消旋酶，該酶當(dāng)與TcPRACA酶對比時呈現(xiàn)略微不同的動力學(xué)參數(shù)和生物化學(xué)特征。代表性的重組蛋白的酶活性顯示由TcPRACB構(gòu)建體產(chǎn)生的39kDa脯氨酸消旋酶的胞內(nèi)同工型與TcPRACA產(chǎn)生的45kDa同工型對比更穩(wěn)定，并且具有較高的D/L-脯氨酸互變速率。另外，用脯氨酸消旋酶的特異性抑制劑吡咯-2-羧酸獲得的酶抑制劑復(fù)合物的解離常數(shù)(Kj)低于重組TcPRACB酶。
另外，本發(fā)明論證了Cys330和Cys160是脯氨酸消旋酶活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸，因?yàn)樵撁傅幕钚酝ㄟ^這些殘基的定點(diǎn)誘變而完全消除。再者，脯氨酸消旋酶氨基酸序列的多重排列可以闡明可用于鑒別在其它微生物中推定的脯氨酸消旋酶的蛋白質(zhì)特征。本發(fā)明討論了脯氨酸消旋酶在真核細(xì)胞，特別是在枯氏錐蟲中存在的意義，以及這種酶活性在生物學(xué)和寄生蟲的感染性中的因果關(guān)系。
本發(fā)明提供了氨基酸基序，其用作脯氨酸消旋酶的特征。這些氨基酸基序如下基序I[IVL][GD]XHXXG[ENM]XX[RD]X[VI]XG[SEQ IDNO1]基序II[NSM][VA][EP][AS][FY]X(13，14)[GK]X[IVL]XXD[IV][AS][YWF]GGX[FWY][SEQ ID NO2]基序IIIDRSPXGXGXXAXXA[SEQ ID NO3]基序III*DRSPCGXGXXAXXA[SEQ ID NO4]其中X在這些序列的每一個中均是一個氨基酸。
本發(fā)明還提供了編碼氨基酸基序的多核苷酸，其在本文也稱作“本發(fā)明的多核苷酸”和“本發(fā)明的多肽”。
使用TcPRACA的這些多核苷酸或多肽序列篩選數(shù)據(jù)庫。搜索基序I-III?；騃相應(yīng)于[IVL][GD]XHXXG[ENM]XX[RD]X[VI]XXG，基序II相應(yīng)于[NSM][VA][EP][AS][FY]X(13，14)[GK]X[IVL]XXD[IV][AS][YWF]GGX[FWY]，基序III相應(yīng)于DRSPXGXGXXAXXA及基序III*相應(yīng)于DRSPCGXGXXAXXA。序列在附件中顯示，其中活性位點(diǎn)的兩個半胱氨酸殘基的保守區(qū)域以方塊表示，在表5中以相應(yīng)的登記號用粗體表示。所述兩個半胱氨酸殘基是Cys330及其同源物Cys160，其中通過定點(diǎn)誘變使殘基Cys160突變?yōu)榻z氨酸也誘導(dǎo)酶活性的急劇喪失，對于殘基Cys330也如此。
脯氨酸消旋酶，這是先前僅在原生細(xì)菌斯氏梭菌(Clostridiumsticklandii)中描述的一種酶(11)，其被顯示還由真核細(xì)胞枯氏錐蟲編碼，枯氏錐蟲是一種高致病原性的原生動物寄生蟲(13)。先前稱為TcPA45的枯氏錐蟲脯氨酸消旋酶(TcPRAC)是一種有效的宿主B細(xì)胞促分裂原，并且是由后錐蟲體形式的寄生蟲感染而分泌，有助于其通過非特異性多克隆淋巴細(xì)胞激活的免疫逃避和持續(xù)(13)。先前的結(jié)果提示TcPRAC由每個單倍體基因組兩個共生同源基因編碼。蛋白質(zhì)定位研究也表明枯氏錐蟲在細(xì)胞周期和分化期間可不同地表達(dá)胞內(nèi)形式和分泌形式TcPRAC，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)在非感染性復(fù)制(短膜蟲期)形式的寄生蟲細(xì)胞質(zhì)中，并與膜結(jié)合或者在感染性非復(fù)制的(后錐蟲體錐蟲成蟲期)寄生蟲中分泌(13)。
本發(fā)明鑒定了兩種TcPRAC共生同源基因，并論證了TcPRACA和TcPRACB均引起輔因子非依賴性脯氨酸消旋酶的功能性同工型產(chǎn)生，其表現(xiàn)不同的生物化學(xué)性質(zhì)，這些性質(zhì)在各自的酶活性的效率中具有重要作用。如先前對于細(xì)菌脯氨酸消旋酶進(jìn)行的生物化學(xué)和理論研究所提示(11，17，18)，TcPRAC活性依賴于兩種單體酶亞基，它們通過雙堿性機(jī)制反應(yīng)(two base mechanism reaction)進(jìn)行L-和/或D-脯氨酸對映體的互變，其中所述酶從底物中除去一個α-氫原子并為α碳原子的對側(cè)提供一個質(zhì)子。已經(jīng)推測同源二聚體的每個亞基提供巰基基團(tuán)之一(18)。
本發(fā)明論證了TcPRAC酶活性確實(shí)是依賴于活性位點(diǎn)的殘基Cys330，因?yàn)槲稽c(diǎn)特異性330Cys突變?yōu)镾er完全地消除了L-和D-脯氨酸外消旋作用，與先前論證的TcPRAC酶活性通過與碘乙酸或碘乙酰胺烷化而消除一致(13)，這也與梭菌脯氨酸消旋酶相似，其中顯示與反應(yīng)位點(diǎn)的兩個半胱氨酸特異性發(fā)生羧甲基化導(dǎo)致酶失活(12)。本發(fā)明還論證了殘基Cys160也是活性位點(diǎn)的一個關(guān)鍵殘基，TcPRAC在其同源二聚體內(nèi)具有兩個活性位點(diǎn)。這些觀察使得可以利用基于天然和突變的序列的分析搜索抑制劑。
基因序列分析推測通過可變剪接的機(jī)制，TcPRACA可以產(chǎn)生胞內(nèi)和分泌形式的寄生蟲脯氨酸消旋酶，本發(fā)明論證了TcPRACB基因序列本身編碼一種蛋白質(zhì)，其缺少參與肽信號形成的氨基酸和TcPRACA蛋白質(zhì)中存在的一個額外N末端結(jié)構(gòu)域，與CsPR更為相似。因此，TcPRACB僅可以產(chǎn)生一種胞內(nèi)形式的TcPRAC脯氨酸消旋酶。這個揭示使得可以實(shí)現(xiàn)搜索一種應(yīng)穿透細(xì)胞的胞內(nèi)酶的推定的抑制劑。
令人感興趣地，枯氏錐蟲基因組中TcPRAC基因的兩個同源拷貝(編碼兩個相似的多肽但具有獨(dú)特的特異性生物化學(xué)性質(zhì))的存在，可以反映出一種基因復(fù)制的進(jìn)化機(jī)制及一種寄生蟲策略，以保證更好的環(huán)境適應(yīng)性。這個假想通過TcPRACA基因通過可變剪接產(chǎn)生兩種相關(guān)的蛋白質(zhì)同工型的潛力而證實(shí)，可變剪接是特別適于必須對環(huán)境刺激迅速應(yīng)答的細(xì)胞的一種機(jī)制。最初，反式剪接表現(xiàn)為確實(shí)是一種古老的方法，其對高等生物體中的斷裂基因可組成一種選擇性優(yōu)勢(19)，可變反式剪接僅僅在最近才證實(shí)在枯氏錐蟲中發(fā)生(20)。作為另一種啟動子選擇，通過TcPRACA基因的可變反式剪接，枯氏錐蟲中脯氨酸消旋酶的胞內(nèi)和/或分泌的同工型的經(jīng)調(diào)節(jié)的產(chǎn)生使得恒定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以嚴(yán)格保守和/或可能獲得額外的分泌區(qū)結(jié)構(gòu)域。事實(shí)上，近來使用基于RT-PCR的策略及與5’剪接前導(dǎo)寡核苷酸組合的TcPRACA和TcPRACB序列共有的3’探針，隨后克隆并測序所得片段的研究確實(shí)證實(shí)了TcPRAC的胞內(nèi)形式也可源自TcPRACA基因，確證了這個假說。
在枯氏錐蟲中基因復(fù)制是相對普通的事件，其增加了對寄生蟲基因組研究的復(fù)雜性。另外，TcPRAC染色體作圖揭示了兩個染色體條帶，每一個均具有3個以上的染色體，并且可以表明脯氨酸消旋酶基因被圖譜定位于大小多態(tài)性的同源染色體中，這是對脯氨酸消旋酶基因家族鑒定的一個重要發(fā)現(xiàn)。初步的結(jié)果已經(jīng)表明例如枯氏錐蟲DM28c I型菌株將脯氨酸消旋酶基因圖譜定位于與本發(fā)明使用的枯氏錐蟲CL II型菌株鑒別的相同的染色體印跡(chromoblot)區(qū)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知脯氨酸組成了一些生物體如一些血鞭毛蟲(21)，(22)，(23)及昆蟲中飛行肌(24)的重要能量來源。另外，提示錐蟲中有脯氨酸氧化酶系統(tǒng)(25)，并且報(bào)道了脯氨酸在錐獵蝽亞科動物(triatominae)腸中富集的研究(26)提示脯氨酸在枯氏錐蟲寄生蟲中的代謝途徑以及其在昆蟲載體的消化道中的區(qū)別(27)。因此，非?？隙菔襄F蟲可使用L-脯氨酸作為碳的主要來源(25)。
另外，使用在指定培養(yǎng)基中培養(yǎng)的寄生蟲的初步結(jié)果表明在載體中發(fā)現(xiàn)的短膜蟲期和感染性后錐蟲體錐鞭毛體形式(metacyclictrypomastigote form)均可有效地代謝L-或D-脯氨酸作為唯一的碳源。某些報(bào)道指出脯氨酸的生物合成在錐蟲中發(fā)生(即通過谷氨酸碳鏈的還原反應(yīng)或轉(zhuǎn)氨基作用)，脯氨酸的一個額外和直接的生理調(diào)節(jié)可存在于寄生蟲中以控制氨基酸氧化及其隨后的降解或者脯氨酸利用。事實(shí)上，近來的報(bào)道顯示枯氏錐蟲中的兩種活性的脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(28)?？菔襄F蟲脯氨酸消旋酶可能在胞內(nèi)脯氨酸代謝途徑的調(diào)節(jié)中因此而起作用，或者，其可參與D-氨基酸翻譯后添加至多肽鏈的機(jī)制。
一方面，這些假說可以允許一種獲得能量的方式，另一方面，其使得寄生蟲逃避宿主應(yīng)答。在這個方面，據(jù)報(bào)道在蛋白質(zhì)的N末端添加一個D-氨基酸足以產(chǎn)生對包含宿主蛋白酶解酶在內(nèi)的裂解反應(yīng)的一般抗性(29)。含有D-氨基酸的蛋白質(zhì)在寄生蟲膜中的表達(dá)除了有助于起始多克隆激活之外，還有助于寄生蟲進(jìn)入宿主細(xì)胞溶酶體中，如已經(jīng)對由D-對映體組成的聚合物描述的那樣(30)，(31)。盡管枯氏錐蟲蛋白質(zhì)中包含D-氨基酸對寄生蟲有益，但這個假說仍需加以證實(shí)并且直接的證據(jù)在技術(shù)上難以獲得。
值得注意的是短膜蟲期在后循環(huán)期發(fā)育成為感染性后錐蟲體形式包括寄生蟲形態(tài)的改變，包括動基體(kinetoplast)(與寄生蟲鞭毛物理性連接的一個結(jié)構(gòu))的遷移，及組合起來賦予寄生蟲感染性/毒性的許多其它顯著的代謝改變(13，32)。脯氨酸消旋酶顯示在發(fā)育后期發(fā)生之后優(yōu)先位于感染性寄生蟲形式的鞭毛袋(flagellar pocket)內(nèi)(13)，與分泌的并參與早期感染的許多已知的蛋白質(zhì)一樣(33)。
也可能的是寄生蟲脯氨酸消旋酶可通過內(nèi)在環(huán)境的游離脯氨酸的胞內(nèi)修飾而發(fā)揮枯氏錐蟲分化的早期中介物的作用，這在前面已經(jīng)提示并已經(jīng)在一些細(xì)菌系統(tǒng)中觀測到。例如，已經(jīng)描述了外源丙氨酸在細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用，此調(diào)節(jié)通過控制編碼丙氨酸消旋酶的基因形成的操縱子及細(xì)菌脫氫酶的一個較小的亞基而進(jìn)行(34)。
在細(xì)菌中，膜丙氨酸受體與丙氨酸和脯氨酸進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞相關(guān)(35)。然后可以假設(shè)在昆蟲消化道環(huán)境中并與通過寄生蟲膜內(nèi)特異性受體進(jìn)行的環(huán)境感受機(jī)制相關(guān)的脯氨酸的可用性支持寄生蟲脯氨酸吸收及其進(jìn)一步的胞內(nèi)外消旋作用。脯氨酸消旋酶然后在寄生蟲生長和分化的調(diào)節(jié)中起基本作用，此作用通過如上述其參與能量代謝途徑和含有D-氨基酸的蛋白質(zhì)的表達(dá)而因此賦予寄生蟲感染性及其逃避宿主特異性應(yīng)答的能力實(shí)現(xiàn)。
迄今為止并與在枯氏錐蟲的短膜蟲期形式中發(fā)現(xiàn)的TcPRAC胞內(nèi)同工型相反，后錐蟲體和血流形式的寄生蟲表達(dá)和分泌脯氨酸消旋酶的能力可進(jìn)一步參與宿主/寄生蟲相互作用。事實(shí)上，寄生蟲分泌的脯氨酸消旋酶同工型主動參與基于宿主感染的非特異性多克隆B細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)(13)并促成寄生蟲逃避，因此保證其在宿主中的持續(xù)。
如針對其它促分裂原和寄生蟲抗原所述(36)、(37)、(38)，及除了其促分裂原性質(zhì)之外，TcPRAC也可以參與宿主細(xì)胞靶位的修飾，使得寄生蟲能更好地的附著于宿主細(xì)胞膜，從而保證感染性改善。因?yàn)橛蠰-脯氨酸的富集與肌肉功能失調(diào)(39)及肌肉收縮抑制(40)相關(guān)的一些報(bào)道，因此胞內(nèi)寄生蟲對脯氨酸消旋酶的釋放可另外有助于通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)L-脯氨酸濃度而保持感染，因?yàn)楦彼崾羌〖?xì)胞靶位的完整性所必需的。因此，近來論證了超表達(dá)TcPRACA或TcPRACB基因而非功能性剔除的轉(zhuǎn)基因寄生蟲對宿主靶細(xì)胞的感染性是5-10倍，指出了脯氨酸消旋酶在正在進(jìn)行的感染過程中的關(guān)鍵作用。同樣，先前的報(bào)道表明單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Lysteria monocytogenes)丙氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶基因的遺傳失活消除了細(xì)菌的致病原性，因?yàn)镈-丙氨酸的存在是保護(hù)所有細(xì)菌免于外部環(huán)境影響的細(xì)胞壁的粘肽成分的合成所必需的(41)。
使用TcPRAC和斯氏梭菌脯氨酸消旋酶基因中經(jīng)鑒別的關(guān)鍵的保守殘基及篩選SWISS-PROT和TrEMBL數(shù)據(jù)庫的分析揭示了脯氨酸消旋酶的最小特征DRSPXGX[GA]XXAXXA，并證實(shí)了推定的蛋白質(zhì)在至少10種獨(dú)特的生物體中的存在。對未完成的基因組序列的篩選顯示在另外8種生物體中高度同源的脯氨酸消旋酶候選基因，其中有真菌煙曲霉(Aspergillus fumigatus)及細(xì)菌炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)和肉毒梭菌(Clostridium botulinum)。這是最令人感興趣的，因?yàn)槭窍付皇歉彼嵯冈诩?xì)菌中普遍存在，并只是在最近才在更復(fù)雜的生物體如枯氏錐蟲中進(jìn)行了描述(42，43)。這些發(fā)現(xiàn)可能反映了細(xì)胞對胞外刺激的適應(yīng)性應(yīng)答并揭示了在真核細(xì)胞中通過D-氨基酸對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)的更普遍的機(jī)制。在人和小鼠基因組數(shù)據(jù)庫中使用脯氨酸消旋酶的較低嚴(yán)格的特征發(fā)現(xiàn)相似的基因是令人驚奇的。然而，在那些推測的蛋白質(zhì)的推定的活性位點(diǎn)中沒有關(guān)鍵的氨基酸半胱氨酸提示與脯氨酸消旋酶不同的功能性。
本發(fā)明顯示TcPRAC同工型是高度穩(wěn)定的，并具有在大范圍pH進(jìn)行其活性的能力。另外，吡咯羧酸(一種特異性脯氨酸消旋酶的抑制劑)對TcPRAC酶比對CsPR的親和性高。
本發(fā)明還提供了與本文揭示的特異性序列基本相似的氨基酸或核酸序列。
術(shù)語“基本相似”當(dāng)就氨基酸或核酸序列而言時，是指特定的目標(biāo)序列例如突變的序列與參考序列由于一或多個取代、缺失或添加而不同，但其凈效應(yīng)保持活性。或者，如果在如下情況下，則核酸亞單位和類似物與本文揭示的特異DNA序列是“基本相似的”(a)所述DNA序列衍生自本發(fā)明的一個區(qū)域；(b)所述DNA序列能與(a)的DNA序列雜交和/或其編碼活性分子；或者所述DNA序列為(a)或(b)的DNA序列的遺傳密碼簡并序列和/或其編碼活性分子。
為了保持活性，缺失和取代優(yōu)選產(chǎn)生同源或保守取代的序列，意味著給定的殘基由一個生物學(xué)相似的殘基置換。保守取代例如包括脂肪族殘基彼此取代，如Ile，Val，Leu或Ala彼此取代，或者極性殘基彼此取代，如Lys與Arg、Glu與Asp或者Gln與Asn之間彼此取代。本領(lǐng)域熟知其它這種保守取代例如具有相似疏水性特征的完整區(qū)域的取代。當(dāng)所述活性是脯氨酸消旋酶活性時，Cys330和Cys160必須存在。
本發(fā)明的多核苷酸可用作探針或者用于選擇擴(kuò)增反應(yīng)的核苷酸引物。PCR在Cetus Corp的美國專利No.4,683,202中有描述。擴(kuò)增的片段可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或者通過毛細(xì)管電泳，或者通過層析技術(shù)(凝膠過濾、疏水性層析，或者離子交換層析)而鑒別。擴(kuò)增的特異性可以通過分子雜交而保證，使用本發(fā)明的多核苷酸、與這些多核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸或者其擴(kuò)增產(chǎn)物自身作為核酸探針。
擴(kuò)增的核苷酸片段在雜交反應(yīng)中用作探針以在如生物學(xué)樣品中檢測本發(fā)明的多核苷酸的存在或者檢測編碼消旋酶活性的基因的存在。本發(fā)明還提供了上述擴(kuò)增的核酸片段(擴(kuò)增子)。這些探針和擴(kuò)增子可以使用例如酶或熒光化合物而放射性或非放射性標(biāo)記。
也可以使用除了PCR技術(shù)之外的其它核酸擴(kuò)增技術(shù)。鏈置換擴(kuò)增(Strand Displacement Amplification，SDA)技術(shù)(Walker et al.，1992)是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其基于限制酶在識別位點(diǎn)(其在半硫代磷酸形式下)切割一條鏈的能力，及基于DNA聚合酶在限制酶產(chǎn)生的3′OH末端起始新鏈合成的性質(zhì)，及基于這個DNA聚合酶置換位于下游的先前合成的鏈的性質(zhì)而進(jìn)行。
SDA擴(kuò)增技術(shù)比PCR(需要一種自動調(diào)溫水浴裝置)更易于進(jìn)行，而且比其它擴(kuò)增方法更快速。因此，本發(fā)明還包含在DNA或RNA擴(kuò)增方法如SDA技術(shù)中使用本發(fā)明的核酸片段(引物)。
本發(fā)明的多核苷酸，尤其是本發(fā)明的引物，在進(jìn)行不同的靶核酸擴(kuò)增方法中是有用的技術(shù)手段，所述方法如-Kwoh等在1989年所述的TAS(基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(Transcription-based Amplification System))；-Guatelli等在1990年所述的SR(自主序列復(fù)制(Self-SustainedSequence Replication))；-Kievitis等在1991年所述的NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增(Nucleic acid Sequence Based Amplification))；及-TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(Transcription Mediated Amplification))。
本發(fā)明的多核苷酸，尤其是本發(fā)明的引物，也可作為技術(shù)手段在進(jìn)行核酸擴(kuò)增或修飾的方法中用作探針，所述方法如-LCR(連接酶鏈反應(yīng)(Ligase Chain Reaction))，由Landegren等在1988年描述并由Barany等在1991年改進(jìn)，Barany采用一種熱穩(wěn)定連接酶；-RCR(修復(fù)鏈反應(yīng)(Repair Chain Reaction))，由Segev等在1992年描述；-CPR(循環(huán)探針反應(yīng)(Cycling Probe Reaction))，由Duck等在1990年描述；及-Q-β復(fù)制酶反應(yīng)，由Miele等在1983年描述并由Chu等在1986年、Lizardi等在1988年及由Burg等和Stone等在1996年改進(jìn)。
當(dāng)被檢測的靶多核苷酸是RNA例如mRNA時，可以在擴(kuò)增反應(yīng)之前使用逆轉(zhuǎn)錄酶以從生物學(xué)樣品中含有的RNA中獲得cDNA。產(chǎn)生的cDNA隨后可用作本發(fā)明的擴(kuò)增方法或檢測方法中使用的引物或探針的核酸靶。
本發(fā)明的寡核苷酸探針在嚴(yán)格條件下與包含本發(fā)明的所有或部分多核苷酸的DNA或RNA分子特異性雜交。在一個舉例性的實(shí)施方案中，為了特異性檢測本發(fā)明的多核苷酸而使用的嚴(yán)格雜交條件如下如下進(jìn)行預(yù)雜交和雜交以增加異源雜交的可能性預(yù)雜交和雜交在50℃在含有5×SSC和1×Denhardt′s溶液的溶液中進(jìn)行。
洗滌如下進(jìn)行在60℃用2×SSC洗滌3次，每次20分鐘。
本發(fā)明的未標(biāo)記的多核苷酸可直接用作探針。然而，多核苷酸通?？捎梅派湫栽?32P、35S、3H、125I)標(biāo)記或者用非同位素分子例如生物素、乙酰氨基芴、洋地黃毒苷、5-溴脫氧尿苷、熒光素)標(biāo)記，以產(chǎn)生用于多種應(yīng)用的探針。核酸片段的非放射性標(biāo)記的實(shí)例在法國專利No.FR 78 10975或由Urdea等或由Sanchez-Pescador等在1988年描述。
也可以使用其它標(biāo)記技術(shù)，如法國專利2 422 956和2 518 755所述那些?？梢圆煌绞竭M(jìn)行雜交步驟。一般的方法包括將已經(jīng)從生物學(xué)樣品中提取出的核酸固定在底物(硝化纖維、尼龍、聚苯乙烯)上，然后在指定條件下溫育所述靶核酸和探針。在雜交步驟后，棄去過量的特異性探針，并通過適當(dāng)?shù)姆椒?放射性、熒光或酶活性測定方法)檢測形成的雜交分子。
優(yōu)選地，本發(fā)明的探針可具有結(jié)構(gòu)特征，由此允許信號擴(kuò)增，這種結(jié)構(gòu)特征例如是由Urdea等在1991年或者歐洲專利No.0 225 807(Chiron)所述的那些分支的DNA探針。
在本發(fā)明的另一個有利的實(shí)施方案中，本文所述的探針可用作“捕捉探針”，并為此而固定在底物上以捕捉生物學(xué)樣品中含有的靶核酸。捕捉的靶核酸隨后用第二種探針檢測，所述第二種探針識別與捕捉探針識別的序列不同的靶核酸序列。
本發(fā)明的寡核苷酸探針也可用于包含固定在基質(zhì)上的探針矩陣文庫(matrix library)的檢測裝置中，給定長度的每個探針的序列彼此移位一或多個堿基，矩陣文庫的每個探針因此與靶核酸的獨(dú)特序列互補(bǔ)。任選地，矩陣的基質(zhì)可以是能作為電子供體的材料，發(fā)生雜交的矩陣位置的檢測隨后通過電子裝置確定。這種探針矩陣文庫及靶核酸的特異性檢測的方法在歐洲專利申請No.0 713 016，或者PCT申請No.WO 95 33846，或者PCT申請No.WO 95 11995(AffymaxTechnologies)，PCT申請No.WO 97 02357(Affymetrix Inc.)，及美國專利No.5,202,231(Drmanac)中有描述，所述專利和專利申請?jiān)诖瞬⑷雲(yún)⒖肌?br> 本發(fā)明還涉及含有至少一種本發(fā)明核酸的重組質(zhì)粒。在細(xì)菌中、尤其在大腸桿菌中表達(dá)的合適載體是pET-28(Novagen)，其使得含有6xHis親和性標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生。所述6xHis標(biāo)記置于重組多肽的C末端或N末端。
本發(fā)明的多肽也可以通過常規(guī)的化學(xué)合成方法在均質(zhì)的溶液或在固相中制備。這種多肽的化學(xué)合成技術(shù)的一個示范性實(shí)例是Houbenweyl在1974年所述的均質(zhì)溶液技術(shù)(homogenous solutiontechnique)。
本發(fā)明的多肽用于制備識別多肽(SEQ ID NO1、2、3和4)或其片段的多克隆或單克隆抗體。單克隆抗體可以根據(jù)Kohler和Milstein在1975年描述的技術(shù)從雜交瘤中制備。多克隆抗體可以通過用本發(fā)明的多肽組合一種佐劑免疫哺乳動物尤其是小鼠或兔，然后在預(yù)先固定有用作抗原的多肽的親和層析柱上純化免疫動物血清中含有的特異性抗體而制備。
本發(fā)明提供了檢測由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亞序列的核苷酸序列編碼的消旋酶的方法。
因此，本發(fā)明還提供了特異性檢測生物學(xué)樣品中本發(fā)明的多肽存在與否的方法。所述方法包括a)將生物學(xué)樣品與本發(fā)明的抗體接觸；b)檢測形成的抗原-抗體復(fù)合物。
本發(fā)明還提供了一種診斷試劑盒，以在體外檢測生物學(xué)樣品中本發(fā)明多肽的存在與否。所述試劑盒包含上述多克隆或單克隆抗體，任選是標(biāo)記的；及檢測形成的抗原-抗體復(fù)合物的試劑，其中所述試劑任選攜帶一個標(biāo)記，或者能通過一個標(biāo)記的試劑而自身識別，更特別地在上述單克隆或多克隆抗體不是通過自身標(biāo)記的情況中。
本發(fā)明還涉及使用多肽的完整序列(SEQ ID NO1、2、3、或4)在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行生物信息搜索。在這種情況中，所述方法檢測編碼選自SEQ ID NO1、2、3、或4的肽的至少一個亞序列的存在與否，其中所述至少一個亞序列是消旋酶的指征。
本發(fā)明還涉及
具有至少10個氨基酸的一種純化的多肽或肽片段，其是由本發(fā)明的多核苷酸或肽序列的抗體識別。
由本發(fā)明的多核苷酸序列編碼的多肽或肽片段的一種單克隆或多克隆抗體。
一種檢測生物學(xué)樣品中消旋酶的方法，包括a)將生物學(xué)樣品的DNA或RNA與本發(fā)明的多核苷酸的引物或探針接觸，所述引物或探針與核苷酸序列雜交；b)使用所述引物或探針擴(kuò)增核苷酸序列；c)檢測在引物或探針與DNA或RNA之間形成的雜交復(fù)合物。
一種檢測生物學(xué)樣品中消旋酶存在與否的試劑盒，其包含a)本發(fā)明的多核苷酸引物或探針；b)進(jìn)行核酸雜交反應(yīng)必需的試劑。
一種在體外篩選能抑制由含有本發(fā)明的多核苷酸的核酸編碼的消旋酶的活性分子的方法，其中測試所述分子對至少所述消旋酶的抑制活性，包括a)提供含有本發(fā)明的多肽的消旋酶；b)將所述活性分子與所述消旋酶接觸；c)測試各種濃度的活性分子抑制消旋酶活性的能力；d)選擇對所述消旋酶的活性有至少80％抑制作用的活性分子。
本文所用術(shù)語“重組”是指本發(fā)明中應(yīng)用的蛋白質(zhì)或多肽衍生自重組(例如微生物或哺乳動物)表達(dá)系統(tǒng)。“微生物”是指在細(xì)菌或真菌(例如酵母)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)或多肽。作為產(chǎn)物，“重組微生物”是指在微生物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽，其基本上沒有天然的內(nèi)源物質(zhì)。在大多數(shù)細(xì)菌培養(yǎng)物例如大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽沒有聚糖。在酵母中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽可具有與在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽不同的糖基化模式。
本發(fā)明的多肽或多核苷酸可以是分離或純化形式的。在本說明書中針對蛋白質(zhì)或多肽組合物的純度而所用的術(shù)語“分離的”或“純化的”是指蛋白質(zhì)或多肽組合物基本上沒有天然或內(nèi)源的其它蛋白質(zhì)，并含有低于大約1％質(zhì)量的生產(chǎn)過程中的蛋白質(zhì)污染物。然而，這種組合物可含有作為穩(wěn)定劑、賦形劑或共治療劑(co-therapeutics)而加入的其它蛋白質(zhì)。這些性質(zhì)相似地用于本發(fā)明的多核苷酸。
本發(fā)明的平臺涉及進(jìn)行篩選D-氨基酸測試方法的試劑、系統(tǒng)和裝置。
適當(dāng)?shù)妮d體、稀釋劑和佐劑可以與本文所述的多肽和多核苷酸組合以制備本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的組合物含有所述多肽或多核苷酸以及固體或液體的可接受的非毒性載體。這種載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成的油脂。合適的液體是花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。水是優(yōu)選的載體。生理溶液也可以用作液體載體。
現(xiàn)在參考如下實(shí)施例對本發(fā)明加以描述。
實(shí)施例1克隆和自動測序λ噬菌體和質(zhì)粒DNA使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備，直接測序使用Big dyeTerminator試劑盒(Perkin Elmer，Montigny-le Bretonneux，F(xiàn)rance)根據(jù)廠商指導(dǎo)而完成。擴(kuò)展產(chǎn)物在ABI 377自動測序儀中運(yùn)行7小時。簡而言之，為獲得全長的TcPRAC基因，32P標(biāo)記的239bp PCR產(chǎn)物用作探針以篩選枯氏錐蟲克隆CL-Brener lamba Fix II基因組文庫(詳見(13)所述)。有4種分離的獨(dú)立的陽性噬菌體。限制分析和Southern印跡雜交顯示兩種類型的基因組片段，每種均由2個噬菌體代表。確定每種模式的代表性噬菌體的完整序列和側(cè)翼區(qū)域。代表第一種噬菌體類型的TcPRACA基因的完全鑒定如先前所述(13)。然后進(jìn)行鑒定代表第二種噬菌體類型的推定的TcPRACB基因的全部序列，并使用該序列內(nèi)在的引物進(jìn)行測序，如前所述(13)。
實(shí)施例2染色體印跡(Chromoblots)將短膜蟲期的枯氏錐蟲(克隆CL Brener)通過在LIT培養(yǎng)基中每周一次傳代而保持。將含有1×107個培養(yǎng)的寄生蟲的瓊脂糖(0.7％)塊用0.5M EDTA/10mM Tris/1％十二烷基肌氨酸鈉pH8.0裂解，由蛋白酶K消化并在10mM Tris/1mM EDTA，pH8.0中洗滌。在18℃使用Gene Navigator裝置(Pharmacia，Upsala，Sweden)在0.5×TBE中進(jìn)行脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)。電泳如(14)所述進(jìn)行。然后將凝膠用溴化乙啶染色、拍照、暴露于紫外線下(265nm)5分鐘，并在堿性條件下進(jìn)一步印跡于尼龍濾膜上(HybondN+，Amersham Life ScienceInc.，Cleveland，USA)。將使用Hi-45(5′CTCTCC CAT GGG GCA GGA AAA GCT TCT G 3′)[SEQ ID NO5]和Bg-45(5′CTG AGC TCG ACC AGA T(CA)T ACT GC 3′)[SEQ IDNO6]寡核苷酸通過PCR擴(kuò)增TcPRACA基因獲得的DNA探針(如(13)所述)使用Megaprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham)用αdATP32標(biāo)記。將染色體印跡在55℃在2×Denhart′s/5×SSPE/1.5％SDS中雜交過夜，并在60℃在2×SSPE/0.1％SDS及隨后在1×SSPE中洗滌。使用Phosphorimager cassette(Molecular Dynamics，UK)，通過將染色體印跡過夜曝光獲得放射自顯影圖實(shí)施例3質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白質(zhì)純化在密碼子30起始的TcPRACA基因片段通過使用Hi-和Bg-45引物PCR獲得，并克隆進(jìn)pET28b(+)表達(dá)載體(Novagen-Tebu，Le Perrayen Yvelines，F(xiàn)rance)中并符合C末端6-組氨酸標(biāo)記的讀框。編碼TcPRACB的片段由通過相似PCR獲得的TcPRACB基因片段的HindIII消化產(chǎn)物組成，并克隆進(jìn)pET28b(+)表達(dá)載體中并符合C末端6-組氨酸標(biāo)記的讀框。相應(yīng)的重組蛋白TcPRACA和TcPRACB在大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen，Cergy Pontoise，F(xiàn)rance)中產(chǎn)生，并在鎳柱(Novagen-Tebu，Le Parrayen Yvelines，F(xiàn)rance)上根據(jù)廠商指導(dǎo)使用固定金屬親和層析(Immobilized Metal Affinity Chromatography)純化。
實(shí)施例4大小排阻層析rTcPRACA和rTcPRACB蛋白質(zhì)如上所述純化，并在透析池(Slide-A-lyzer 7K Pierce)中在4℃對PBS pH7.4或0.2M NaOAc pH6.0洗脫緩沖液透析過夜。將最終的蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)為2mg/ml，并將0.5ml該溶液加樣于預(yù)先用中等范圍的蛋白質(zhì)校準(zhǔn)試劑盒(Pharmacia)校準(zhǔn)的Pharmacia Superdex 75柱(HR10×30)中。大小排阻層析(SEC)使用FPLC系統(tǒng)(AKTA Purifier，Pharmacia)進(jìn)行。洗脫在恒定的0.5ml/分鐘流速進(jìn)行，收集0.5ml蛋白質(zhì)級分并在280nm監(jiān)測吸光度。將每個級分如下所述在外消旋分析中檢測。將級分B1和B5再次加樣于Superdex 75柱中并進(jìn)行進(jìn)一步的SEC以核實(shí)所述級分的純度。
實(shí)施例5外消旋作用分析如(13)所述，計(jì)算不同濃度的L-脯氨酸、D-脯氨酸，L-羥基(OH)-脯氨酸，D-羥基(OH)-脯氨酸的外消旋作用百分比，通過將0.25μM二聚體蛋白質(zhì)和40mM底物于0.2M乙酸鈉pH 6.0中的500μl混合物在37℃溫育30分鐘或1小時而進(jìn)行。反應(yīng)通過在80℃溫育10分鐘并冷凍而終止。然后加入水(1ml)，并在旋光計(jì)241MC(Perkin Elmer，Montigny le Bretonneux，F(xiàn)rance)中測定路徑長度10cm的細(xì)胞中旋光度，波長為365nm，精確度為0.001度。使用0.2M乙酸鈉、磷酸鉀和Tris-HCl緩沖液確定作為pH函數(shù)的40mM L-脯氨酸外消旋作用的百分比，如上述將反應(yīng)在37℃溫育30分鐘。所有試劑均購自Sigma。
實(shí)施例6動力學(xué)分析L-和D-脯氨酸的濃度從溶液的旋光度中經(jīng)旋光計(jì)在熱穩(wěn)定在37℃，路徑長度10cm的細(xì)胞中確定，波長365nm。使用終體積為1.5ml的于0.2M乙酸鈉(pH6)中的40mM L-脯氨酸進(jìn)行初步分析。在10分鐘期間每5秒測定一次旋光度，及每5分鐘測定一次旋光度至1小時。在曲線的線性部分確定之后，在10分鐘期間內(nèi)每30秒測定一次在5-160mM底物中的速度以確定KM和Vmax。使用 程序進(jìn)行計(jì)算。抑制分析通過如上述溫育0.125μM二聚體蛋白質(zhì)、6,7μM-6mM吡咯-2-羧酸(PAC)、20-160mM L-脯氨酸而進(jìn)行。圖式和曲線線性回歸可以確定Ki為[PAC]/[(具有PAC的斜率/無PAC的斜率)-1]。所有試劑均購自Sigma。
實(shí)施例7C330STcPRACA的定點(diǎn)誘變定點(diǎn)誘變通過PCR，調(diào)整Higuchi等(15)的方法進(jìn)行。簡而言之，使用基于如下兩種重疊(overlapping)的致突變引物的定點(diǎn)誘變通過兩個連續(xù)的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生脯氨酸消旋酶活性位點(diǎn)的Cys330突變(act-1)5′GCG GAT CGC TCT CCAAGCGGG ACA GGC ACC 3′[SEQID NO7]和(act-2)5′GGT GCC TGT CCCGCTTGG AGA GCG ATCCGC 3′[SEQ ID NO8]，設(shè)計(jì)為在活性位點(diǎn)通過用絲氨酸(AGC)置換第330位的半胱氨酸(TGT)而導(dǎo)入一個密碼子突變。第一步的標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增通過使用TcPRACA DNA作模板及act-1引物和反向C-末端引物(Bg-45)5′CTG AGC TCG ACC AGA T(CA)T ACT GC 3′(密碼子423)的混合物，或者act-2引物和正向N-末端引物(Hi-45)5′CTC TCCCAT GGG GCA GGA AAA GCT TCT G 3′(密碼子-53)的混合物(見圖5)進(jìn)行。將獲得的分別為316bp和918bp的擴(kuò)增片段通過Qiagen PCR提取試劑盒(Qiagen，Courtaboeuf，F(xiàn)rance)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行純化，并進(jìn)一步通過T4連接酶連接以產(chǎn)生由全長的潛在突變的TcPRACA*編碼序列組成的模板用于第二步PCR。這個模板的擴(kuò)增使用正向Hi-45和反向Bg-45引物進(jìn)行，將編碼成熟的脯氨酸消旋酶的所得TcPRACA*片段純化并克隆進(jìn)pCR_2.1-TOPO_載體(Invitrogen)中。TOP10感受態(tài)大腸桿菌用pCR_2.1-TOPO_-TcPRACA*構(gòu)建體和分離自為DNA測序而制備的各個克隆的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化。然后將陽性突變體亞克隆進(jìn)pET28b(+)表達(dá)載體(Novagen-Tebu，Le ParrayenYvelines，F(xiàn)rance)的NcoI/SacI位點(diǎn)并符合C末端6-組氨酸標(biāo)記的讀框。對在大腸桿菌(DH5α)中產(chǎn)生的pET28b(+)-TcPRACA*的亞克隆再次測序以證實(shí)突變的存在。可溶的重組C330STcPRACA蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen)中產(chǎn)生，使用鎳柱(Novagen-Tebu)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行純化。
實(shí)施例8誘變?yōu)楹藢?shí)脯氨酸消旋酶的反應(yīng)機(jī)制中涉及殘基Cys160，進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變以用絲氨酸置換殘基Cys160，與針對Cys330殘基所述突變相似(見實(shí)施例7)。簡而言之，使用如下引物通過PCR進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變Ser160-正向5′GGCTATTTAAATATGTCTGGACATAACTCAATTGCAGCG3′Ser160-反向5′CGCTGCAATTGAGTTATGTCCAGACATATTTAAATAGC3′半胱氨酸-絲氨酸突變的存在通過測序含有所述PCR產(chǎn)物的相應(yīng)質(zhì)粒而核實(shí)，如下所示。質(zhì)粒pET-C160S用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)并用于產(chǎn)生相應(yīng)的重組的突變蛋白。
139M D T C G Y L N MCG H N G I A A145pET-TcPRAC 499ATCGATACCGCTGGCTATTTAAATATGTGTGGACATAACTCAATTGCAGCG550Ser160-F/RGGCTATTTAAATATGTCTGGACATAACTCAATTGCAGCG550pET-C160S 499ATGGATACCGGTGGCTATTTAAATATGTCTGGACATAACTCAATTGCAGCG550pET-C330S 499ATGGATACCGGTGGCTATTTAAATATGTGTGGACATAACTCAATTGCAGCG550139M D T C G Y L N MSG H N G I A A145318V I F G N R Q A D R S PCG T C T334pET-TcPRAC 999GTGATATTTGGCAATCGCCAGGCGGATCGCTCTCCATGTGGGACAGGCACC1050Ser330-F/RGCGGATCGCTCTCCAAGCGGGACAGGCACC1050pET-C160S 999GTCATATTTGGCAATCGCCAGGCGGATCGCTCTCCATGTGGGACAGGCACC1050pET-C330S 999GTGATATTTGGCAATCGCCAGGCGGATCGCTCTCCAAGCGGGACAGGCACC1050318V I F G N R Q A D R S PSG T C T334下劃線處是用于位點(diǎn)特異性誘變的引物序列。Cys160和Cys330殘基的Cys→Ser突變用黑體字和下劃線表示。
實(shí)施例9脯氨酸消旋酶的功能性胞內(nèi)同工型的表達(dá)先前鑒定的是來自枯氏錐蟲的TcPRAC基因，在體內(nèi)和體外論證了其編碼脯氨酸消旋酶(13)。TcPRAC基因的基因組組構(gòu)和轉(zhuǎn)錄分析表明每個單倍體基因組中存在兩個同種異型基因拷貝，稱為TcPRACA1和TcPRACB2。TcPRACA顯示編碼一種功能上不依賴于輔因子的脯氨酸消旋酶，與斯氏梭菌脯氨酸消旋酶(CsPR)非常相似(11)。對全長TcPRACB進(jìn)行測序，從圖1A中可以觀察到TcPRACA和TcPRACB基因在基因間區(qū)域均具有特征性錐蟲多嘧啶富集基序，當(dāng)其位于用作受體位點(diǎn)的(AG)-二核苷酸的上游時是關(guān)鍵的反式剪接信號。在其它枯氏錐蟲基因中，發(fā)現(xiàn)UUA三聯(lián)體在聚腺苷酸化位點(diǎn)之前的3’未翻譯區(qū)的末端。這兩個序列之間的對比表明14個點(diǎn)突變(導(dǎo)致96％相同性)產(chǎn)生7個氨基酸差異。當(dāng)表達(dá)時，預(yù)測TcPRACB產(chǎn)生較短的蛋白質(zhì)(39kDa)，其翻譯在位于(AG)-剪接的前導(dǎo)受體位點(diǎn)(在第175位)下游的第274位ATG密碼子開始。對比之下，TcPRACA具有編碼具有45kDa表觀分子量的肽的開放讀框。圖1B中所示的兩種蛋白質(zhì)TcPRACA和TcPRACB的蛋白質(zhì)序列對比圖式表明TcPRACB脯氨酸消旋酶缺少相應(yīng)于在TcPRACA蛋白質(zhì)中觀測到的信號肽氨基酸序列(圖中陰影框所示；見圖1C中推測的切割位點(diǎn))。因此，TcPRACB產(chǎn)生39kDa的胞內(nèi)和非分泌的蛋白質(zhì)同工型。與CsPR(11)和TcPRACA(13和圖1B)一樣，脯氨酸消旋酶的活性位點(diǎn)在TcPRACB序列中是保守的。另外，雖然僅有7個氨基酸不同，但TcPRACA和TcPRACB序列與CsPR具有大約50％同源性(13)。與枯氏錐蟲中其它蛋白質(zhì)編碼基因一致，TcPRAC基因位于兩個不同的染色體條帶上，一個條帶含有三或多個相似大小的染色體，見圖1D所示。因此，含有通過脈沖場凝膠電泳分離的枯氏錐蟲CL Brener染色體條帶的印跡的雜交表明由與TcPRACA和TcPRACB均同源的探針識別的序列圖譜定位于分別相應(yīng)于區(qū)域VII和V的大約0.9Mb和0.8Mb的鄰近遷移條帶中，根據(jù)Cano等的編號系統(tǒng)進(jìn)行(14)。
為了核實(shí)TcPRACB基因是否可編碼功能性脯氨酸消旋酶，將兩種枯氏錐蟲同種異型基因均在大腸桿菌中表達(dá)以產(chǎn)生C-末端His6-標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)。在鎳-次氮基三乙酸瓊脂糖柱上通過親和層析純化后，重組蛋白質(zhì)通過SDS凝膠電泳分離，揭示了對于rTcPRACA和rTcPRACB的分別具有45.8和40.1kDa預(yù)期大小的單一條帶(圖2A)。為確定rTcPRACB是否顯示脯氨酸消旋酶活性，如述應(yīng)用生物化學(xué)分析以測定L-和D-脯氨酸底物的旋光變化(13)。從圖2B中可以看出，rTcPRACB對L-和D-脯氨酸均具有外消旋作用，但對L-羥基-脯氨酸無外消旋作用，rTcPRACA也如此。相似地，如對于CsPR(11)和rTcPRACA(13)脯氨酸消旋酶所述，rTcPRACB是一種輔因子非依賴性脯氨酸消旋酶。使用這兩種重組酶在各種pH值測定L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為D-脯氨酸的速率。如圖2C所示，rTcPRACA活性明顯顯示出pH依賴性，在pH 5.5-7.0活性最佳。相反，rTcPRACB的最佳活性可以在pH 4.5-8.5的pH大范圍內(nèi)觀測到。這些結(jié)果表明這兩種TcPRAC基因拷貝的開放讀框的翻譯產(chǎn)生功能性脯氨酸消旋酶同工型。如前所述，使用對抗45kDa分泌的脯氨酸消旋酶而產(chǎn)生的抗體對非感染性短膜蟲期寄生蟲提取物進(jìn)行的Western印跡分析已經(jīng)表明39kDa蛋白質(zhì)主要在可溶的細(xì)胞級分中，僅少量在不可溶的細(xì)胞級分中，培養(yǎng)基中不存在(13)。為表明蛋白質(zhì)的胞內(nèi)39kDa同工型在體內(nèi)的功能相同，從5×108個短膜蟲期非感染性寄生蟲中獲得可溶的細(xì)胞提取物，39kDa可溶的蛋白質(zhì)的水平通過Western印跡量化，與已知量的rTcPRACB酶對比。從圖2D中可以看出，該蛋白質(zhì)的胞內(nèi)同工型在體內(nèi)確實(shí)是功能性的，因?yàn)轱@示了脯氨酸消旋酶活性并且外消旋作用的水平依賴于蛋白質(zhì)濃度。這個發(fā)現(xiàn)對到達(dá)胞內(nèi)區(qū)室的特異性抑制劑是有益的。
實(shí)施例10重組枯氏錐蟲脯氨酸消旋酶的功能分析和動力學(xué)性質(zhì)由于TcPRAC基因拷貝編碼具有獨(dú)特的pH依賴性活性的分泌的和非分泌的脯氨酸消旋酶同工型，因此我們進(jìn)行了研究以確定rTcPRACA與rTcPRACB蛋白質(zhì)之間的其它生物化學(xué)性質(zhì)是否不同。這種差異可反映寄生蟲分化期間蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位及在宿主內(nèi)的存活力。rTcPRACA和rTcPRACB酶活性均在37℃為最大，并可以通過在80℃加熱5分鐘而消除。然而，當(dāng)在不同的貯存條件下分析時，這兩種重組酶的穩(wěn)定性顯著不同。因此，如表1所示，純化的rTcPRACB是高度穩(wěn)定的，因?yàn)槠浠钚栽谑覝卦?.5M咪唑緩沖液pH8.0中保持至少10天，對比之下，rTcPRACA在這種條件下喪失84％的活性。相反，在4℃rTcPRACA的大部分酶活性得以保持(65％)，相比之下rTcPRACB酶活性較低(34％)。這兩種酶均可以在50％甘油中在-20℃保存，或者在乙酸鈉緩沖液pH6.0中稀釋，但在這些貯存條件下，rTcPRACA活性被削弱。然而，當(dāng)將蛋白質(zhì)作為硫酸銨沉淀保持在-20℃時無疑獲得對這兩種重組脯氨酸消旋酶的最佳保存方法。保存對試劑盒而言是重要的。
表1重組TcPRACA和TcPRACB脯氨酸消旋酶在不同貯存條件下的穩(wěn)定性
在鎳-次氮基三乙酸瓊脂糖柱上純化后，將重組蛋白質(zhì)在鎳柱緩沖液(20mM Tris/500mM NaCl/500mM咪唑，pH8.0)中在室溫(RT)或+4℃保持10天，或者在50％甘油中稀釋在-20℃保持(Gly/-20℃)，或者在4℃在最佳pH緩沖液(NaOAc，pH6.0)中保持。將重組酶在(NH4)2SO4中沉淀并在溶液中在4℃保持或?qū)⒊恋砀稍镌?20℃保持。在37℃進(jìn)行30分鐘消旋酶分析?；钚员４姘俜直仁褂?.25μM純化的rTcPRACA或rTcPRACB酶和40mM的L-脯氨酸經(jīng)旋光計(jì)測定，與用新純化的蛋白質(zhì)(CTRL)獲得的結(jié)果相對比。這些結(jié)果是至少兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。
這兩種重組酶均呈現(xiàn)Michaelis-Menten動力學(xué)(圖3A)，rTcPRACB比rTcPRACA具有較高的活性。事實(shí)上從圖3B可以看出，通過恒定量每種酶催化的L-脯氨酸的系列稀釋液的L至D的轉(zhuǎn)化分析顯示rTcPRACB酶(KM為75mM，Vmax為2×10-4mol/秒)與rTcPRACA(KM為29mM，Vmax為5.3×10-5mol/秒)相比具有較高速度。為了確定吡咯-2-羧酸(PAC)的Ki值，對這兩種重組蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，吡咯-2-羧酸是CsPR的特異性抑制劑(16)。這些分析表明PAC是比較有效的rTcPRACA(圖3C)和rTcPRACB抑制劑，獲得的Ki值分別為5.7μM和3.6μM。Ki值的差異幾乎完全地反映了對這兩種酶所報(bào)道的KM值的差異，其與天然蛋白質(zhì)的值相似。這些Ki值表明PAC抑制劑對rTcPRACA和rTcPRACB的親和性高于對CsPR(Ki為18μM)的親和性。KM和Ki值對抑制劑而言是重要的。
實(shí)施例11脯氨酸消旋酶活性對二聚體結(jié)構(gòu)的需求當(dāng)對rTcPRACA在Superdex 75柱上在pH6.0進(jìn)行大小排阻層析時，洗脫了分別為大約80kDa(B2級分)和43kDa(B4級分)的兩個蛋白質(zhì)峰，推測其相應(yīng)于酶的二聚體和單體形式(圖4)。使用非變性的PAGE對完整的枯氏錐蟲短膜蟲期提取物進(jìn)行Western印跡分析已經(jīng)表明天然蛋白質(zhì)的80kDa分子量條帶，通過SDS-PAGE獲得45kDa條帶(13)。為了消除交叉污染，將在預(yù)測的二聚體(B2)或單體(B4)峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)分別洗脫的B1和B5級分再加樣于該柱上，獲得的圖式(見圖4插入圖)證實(shí)級分的純度。酶活性位于80kDa峰，但未在43kDa峰(表2)。這些結(jié)果確證了蛋白質(zhì)的這兩個亞基是消旋酶活性所必需的。在中性pH(7.4或之上)，rTcPRACA產(chǎn)生高分子量的聚合體，其在rTcPRACB的情況中未觀測到，這與其更廣泛的最佳pH范圍一致。例如對于試劑盒緩沖液而言，所述酶應(yīng)在最佳pH條件下。
表2在大小排阻層析后重組TcPRACA級分的消旋酶活性
在從Superdex 75柱洗脫后，將相應(yīng)于1μg蛋白質(zhì)的20μl每個峰(A15至B7，見圖4)在37℃與于0.2M NaOAc，pH6.0中的40mM L-脯氨酸溫育1小時。如實(shí)施例5所述測定旋光度及確定外消旋作用百分比。
實(shí)施例11通過催化位點(diǎn)的Cys330及或者Cys160突變對脯氨酸消旋酶活性的消除斯氏梭菌脯氨酸消旋酶被描述為具有38kDa亞基及每兩個亞基有一個脯氨酸結(jié)合位點(diǎn)的同源二聚體酶，其中在第256位的兩個半胱氨酸也許在催化中通過轉(zhuǎn)移質(zhì)子至結(jié)合的底物而發(fā)揮關(guān)鍵作用(12)。先前已經(jīng)顯示枯氏錐蟲脯氨酸消旋酶的促分裂原性質(zhì)依賴于酶活性位點(diǎn)的完整性，因?yàn)锽細(xì)胞增殖的抑制是通過底物競爭及通過與底物脯氨酸在過渡狀態(tài)中的假定的結(jié)構(gòu)相似的類似物(PAC)的特異性應(yīng)用而獲得的(16)。為核實(shí)枯氏錐蟲脯氨酸消旋酶的活性位點(diǎn)的半胱氨酸殘基的潛在作用，將Cys330或者Cys160通過TcPRACA的位點(diǎn)特異性突變而用絲氨酸殘基置換。選擇絲氨酸作為取代氨基酸以避免對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步的較大干擾(見上圖5中的策略)。在通過對構(gòu)建體測序而證實(shí)單一密碼子突變之后，將C330S或C160SrTcPRACA突變體脯氨酸消旋酶在大腸桿菌中表達(dá)并以與野生型rTcPRACA相同的方式純化。然后在外消旋作用分析中使用C330S或C160SrTcPRACA以核實(shí)突變對蛋白質(zhì)酶活性的作用。從表3(及圖12)中可以看出，與野生型酶相對比觀測到脯氨酸消旋酶活性全部喪失，確定在脯氨酸外消旋作用期間質(zhì)子轉(zhuǎn)移特異性依賴于活性位點(diǎn)中半胱氨酸殘基的存在。
表3在定點(diǎn)C330SrTcPRACA中消旋酶活性的喪失
在純化后，將5μg rTcPRACA或者C330SrTcPRACA在37℃與在NaOAc緩沖液pH6.0中的40mM L-脯氨酸溫育。在不同時間測定旋光度及如實(shí)施例5所述測定外消旋作用百分比。
實(shí)施例12序列數(shù)據(jù)庫中脯氨酸消旋酶蛋白質(zhì)特征和推定的脯氨酸消旋酶寄生蟲和細(xì)菌脯氨酸消旋酶之間關(guān)鍵殘基的保守促使對TcPRAC與SWISS-PROT和TrEMBL數(shù)據(jù)庫中其它蛋白質(zhì)序列之間的相似性進(jìn)行研究。來自11種生物體的21個蛋白質(zhì)序列產(chǎn)生顯著同源，所述生物體如α亞門的幾種α-蛋白菌(proteobacteria)(農(nóng)桿菌(Agrobacterium)、布魯氏菌(Brucella)、根瘤菌(Rhizobium))和γ亞門的一些蛋白菌(黃單胞菌(Xanthomonas)和假單胞菌(Pseudomonas))，以及硬壁菌(fermicutes)(鏈霉菌(Streptomyces)和梭菌(Clostridium))。在真核生物中，除了枯氏錐蟲之外，在人和小鼠基因組中檢測到同源基因，其中預(yù)測的蛋白質(zhì)顯示與脯氨酸消旋酶的全面相似性。除了斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)和野油菜黃單胞菌(Xantomonas campestri)之外，每個其它生物體均編碼2個同種異型，根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)含有3個基因。多重排列對比還可以闡明脯氨酸消旋酶的3個特征，其在此以PROSITE形式描述。從表4中可以看出，當(dāng)使用位于第79位起始密碼子之后的脯氨酸消旋酶蛋白的最小基序(M I)，即[IVL][GD]XHXXG[ENM]XX[RD]X[VI]XXG時，本發(fā)明人獲得了9個標(biāo)的(hit)。在第218位起始的由[NSM][VA][EP][AS][FY]X(13，14)[GK]X[IVL]XXD[IV][AS][YWF]GGX[FWY]組成的第二個基序(M II)提供14個標(biāo)的；然而，本基序的前一半或后一半不足以嚴(yán)格限制推定的脯氨酸消旋酶，但提供不同的蛋白質(zhì)家族標(biāo)的。從第326-339位的第三個基序(M III)稱為DRSPXGX[GA]XXAXXA，被認(rèn)為是最小的模式。注意在第330位，活性位點(diǎn)的半胱氨酸被X置換。如表4所示，這個最小模式產(chǎn)生所有21個標(biāo)的。令人好奇地，在人體以及在小鼠中的基因均編碼基序III中第X位的蘇氨酸而不是半胱氨酸，而在布魯氏菌、根瘤菌和農(nóng)桿菌屬的菌種中均編碼在這個位置具有C的一個蛋白質(zhì)和具有T的一個蛋白質(zhì)。人們不能假定這種取代與這些推定的蛋白質(zhì)功能的關(guān)系。如果在第330位的殘基在基序III中保持是半胱氨酸，則因此從9種生物體種獲得的生物體標(biāo)的數(shù)降低至12，其可正確地認(rèn)為是真實(shí)的脯氨酸消旋酶。21個蛋白質(zhì)序列的對比和衍生的進(jìn)化樹分別示于圖6和圖7，三個框相應(yīng)于上述基序I、II和III。本發(fā)明因此顯示DRSPCGXGXXAXXA是脯氨酸消旋酶的最小特征。目前針對未完成的基因組的Blast研究從8種生物體中獲得了額外13個推測的蛋白質(zhì)序列，與脯氨酸消旋酶具有高度相似性，均含有基序III。生物體是艱難梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(C.botulinum)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、豬布魯氏菌(Brucella suis)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(B.mallei)和真菌煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。這些結(jié)果表明脯氨酸消旋酶可以是非常廣泛分布的。
表4使用PROSITE基序的SWISS-PROT和TrEMBL數(shù)據(jù)庫篩選
使用基序I-III(M I、M II和M III)篩選SWISS-PROT和TrEMBL數(shù)據(jù)庫。M I相應(yīng)于[IVL][GD]XHXXG[ENM]XX[RD]X[VI]XXG，M II相應(yīng)于[NSM][VA][EP][AS][FY]X(13，14)[GK]X[IVL]XXD[IV][AS][YWF]GGX[FWY]，M III相應(yīng)于DRSPXGXGXXAXXA，MIII*相應(yīng)于DRSPCGXGXXAXXA。Access.Nb序列的SWISS-PROT登記號；seq根據(jù)圖6的序列號；+和-使用相應(yīng)的基序分別存存或不存在標(biāo)的。
最后，表5概括了其中已經(jīng)鑒別了脯氨酸消旋酶特征及存在包括催化位點(diǎn)的關(guān)鍵的殘基Cys330和Cys160的序列的基因。
表5用TcPRACA的核苷酸或肽序列篩選的結(jié)果基序 一般序列
使用TcPRACA的核苷酸或肽序列篩選數(shù)據(jù)庫。搜索基序I-III(M I，M II和M III)。M I相應(yīng)于[IVL][GD]XHXXG[ENM]XX[RD]X[VI]XXG，M II相應(yīng)于[NSM][VA][EP][AS][FY]X(13，14)[GK]X[IVL]XXD[IV][AS][YWF]GGS[FWY]，M III相應(yīng)于DRSPXGXGXXAXXA，M III*相應(yīng)于DRSPCGXGXXAXXA。Access．NbsTIGR，EMBL或SANGER序列登記號；+和-分別存在或不存在相應(yīng)的基序。其它的是所述基序之外的極度保守區(qū)域，包括含有活性位點(diǎn)半胱氨酸之一的NMCGH。序列示于附頁中，其十活性位點(diǎn)的2個半胱氨酸殘基的保守區(qū)域以方塊表示，在表中與相應(yīng)登記號以黑體字表示。
在天然發(fā)生的條件下在不同的哺乳動物組織中可以發(fā)現(xiàn)多種游離的D-氨基酸。一些實(shí)例包括D-絲氨酸存在于哺乳動物腦、外周和生理體液中，或者D-asp也可以在內(nèi)分泌腺、睪丸、腎上腺和垂體中檢測到。D-pro和D-leu水平在一些腦部區(qū)域、松果體和垂體中也非常高。一些報(bào)道認(rèn)為D-氨基酸具有神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的關(guān)鍵作用(受體介導(dǎo)的神經(jīng)傳遞)，在D-ser的情況中也如此，或者具有激素分泌、致癌和分化調(diào)節(jié)劑作用(即D-asp)。確信在哺乳動物組織和體液中天然發(fā)生的D-氨基酸的最可能的來源是通過原位存在的游離L-對映體的直接外消旋作用而合成。然而，除了絲氨酸消旋酶基因從大鼠腦和人中克隆之外，至今在人體內(nèi)還未鑒別其它的氨基酸消旋酶。一些其它報(bào)道認(rèn)為哺乳動物組織中存在的D-氨基酸衍生自營養(yǎng)和細(xì)菌。
關(guān)于D-氨基酸的存在與病理過程相關(guān)的報(bào)道數(shù)目越來越多表明生物學(xué)樣品中D-氨基酸水平的改變具有一些診斷價值，例如患有阿爾茨海默病(Alzheimer)個體的腦中D-asp和D-Ala游離水平改變的鑒別。D-asp的數(shù)量在患有神經(jīng)病變的腦區(qū)域中似乎降低，并且相應(yīng)地D-ala增加?？偠灾c正常腦相比在阿爾茨海默病存在記憶力下降的患者腦中D-氨基酸總量增加，這提供了關(guān)于揭示新的簡便D-氨基酸檢測方法的新觀點(diǎn)。同樣，在帕金森病和精神分裂癥患者腦中D-ser濃度改變，但其它的發(fā)現(xiàn)明顯顯示患者血漿中D-氨基酸的顯著較高濃度與腎病相關(guān)或者老年人的血漿中D-氨基酸濃度較高。
先前的結(jié)果表明寄生蟲促分裂原對多克隆B細(xì)胞激活有助于導(dǎo)致寄生蟲逃避并在哺乳動物宿主中持續(xù)存在的機(jī)制。還已經(jīng)表明TcPRAC是由感染形式的寄生蟲釋放的一種強(qiáng)力的B細(xì)胞促分裂原。吡咯羧酸對TcPRAC的抑制誘導(dǎo)TcPRAC的B細(xì)胞促分裂原能力全部喪失。
也已經(jīng)顯示突變體寄生蟲對TcPRACA和TcPRACB基因的過表達(dá)能賦予這些突變體在體外對宿主細(xì)胞較好的入侵能力。這與如果這些基因通過遺傳操縱而失活則寄生蟲不能存活形成鮮明對照。另外，用亞促分裂原劑量的TcPRAC或者用適當(dāng)?shù)腡cPRAC-DNA載體疫苗制劑對小鼠進(jìn)行免疫，顯示引發(fā)對TcPRAC的高水平特異性抗體應(yīng)答及對活枯氏錐蟲的感染性攻擊的高水平的免疫保護(hù)作用。
總而言之，這些數(shù)據(jù)提示TcPRAC酶同工型是寄生蟲存活和命運(yùn)所必需的因子，并還支持寄生蟲脯氨酸消旋酶對免疫接種和化療均是一個良好靶位。事實(shí)上，將TcPRAC中和劑量吡咯羧酸加入到非感染的猴細(xì)胞培養(yǎng)物中不干擾細(xì)胞生長。此外，推測在人體中利用脯氨酸消旋酶抑制劑是可能的，因?yàn)樵陲@示與TcPRAC有一些肽同源性的一個序列中已經(jīng)觀測到不存在PRAC酶活性關(guān)鍵的兩個活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基(Cys330和Cys160)，這通過用TcPRAC基因序列blasting搜索人基因組可利用的數(shù)據(jù)而鑒別。
通過使用TcPRAC基因序列的數(shù)據(jù)進(jìn)行資料探勘(data mining)觀察到，可以在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)學(xué)感興趣的其它微生物中鑒別推定的脯氨酸消旋酶。從圖8中可以看出，M I、M II和最特別地M III嚴(yán)格基序(脯氨酸消旋酶的特征)的存在表明那些蛋白質(zhì)是功能性的脯氨酸消旋酶的可能性。一方面，可以觀測到所述酶活性必需的關(guān)鍵殘基在那些序列中展現(xiàn)，另一方面，該開放讀框(ORF)與寄生蟲PRAC的ORF高度同源。
為了搜索可用作TcPRAC或其它脯氨酸消旋酶抑制劑的推定的分子，必須研制能特異性表明脯氨酸外消旋作用被TcPRAC抑制及因此妨礙給定的脯氨酸立體異構(gòu)體產(chǎn)生的一種微量測試。例如，這可以通過分析任何潛在的抑制分子在L-脯氨酸受到TcPRAC酶活性作用的反應(yīng)中阻礙D-脯氨酸產(chǎn)生的能力而進(jìn)行。
目前，檢測D-(或L-)氨基酸的可利用的分析是非常有挑戰(zhàn)性的，并且區(qū)分L-立體異構(gòu)體與D-立體異構(gòu)體的方法是耗時的，即氣相層析、使用手性平板(chiral plate)的薄層層析、高效毛細(xì)管電泳方法、HPLC、及一些酶學(xué)方法。這些技術(shù)中有一些還需要使用柱和/或重裝置，如旋光計(jì)或熒光檢測儀。
針對用于快速篩選推定的TcPRAC抑制劑的簡便測試的研制，使用可以產(chǎn)生大量重組活性酶的TcPRAC構(gòu)建體及已知的脯氨酸消旋酶特異性抑制劑(吡咯羧酸，PAC)以產(chǎn)生一種中等/高流量的微量培養(yǎng)板(microplate)測試，其可用于簡便地篩選大量的抑制劑候選物(即100-1000個)。這種測試基于比色反應(yīng)，與旋光測定及其它耗時的測試相比確實(shí)是一種較簡便的方法。通過旋光計(jì)評價L-或D-脯氨酸對映體的偏光度以量化脯氨酸外消旋作用的抑制以測試這種分子數(shù)目增加是不可行的，敏感性較低，及與微量培養(yǎng)板測試相比需要更多量的試劑，因而另外微量培養(yǎng)板測試的價格將是可以負(fù)擔(dān)的。
因此，本發(fā)明的基礎(chǔ)是在存在或不存在已知濃度的PAC抑制劑分別作為外消旋作用的陽性和陰性對照的情況下檢測通過TcPRAC對L-脯氨酸的外消旋作用而產(chǎn)生的D-脯氨酸。為此，本發(fā)明利用另一種酶D-氨基酸氧化酶(D-AAO)，其在存在電子供體/受體的情況下具有特異性氧化D-氨基酸的能力并產(chǎn)生過氧化氫。這個策略的優(yōu)勢是過氧化氫可以在例如包含正-苯二胺的非常靈敏的反應(yīng)中通過過氧化物酶而傳統(tǒng)量化，最后提供通過在490nm比色而觀測的顯色反應(yīng)。
由于D-氨基酸氧化酶與任何“D-氨基酸”均不加選擇地反應(yīng)，而與其L-立體異構(gòu)體不反應(yīng)，因此這種測試不僅有助于鑒別脯氨酸消旋酶抑制劑，而且如果稍加修改還可用于檢測各種體液中游離D-氨基酸水平的任何改變，以診斷一些病理過程。
ID-氨基酸定量測試的基礎(chǔ)如下本發(fā)明的方法可以檢測和量化D-氨基酸。第一個反應(yīng)包括D-氨基-氧化酶。根據(jù)酶的起源，這個酶與輔基黃素-腺苷-二核苷酸(Flavin-Adenin-Dinucleotide，F(xiàn)AD)或黃素-單核苷酸(Flavin-Mononucleotide，F(xiàn)MN)，一起特異性催化D-氨基酸的氧化脫氨作用(注如果酶來自豬腎則是FAD)。
一般反應(yīng)如下進(jìn)行
在(1)中，D-氨基酸被脫氨及氧化，釋放氨和還原的輔基。如果氨基基團(tuán)不是初級基團(tuán)，則氨基基團(tuán)保持不變并且無氨釋放。
在(2)中，還原的輔基使氧還原并產(chǎn)生過氧化氫。
過氧化氫酶或過氧化物酶均可分解過氧化氫。
過氧化氫酶活性寫作
氧而過氧化物酶活性是
其中R′是任何碳鏈。
因此，過氧化氫的檢測可以使用過氧化氫酶和對氧靈敏的試劑進(jìn)行，如通過用氧使還原的亞甲藍(lán)脫色或者使用過氧化物酶使試劑的顏色改變，如下所示
II評價枯氏錐蟲消旋酶活性和這種消旋酶抑制的這種測試的應(yīng)用II-1消旋酶活性的測試枯氏錐蟲消旋酶活性將L-Pro可逆地轉(zhuǎn)變D-Pro。由于這兩種形式可誘導(dǎo)偏振光偏離，因此這種轉(zhuǎn)變可通過光學(xué)偏振光偏離而測定。但是D-形式的存在也可以使用D-氨基酸氧化酶以確定消旋酶動力學(xué)中D-脯氨酸的量。在這個測試中包含如下反應(yīng)1)脯氨酸消旋酶活性
2)D-氨基酸氧化酶
(注在脯氨酸的情況中無形成的氨，因?yàn)楦彼岬牡獏⑴c仲胺中)。
3)用過氧化物酶對過氧化氫進(jìn)行檢測
(無色) (顯色)生色試劑可例如是正苯二胺(orthophenylenediamine，OPD)，或者3，3′，5，5′四甲基聯(lián)苯胺(3，3′，5，5′tetramethyl benzidine，TMB)，或者5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid，ASA)。
這些反應(yīng)可以使用如下舉例且優(yōu)選的材料和方法進(jìn)行。
II-1-1材料
II-1-2方法II-1-2.1微量培養(yǎng)板中的外消旋作用(1)體積是指一個孔而言，但強(qiáng)制一式兩份進(jìn)行。為在進(jìn)一步的步驟中使用的標(biāo)準(zhǔn)和對照孔，剩余足夠的空的顯微培養(yǎng)板孔。每個孔反應(yīng)分配如下體積a)無抑制劑(Vol＝QS 81μl)
b)有抑制劑(Vol＝QS 81μl)對于抑制劑，濃度范圍可以計(jì)劃在5mM-1mM之間。其應(yīng)在0.2M pH 6.0乙酸鈉緩沖液中稀釋。因此，抑制劑的體積從加入的緩沖液的體積中減去以達(dá)到終體積為81μl。例如，當(dāng)使用36.5μl PAC+44.5μl緩沖液時，10mM L-脯氨酸的外消旋作用的50％抑制是用45μM吡咯羧酸(PAC，脯氨酸消旋酶的特異性抑制劑)獲得(見圖8中結(jié)果)。
表6是10mM L-脯氨酸作為底物的結(jié)果。
表6
(2)用粘性蓋子覆蓋所述微量培養(yǎng)板并在37℃放置30分鐘。
(3)在外消旋作用結(jié)束時，向微量培養(yǎng)板的每個反應(yīng)孔中加入5.5μl 0.235M Pop以將pH從pH6.0改變至pH8.3。
II-1-2.1-2形成的D-脯氨酸的量化標(biāo)準(zhǔn)和對照(1)制備標(biāo)準(zhǔn)和對照標(biāo)準(zhǔn)L-和D-脯氨酸的等摩爾混合物用作標(biāo)準(zhǔn)，范圍是0.05mM-50mM(分析中的終濃度)。其用于確定在外消旋作用后形成的D-脯氨酸的量。如下在微量試管中產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)范圍。
在試管1中，根據(jù)所述比例混和脯氨酸和緩沖液。然后在下一個試管中將500μl獲得的混合物加入500μl緩沖液中，等等。
陰性對照如下所述在另一個微量試管中制備。
L-脯氨酸(1M) 200μl緩沖液*800μl終濃度40ml空白＝緩沖液*(2)在微量培養(yǎng)板的空孔中分配(見步驟II-1-2.1)緩沖液*67μl標(biāo)準(zhǔn)稀釋液或陰性對照 20μl
注對空白僅分配87μl緩沖液*(3)如下制備含有酶(D-AAO/HRP混合物)的混合物給定的量是針對一個孔的，終體積是具有所述消旋酶產(chǎn)物或底物的100μl總體積13μl緩沖液*6.5μlD-AAO 50U/ml 1.7μlOPD(20mg/ml) 2.5μlHRP 5000U/ml 0.75μlFAD 10-3M(4.5μl 10-1M+446μl緩沖液) 1.5μl將這個混合物在冰上保持直至使用。
(4)當(dāng)將13μl D-AAO/HRP混合物加入反應(yīng)孔中時開始量化反應(yīng)。
(5)將微量培養(yǎng)板用粘性蓋子覆蓋并將其在37℃置于黑暗中30分鐘-2小時。反應(yīng)可以隨時通過目測檢測，只要顏色梯度符合標(biāo)準(zhǔn)稀釋的D-氨基酸濃度。
(6)使用490nm濾片用微量培養(yǎng)板分光光度計(jì)讀數(shù)該微量培養(yǎng)板。
實(shí)施例13D-AOO微量培養(yǎng)板測試與通過旋光計(jì)檢測D-氨基酸相比更靈敏為了對比通過旋光計(jì)和通過D-氨基-氧化酶/HRP對D-脯氨酸的量化，使用不同濃度的L-脯氨酸和不同濃度的PAC(脯氨酸消旋酶的特異性抑制劑)在這兩個測試之間進(jìn)行對比。圖8顯示使用D-AAO(D-AAO/L-)微量測試與常規(guī)旋光計(jì)檢測(Pol/L-)相對比，不同濃度(10-40mM)的L-脯氨酸的外消旋作用的抑制百分比使用旋光計(jì)，似乎三種濃度的L-脯氨酸對TcPRAC的PAC抑制無差異。因此，使用1mM PAC獲得50％抑制，無論使用10mM還是40mM L-脯氨酸。相反，當(dāng)使用D-AAO/HRP測試時可以看出PAC抑制在低濃度(例如10mM)比在高濃度(20mM或40mM)L-脯氨酸情況下略微更高。因此，50％抑制在如下情況中獲得-當(dāng)使用10mM L-脯氨酸時用50μM PAC，-當(dāng)使用20mM L-脯氨酸時用170μM PAC，-當(dāng)使用40mM L-脯氨酸時用220μM PAC。
總而言之，D-AAO/HRP評估是更靈敏的，因?yàn)槠淇梢栽诒刃庥?jì)評估更低的濃度區(qū)別PAC抑制。另外，在邏輯上抑制與L-脯氨酸濃度成反比，這可以用D-AAO/HRP方法確定，而不是用旋光計(jì)測定方法確定。這種測試用于在中等/高流量測試中篩選新的TcPRAC抑制劑。
進(jìn)行上述測試及選擇適當(dāng)?shù)囊种苿┑囊环N優(yōu)選的技術(shù)平臺含有至少如下產(chǎn)品L-脯氨酸，D-脯氨酸，脯氨酸消旋酶過氧化物酶，過氧化物酶的底物D-氨基酸氧化酶及任選地，一組潛在的抑制分子實(shí)施例14L-脯氨酸抑制D-氨基-氧化酶活性圖9顯示單獨(dú)使用D-脯氨酸或者使用D-和L-脯氨酸的等摩爾混合物作為標(biāo)準(zhǔn)，D-AAO/HRP反應(yīng)的對比?？梢钥闯霎?dāng)使用L-和D-脯氨酸的混合物與單獨(dú)使用D-脯氨酸進(jìn)行對比時，獲得給定光密度需要的D-脯氨酸量較高。因?yàn)楫?dāng)L-和D-脯氨酸等量時，脯氨酸消旋酶活性終止，這對使用脯氨酸的兩種對映體的等摩爾混合物作為D-脯氨酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)也是適當(dāng)?shù)摹?br> 實(shí)施例15PAC不干擾DAAO/HRP活性圖10顯示在如下條件下作為D-脯氨酸濃度的函數(shù)的490nm光密度。
在μl孔中的條件[D-脯氨酸]0.1mM-40mM[D-AAO] 0.89U/ml[HRP] 37.5U/ml[OPD] 0.5U/ml[FAD] 1.5×10-5M緩沖液*PAC的存在不影響DAAO/HRP反應(yīng)。
實(shí)施例16使用D-AAO微量培養(yǎng)板測試的中/高流量測試表VII顯示了使用D-AAO微量培養(yǎng)板測試的中等/高流量測試的實(shí)例。
藍(lán)色D-脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)(第1列)綠色使用avec 10mM底物的外消旋作用陽性對照(第2列，A和B行)橙色使用10mM底物通過PAC對外消旋反應(yīng)的抑制對照(第2列，C和D行)空白1含有消旋酶的混和物(第2列，E行)空白2不含消旋酶的混和物(第2列，F(xiàn)行)黃色特異性陰性對照(無消旋酶+40mM L-脯氨酸)(第2列，G和H行)其它孔具有抑制劑(T1，T2，T3，…T40)一式兩份。
表VII1
實(shí)施例17這種測試在通常檢測樣品中D-氨基酸中的應(yīng)用基于D-氨基酸氧化酶與過氧化物酶如辣根過氧化物酶的微量培養(yǎng)板測試可以用于檢測并量化任何生物學(xué)或化學(xué)樣品中的任何D-氨基酸。例如，由于D-氨基酸參與一些病理過程或神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病、帕金森病或腎病，因此對其的檢測可以是這些病變的診斷及預(yù)后的重要標(biāo)記或參數(shù)。這個技術(shù)也可以擴(kuò)展為檢測和量化真核生物體如植物或真菌及在細(xì)菌中的D-氨基酸。
上述D-AAO/HRP測試略加修改也可以用于此目的。為此，應(yīng)跳過消旋酶反應(yīng)步驟，微量培養(yǎng)板測試應(yīng)直接在上述II-1-2.1-2步驟開始，備注如下1)標(biāo)準(zhǔn)其不應(yīng)是D-和L-氨基酸的等摩爾混合物，而是D-氨基酸的系列稀釋液。根據(jù)研究中的感興趣的D-氨基酸選擇氨基酸?？字薪K體積應(yīng)為87μl。
2)陰性對照其是用研究的D-氨基酸的L-對映體制成。終體積應(yīng)為87μl。
3)空白其用87μl緩沖液*制成(見段落II.1.1材料)。
4)樣品測試的樣品應(yīng)用緩沖液*調(diào)節(jié)為pH8.3，其終體積應(yīng)為87μl/孔。
注標(biāo)準(zhǔn)、陰性對照、測試樣品和空白應(yīng)制成一式兩份。將它們分配至微量培養(yǎng)板的孔中。
5)然后，如上述進(jìn)行步驟3)-6)。
一些D-氨基酸及其L-對映體已經(jīng)使用上述微量培養(yǎng)板測試。表VIII和表IX顯示了酪氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、賴氨酸和色氨酸的D-形式確實(shí)是D-AAO/HRP的底物并通過如對于D-脯氨酸所述同樣測試檢測。結(jié)果還顯示通過這種方法學(xué)未檢測到L-氨基酸。
表VIII
在D-AAO反應(yīng)后獲得的490nm處的光密度(原始OD數(shù)據(jù))表IX
微量培養(yǎng)板的模板，其中制成D-脯氨酸(mM)的系列稀釋液作為D-AAO反應(yīng)的陽性對照。顯示了含有緩沖液*的空白孔。測試了不同的L-和D-氨基酸，即酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蘇氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)和色氨酸(Try)。為突出D-AAO微量測試的靈敏性，在反應(yīng)中使用與用于D-對映體的濃度(6.25mM)相比較高濃度的L-對映體(12.5mM)。
圖11是用D-脯氨酸的系列稀釋液作為陽性反應(yīng)對照獲得的圖表。注孔(-)的OD得自空白孔的平均OD。
一種搜索并量化樣品中D-氨基酸存在的優(yōu)選平臺，其含有至少如下的產(chǎn)品D-氨基酸，過氧化物酶和過氧化物酶底物D-氨基酸氧化酶及任選地L-氨基酸對映體作為對照。
最后，本發(fā)明涉及一種篩選可調(diào)節(jié)消旋酶活性的分子的方法，其中所述方法包括(A)在存在L-氨基酸和D-氨基酸的等摩爾混合物及待被調(diào)節(jié)的消旋酶的情況下，利用被測試的分子調(diào)節(jié)消旋酶活性；(B)利用輔基中的D-氨基酸氧化酶對在步驟(A)中產(chǎn)生的D-氨基酸進(jìn)行氧化脫氨；(C)檢測通過氧化脫氨產(chǎn)生的過氧化氫；其中過氧化氫的調(diào)節(jié)表示測試的分子調(diào)節(jié)消旋酶活性的能力。優(yōu)選地，所述分子抑制消旋酶活性，更優(yōu)選地，所述消旋酶是脯氨酸消旋酶，例如枯氏錐蟲脯氨酸消旋酶。通過這種方法鑒別的分子也是本發(fā)明的一部分。
另外，本發(fā)明涉及進(jìn)行本發(fā)明方法必需的技術(shù)平臺及所有試劑和裝置。所述技術(shù)平臺包含a)L-氨基酸、D-氨基酸和消旋酶；
b)過氧化物酶和過氧化物酶底物，或者過氧化氫酶和一種對氧敏感的試劑；c)D-氨基酸氧化酶；及d)任選地，就抑制所述消旋酶的活性而被篩選的一或多種分子。
優(yōu)選地，所述消旋酶是脯氨酸消旋酶，L-氨基酸和D-氨基酸分別是L-脯氨酸和D-脯氨酸。
一種分子抑制脯氨酸消旋酶，其含有選自SEQ ID NO1、2、3或4的亞序列。
實(shí)施例18脯氨酸消旋酶的特征DRSPCGXGXXAXXA在此定義為基序III*的脯氨酸消旋酶的特征DRSPCGXGXXAXXA含有在上述序列中也觀測到的殘基Cys330。不同的序列和重疊群也含有NMCGH基序，相應(yīng)于TcPRAC的殘基Cys160周圍的序列，已表明其對酶活性是重要的。下面描述了一些實(shí)例。與脯氨酸消旋酶活性的關(guān)鍵Cys殘基相關(guān)的序列框在方塊內(nèi)。
方框顯示的是NMCGH(Cys160)殘基和DRSPCGTGTSAKMA(基序III，含有Cys330的特征)殘基1-Bacillus anthracis＞gnl|TIGR_1392|banth_4742 Bacillus anthracis unfinished fragment of complete genomeLength＝11981Score＝14l bits(302)，Expect(3)＝4e-69Identities＝60/146(41％)，Positives＝91/146(62％)Frame＝+1/-3Query763 GEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHIN 942G V DIA+GGNF+AI+ A+ +G+++ ++ S + ++R IN ++ HP+ ISbjct8379 GTVEADIAYGGNFYAIIDAKSVGLELVPEHASTIIDKAIHIRNIINERFEIIHPEYSFIR 8200
Query1123 SILGSLFQGRVLGEERIPGVKVPVTK 1200SI+GSLF+G V++ ++ VTKSbjct8019 SIVGSLFKGCVINTTNVANMEAVVTK 7942Score＝137 bits (294)，Expect(3)＝4e-69Identities＝54/117(46％)，Positives＝79/117(67％)Frame＝+1/-3Querv262 MRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHD 44lMR +K FT ID HT G R + SGLP + G MAEK ++++ D++R+ +M EPRGHDSbjct8859 MRTQKVFTTIDTHTGGNPTRTLISGLPKLLGETMAEKMLHMKKEYDWIRKLLMNEPRGHD 8680 ＞gnl|TIGR_1392|banth_4799 Bacillus anthracis unfinished fragment of complete genomeLength＝22506Score＝125 bits(267)，Expect(4)＝4e-68Identities＝56/145(38％)，Positives＝86/145(59％)Frame＝+1/-3Query766 EVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHINT 945E +VDIAFGG F+A+V +++ G+ + ++LS +Q+ G ++ I ++V+HP+Sbjct5188 EFQVDIAFGGAFYAVVDSKEFGLKVDFKDLSAIQQWGGKIKHYIESKMEVKHPLEEGLKG 5009
Query1126 ILGSLFQGRVLGEERIPGVKVPVTK 1200IF+G VL+ + V KSbjet4828 ITDGEFEGEVLSVTAVHTYEAVVPK 4754Score＝124 bits(266)，Expect(4)＝4e-68Identities＝48/113(42％)，Positives＝65/113(57％)Frame＝+1/-3Query262 MRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHD 441M+ K +T ID H GE RI+T G+P I GE++ Y E++DYLR +M EPRGHSbjct5662 MKVSKVYTTIDAHVAGEPLRIITGGVPEIKGETQLERRWYCMEHLDYLREVLMYEPRGHH 5483 M+G + PAD G++FM G+ MCGH IA +T +ETG+ KSbjct5482 GMYGCIITPPASAHADFGVLFMHNEGWSTMCGHGIIAVITVGIETGMFETKQK 53242-Clostridium botulinum＞gnl|SANGER_36826|cbotul_Contig173 clostridium botulinum A unfinished fragment of completegenomeLength＝97750Score＝178 bits(383)，Expect(4)＝3e-98Identities＝70/138(50％)，Positives＝102/138(73％)Frame＝+1/-2Query760 YGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHI 939YG++ +DI+FGG+FFA+V AE++GIDIS N +L + G + +N V+++HP L HISbjct70443 YGKLTLDISFGGSFFAMVDAEKVGIDISPANSQKLNDLGMKIVHAVNEQVEIKHPVLEHI 70264 Query1120 ESILGSLFQGRVLGEERI 1173ESI+ + F+G++L E ++Sbjct70083 ESIICTKFKGKILEETKV 70030Score＝166 bits(357)，Expect(4)＝3e-98Identities＝70/118(59％)，Positives＝81/118(68％)Frame＝+1/-2
Query259 IMRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGH 438IMR K+ I+ HT GE RIV GLP +PG MAEK YL+EN D LR +M EPRGHSbjct70926 IMRAIKTIQTIESHTMGEPTRIVIGGLPKVPGKTMAEKMEYLEENNDSLRTMLMSEPRGH 70747 ＞SANGER Cbot12g05.q1cScore＝584(210.6bits)，Expect＝7.7e-57，P＝7.7e-57Identities＝115/224(51％)，Positives＝156/224(69％)，F(xiàn)rame＝-2 Query135 QSGTESEVSNASIINVPSFLYQQDVVIVLPKPYGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEHLGIDIS 194+ G E S I+NVP+FLY++DV I +P YG++ +DI+FGG+FFA+V AE +GIDISSbjct480 EDGKAKETS---IVNVPAFLYKKDVEIDVPD-YGKLTLDISFGGSFFAMVDAEKVGIDIS 313Query195 VQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHINTVDCVEIYGNATNPEAKYKNVVIFGNR 254N +L + G + +N V+++HP L HI TVD E YG A + +A +NVV+FGSbjct312 PANSQKLNDLGMKIVHAVNEQVEIKHPVLEHIKTVDLCEFYGPAKSEDADVQNVVVFGQG 133 3-Aspergillus fumigatus＞gnl|TIGR_5085|afumi_1044 Aspergillus fumigatus unfinished fragment of complete genomeLength＝7621Score＝46.0bits(94)，Expect(4)＝3e-16Identities＝21/72(29％)，Positives＝34/72(47％)Frame＝+1/+2 Query1153 VLGEERIPGVKV 1188E + V +
Sbjct6407 AFSAEIVEEVTI 6442Score＝40.9bits(83)，Expect(4)＝3e-16Identities＝13/34(38％)，Positives＝26/34(76％)Frame＝+1/+2Query361 MAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMFGAFL 462+ E++ +++ D++R+ +MLEPRGH+ M+GA +Sbjct5513 LLEQRDQAKQHHDHIRKCLMLEPRGHNGMYGAII 5614Score＝40.0bits(81)，Expect(4)＝3e-16Identities＝14/29(48％)，Positives＝20/29(68％)Frame＝+1/+2Query286 CIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEK 372CIDMHT GE RI+ SG P + G+ + ++Sbjct5441 CIDMHTTGEPTRIIYSGFPPLSGTLLEQR 5527Score＝32.2bits(64)，Expect(4)＝3e-16Identities＝12/27(44％)，Positives＝20/27(74％)Frame＝+1/+2Query775 VDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNL 855+DI++GG F+AIV A+LG +++LSbjct5996 LDISYGGAFYAIVQASELGFSGGLRDL 6076Score＝25.8bits(50)，Expect(4)＝5e-04Identities＝12/21(57％)，Positives＝13/21(61％)Frame＝-2/-2Query479 SSIGSNKKAPNISS*PRGSSI 417SS+ AP I *PRGSSISbjct5631 SSVSGRMMAPYIPL*PRGSSI 55694-Clostridium difficile＞gnl|Sanger_1496|cdifficile_1080 Clostridium difficile unfinished fragment of complete genomeLength＝204145Score＝209bits(451)，Expect(4)＝e-109Identities＝86/146(58％)，Positives＝107/146(73％)Frame＝+1/-2
Query763 GEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHIN 942G V+ DI+FGG+FFAI+ A QLG+ I QN +L ELR IN +++QHP L HISbjct88224 GTVKFDISFGGSFFAIIHASQLGLKIEPQNAGKLTELAMKLRDIINEKIEIQHPTLAHIK 88045 Query1123 SILGSLFQGRVLGEERIPGVKVPVTK 1200SILG+LF+G ++ E ++ V KSbjct87864 SILGTLFKGEIVEETKVADFNAVVPK 87787Score＝173bits(373)，Expect(4)＝e-109Identities＝68/117(58％)，Positives＝86/117(73％)Frame＝+1/-2Query262 MRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHD 441M+F +S ID HT GEA RIV G+P+I G++M EKK YL+EN+DYLR IMLEPRGH+Sbjct88707 MKFSRSIQAIDSHTAGEATRIVVGGIPNIKGNSMPEKKEYLEENLDYLRTAIMLEPRGHN 88528 5-Brucella suis＞gnl|TIGR_29461|bsuis_1327 Brucella suis unfinished fragment of complete genomeLength＝69104Score＝150bits(323)，Expect(5)＝3e-73Identities＝62/139(44％)，Positives＝92/139(66％)Frame＝+1/-2Query763 GEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHIN 942G ++VD+A+GGNF+AIV ++ D+ + +L +LR +N K QHP+LP INSbjct24931 GPIKVDVAYGGNFYAIVEPQENYTDMDDYSALQLIAWSPVLRQRLNEKYKFQHPELPDIN 24752 Query1123 SILGSLFQGRVLGEERIPG 1179SI+GSLF GRV + GSbjct24571 SIIGSLFHGRVERAAEVAG 24515
Score＝122bits(262)，Expect(5)＝3e-73Identities＝47/106(44％)，Positives＝68/106(64％)Frame＝+1/-2Query271 KKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMF 450+ SF C+D HT G R+V G P++ GS M EK+A+ D++R G+M EPRGHD MSbjct25402 RHSFFCVDGHTCGNPVRLVAGGGPNLNGSTMMEKRAHFLAEYDWIRTGLMFEPRGHDMMS 25223 6-Rhodobacter sphaeroides＞gnl|UTHSC_1063|rsphaer_X8758Contig3 Length＝2326Score＝124bits(265)，Expect(5)＝8e-41Identities＝50/109(45％)，Positives＝70/109(64％)Frame＝+1/+2Query262 MRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHD 441MR + + I HTEGE I+ SG+P+ GS + EK+A+L+EN D+LR+ +M EPRGHSbjct1448 MRVQDVYNVIYTHTEGEPLCIIYSGVPYPAGSTILEKRAFLEENYDWLRKALMREPRGHA 1627 Score＝65.2bits(136)，Expect＝4e-09Identities＝38/95(40％)，Positives＝51/95(53％)Frame＝-2/-2Score＝34.1bits(68)，Expect(5)＝8e-41Identities＝18/47(38％)，PositiveS＝23/47(48％)Frame＝+1/+2 7-Burkholderia pseudomallei＞gnl|Sanger_28450|bpsmalle_Contig394 Burkholderia pseudomallei unfinished fragment of completegenomeLength＝3107Score＝105bits(224)，Expect(3)＝1e-33Identities＝47/118(39％)，Positives＝59/118(50％)Frame＝+1/+1Query265 RFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDD 444R KID HT GE R+V SG P + G MAE+ A LD R +LEPRG DSbjct1033 RDMKHIHIIDSHTGGEPTRVVVSGFPALGGGTMAERLAVLAREHDRYRAACILEPRGSDV 1212 Score＝61.5bits(128)，Expect(3)＝1e-33Identities＝27/63(42％)，Positives＝38/63(60％)Frame＝+1/+1 Query1159 GEE 1167ESbjct1861 AAE 18698-Burkholderia mallei＞gnl|TIGR_13373|bmallei_191 Burkholderia mallei unfinished fragment of complete genomeLength＝4017Score＝105bits(224)，Expect(3)＝4e-33Identities＝47/118(39％)，Positives＝59/118(50％)Frame＝+1/-1Query265 RFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDD 444R KID HT GE R+V SG P + G MAE+ A LD R +LEPRG DSbjct2601 RDMKHIHIIDSHTGGEPTRVVVSGFPALGGGTMAERLAVLAREHDRYRAACILEPRGSDV 2422
Score＝60.6bits(126)，Expect(3)＝4e-33Identities＝27/63(42％)，Positives＝38/63(60％)Frame＝+1/-1 Query1159 GEE 1167ESbjct1773 AAE 17659-Pseudomonas putida＞gnl|TIGR|pputida_13538 Pseudomonas putida KT2440 unfinished fragment of complete genomeLength＝6184039Score＝108bits(230)，Expect(2)＝1e-32Identities＝45/115(39％)，Positives＝64/115(55％)Frame＝+1/-2Query274KSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMFG 453KID HT GE R+V G P + G +MAE++ L+E D RR +LEPRG+D + GSbjct909066 KQIHVIDSHTGGEPTRLVMKGFPQLRGRSMAEQRDELRELHDRWRRACLLEPRGNDVLVG 908887 Score＝71.2bits(149)，Expect(2)＝1e-32Identities＝31/58(53％)，Positives＝40/58(68％)Frame＝+1/-2 10-Leishmania majorSANGERLM16_BIN_Contig2054L.major Friedlin contig not yet a...2.5e-31 3LM16W5b02.qlc2.3e-19 1LM16B3d03.plc3.1e-05 3
＞LM16_BIN_Contig2054 L.major Friedlin contig not yet assigned to chromosomefrom LM16bin，unfinished whole chromosome shotgun data sequencedby the Wellcome Trust Sanger Institute，Contig number Contig2054，length 873bpLength＝873Score＝242(90.2bits)，Expect＝2.5e-31，Sum P(3)＝2.5e-31Identities＝61/180(33％)，Positives＝91/180(50％)，F(xiàn)rame＝+2[HSP Sequence]Query93 SGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMFGAFLFDPIEEGADLGIVFMD 152+G P + G +A+K L+ D RR +LEPRG+D + GAP+ A G++F +Sbjct2 TGFPELAGETIADKLDNLRTQHDQWRRACLLEPRGNDVLVGALYCAPVSADATCGVIFFN 181 Query213 NASIINVPSFLYQQDVVVVLPKPYGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQE 272++ NVP++ Y+Q V V +P +G V DIA+GGN+F +V G + + N+ L +Sbjct329 --TLRNVPAYRYRQQVPVDVPG-HGRVYGDIAWGGNWFFLVSDH--GQALQMDNVEALTD 493Score＝91(37.1bits)，Expect＝2.5e-31，Sum P(3)＝2.5e-31Identities＝24/69(34％)，Positives＝34/69(49％)，F(xiàn)rame＝+3[HSP Seauence] Query367 VLGE-ERIP 374E +R+PSbjct759 YQWECKRVP 785Score＝48(22.0bits)，Expect＝2.5e-31，Sum P(3)＝2.5e-31Identities＝11/28(39％)，Positives＝16/28(57％)，F(xiàn)rame＝+3[HSP Seauence]Query391 VTAEITGKAFIMGFNTMLFDPTDPFKNG 418V IT +A++ +T+L D DPF GSbjct780 VPPSITRRAYMTADSTLLID*QDPFAWG 863
＞LM16W5b02.qlcScore＝245(91.3bits)，Expect＝2.3e-19，P＝2.3e-19Identities＝62/182(34％)，Positives＝92/182(50％)，F(xiàn)rame＝+1[HSP Seouence]Query91 VTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMFGAFLFDPIEEGADLGIVF 150V +G P + G +A+K L+ D RR +LEPRG+D + GAP+ A G++FSbjct1 VMTGFPELAGETIADKLDNLRTQHDQWRRACLLEPRGNDVLVGALYCAPVSADATCGVIF 180 Query211 VSNASIINVPSFLYQQDVVVVLPKPYGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRL 270++ NVP++ Y+Q V V +P +G V DIA+GGN+F +V G + + N+ LSbjct334 ----TLRNVPAYRYRQQVPVDVPG-HGRVYGDIAWGGNWFFLVSDH--GQALQMDNVEAL 492Query271 QE 272+Sbjct493 TD 49811.Trypanosoma bruceiSANGER＞tryp_IXb-28b06.qlcScore＝305(112.4bits)，Expect＝5.4e-27，P＝5.4e-27Identities＝61/142(42％)，Positives＝84/142(59％)，F(xiàn)rame＝-2[HSP Sequence]Query20 RIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMFGAFLFDPIEEGADLGI 79RI+T G+P I GE++AY E++DYLR +M EPRGH M+G + PAD G+Sbjct421 RIITGGVPEIKGETQLERRAYCMEHLDYLREILMYEPRGHHGMYGCIITPPASAHADFGV 242 Query140 SEVSNASIINVPSFLYQQDVVI 161SEV + S NVPSF+Y++DV ISbjct76 SEVESVSFENVPSFVYKKDVPI 11＞tryp_IXb-28b06.plc[Full Sequence]Score＝296(109.3bits)，Expect＝4.8e-26，P＝4.8e-26
Identities＝59/140(42％)，Positives＝82/140(58％)，F(xiàn)rame＝+1[HSP Sequence]Query22 VTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPRGHDDMFGAFLFDPIEEGADLGIVF 81+T G+P I GE++AY E++DYLR +M EPRGH M+G + PAD G++FSbjct10 ITGGVPEIKGETQLERRAYCMEHLDYLREILMYEPRGHHGMYGCIITPPASAHADFGVLF 189 Query142 VSNASIINVPSFLYQQDVVI 161V + S NVPSF+Y++DV ISbjct355 VESVSFENVPSFVYKKDVPI 41412.Trypanosoma congolenseSANGER＞congo208e06.plkw[Full Sequence]Length＝478Plus Strand HSPsScore＝104(41.7bits)，Expect＝0.00070，P＝0.00070Identities＝31/103(30％)，Positives＝56/103(54％)，F(xiàn)rame＝+3[HSP Sequence]Query187 FGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHINTVDCVEIY 246+GGN+F +V G ++ + N+ L + + +N +++ Q + +D +E++Sbjct54 WGGNWFFLVSDH--GHELQMDNVEALTDYTWAM---LN-ALEAQGIRGADGALIDHIELF 215 SANGER＞congo208e06.plk[Full Sequence]Lenghh＝164Plus Strand HSPsScore＝78(32.5bits)，Expect＝0.085，P＝0.082Identities＝19/55(34％)，Positives＝34/55(61％)，F(xiàn)rame＝+3[HSP Sequence]Query160 NVPSFLYQQDVVVVLPKPYGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQE 214
+VP++ Y++ V V +P +G V DIA+GGN+F +V G ++ + N+ L +Sbjct3 HVPAYRYRKQVPVEVPG-HGVVLGDIAWGGNWFFLVSDH--GHELQMDNVEALTD 15813.Trypanosoma vivaxSANGER＞Tviv655d02.plk 4405bp，11 reads，51.90 AT[Full Sequence]Length＝4405Plus Strand HSPsScore＝403(146.9bits)，Expect＝4.3e-37，P＝4.3e-37Identities＝77/117(65％)，Positives＝91/117(77％)，F(xiàn)rame＝+1[HSP Sequence]Query174 LPKPYGEVRVDIAFGGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQ 233LP PYG+ V I+FGG+FFA++ A QL + + +LS LQ G LLR +NR+V VQHPQSbjct34 LPHPYGKYAV-ISFGGSFFALIDAAQLQLTVDKGHLSTLQHVGGLLRDTLNRNVSVQHPQ 210 SANGER＞Tviv380d6.plkScore＝156bits(395)，Expect＝1e-36Identities＝70/106(66％)，Positives＝88/106(82％)IQuery67 REIMRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEPR 126R +M+F + TCIDMHT GE ARIVTSG P+IPG+++ EK+ +LQ +MD++RR +MLEPRSbjct41 RVVMQFTGTMTCIDMHTAGEPARIVTSGFPNIPGASLVEKRDHLQRHMDHIRRRVMLEPR 100 14.Vibrio parahaemolyticus＞EM_PROAP005077 AP005077.1 Vibrio parahaemolyticus DNA，chromosome 1，completesequence，5/11.
Length＝299，130Minus Strand HSPs
Score＝616(221.9bits)，Expect＝6.2e-57，P＝6.2e-57Identities＝134/357(37％)，Positives＝207/357(57％)，F(xiàn)rame＝-2IQuery66 KREIMRFKKSFTCIDMHTEGEAARIVTSGLPHIPGSNMAEKKAYLQENMDYLRRGIMLEP 125K MR + +F CID HT G R+V G+P + G+ M+EK+ Y E+ D++R+ +M EPSbjct210923 KERKMR-QGTFFCIDAHTCGNPVRLVAGGVPPLEGNTMSEKRQYFLEHYDWIRQALMFEP 210747 Query186VPVVLDTPAGLVRGTAHLQSGTESEVSNASIINVPSFLYQQDVVVVLPKPYGEVRVDIAF 245+ +LD PAG +H Q+ + +V++ I NVP++L QDV V + + GE+ VD+A+Sbjct210569 L--ILDVPAGQIE--VHYQTKGD-KVTSVKIFNVPAYLAHQDVTVEI-EGLGEITVDVAY 210408Query246GGNFFAIVPAEQLGIDISVQNLSRLQEAGELLRTEINRSVKVQHPQLPHINTVDCVEIYG 305GGN++ IV +++ + + +RT ++++V+ HP P + V V GSbjct210407 GGNYYVIVDPQENYAGLEHYSPDEILMLSPKVRTAVSKAVECIHPNDPTVCGVSHVLWTG 210228 Query366RyLGEERIPGVKVPVTKDAEEGMLVVTAEITGKAFIMGFNTMLFDPTDPFKNGFTLK 422R+ G +T+G + I G A + G NT+ D DP+ GF +KSbjct210047 RIEG----------ITE--VNGQTAILPSIEGWAQVYGHNTIWVDDEDPYAYGFEVK 209913
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權(quán)利要求
1.一種純化的核酸分子，其編碼由選自SEQ ID NO1、2、3、或4的基序組成的肽。
2.一種純化的核酸分子，其在中等嚴(yán)格條件下與包含權(quán)利要求1的核酸分子的變性雙鏈DNA的任一鏈雜交。
3.一種重組載體，其指導(dǎo)選自由權(quán)利要求1或2的純化的核酸分子組成的一組的一種核酸分子的表達(dá)。
4.一種純化的多肽，其由選自由權(quán)利要求1或2的純化的核酸分子組成一組的一種核酸分子編碼。
5.一種由基序I(SEQ ID NO1)組成的純化的多肽。
6.一種由基序II(SEQ ID NO2)組成的純化的多肽。
7.一種由基序III(SEQ ID NO3)組成的純化的多肽。
8.一種由基序III*(SEQ ID NO4)組成的純化的多肽。
9.與權(quán)利要求4的多肽結(jié)合的純化的抗體。
10.權(quán)利要求9的純化的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
11.與權(quán)利要求5的多肽結(jié)合的純化的抗體。
12.權(quán)利要求11的純化的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
13.與權(quán)利要求6的多肽結(jié)合的純化的抗體。
14.權(quán)利要求13的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
15.與權(quán)利要求7的多肽結(jié)合的純化的抗體。
16.權(quán)利要求15的純化的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
17.與權(quán)利要求8的多肽結(jié)合的純化的抗體。
18.權(quán)利要求17的純化的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
19.由權(quán)利要求3的重組載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
20.一種生產(chǎn)由SEQ ID NO1、2、3或4組成的多肽的方法，包括在促進(jìn)表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，并從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所述多肽。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞、寄生蟲細(xì)胞及真核細(xì)胞。
22.一種免疫復(fù)合物，其包含權(quán)利要求4的多肽和特異性識別所述多肽的抗體。
23.一種檢測由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亞序列的核苷酸序列編碼的消旋酶的方法，所述方法包括(a)將所述核苷酸序列與一種與權(quán)利要求1的核酸分子雜交的引物或探針接觸；(b)使用所述引物或所述探針擴(kuò)增所述核苷酸序列；(c)檢測在所述引物或探針與所述核苷酸序列之間形成的雜交復(fù)合物。
24.一種檢測由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亞序列的核苷酸序列編碼的消旋酶的方法，所述方法包括(a)將由所述核苷酸序列編碼的產(chǎn)物消旋酶與權(quán)利要求9-18任一項(xiàng)的抗體接觸；(b)檢測所得免疫復(fù)合物。
25.一種檢測由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亞序列的核苷酸序列編碼的消旋酶的試劑盒，所述試劑盒包含(a)一種多核苷酸引物或探針，其與權(quán)利要求1的多核苷酸序列雜交；(b)進(jìn)行核酸雜交反應(yīng)的試劑。
26.一種檢測由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亞序列的核苷酸序列編碼的消旋酶的試劑盒，所述試劑盒包含(a)權(quán)利要求9或10任一項(xiàng)的純化的抗體；(b)純化形式的標(biāo)準(zhǔn)試劑；(c)檢測試劑。
27.一種篩選能抑制由含有編碼選自SEQ ID NO1、2、3或4的肽的亞序列的核苷酸序列編碼的消旋酶的活性分子的體外方法，所述方法包括(a)將所述活性分子與所述消旋酶接觸；(b)測試各種濃度的所述活性分子抑制消旋酶活性的能力；(c)選擇對消旋酶的活性有至少80％抑制作用的所述活性分子。
28.一種免疫組合物，其含有能在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的權(quán)利要求4的至少一種純化的多肽，及一種藥物學(xué)載體。
29.一種檢測D-氨基酸的方法，其中所述方法包括(A)提供含有D-氨基酸的反應(yīng)介質(zhì)；(B)將該D-氨基酸與具有輔基的D-氨基氧化酶反應(yīng)以通過對具有伯胺的D-氨基酸的氧化脫氨或者對具有仲胺的D-氨基酸的氧化而形成還原的輔基；(C)將還原的輔基與氧反應(yīng)形成過氧化氫；(D)檢測由此形成的過氧化氫。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述輔基是黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或者黃素單核苷酸(FMN)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述過氧化氫通過與過氧化氫酶反應(yīng)而被檢測。
32.權(quán)利要求29的方法，其中D-氨基酸是D-脯氨酸、D-酪氨酸、D-纈氨酸、D-蘇氨酸、D-谷氨酸、D-賴氨酸或D-色氨酸。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述過氧化氫通過與過氧化物酶反應(yīng)而被檢測。
34.權(quán)利要求29-33任一項(xiàng)的方法，包括在過氧化氫形成后確定反應(yīng)介質(zhì)中的D-氨基酸的量。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述反應(yīng)介質(zhì)包含來自患有阿爾茨海默病、帕金森病、腎病或精神分裂癥患者的生物學(xué)樣品。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述生物學(xué)樣品包含患者的體液或組織樣品。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述生物學(xué)樣品包含患者的細(xì)胞。
38.一種檢測反應(yīng)介質(zhì)中的消旋酶活性的方法，其中所述方法包括(A)提供含有特異于所檢測的消旋酶的D-氨基酸的反應(yīng)介質(zhì)；(B)將D-氨基酸與具有輔基的D-氨基氧化酶反應(yīng)以通過D-氨基酸的氧化而形成還原的輔基；(C)將還原的輔基與氧反應(yīng)以形成過氧化氫；和(D)檢測由此形成的過氧化氫，其中檢測到過氧化氫表示反應(yīng)介質(zhì)中有消旋酶活性。
39.權(quán)利要求38的方法，其中過氧化氫通過與過氧化氫酶反應(yīng)而被檢測。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述過氧化氫用生色試劑檢測。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述生色試劑是正苯丙氨酸二胺(OPD)、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或者5-氨基水楊酸(ASA)。
42.一種篩選TcPRAC抑制劑的試劑盒，其中該試劑盒包含(A)L-脯氨酸、D-脯氨酸和脯氨酸消旋酶；(B)一種過氧化物酶和過氧化物酶的底物，或者一種過氧化氫酶和一種對氧敏感的試劑；(C)一種D-氨基酸氧化酶；和(D)任選地，針對TcPRAC抑制活性而待篩選的一或多種分子。
43.一種檢測樣品中D-氨基酸的試劑盒，其中所述試劑盒包含(A)一種D-氨基酸；(B)一種過氧化物酶和過氧化物酶的底物；(C)一種D-氨基酸氧化酶；和(D)任選地，作為對照的L-氨基酸對映異構(gòu)體。
44.一種檢測樣品中D-氨基酸的方法，其中所述方法包括(A)通過與輔基中的D-氨基酸氧化酶反應(yīng)而使D-氨基酸氧化脫氨；(B)檢測通過氧化脫氨而產(chǎn)生的過氧化氫，其中過氧化氫的存在表示樣品中存在D-氨基酸。
45.權(quán)利要求43的方法，其中D-氨基酸是D-脯氨酸、D-酪氨酸、D-纈氨酸、D-蘇氨酸、D-谷氨酸、D-賴氨酸或D-色氨酸。
46.一種篩選可調(diào)節(jié)消旋酶活性的分子的方法，其中所述方法包括(A)在存在L-氨基酸和D-氨基酸的等摩爾混合物及待調(diào)節(jié)的消旋酶的情況下，利用被測試的分子調(diào)節(jié)消旋酶活性；(B)利用輔基中的D-氨基氧化酶對在步驟(A)中產(chǎn)生的D-氨基酸進(jìn)行氧化脫氨；(C)檢測通過氧化脫氨產(chǎn)生的過氧化氫，其中過氧化氫的調(diào)節(jié)代表測試的分子調(diào)節(jié)消旋酶活性的能力。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述分子抑制所述消旋酶活性。
48.權(quán)利要求46的方法，其中所述消旋酶是脯氨酸消旋酶。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述脯氨酸消旋酶是枯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)脯氨酸消旋酶。
50.一種通過權(quán)利要求45-48的方法鑒別的分子。
51.進(jìn)行權(quán)利要求29-41及44-49的方法所需的技術(shù)平臺及所有試劑和裝置。
52.權(quán)利要求51的技術(shù)平臺，包含a)L-氨基酸、D-氨基酸和一種消旋酶；b)一種過氧化物酶和過氧化物酶的底物，或者一種過氧化氫酶和一種對氧敏感的試劑；c)D-氨基酸氧化酶；和d)任選地，針對抑制所述消旋酶的活性而待篩選的一或多種分子。
53.權(quán)利要求51的技術(shù)平臺，其中所述消旋酶是脯氨酸消旋酶，所述L-氨基酸和D-氨基酸分別是L-脯氨酸和D-脯氨酸。
54.一種抑制脯氨酸消旋酶的分子，其含有選自SEQ ID NO1、2、3或4的亞序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及消旋酶的鑒別和鑒定，以及這些消旋酶的蛋白質(zhì)特征的確定。更特別地，本發(fā)明涉及編碼由蛋白質(zhì)特征特有的基序組成的肽的核酸分子的鑒別，還涉及由這些基序特別是SEQ ID NO1－4組成的肽。本發(fā)明還涉及特異于所述肽的抗體及這些抗體與所述肽的免疫復(fù)合物。另外，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的核酸分子檢測消旋酶的方法和試劑盒，以及由所述基序組成的肽和這些肽的抗體。
文檔編號G01N33/68GK1820070SQ200480009743
公開日2006年8月16日 申請日期2004年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月11日
發(fā)明者保拉·米諾普里奧, 納塔莉·沙芒特, 維姆·德格拉夫, 阿爾芒·貝爾內(nèi)曼 申請人:巴斯德研究院, 國立科學(xué)研究中心