專利名稱：亞細胞組分的分離和積累和從其得到的蛋白質的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及蛋白質組學領域和可以使用亞細胞蛋白質組的領域。更具體地，本發(fā)明涉及分級分離生物樣品的蛋白質組以實現改進地檢測和分析含有所述蛋白質組的蛋白質，尤其檢測和分析低豐度蛋白質。另一方面，本發(fā)明涉及通過連續(xù)流動超速離心從任意生物樣品平行分開和分離不同類型的亞細胞細胞器。此外，本發(fā)明的方法提供了純化、富集、積累和整合分離的亞細胞細胞器和其中所含的蛋白質，從而提供研究和分析亞細胞蛋白質，尤其低豐度蛋白質的增強策略。
背景蛋白質組學試圖通過細胞和/或組織中每種蛋白質的功能、亞細胞或細胞外定位、相互作用、活性和量的詳細知識和理解來理解生物現象——例如，疾病、細胞分化、生長周期和進化。這種理解將極大地推動例如，疾病的診斷、治療和預防的發(fā)展。蛋白質組學可用于例如，藥物發(fā)現、預臨床和臨床研究、臨床診斷、獸醫(yī)醫(yī)學、法醫(yī)、農業(yè)化學和生物治療學。
然而，與基因組學領域相比，蛋白質組學被認為具有顯著更高的復雜性水平。該復雜性來自于蛋白質含量、定位、翻譯后修飾和蛋白質-蛋白質相互作用通常隨時間的動態(tài)改變。這些改變在個體、組織、細胞和細胞器之間不同并且對例如生長、分化、衰老、環(huán)境改變和疾病響應而產生這些改變。
當前，還沒有一種策略可以足夠處理蛋白質組組織的所有水平。此外，監(jiān)測動態(tài)蛋白質組改變(如蛋白質定位)需要用于在細胞器水平進行蛋白質組分析的特定技術。
亞細胞分級分離技術通常是細胞生物學和生物化學中用于分離和表征細胞器的關鍵方法(Bonifacino等人，(2000)，Supplement 3-6，John Wiley & Sons，Inc.，NY)。這些方法利用多種分離技術，如密度梯度離心、自由流動電泳和配體親和層析。在多數情況中，對從不同來源制備的單一靶定的細胞器優(yōu)化亞細胞細胞器的制備。除了分離靶定的細胞器，制備的剩余物通常認為是殘渣并丟棄。
分離靶定的細胞器的一個實例在Price等人((1973)，Analytical Biochemistry 54239-246)中描述，其中作者描述了在硅膠梯度中通過CF-6轉子中連續(xù)流動分區(qū)離心從菠菜brie分離和分開完整的葉綠體。作者報導發(fā)現了葉綠體，該發(fā)現經過相差顯微術和每單位葉綠素物質的葉綠體特定蛋白質的濃度的證實。在另一實例中，Cline和Dagg((1978)Methodological Developments inBiochemistry，Longman，p.61-70)報導使用連續(xù)樣品流動方法利用等密度分帶分區(qū)轉子如J-1和RK-II從其他植物細胞組分分離葉綠體。
關于在亞細胞水平監(jiān)測蛋白質組中的動態(tài)改變的其他報導在下面提到的文獻中描述。
Dreger等人，((2003)，Mass.Spec.，2227-56)報導在細胞器水平上監(jiān)測動態(tài)蛋白質組改變，例如，蛋白質轉運事件，是特別困難的任務，因為多數分級分離技術都設計成富集單一類型的細胞器。作者報導本領域需要開發(fā)新的細胞分級分離技術以平行監(jiān)測至少兩種類型的細胞器以便為本領域技術人員提供對細胞器特異的蛋白質轉運的闡明。
Dreger等人，((2003)Eur.J.Biochem.，270589-599)等人報導需要改進監(jiān)測蛋白質轉運事件的技術，因為幾種蛋白質可能僅在某些生理狀態(tài)下與某些亞細胞結構有關。盡管作者陳述可能分離主要細胞級分，例如，胞質和核質級分，作者報導這些研究為本領域技術人員提供了關于動態(tài)蛋白質組改變的有限信息，因為這些研究不富集細胞器，結果不能闡明細胞器特異的蛋白質轉運。
此外，Gerner等人，((2000)J.Biol.Chem.27539018-39026)分析了Fa s誘導的程序性細胞死亡對TCP-1A蛋白質的細胞定位的影響。然而，該研究沒有為本領域技術人員提供關于胞質溶膠中哪種特定細胞器已經獲得的TCP-1A蛋白質的信息。獲得該信息將可以用于設計針對阻斷或增強特定蛋白質轉運事件的特定治療劑。
類似研究由Huber等人((2003)Ciculation Research，92962-968)綜述。在最近的2003年綜述中，作者指出本領域現狀允許通過差別離心將細胞分級分離成三種主要組分，如胞質溶膠、細胞核和細胞膜。類似于Gerner等人的文章，這些研究沒有提供關于細胞器特異的蛋白質轉運的動態(tài)改變。
當前，本領域仍然需要開發(fā)亞細胞分級分離技術，其中至少兩種細胞器可以同時富集、積累和分離而保持高純度和完整性，從而增加蛋白質，例如，低豐度蛋白質的檢測閾值。本領域還需要開發(fā)分級分離技術，借此亞細胞細胞器的亞型可以以不同量積累和分離并且定性分辨，從而可以確定亞細胞細胞器亞型的蛋白質組譜。
發(fā)明概述本發(fā)明的一方面涉及從樣品，優(yōu)選從生物樣品分離和積累細胞器，如亞細胞細胞器。通過例如，連續(xù)流動方法進行分級分離，從而進行細胞器的分離和積累。連續(xù)流動方法又利用了離心力，如通過離心產生離心力。在一個實施方案中，用連續(xù)流動超速離心分離和積累細胞器。然而，將理解可以使用其他連續(xù)流動方法并且本發(fā)明不限于使用超速離心。將細胞器的成分分級分離。例如，可以裂解細胞器并從中釋放蛋白質組。蛋白質組的蛋白質和肽可以通過例如，層析、電泳、連續(xù)流動離心或者本領域公知的其他技術分離。分離的蛋白質和肽可以通過許多技術如質譜法進行表征和定量分析。之后，如果可能，可以鑒定和表征蛋白質并將其用于下游應用。
更特別地，分離和積累的亞細胞細胞器，和分離和積累的低豐度蛋白質可以用于下游應用中。此類應用包括，例如，出售亞細胞細胞器和/或低豐度蛋白質，出租亞細胞細胞器和/或低豐度蛋白質，許可亞細胞細胞器和/或低豐度蛋白質、保護亞細胞細胞器和/或低豐度蛋白質中的知識產權利益和將關于亞細胞細胞器和/或低豐度蛋白質的信息存入數據庫，可以任選將該數據庫提供給第三方。
在該背景下，并且根據本發(fā)明的一個實施方案，提供了從含有細胞器的樣品富集和積累細胞器的方法，該方法包括步驟a)從樣品釋放細胞器；b)將細胞器導入連續(xù)流動離心機內的密度梯度；c)應用足夠至少兩種類型的細胞器遷移到密度梯度內的離心力；和d)從密度梯度收集所述至少兩種類型的細胞器以便利用所述至少兩種類型亞細胞細胞器。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了用于從細胞器積累低豐度蛋白質的方法，該方法具有步驟a)從含有細胞器的樣品釋放細胞器；b)將細胞器導入連續(xù)流動離心機內的密度梯度；c)應用離心力從而細胞器在密度梯度內富集和積累；和d)從密度梯度收集細胞器；e)裂解細胞器以形成蛋白質組；和f)從蛋白質組收集低豐度蛋白質。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了從含有至少兩種類型細胞器的生物樣品分離所述至少兩種類型細胞器的方法，該方法具有步驟a)從樣品以勻漿物釋放所述至少兩種類型的亞細胞細胞器；b)在密度梯度內連續(xù)流動勻漿物并應用一定量的離心力以足夠所述至少兩種類型的細胞器的每一種都進入密度梯度并遷移到密度梯度的某個位置從而梯度的密度和每種各自細胞器的浮力密度基本上相等；和c)從密度梯度分離所述至少兩種類型的細胞器。
在本發(fā)明的另一實施方案中，從生物樣品富集和積累至少兩種類型細胞器的方法具有步驟a)從組織或細胞材料獲得生物樣品；b)勻漿組織材料或裂解細胞材料以形成細胞器勻漿物；c)將所述細胞器勻漿物進料到具有密度梯度的連續(xù)流動超速離心機；d)應用離心力從而至少兩種類型的細胞器在密度梯度內遷移和積累；和e)從密度梯度收集至少兩種類型的細胞器以便利用至少兩種類型的細胞器。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，提供了從亞細胞細胞器積累低豐度蛋白質的方法，該方法具有步驟a)從含有亞細胞細胞器的樣品釋放亞細胞細胞器；b)向連續(xù)流動離心機內的密度梯度導入亞細胞細胞器；c)應用離心力使得亞細胞細胞器在密度梯度內遷移和積累；d)從密度梯度收集亞細胞細胞器；e)裂解亞細胞細胞器以形成蛋白質組懸浮液；f)從蛋白質組懸浮液收集低豐度蛋白質；和g)以一種方法中利用所述低豐度蛋白質，所述方法選自出售低豐度蛋白質，出租低豐度蛋白質，許可低豐度蛋白質，保護低豐度蛋白質中的知識產權利益，將關于所述低豐度蛋白質的信息存入數據庫和察看數據庫中關于該低豐度蛋白質的信息。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了從含有亞細胞細胞器的生物樣品純化和積累所述亞細胞細胞器的方法，該方法具有步驟a)將所述生物樣品導入離心機，所述離心機含有適于分成離散的層的密度梯度溶液，每個所述層具有容積；和b)以連續(xù)模式離心所述生物樣品以在所述密度梯度溶液中所述離散的層中產生所述積累和純化的亞細胞細胞器，其中所述至少兩種類型的亞細胞細胞器的每一種在所述密度梯度溶液內的分開的離散層中遷移，其中所述至少兩種類型的亞細胞細胞器在所述至少兩個離散層的容積的濃度或略低此濃度處積累，并且其中所述至少兩種積累的亞細胞細胞器是基本上完整的。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，提供了積累亞細胞細胞器的方法，該方法具有步驟使用連續(xù)流動超速離心機從生物樣品以足夠產率和純度獲得所述亞細胞細胞器以便分離和檢測其中的低豐度蛋白質。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了積累至少兩種不同類型的亞細胞細胞器的方法，其具有步驟使用連續(xù)流動超速離心機從生物樣品以足夠產率和純度獲得所述至少兩種不同類型的亞細胞細胞器以便分離和檢測其中的低豐度蛋白質。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了分析作為時間的函數的至少兩種類型的亞細胞細胞器的蛋白質組譜的方法，該方法具有步驟a)在第一時間從生物樣品釋放所述至少兩種類型的亞細胞細胞器；b)將至少兩種類型的亞細胞細胞器導入連續(xù)流動超速離心機內的密度梯度；c)應用離心力使得至少兩種類型的亞細胞細胞器在密度梯度內遷移；d)從密度梯度收集至少兩種類型的亞細胞細胞器；e)從所述至少兩種類型的亞細胞細胞器分離和純化蛋白質以確定所述第一時間的所述至少兩種類型的亞細胞細胞器的蛋白質組譜；f)在第二時間從第二種生物樣品釋放至少兩種類型的亞細胞細胞器；g)重復步驟b)到d)；h)從所述至少兩種類型的亞細胞細胞器分離和純化蛋白質以確定在第二時間的所述至少兩種類型的亞細胞細胞器的蛋白質組譜；和i)分析所述第一和第二時間的蛋白質組譜以檢測作為時間的函數的所述蛋白質組譜中的改變。
在本發(fā)明的其他實施方案中，提供了分析生物樣品的轉運蛋白質的轉運過程的方法，所述轉運過程涉及作為時間的函數，轉運蛋白質從所述生物樣品的第一種細胞器向第二種細胞器的細胞內移動，所述時間的函數具有至少兩個時間點，所述方法具有步驟(a)測定所述第一種生物樣品中所述第一種和第二種細胞器中所述轉運蛋白質的相對量，所述第一種生物樣品在第一個時間點分離，包括步驟在足夠將所述第一種和第二種細胞器釋放到勻漿物的條件下勻漿所述第一種生物樣品，所述第一種和第二種細胞器每一種均含有亞細胞蛋白質組，將所述勻漿物導入連續(xù)流動超速離心機內的密度梯度，對所述勻漿物應用離心力從而所述第一種和第二種細胞器在密度梯度內遷移，從所述密度梯度除去所述第一種和第二種細胞器，溶劑第一種和第二種細胞器的亞細胞蛋白質組，檢測第一種生物樣品的第一種和第二種細胞器中的所述轉運蛋白質，測量第一種生物樣品中第一種和第二種細胞器中所檢測的轉運蛋白質的水平，確定第二種生物樣品中第一種和第二種細胞器中的轉運蛋白質的相對量，所述第二種生物樣品在第二時間點分離并重復上面的步驟；和通過比較在每個所述時間點分離的每種所述生物樣品的第一和第二種細胞器中所檢測的轉運蛋白質的測量水平分析所述作為時間的函數的所述轉運蛋白質的所述轉運過程。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，提供了從亞細胞細胞器和其亞型獲得蛋白質的方法，其具有步驟a)從生物樣品釋放亞細胞細胞器和其亞型；b)將亞細胞細胞器和其亞型導入連續(xù)流動超速離心機中的密度梯度；c)應用離心力使得亞細胞細胞器和其亞型在單次運行中遷移和積累在密度梯度中；和d)從密度梯度收集亞細胞細胞器和其亞型并從中獲得蛋白質。
在下面的本發(fā)明詳細描述中提供可本發(fā)明的這些和其他實施方案或者根據本發(fā)明的實施方案，這些和其他實施方案是顯而易見的。
附圖簡述給出下面的詳細描述作為實例，但是不限制本文描述的特定實施方案，該詳細描述可以結合附圖更好地理解，附圖中

圖1是流程圖，其描繪了本發(fā)明的一個實施方案中分離和積累細胞器的方法。
圖2是流程圖，其描繪了蛋白質表征和定量的方法。
圖3描繪了大鼠肝臟級分中線粒體、內質網、高爾基體和質膜的百分數。
圖4描繪了大鼠肝臟級分中收集的線粒體、內質網、高爾基體和質膜的富集。
圖5描繪了如下制備物的百分數(％)完整性(1)內質網(76.3％)，(2)線粒體(72.6％)，(3)高爾基體(89.3)，和(4)質膜(72.7)。
圖6描繪了電子透射顯微照片，其比較通過本發(fā)明方法制備的大鼠肝細胞的粗提物樣品和內質網級分的細胞器含量和超微結構。
圖7描繪了對HeLa細胞收集的級分中線粒體、內質網、高爾基體和質膜的百分數。
圖8描繪了對HeLa細胞收集的級分中線粒體、內質網、高爾基體和質膜的富集。
圖9描繪了通過本發(fā)明方法富集的特定細胞器的水平。
圖10描繪了圖7中顯示的每種級分的定量信號。
圖11描繪了勻漿和離心的HeLa細胞的收集的離心后級分的蔗糖含量百分數。
圖12描繪了對粗提(CE)樣品和內質網(ER)級分的2D凝膠電泳分析的比較。
圖13描繪了HeLa細胞粗提物、高爾基體級分和質膜級分的2D凝膠電泳分析的結果。
圖14描繪了圖13的點12、13和14的質譜數據。
圖15顯示了大鼠肝細胞粗提物和內質網級分的2D凝膠電泳分析。
圖16顯示了大鼠肝細胞粗提物和線粒體級分的2D凝膠電泳分析。
圖17顯示了大鼠肝細胞粗提物和高爾基體級分的2D凝膠電泳分析。
圖18顯示了大鼠肝細胞粗提物和質膜級分的2D凝膠電泳分析。
圖19顯示了將屬于本發(fā)明方法的信息提供給第三方的流程圖。
圖20顯示了保護本發(fā)明方法產生的知識產權的流程圖。
圖21A和21B顯示了使用從本發(fā)明方法獲得的肽序列進行同源性檢索的方法。
圖22A和22B顯示了相對于蛋白質拷貝數，使用2D凝膠分析的蛋白質檢測限和達到蛋白質檢測限所需的生物材料的估計量。圖22A和22B分別涉及細胞和組織。
下面的發(fā)明詳述公開或者顯然可以獲得和包括這些和其他實施方案。
發(fā)明詳述如圖1和2中所見到的，本發(fā)明的實施方案包括以組織或細胞的形式獲得生物樣品；勻漿組織和/或裂解細胞以提供勻漿物；任選澄清以除去某些物質，如細胞核；將勻漿物進料到其中具有密度梯度的連續(xù)流動超速離心機；對勻漿物應用離心力以分離和積累完整細胞器；收集細胞器；和在進一步的下游過程中使用細胞器。一種該下游過程包括通過裂解細胞器以釋放蛋白質組從細胞器獲得低豐度蛋白質；從中分離和積累低豐度蛋白質；表征、定量和如果可能，鑒定所述低豐度蛋白質；和在進一步下游過程中使用低豐度蛋白質。
獲得樣品。如圖1中所見，本發(fā)明的方法可應用于本領域技術人員公知的任意生物樣品，或者使用本領域技術人員公知的任何方法從任意來源分離或獲得的含有生物樣品的任意樣品。
對于本發(fā)明，“生物材料”，其可以與“生物樣品”、“生物樣本”或者“生物物質”，或者本領域技術人員公知的任何其他類似變化形式具有相同的意思，指本領域技術人員公知的任意類型的生物材料，包括，例如，完整細胞、細胞提取物、組織、勻漿細胞和組織、蛋白質溶液、亞細胞結構，如細胞器和細胞器亞型，或者本領域技術人員認為是生物材料的任何其他材料。生物材料可以是任意溶液、混合物、懸浮液、物質、緩沖液、等等，如非生物溶液，如含有加入其中的生物材料，如細胞器或者細胞器亞型的磷酸緩沖液。更具體地，本發(fā)明的生物材料可以從任意公知的活的或死的來源，如器官、體液、血液、血清、血漿、唾液、淚液、糞便、尿、精液、粘液、組織、組織勻漿物、細胞提取物或者脊髓液獲得，來源于任意公知的生物體或者其部分或者病毒，包括，但不限于，例如，任意原核或真核生物；脊椎動物或無脊椎動物；或者任何生物體，例如，動物、哺乳動物、鳥、馬、魚、嚙齒類、昆蟲、或者植物等等，或者它們的組合。
在一個實施方案中，生物樣品是細胞。根據本發(fā)明，“細胞”在普通生物學意義上指能夠獨立繁殖的最小的、膜包圍體。在更廣意義上，細胞可以是真核或原核的。此外，將理解可以從多細胞生物體、組織、細胞或組織培養(yǎng)物、細胞培養(yǎng)物中的病毒感染的細胞，或者從任意生物樣品獲得細胞。還將理解細胞，特別是真核細胞，含有亞細胞結構，包括，例如，細胞器和其他亞細胞結構。
“細胞器”和“亞細胞細胞器”在本發(fā)明中具有相同意思，按照本領域技術人員在普通生物學意義上理解。細胞器包括形成細胞的組分并且通常實施特征性功能的任何類型的復雜結構。本發(fā)明預計來自本領域技術人員公知的任何生物樣品的任意細胞器，例如，線粒體、葉綠體、過氧化物酶體、高爾基體、內質網、細胞核、蛋白酶體、核糖體、和其他的，包括任何公知的或未知的細胞器亞型，例如，平滑和粗糙線粒體、早期和晚期內質網，或者本領域技術人員將理解或可以發(fā)現的特定細胞器的任何亞型或者亞群。
根據本發(fā)明，細胞器“亞型”或者“亞群”可以指細胞中特定細胞器群體的子部分，其與相同群體的相同類型細胞器的其余部分以某種方式不同。例如細胞器亞型包括基于，例如，細胞器的總體大小和形狀、細胞器密度、表達的特征性蛋白質群體的組成、細胞器膜的成分，或者技術人員將知道的任何其他生理或形態(tài)不同的差別。某些細胞器含有膜，其稱作“細胞器膜”。
還理解細胞器具有例如，生物分子的特征集合，尤其蛋白質的特征集合，其組成細胞的全體蛋白質組的子集，該子集為細胞的完整蛋白質組的子集。與亞細胞結構相關的蛋白質的子集，例如，細胞器，或者形成細胞、組織或者基因組的完整蛋白質組的子集的那些蛋白質可以稱作“亞細胞蛋白質組”。尤其對于細胞器，與細胞器特異性蛋白質相關的亞細胞蛋白質組——包含在細胞器膜內和/或直接或間接結合、整合或者附著細胞器膜的那些蛋白質——可以稱作“細胞器蛋白質組”。細胞器亞型可以具有組成獨特的蛋白質組，從而其可以與從含有包括該細胞器的剩余細胞器亞型的每一種的部分或全部組合形成的蛋白質組相區(qū)別。
本領域技術人員將理解通常認為術語“蛋白質組”是MacquarieUniversity(澳大利亞)的Marc Wilkins構造的，他將蛋白質組定義為“基因組、細胞或者組織表達的所有蛋白質”。例如，并且對于本發(fā)明，術語蛋白質組指整個蛋白質組并且包括基因組、細胞、組織或器官表達的所有蛋白質。同樣，可以認為蛋白質組是基因組、細胞或組織表達的蛋白質的動態(tài)集合，其可以根據多種不同的因素而變，所述因素為例如細胞的生長和/或分化階段、內部和外部環(huán)境因素、疾病因素，和技術人員公知的任何其他因素。
在一些情況中，將理解某些細胞器，例如，線粒體和葉綠體，含有它們自己的染色體，其可以表達與含有染色體的細胞器相關的某些蛋白質。然而，技術人員將理解組成細胞器蛋白質組的主要的蛋白質是由細胞的染色體表達并通過多種機制，例如，轉運和囊泡遞送運輸到目的細胞器中。
對于本發(fā)明，術語“蛋白質組學”指建立生物、器官、組織、細胞外空間、細胞、細胞器或者它們的任意組合中所有蛋白質的包括身份、量、結構和生物化學和細胞功能的性質，以及這些性質是怎樣在空間、時間和生理狀態(tài)中改變的努力。還理解蛋白質組學通過表征蛋白質關于時間、空間和生理狀態(tài)的許多定義性質和行為，例如，蛋白質表達譜、翻譯后修飾、細胞內定位和蛋白質-蛋白質相互作用研究細胞過程的性質。蛋白質組學不僅包括鑒定和定量蛋白質，還包括確定它們的定位、修飾、相互作用、活性和最終地，它們的功能。
勻漿/裂解生物樣品。再次參考圖1，一旦獲得生物樣品，勻漿和/或裂解生物樣品。勻漿步驟的產物通常稱作勻漿物。勻漿物具有與本領域公知的相同的意思。從而，勻漿物是生物樣品勻漿和/或裂解后的生物樣品的形式。勻漿和/或裂解的方法在下文進一步解釋。
用于勻漿和/或裂解的方法和材料通常是本領域公知的。根據本發(fā)明，術語“勻漿”可以指本領域技術人員用以實現組織破碎成更小或更均勻的組分，如細胞和含有該組織的細胞外材料的多種技術的任意一種。例如，組織的勻漿可以指將組織破碎成單個細胞從而細胞相互或者與其他細胞外材料分開和/或脫離。術語勻漿和/或裂解還可以指將細胞，例如組織的細胞破碎成它們的亞細胞組分的步驟。從而，根據本發(fā)明，勻漿的組織或勻漿的和/或裂解的細胞可以導致釋放亞細胞組分，包括例如，細胞器。細胞內組分例如細胞器從細胞釋放指細胞內組分不再受到細胞或者質膜的限制。
本領域普通技術人員將明白可以用多種方法實施組織和/或細胞的破碎。將理解裂解和/或破碎可以導致細胞膜的破碎從而釋放細胞內組分，如細胞器?？梢哉{節(jié)勻漿和/或裂解條件從而破壞細胞膜而使細胞器膜的破壞最小。調節(jié)這些條件以實現細胞膜裂解而細胞器膜裂解最小化的方法是公知的并且可以在例如Current Protocols in CellBiology(1999)，編者J.S.Bonifacino等人和SubcellularFractionationA Practical Approach，(1997)，編者J.M.Graham等人中找到。
本發(fā)明考慮用于勻漿和/或裂解生物樣品或者本領域普通技術人員將可以獲得的任意技術，例如，任意基于化學、機械、壓力或者溫度的技術。例如，此類方法可以包括通過將細胞和/或組織通過注射器中含有小球和金屬塊的狹窄環(huán)帶(“含有球的勻漿器”)應用液體剪切力；將細胞和/或組織強行高壓通過小孔；在高壓下將細胞和/或組織暴露于氮氣然后強行通過針閥門，如注射器閥門；對細胞超聲處理以破壞細胞膜；將細胞和/或組織與去污劑，例如，Tween-20或者十二烷基硫酸鈉(“SDS”)接觸；將細胞和/或組織與提供滲透壓的溶液，例如，等滲介質、低滲介質，流入，0.1M蔗糖溶液接觸；和應用剪切力，例如，將細胞和/或組織導入組織攪拌器(如WaringTM攪拌器，Waring Laboratory，CT)；或者上面方法的任意組合或者本領域技術人員公知的任何其他額外的方法。
本領域技術人員將理解根據設計用于特定細胞和/或組織的技術或步驟可以對來自任何生物材料(例如，心臟、胰臟、腺體、肌肉、骨骼、腎臟、皮膚、肝臟、腦或者血液或者其他器官，和特定細胞來源，包括例如，組織培養(yǎng)細胞、細胞培養(yǎng)細胞，或者懸浮的任何細胞類型)的特定來源和/或類型的組織進行勻漿。例如，肝細胞可以具有設計用于勻漿或者裂解該具體細胞類型的勻漿方法。關于細胞和組織勻漿和/或細胞裂解的許多技術的信息可以見通過商業(yè)途徑可獲得的手冊，例如，Sambrook J.等人，Molecular Cloninga LaboratoryManual，第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
術語“基本上完整的”指本發(fā)明方法的任意時間點亞細胞組分，特別是細胞器的相對完整性程度，所述時間點包括細胞器從勻漿和/或裂解后的細胞/或組織釋放或者連續(xù)流動過程期間或之后，例如，連續(xù)流動離心過程，或者本發(fā)明方法的任意其他時間點。通過本領域技術人員公知的任意方法可以確定細胞器是否基本上完整，所述方法為例如通過細胞器特異標記的定量酶測定、細胞器特異標記的蛋白質印跡，或者通過使用顯微術，例如透射電鏡法(TEM)通過視覺檢查。對于顯微術的使用，技術人員將明白來自任意生物來源和/或細胞或組織類型的任意和所有類型細胞器的形態(tài)特征和特點并且將理解怎樣基于特定形態(tài)特征判斷給定細胞器是否完整。
在一個實施方案中，可以通過酶法測量細胞器完整性。例如，目標細胞器制備物，例如，根據本發(fā)明方法的線粒體的制備物，可以經離心以沉淀不可溶部分，其可以含有完整細胞器或者其部分，例如，細胞器片段。上清液含有從破碎的目的細胞器釋放的任意可溶的組分，包括任意可溶的蛋白質和/或酶。然后，可以對細胞器沉淀和剩余的上清液級分測量細胞器特異標記，例如，給定目的細胞器的特定酶的相對水平或者量。將明白可以在測量或者檢測細胞器特異標記之前裂解沉淀的細胞器。
本領域普通技術人員將明白不同的亞細胞細胞器將具有不同的“細胞器特異標記”，其可以用抗體檢測、測定或探測以便確定具體細胞器的富集因子。例如，細胞色素c氧化酶和/或Tom20(18kDa)可以用于檢測線粒體；β-氨基己糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶可以用于檢測溶酶體；過氧化物酶可以用于檢測內體；堿性磷酸二酯酶I和/或NaKATPase(150kDa)可以用于檢測質膜；α-甘露糖苷酶II和/或GM130(130kDa)和/或P115(115kDa)可以用于檢測高爾基體；過氧化氫酶可以用于檢測過氧化物酶體；乳糖脫氫酶可用于檢測胞質溶膠級分；RNA和/或BiP/GRP78(78kDa)可用于檢測粗糙內質網。優(yōu)選地，可以用針對線粒體特異的Tom20(18kDa)的抗體、針對內質網特異的BiP/GRP78(78kDa)的抗體、針對質膜特異的NaKATPase(150kDa)的抗體、針對高爾基體特異的GM130(130kDa)的抗體和針對高爾基體特異的P115(115kDa)的抗體，使用技術人員公知的任意適宜的方法，例如，蛋白質印跡和免疫印跡檢測和定量本發(fā)明的離心生物樣品的級分中特定細胞器。這些抗體可以從商業(yè)來源，例如，BDBIOSCIENCES(CA)、STRESSGEN(Victoria，BC加拿大)和從學術界獲得。
從而，通過將細胞器制備物分離成可溶的(上清液)和不可溶(固體沉淀)級分，分析或檢測兩種級分中細胞器特異標記的存在，然后比較來自兩種級分的相對水平或者量可以評估完整性。通常，將理解不可溶級分(與可溶級分比較)中所含細胞器特異標記的量的更高相對水平相應于更高程度的細胞器完整性。優(yōu)選地，本發(fā)明考慮在細胞器裂解階段之前本發(fā)明方法的任何階段細胞器具有等于或大于約60％、70％、80％或90％以上的完整性。
在一個實施方案中，通過將對不可溶級分測量的細胞器特異標記的相對量除以兩種級分中細胞器特異標記的相對量之和再乘以100得到完整性百分數(％)可以計算細胞器完整性。例如，可以將線粒體制備物離心形成線粒體沉淀(和線粒體片段，如受到破壞和/或裂解從而釋放細胞器內可溶物質，如可溶性線粒體蛋白質，包括線粒體特異標記的那些線粒體)和含有所破壞的和/或裂解的細胞器的可溶組分的上清液。然后可以為可溶和不可溶級分測定線粒體特異蛋白質和/或酶(線粒體標記，如Tom20)的相對水平。然后可以通過將不可溶級分中線粒體標記的量除以不可溶和可溶級分中線粒體標記量的總和再乘以100得到反映含有完整線粒體的線粒體制備物的相對比例的百分數，可以計算完整性百分數。
技術人員將明白在勻漿過程中通常使用緩沖液。本發(fā)明考慮本領域技術人員公知的任意適宜的緩沖液，包括，例如，去污劑，如Triton-X、十二烷基硫酸鈉(SDS)等等，鹽，如氯化鈉、蛋白酶，如蛋白酶K，DNA和RNA降解酶抑制劑，和適宜用于勻漿緩沖液中的任何其他額外的組分。技術人員將明白緩沖液的組成可以取決于生物樣品的類型和/或來源。
任選澄清步驟。再次參考圖1，生物樣品的細胞和/或組織勻漿物通常經“澄清”以除去某些細胞內組分，如細胞核，其中所述勻漿物含有完整細胞器。細胞核通常阻礙樣品中其組分如其他細胞器進入梯度。從而，可以在本發(fā)明的連續(xù)流動離心過程之前從樣品除去細胞核。
本發(fā)明考慮適于除去細胞核的任意方法，包括，但不限于，離心。例如，為了使用離心機澄清勻漿物，可以使用本領域技術人員公知的任意離心機，如分批或者分析離心機，使用適宜的相對離心力(RCF)(×g)，例如約500×g到約40,000×g。通過對勻漿物應用導致細胞核但不導致剩余細胞器向離心管的一個末端遷移，例如，向離心管的底部遷移的離心力可以用離心機分離例如，細胞核。在一個實施方案中，本領域公知的低速澄清離心機可以用于澄清勻漿物。低速澄清離心機可以是連續(xù)流動離心機。
離心機。如在圖19中可以看到，一旦生物樣品經勻漿和/或細胞受到裂解，從中得到的勻漿物和/或產物導入連續(xù)流動離心機內的密度梯度。
對于本發(fā)明，“連續(xù)流動離心機”是一種類型的離心機或者超速離心機，其轉子具有入口和通常具有出口，其中生物材料可以通過入口導入轉子，允許生物材料在轉子中接觸梯度，并且允許生物材料通過出口出去。連續(xù)流動離心機可以包括半連續(xù)流動離心機。
本發(fā)明考慮連續(xù)流動離心機和連續(xù)流動離心機轉子的任何公知的結構。例如，連續(xù)流動轉子可以具有一個入口或者一個入口和一個出口從而樣品可以通過入口連續(xù)或間歇地導入并通過出口連續(xù)或間歇地釋放。轉子還可以具有入口而無出口，允許樣品連續(xù)導入轉子，但是不連續(xù)釋放。當轉子旋轉時，梯度可以預形成或者預先建立。從出口釋放的樣品也可以是連續(xù)或間歇再循環(huán)的或者通過入口再導入轉子以提供樣品材料多次“通過”梯度。本發(fā)明考慮任意次數通過梯度以足以富集和積累細胞器。
還可以讓轉子連續(xù)旋轉而在運行結束時從連續(xù)流動離心機的轉子除去梯度。在其位置，可以將新鮮梯度材料加入到運動的轉子。一旦在轉子中建立了新的梯度，就可以將另一生物樣品，如另一種生物樣品的勻漿物導入轉子并允許接觸梯度。在該意思上——連續(xù)流動離心機如此運行使得其中含有在其中分離的第一種生物樣品的第一種梯度在轉子旋轉時除去并用新鮮體積的梯度材料替換而轉子繼續(xù)旋轉以分離第二種生物樣品——稱作“連續(xù)流動模式”。連續(xù)流動模式不限于加入和除去僅第一和第二個梯度，而是可以連續(xù)從離心機轉子加入和除去任意數目的梯度以連續(xù)分離任意數目的生物樣品而轉子持續(xù)旋轉，例如不用關閉或者停止離心機的轉子。
本發(fā)明還考慮本發(fā)明的生物樣品，如生物樣品的勻漿物，可以以人工、自動或者半自動方式加載到連續(xù)流動離心機。例如，可以以適宜的方式使用模擬機器人系統(tǒng)，包括適宜的傳感器或電子儀器，以實現生物樣品自動或半自動加載到連續(xù)流動離心機的轉子中。除了加載生物樣品，還可以將梯度物質人工、自動或半自動方式加載到連續(xù)流動離心機的轉子并可以使用任何適宜的模擬機器人、傳感器、電子儀器或者計算機系統(tǒng)和/或用于控制和/或編程自動化或半自動系統(tǒng)的軟件。
適宜的連續(xù)流動離心機的實例為Alfa Wassermann，Inc.(WestCaldwell，NJ)生產的那些，包括，但不限于，KII、PKII和RK。某些代表性轉子模型包括，但不限于AW K3-3200、AW PK3-1600、AWPK3-800、AW PK3-400、AWPK3-200、和AW PK3-100。預計具有更大或更小體積的轉子在本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明可以使用其他連續(xù)流動離心機。這些連續(xù)流動離心機包括例如，Beckman CF32Ti、Beckman JCF-Z-standard core、BeckmanJCF-Z small pellet core、Beckman JCF-Z large pellet core、Beckman Z60、Sorvall SS34/KSB、Sorvall TZ-28/GK、Sorvall TCF-32(P32CT，具有940ml芯)、Sorvall TCF-32、和Hitachi生產的那些，例如，離心機CC40、CP40Y、C40CT2-H、C40CT和CP60Y。Hitachi離心機由Kendro經銷。
在另一實施方案中，連續(xù)流動離心機是速率分區(qū)離心機。分區(qū)轉子組件已經多年使用并且關于該主題由大量文獻。關于分區(qū)轉子的信息包括在多數純化手冊和生物化學教材中。具體信息可以見Anderson，An Introduction to Particle Separations in Zonal Centrifuges(National Cancer Institute Monograph No.21，1966)；Anderson，Separation of Sub-Cellular Components and Viruses by CombinedRate and Isopycnic Zonal centrifugation(National CancerInstitute Monograph No.2191966)；和Anderson，PreparativeZonal Centrifugation，in Methods of Biochemical Analysis(1967)，將它們全部并入本文作為參考。
對于本發(fā)明，離心機“運行”指樣品加入轉子時(轉子已經在運動并具有預先形成的梯度或者轉子停止)直到樣品被離心機處理(包括任何通過次數，例如，一次通過(無樣品再循環(huán))、兩次通過(樣品再循環(huán)一次)、三次通過(樣品再循環(huán)2次)等)?？梢赃M行通過，從而轉子不停止或減慢。此外，樣品還可以連續(xù)再循環(huán)任意時間。還考慮離心機運行可以以恒定或者可變速度進行。
在一個實施方案中，本發(fā)明所用的離心機運行可以是單次運行。例如，亞細胞細胞器和其亞型的遷移、分離和積累在一次離心機運行中進行。
通常，進行連續(xù)流動離心機運行的準備是通過人工、自動，例如，計算機或者人工形成和自動化聯合形成的。優(yōu)選地，用計算機和軟件控制離心機和計算離心方案。此類計算機和軟件為操作人員提供了“實時”顯示在控制屏上的操作參數。自動化程序也可以從預先存儲的文件，或者通過控制屏手動運行。
在一個實施方案中，在每次離心運行期間，產生監(jiān)測和記錄設置參數、運行參數和警報狀態(tài)的在線數據并將它們下載到系統(tǒng)存儲器中。此類下載也可以涉及外部數據存儲位置。
計算機自動化、人工進行的或者兩者的聯合的分離方案通常包括操作許多變量。此類變量包括，例如，靶細胞器的物理特征；梯度的形成；和運行參數的計算。
用于定義分離方案的靶細胞器的物理特征包括，例如，靶細胞器的沉降系數(S20ω)和浮力密度。這些值可以用于例如，減小嘗試和錯誤試驗的次數(見，Rickwood等人，Centrifugation Essential Data，BIOS Scientific Publishers Limited 1994，Publisher J Wiley &Sons；Preparative CentrifugationA Practical Approach，DRickwood編著，Oxford University Press 1921；和Methods inEnzymology，卷182Guide to Protein Purification，Murray P編著.Deutscher，Academic Press 1990)。
分離方案還通常包括梯度的知識。梯度可以包括但不限于，密度梯度。密度梯度又可以是例如，連續(xù)梯度、不連續(xù)梯度或者分級梯度。梯度材料的選擇取決于例如，產物、雜質穩(wěn)定性和產物密度。常用的梯度材料包括本領域技術人員公知和可以通過商業(yè)途徑得到或者由技術人員制備的任意適宜的梯度材料。梯度材料包括，但不限于堿金屬溶液，例如，氯化銫(CsCl)、硫酸銫(Cs2SO4)、酒石酸鉀或者氯化鉀；非電解質溶質，例如，蔗糖、甘露醇或者甘油；多糖，例如，Ficoll400(Pfizer，CT)；碘化非電解質，例如，三碘苯甲酰氨基葡萄糖、Nycodenz(Nycomed，Inc.，NJ)、Iodixanol或者Optiprep；Percoll(用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠)(Pfizer，CT)，或者本領域技術人員公知的任何其他適宜的材料。
將理解含有堿金屬的梯度盡管具有腐蝕性，但是產生低粘度的高密度。例如，常用作梯度材料的氯化銫可以實現高密度，其通常高達約1.9g/cm3。在另一實例中，溴化鉀也可以形成高密度，但是僅在更高溫度，例如25℃下形成高密度。此類更高溫度可能與目標蛋白質的穩(wěn)定性不相容。
上面提到的梯度的實例還包括Nycodenz、Optiprep、Iodixanol和蔗糖。蔗糖是一種劃算的梯度材料并對于多數操作利用足夠的密度范圍(高達例如，1.3g/cm3)。蔗糖梯度的粘度允許形成用于產物顯帶的陡梯度，或者備選地，在同一轉子中產生寬的產物容量。如果例如非靶蛋白的進入將最小化時，陡梯度對于連續(xù)流動操作通常是有效的。由于在連續(xù)流動轉子中長時間形成陡梯度，蔗糖的粘性也是希望的。相比，低粘度溶液，如CsCl可能需要加入更高粘度的材料，如甘油，以增加粘度和減小連續(xù)流動運行期間梯度腐蝕。
本發(fā)明考慮使用具有任意濃度譜的任意類型的梯度。“濃度譜”將被技術人員理解為沿著垂直于水平、垂直、對角或者它們之間的任意方向的梯度的路徑上密度介質或者材料的濃度變化。同樣，梯度可以是“線性梯度”、“凹梯度”或者“凸梯度“，或者“不連續(xù)梯度”，或者技術人員公知的任意其他適宜的形式。
蔗糖是優(yōu)選的密度梯度材料。表1描述了使用蔗糖密度梯度分離經勻漿的生物樣品中所含線粒體、內質網、質膜和高爾基體的理論分離要求。
表1.經勻漿的生物樣品的理論分離要求
*來源于使用蔗糖的密度數據表**基于分級梯度***基于類似于質膜的顯帶如上所述和本文中定義的，連續(xù)流動離心機運行可以包括許多通過。例如，勻漿的生物樣品可以兩次通過本發(fā)明的連續(xù)流動離心機。第一次通過可以以20,000RPM在PK-3-800轉子中使用20ml/分鐘(1.2L/小時)的流速進行。同樣，預期高于487 Svedberg(S)的材料進入梯度。對于第一次運行使用下面的參數
第二次通過可以以40,000RPM進行。同樣，預計超過122S的物質進入梯度。下面的參數可以用于第二次運行
備選地，第二次通過可以以35,000RPM在PK-3-800轉子中進行，使用20ml/min(1.2L/hr)的流速。同樣，預計超過159S的物質進入梯度。對這種備選通過可以使用下面的參數
用于實施以特定RPM值離心所用時間長度決定了特定物質是否將沉淀出來，其又通常取決于該物質的Svedberg值。例如，使用PK-3-800轉子在35,000RPM下，超過53S的物質通常在45分鐘內沉淀出來。對于120分鐘，超過19.9S的物質通常沉淀出來。在兩種情況中，在芯和轉鼓的RCF值將分別為74,660×g和90.535×g。
基于如下所示的細胞器，例如，線粒體、質膜、內質網和高爾基體的公知的理論沉降范圍，可以估計沉淀所需的時間。例如，線粒體、質膜、內質網和高爾基體的公知的沉降范圍分別如下10,000到50,000S；50到1,000S和100,000到500,000S；1到5,000S；和1,000到10,000S。
可以確定以不同速度沉淀出細胞器所需的時間。例如，基于PK-3-800轉子中以20,000PRM和20ml/min樣品流速的離心，沉淀下面組分的時間在下表中顯示
在35,000RPM下，在PK-3-800轉子中以20ml/min的樣品流速沉淀下面的組分所需時間如下
備選地，在40,000RPM下，在PK-3-800轉子中以20ml/min的樣品流速沉淀下面的組分所需時間如下
可以確定具有特定Svedberg常數的特定組分的顯帶時間。例如，可以基于35,000RPM下使用第一次通過45分鐘和第二次通過120分鐘在PK-3-800轉子中離心進行預測，如下表所示。該表還顯示了45分鐘和120分鐘后是否顯帶完成。
在一個實施方案中，本文中考慮的連續(xù)流動離心機可以使用不同幾何形狀的不同大小的轉子以便提供可縮放的分離。例如，本發(fā)明的連續(xù)流動離心機可以配置不同大小的轉子，例如，15英寸或者30英寸的轉子。將理解用于本發(fā)明的轉子的幾何性狀可以影響可以處理的樣品的體積、沉降途徑的縮窄和分離所需的總持續(xù)時間。此外，本發(fā)明考慮的連續(xù)流動離心機轉子可以以“再定向梯度模式”運行，其中梯度從上樣位置(水平位置)移動到運行位置(垂直位置)并返回到上樣位置以允許產物收集。在本發(fā)明考慮的轉子的使用期間，樣品材料的流動路徑可以通過芯的中心口進入每端(頂端或底端)，然后樣品材料可以通過長的薄管狀軸流出所連接的產物線路或者管。
在另一實施方案中，使用具有相同轉子長度但是改變轉子芯的構造以減小或者增加體積來進行縮放分離。例如，如共同未決的美國申請序號09/995,054中所描述的(并入本文作為參考)，該方法通常包括使用不同設計的芯，如具有軸向伸出的“鰭”的芯。在一個實施方案中，改變鰭的尺寸調節(jié)轉子芯所排出的體積。例如，通過增大鰭大小通常實現按比例縮小，從而減小離心機運行可利用的體積。通過減小鰭的大小通常得到按比例增大，從而允許離心機運行的更多體積。
為了利用不同大小的轉子，例如，Alfa Wassermann，Inc生產的那些轉子可以實施縮放分離，通常考慮許多參數。這些參數包括但不限于，轉鼓的Rmax、芯的Rmin、轉鼓的×g力、沉淀時間、過渡時間、K因子和樣品流速。這些參數取決于所分離的具體顆粒的Svedberg值。
例如，下文描述轉子，例如Alfa Wassermann，Inc生產的那些轉子1,000S顆粒的分離參數。以厘米表示的轉子的Rmax(最大半徑)、以厘米表示的轉子Rmin(最小半徑)，和超速離心機(UCF)轉子最大速度(rpm)通常是公知的并且由轉子的生產商說明并再次引用作為參考。技術人員還公知轉子體積(ml)和轉子的最大流速(L/hr或者ml/min)可以容易地從生產商得到并且此處引用作為參考。
所計算的一個參數是轉子相對離心力(RCF)(×g)(見Rickwood，1994)?？梢允褂孟旅娴牡仁接嬎鉘CFRCF＝11.18×R×(Q/1,000)2，其中RCF＝相對離心力(×g)，R＝半徑(cm)，Q＝速度(轉/分鐘)。例如，基于下面的參數可以在PK3-800轉子中分離1000S的顆粒Rmax 6.6cm，Rmin 5.45cm，轉子最大速度40,500rpm。計算如下RCF＝11.8×6.6×(40,500/1,000)2RCF＝73.7881,640.25RCF＝12,1030xgRCF＝121,000xg同樣，對于Rmin值為5.45的轉子，計算RCF為99,900xg。
用于計算的另一參數是運行持續(xù)時間，其是K因子的函數。運行持續(xù)時間通常稱作“運行時間”或者“沉降時間”。為了測定1,000S顆粒的運行持續(xù)時間，可以從文獻確定或者如下計算轉子的K因子K=2.53×1011Q2LN(RMAX/RMIN)]]>例如，對于用于1,000S顆粒和轉子最大速度為40,500RPM的PK3-800轉子(Rmax 6.6cm，Rmin 5.45cm)，可以如下計算K因子K=2.53×1011405002LN(6.6/5.45)]]>
K=2.53×1011405002LN(6.6/5.45)]]>154.244 0.19145K＝29.53K也可以用于計算備選速度。例如，在35,000rpm或20,000rpm的速度下，通常使用下面的公式Knew＝K(Qmax/Qnew)2Qmax-轉子最大速度(rpm)Qnew-新設定的速度(rpm)。
從而，為了計算20,000rpm的K因子Knew＝K(Qmax/Qnew)2Knew＝29.53(40500/20000)2Knew＝29.53×4.100Knew＝121。
類似地，對于35,000rpm的K因子計算為39。
當確定K因子后，可以計算運行時間。例如，可以如下計算沉降時間(T)T＝K/ST-沉降時間(小時)S-沉積系數(S)。
從而，對于以20,000rpm在PK3-800轉子中離心的1,000S顆粒，可以如下計算運行時間T＝K/ST＝121/1000T＝0.211小時T＝7分16秒。
在另一實施方案中，可以以備選方式計算運行時間。更具體地，可以用下面的公式確定可縮放離心機運行中另一轉子的運行時間T轉子2＝T轉子1×(K轉子1/K轉子2)，其中T轉子1是第一個轉子的沉降時間，T轉子2是第二個轉子的沉降時間，K轉子1是第一個轉子的K因子，K轉子2是第二個轉子的K因子。
可以計算的另一參數是樣品流動速度。樣品流動速度是沉降時間(T)的函數并且如下計算F＝VF/TF-流動速度(L/hr)VF-流過體積(L)T-沉降時間PK3-800轉子通常具有50％的流過體積。從而，對于以20,000RPM運行的1,000S顆粒，可以如下計算流動速度F＝VF/TF＝0.4/0.121F＝3.3L/hrF＝55ml/min。
在本發(fā)明實施方案中離心機運行期間，細胞器在密度梯度內富集和積累(其中積累也可以指擴增)。在一個實施方案中，通過連續(xù)流動超速離心機，在密度梯度內富集和積累至少兩種或多種細胞器和/或它們的亞型。在另一實施方案中，積累至少兩種或多種類型的細胞器直到梯度被所述至少兩種或多種類型飽和。本發(fā)明的連續(xù)流動方法有利地以一定量積累至少兩種或多種細胞器和/或它們的亞型，所述量足夠分離和鑒定，例如，存在于所述至少兩種或多種細胞器和/或它們的亞型中的公知的和/或未鑒定的低豐度蛋白質。本發(fā)明的連續(xù)流動方法還有利地允許積累和富集大量特定亞型的細胞器，它們相對于生物樣品中細胞器群體的整個蛋白質組具有較不復雜的蛋白質組。
對于本發(fā)明，“富集”定義為如在標準條件下測量的相對于生物樣品中相同細胞器或者蛋白質，梯度位置中細胞器或者其蛋白質增加的倍數(例如，1.1X、2X、5X、10X、50X，等等)。在更一般的術語中，富集涉及與原始生物樣品中相同細胞器或者多種細胞器的相對量相比，特定梯度中細胞器或者多種細胞器的相對量的增加。富集還是勻漿物中兩種細胞器群體純化的形式，因為其將細胞器類型分離成相應于細胞器類型密度的密度梯度中的離散部分。
用于測定梯度，尤其特定梯度級分中細胞器或者其蛋白質富集的一般方法是對細胞器特異標記，如前面提到的那些特異標記進行蛋白質印跡分析。具體地，通常使用兩種目標梯度級分的歸一化量(例如，材料的標準化和/或可比較的量)進行蛋白質印跡分析，其中所述目標梯度級分來自本發(fā)明的分離和積累方法或者相應的原始生物樣品。然后通過將所測量的目的梯度級分中細胞特異標記的相對量除以相應原始生物樣品中的量計算富集。
例如，并且作為第一步，使用本領域公知的技術，例如Bradford或者Lowry蛋白質測定法將目的梯度級分和原始相應生物樣品的總蛋白質濃度歸一化。用于此類測定法的試劑和材料可以由本領域技術人員按照公知的方法(例如，Current Protocols in Biochemistry，JohnWiley & Sons，Inc.，1999，編者Juan S.Bonifacino)或者從商業(yè)來源購買(例如QIAGEN，INC.，CA)得到。測定兩種梯度級分和原始生物樣品的總蛋白質濃度可以包括溶解蛋白質，特別是其中的不溶蛋白質，例如，膜蛋白的步驟。溶解步驟通常包括例如，適宜的去污劑，如SDS或者Triton-X。一旦每種樣品中的蛋白質溶解，就通過離心沉淀可溶物質，如殘留的膜材料和/或殘渣，并除去含有可溶蛋白質的剩余上清液。然后使用標準方法，如上面提到的Bradford和Lowry測定法測量上清液的蛋白質濃度。
作為第二步，可比較的量-其可以等價于梯度級分和相應原始生物樣品的上清液-可以以相同或不同裝置，使用適宜的蛋白質分離材料，例如，聚丙烯酰胺進行電泳分離。通常，使用一維聚丙烯酰胺凝膠電泳。
通過本領域公知的印跡技術將分離的蛋白質轉移的適宜的支持介質(例如，“印跡紙”)，如硝酸纖維素。然后，可以通過本領域公知的蛋白質印跡分析技術測定細胞器特異標記的相對量。通常，在蛋白質印跡中，允許對所述細胞器特異的標記特異的第一抗體與印跡紙上分離的蛋白質反應適宜的時間，其中第一抗體將以一定量結合細胞器特異的標記，所述量與印跡中存在的細胞器特異標記的量成正比。
然后通過任意適宜的方法，例如，導入和檢測對第一抗體特異的第二抗體來檢測第一抗體的量。第一和/或第二抗體可以共價連接到可檢測的部分，例如，熒光分子，如酶，或者生色團。對于酶，可檢測的酶底物，如生色或熒光底物可用于檢測第一和/或第二抗體。然后可以測量并以數字形式，如象素代表印跡中存在的第一和/或第二抗體的量。
例如，通過蛋白質印跡分析通過測量來自目的線粒體級分或者相應原始生物樣品的蛋白質的歸一化量中線粒體特異標記的相對量可以通過蛋白質印跡分析測定含有線粒體的級分中線粒體的富集。梯度級分和原始生物樣品中線粒體特異標記的檢測可以通過熒光標記的第一和/或第二抗體和通過使用數字成像和/或照相檢測印跡中存在的熒光信號的量來檢測?？梢允褂脵z測和測量第一和/或第二抗體的熒光信號強度的任意本領域公知的儀器和/或計算機軟件，例如，可以從MOLECULAR DYNAMICS，INC(CA)得到的那些軟件。
數字信號的數目和/或強度相應于印跡上第一和/或第二抗體的相對量，其又相應于印跡上細胞器特異標記的相對量，其又相應于樣品中目的細胞器的相對量。以從目的梯度測量的細胞器特異標記的相對量與從原始生物樣品測量的細胞器特異標記的相對量的比率確定富集。
根據本發(fā)明方法的連續(xù)流動離心運行期間細胞器被富集并積累。例如，如上文解釋的，可以在導入生物樣品之前在連續(xù)流動離心機的轉子中建立密度梯度。同樣，可以將梯度材料加入到連續(xù)流動轉子中然后以足夠建立梯度的速度離心。一旦建立梯度，可以將生物樣品導入轉子中而轉子持續(xù)旋轉。如前面描述的，生物樣品通常是生物樣品的勻漿物并且含有細胞器、胞質溶膠組分和可能的膜碎片。如前面解釋，任選地在將生物樣品導入連續(xù)流動離心機的轉子之前，可以澄清生物樣品以除去大的顆粒物質，如細胞碎片和細胞核。
如前面解釋的，可以以連續(xù)方式向連續(xù)流動離心機的旋轉的轉子中導入生物樣品。例如，將生物樣品進料到轉子而轉子持續(xù)旋轉。加入生物樣品時轉子的速度可以保持恒定或者可以增加或者減小。可以使用任意適宜的方法向轉子導入樣品，所述方法包括但不限于，蠕動泵。此外并且如前面解釋的，樣品向轉子中的導入可以以任意適宜的人工、自動或者半自動方式進行并且可以包括使用任意適宜的模擬機器人和/或計算機控制系統(tǒng)。此外，可以向轉子導入任意適宜體積的生物樣品，包括，例如，小于、等于或者大于轉子中梯度物質體積的任意體積。
隨著生物樣品進入和開始通過轉子流動，其與轉子中的密度梯度接觸。密度梯度具有近端和遠端，其中近端的密度低于遠端密度。從梯度的近端移動到遠端，梯度根據特定密度譜增加密度。如前面解釋的，梯度的密度譜也可以稱作濃度譜，其可以為例如，線性、凸的或者凹的。密度梯度也可以認為含有不同的“部分”，其中每個部分具有在第一個密度下的近端和第二個密度下的遠端，其中第二個密度大于第一個密度。
生物樣品的特定組分是否進入梯度可以通過組分的物理特征以及連續(xù)流動離心機所用的參數來確定。此類物理參數包括，例如，組分的沉降值和浮力密度，和離心參數，例如，轉子的RCF(xg)和生物樣品的流速，所述物理參數可以在離心機運行期間增加或減小以影響不同組分向梯度的進入。在連續(xù)流動離心機的操作整個期間，包括生物樣品的導入期間可以改變離心機的參數，特別是RCF(xg)。
一旦生物樣品的組分進入梯度的近端，離心過程應用于組分的離心機導致組分通過一定速率經密度梯度遷移，所述速率部分取決于組分的物理性質，包括組分的浮力密度和沉降系數。組分通過梯度遷移直到到達等密度點，在該等密度點組分基于其浮力密度富集。
在離心運行期間，如前描述，可以向離心機引入其他生物樣品，以便積累生物樣品的組分。例如，當線粒體及其亞型在等于它們的浮力密度的部分富集時，向離心機加入更多的含有線粒體及其亞型的生物樣品導致在該梯度部分積累線粒體及其亞型。
收集細胞器。如圖1中所見，一旦完成了離心運行，就收集遷移到梯度中的細胞器。本發(fā)明公知的用于收集細胞器的任意技術在本發(fā)明的范圍內。例如，通過人工、自動化或者兩者的聯合除去梯度的容量級分可以收集細胞器并將它們保存和/或置于容器，例如，樣品管中?？紤]任意適宜的級分體積，例如，梯度總體積的1/10,000、1/1,000、1/100或1/10，或者它們的任意其他適宜的體積。容積級分可以是相同或不同的體積。此外，一旦收集，就可以將不同的容積級分合并在一起。
還可以基于所指定的密度范圍收集級分。在一個實施方案中，可以認為級分是第一個密度點和第二個密度點之間的并且包括第一個密度點和第二個密度點的梯度材料，其中第一個和第二個密度點是不同的。例如，可以收集10％和15％蔗糖之間并包括10％和15％蔗糖的所有梯度材料作為級分。特定級分的梯度密度可以使用通過商業(yè)途徑可以獲得的反射率分析器，例如，DMA4500、RXA156、或RXA170(ANTONPAAR，GMBH，奧地利)進行估計或者測量。
本發(fā)明的范圍考慮和包括用于收集梯度級分的任意其他自動化、半自動或者人工方法。對于用于從梯度收集級分的自動化或半自動化系統(tǒng)，本發(fā)明考慮任意適宜的模擬機器人系統(tǒng)，包括任意適宜的傳感器、電子儀器或者其他有用和/或必要的組件。用于收集梯度級分的自動化或半自動化系統(tǒng)可以稱作自動化或半自動化級分收集器，可以使用任意適宜的軟件或者計算機系統(tǒng)控制和/或編程。自動化和半自動化級分收集器可以是獨立裝置或者，在另一實施方案中，作為單板裝置與連續(xù)流動離心機集成。
細胞器分析。根據圖1，一旦收集細胞器，就通過本領域公知的方法分析細胞器。例如，使用本領域公知的任意適宜的方法可以鑒定和/或表征所收集的級分中的細胞器，所述方法為例如蛋白質印跡分析、酶測定法、使用對細胞器特異標記特異的熒光標記的抗體，和顯微術，例如，電子顯微術，或者任意公知的其他方法。通過這些方法，例如，可以例如針對級分中存在的不同類型的細胞器的相對量評估和表征級分的細胞器組分。例如，通過對級分進行蛋白質印跡分析并試驗細胞器(如線粒體、內質網、質膜和高爾基體)特異標記的存在，可以評估級分含有的這些細胞器的每種的相對量。關于前面方案的信息可以見通過商業(yè)途徑可獲得的文獻，例如，Current Protocols in CellBiology，John Wiley & Sons，Inc.，1999，編者Bonifacino等人或者Current Protocols in MolecularBiology.John Wiley & Sons，Inc.，1999，Juan S.Bonifacino編著。
而且，通過本領域中任意適宜的方法可以測定細胞器的完整性，所述方法為例如，定量酶測定法、對細胞器特異標記蛋白質的蛋白質印跡和電子顯微術實驗?？梢杂猛干潆娮语@微術(TEM)鑒定細胞器和定量地通過它們的形態(tài)(例如，大小、形狀、結構組織和密度)表征細胞器，所述完整性通常與細胞器的功能相關。換句話說，具有更高程度完整性的細胞器將具有更完整的功能。
細胞器應用。通過本發(fā)明所得細胞器可以用于蛋白質組學領域，以及其他領域。此類其他領域包括，但不限于，基因組學、神經化學、免疫化學、生物化學、組織學、植物學、植物生物化學、生理人類學、法醫(yī)病理學及其組合。技術人員將理解細胞器可以怎樣用于這些學科。此外，通過本發(fā)明方法所得細胞器可以用于開發(fā)診斷劑、藥物、化學品和疫苗，它們用于例如人、動物、牲畜和寵物護理。
蛋白質表征和定量。圖2涉及表征和定量細胞器中存在的蛋白質。根據本發(fā)明方法的亞細胞細胞器和其他亞細胞結構的分離、富集和積累可以認為是“預先分級分離”生物樣品的蛋白質組的方法，因為細胞的蛋白質組分成不同類型的亞細胞細胞器和結構。從而，一旦分離和純化了細胞器，就可以將完整的整個生物樣品的蛋白質組有效分級分離成亞蛋白質組組分。本發(fā)明的方法減小了生物樣品的蛋白質組的復雜性并方便了蛋白質組的蛋白質組分的隨后分離。
裂解細胞器。如圖1中所見，通過本領域公知的任意技術裂解積累的細胞器。通常進行裂解從而以足夠釋放細胞器內含物的方式破壞細胞器的膜。細胞器內含物包括，例如，細胞器的蛋白質組。
分離蛋白質和肽。一旦實現了亞細胞細胞器的富集、積累和裂解，可以分析每種分離的細胞器(例如，每種細胞器的亞細胞蛋白質組)的蛋白質組分以方便檢測目的蛋白質，如低豐度蛋白質。分析多種蛋白質和肽，如細胞器的亞細胞蛋白質組的不同方法是本領域公知的。本領域普通技術人員可以選擇最適宜的蛋白質分離和純化技術而不背離本發(fā)明的范圍。
具體方法的一個實例是二維(2D)凝膠電泳。復雜蛋白質溶液，如亞細胞蛋白質組的二維凝膠電泳導致多肽的分離的圖案，本領域通常稱作分辨圖案，其可以用于進一步研究所述多肽的身份。例如，可以用蛋白質印跡通過用特定抗體探測來鑒定特定類型、類別或者特定蛋白質或者其片段。此外，通過將質譜儀產生并檢測的所得多肽片段的分子量譜與質譜法數據庫或者完整基因組序列或者多肽數據庫進行比較可以用質譜法確定凝膠中分辨的蛋白質的身份。
檢測和鑒定方法可以自動化或半自動化。而且，可以使用本領域技術人員公知的模擬機器人或者高通量儀器。
用于研究蛋白質的其他技術包括，例如，液相層析，如正常和反相的，使用HPLC、FPLC等等；大小排阻層析；固定化金屬螯合層析；親和層析；和任意其他層析方法；蛋白質結合分析；酵母雙雜交分析；三維結構研究；凝膠電泳，如一維和二維凝膠電泳；和最近的蛋白質/多肽微陣列，和生物信息學。
本發(fā)明范圍內用于分離蛋白質和多肽另一種技術是多維液相層析(“MDLC”)，也稱作“MudPIT”。MudPIT用作二維凝膠電泳的備選方法鑒定蛋白質組中不同的、部分重疊的蛋白質集合。不是使用最初蛋白質分離步驟，像二維凝膠電泳，而是將生物樣品的完整蛋白質組，如用于富集細胞器的梯度級分首先用胰蛋白酶消化。所得肽的復雜混合物通過MDLC，使用強陰離子交換(SAX)和反相(RP)柱聯合進行分辨，通過串聯的質譜法(MS/MS)分析分離的肽。從肽的MS/MS所得信息用于預測蛋白質身份。
通常通過聯合2D-GE的高分辨分離技術與基質輔助的激光解吸-電離(“MALDI”)質譜法的高靈敏鑒定能力進行蛋白質組分析。已經開發(fā)了基于該聯合的幾種策略。最近，已經出現了基于ESI/MS/MS的方法，其用作蛋白質組分析的補充或者備選技術。此類方法包括對復雜樣品的總體蛋白質酶解消化，然后使用一次或多次重復的串聯的層析步驟部分分離蛋白質酶解混合物，然后使用MS/MS，通常通過電噴霧電離界面分析肽獨立于用于得到數據的策略，將所消化肽的通過實驗得到的質量輸入數據庫檢索程序以便將所得值與給定數據庫內對來源于所有蛋白質的胰蛋白解肽的理論計算值匹配。
表征和定量蛋白質和肽。再次參考圖2，表征和定量蛋白質，如低豐度蛋白質，和來源于本發(fā)明的肽的技術包括，例如，任意公知的生物化學方法、酶測定法、抗體免疫反應、配體分析、蛋白質/肽質譜法、底物分析或者它們的聯合。用于驗證蛋白質功能的實驗法類型通常取決于關于該蛋白質的預測功能的知識并且由所述知識指導。
在一個實施方案中，可以從二維凝膠得到蛋白質水平的相對定量，這可以通過使用計算機軟件，例如，Nonlinear Dynamics的Phoretix 2D Evolution來分析凝膠圖像的數字形式的蛋白質/肽點的強度來實現?？梢允褂貌话ǘS凝膠的其他方法，如同位素編碼的親和標記(ICAT)(APPLIED BIOSYSTEMS，CA)。
ICAT方法使用與蛋白質反應的試劑的重和輕形式。除了該“同位素編碼”，該試劑還具有化學基團碘乙酰胺，其與半胱氨酸巰基反應，還具有親和標記生物素，其方便純化。ICAT實驗通常包括將蛋白質組與試劑的輕形式反應并將另一蛋白質組與重形式反應。然后合并標記的蛋白質組并使用適宜的工作流儀器分析。例如，通過胰蛋白酶產生的經標記的肽可以從非標記肽親和純化以減小所分析的肽混合物的復雜性。然后通過MS分離和分析親和純化的肽。
ICAT標記的肽的質譜通常含有質量不同的離子對，所述不同與重和輕試劑重的質量的差異相等。因為在相同質譜中測量肽，所以可能得到兩種蛋白質組中肽和蛋白質的相對定量。ICAT用于定量不適于二維凝膠電泳的蛋白質或者亞蛋白質組。
鑒定蛋白質。技術人員可以利用的任意鑒定和分析技術可以用以鑒定通過本發(fā)明所得蛋白質和肽。用于鑒定和研究蛋白質的技術包括，例如，質譜法、共免疫沉淀、親和層析法、蛋白質結合分析、酵母雙雜交分析、三維結構研究和最近的蛋白質/多肽微陣列和生物信息學。一些更常見的鑒定技術包括2D-GE聯合MALDI；ESI/MS-MS和串聯質譜法(MS-MS)，其通常通過電噴霧電離界面。
在一個實施方案中，本發(fā)明從通過本文方法積累的細胞器分離了基本上純形式的蛋白質，尤其一種或多種低豐度蛋白質。例如，可以從聚丙烯酰胺凝膠，如本發(fā)明的二維聚丙烯酰胺凝膠除去低豐度蛋白質，并使用標準技術從中純化。使用其他本領域公知的技術，如使用特定目的低豐度蛋白質的特異抗體的免疫沉淀或者免疫親和層析。此外并且如本文更詳細解釋的，使用本領域中公知的技術可以克隆編碼目的低豐度蛋白質的基因，在宿主生物體中表達，并分離和純化。
本發(fā)明的低豐度蛋白質不限于任何具體類別。低豐度蛋白質可以基于細胞中它們的相對量或者拷貝數分類。例如，公知通常的細胞具有約109個蛋白質分子，至少104個獨特蛋白質種類并針對拷貝數具有數量級的“動態(tài)范圍”(即，少于102個拷貝到大于107個拷貝)?！皠討B(tài)范圍”是細胞中蛋白質顯示出最低拷貝數到最高拷貝數的范圍。細胞中約9,000種蛋白質以少于約1,000個拷貝/細胞存在并且稱作“低豐度蛋白質”。細胞中低豐度蛋白質的和通常構成約3％以下的細胞質量。例如，酪氨酸激酶以每個細胞30-40個拷貝存在。此外。某些低豐度蛋白質可以以約皮摩爾(pM)或者10-9到約飛摩爾(fM)或者10-12濃度，例如約10-9、約10-12，或者低于約10-9的濃度存在。
使用公知的蛋白質分析儀器和/或方法通常難以檢測低豐度蛋白質。例如，在二維凝膠電泳中低豐度蛋白質由于低拷貝數和/或它們與多種優(yōu)勢蛋白質重疊而難以以“點”(凝膠上電泳分離的多肽)檢測。本發(fā)明考慮任意低豐度蛋白質，甚至以小于約750、500、250或者100個拷貝/細胞，或者甚至約1個拷貝/細胞存在的已知或未知、細胞內或細胞外的低豐度蛋白質(如間質間隙中的蛋白質、神經遞質和信號蛋白)。
經表征的公知和未知蛋白質的蛋白質應用。
再次參考圖2，有許多方法可以利用通過本發(fā)明方法得到的蛋白質，如低豐度蛋白質。例如，通過本發(fā)明方法得到的蛋白質可用于開發(fā)診斷劑、藥物、化學品和疫苗，用于例如，人、動物、牲畜和寵物護理領域。
本發(fā)明的一個應用提供了分析兩組生物樣品之間或者作為時間的函數的蛋白質組改變的方法。時間涉及采集生物樣品，如活組織檢查的時間點。在該實施方案中，通常通過本領域公知的勻漿或者裂解方法從生物樣品釋放至少兩種類型的亞細胞細胞器。然后所述至少兩種類型的亞細胞細胞器導入連續(xù)流動離心機內的密度梯度。應用離心力，優(yōu)選大于或者約100,000×g的離心力，從而至少兩種類型的亞細胞細胞器在密度梯度內遷移。在一個實施方案中，以單次運行進行離心。離心后，從密度梯度收集所述至少兩種類型的亞細胞細胞器。然后從所述至少兩種類型的亞細胞細胞器分離和純化蛋白質以在第一時間測定所述至少兩種類型的亞細胞細胞器的蛋白質組譜。該方法還可以用一種類型的亞細胞細胞器進行。
提供第二種生物樣品并從中收集至少兩種不同類型的亞細胞細胞器。然后所述至少兩種類型的亞細胞細胞器導入連續(xù)流動離心機內的密度梯度；應用離心力，從而至少兩種類型的亞細胞細胞器在密度梯度內遷移，優(yōu)選單次運行。離心后，從密度梯度收集所述至少兩種類型的亞細胞細胞器。然后從所述至少兩種類型的亞細胞細胞器分離和純化蛋白質以在第二時間測定所述至少兩種類型的亞細胞細胞器的蛋白質組譜。該方法的該部分也可以以一種類型的細胞器進行。最后，通過本領域公知的技術分析在第一時間和第二時間的蛋白質組譜以檢測蛋白質組譜隨時間的改變。本發(fā)明發(fā)現了在例如，在疾病分析和當比較個體或者不同組的個體的蛋白質組譜時的應用性。
在另一蛋白質應用實施方案中，使用本領域的方法可以分析蛋白質轉運事件。更具體地，轉運過程涉及轉運蛋白質或者作為時間的函數的轉運蛋白質的細胞內和/或細胞間運動。首先測定第一種生物樣品的第一種和第二種類型細胞器中轉運蛋白質的相對量。該方法包括，例如，在足夠將第一種和第二種細胞器釋放到勻漿物的條件下勻漿第一種生物樣品，其中第一種和第二種細胞器每種含有一種亞細胞蛋白質組。然后將勻漿物導入連續(xù)流動離心機內的密度梯度。對勻漿物應用離心力從而第一和第二種細胞器在密度梯度內遷移。從密度梯度除去第一和第二種細胞器，并隨后溶解第一和第二種細胞器的亞細胞蛋白質組。溶解后，檢測第一種生物樣品中第一和第二種細胞器中的轉運蛋白質，并測量所檢測的轉運蛋白質的水平。
第二種生物樣品也按照第一種生物樣品的途徑類似處理。即，在足夠將第一種和第二種細胞器釋放到勻漿物的條件下勻漿第二種生物樣品，其中第一種和第二種細胞器每種含有一種亞細胞蛋白質組。然后將勻漿物導入連續(xù)流動離心機內的密度梯度。對勻漿物應用離心力從而第一和第二種細胞器在密度梯度內遷移。從密度梯度除去第一和第二種細胞器，并隨后溶解第一和第二種細胞器的亞細胞蛋白質組。溶解后，檢測第二種生物樣品中第一和第二種細胞器的轉運蛋白質，并測量所檢測的轉運蛋白質的水平。
檢測和側鏈第一個和第二種生物樣品的一種和/或幾種轉運蛋白質后，分析轉運過程。例如，通過比較第一次和第二次每種生物樣品的第一和第二種細胞器中所檢測的轉運蛋白質的測量水平可以測定作為時間的函數的轉運蛋白質的轉運過程。
如圖19(A)(3-4)所示，本發(fā)明還考慮涉及分析和分離細胞器蛋白質和檢測和/或鑒定其低豐度蛋白質的信息可以提供給、傳輸或者儲存到數據庫，該數據庫可以在以后的時間點由相同或另一用戶進入。本發(fā)明考慮在分離蛋白質組的所述蛋白質或者檢測低豐度蛋白質的方法期間產生或收集的任何數據可以傳輸或者轉移到第三方。例如，涉及二維電泳上分辨的蛋白質的模式的圖像數據或者涉及凝膠上分辨的蛋白質的不同表達水平的信息可以通過電子傳輸，例如，通過email，或者通過因特網或者網絡傳輸給第三方、傳輸到數據庫或從數據庫輸出、傳輸到實驗室、個人或者研究組。所述數據還可以電子轉移(“例如，發(fā)布)到網絡，如萬維網或者其他全球通訊網絡。
本領域技術人員將理解本發(fā)明的數據庫可以具有許多不同形式和/或結構并且可以使用用于電子存儲和信息檢索的任意公知的方案。本發(fā)明還考慮為了商業(yè)目的提供數據庫的存取。存取可以通過全球通訊網絡，如萬維網。
一旦通過本發(fā)明考慮的檢測方法，如通過質譜法鑒定了低豐度蛋白質，就可以從完整基因組序列數據庫得到蛋白質或者蛋白質片段的完整氨基酸序列。本發(fā)明還考慮通過比較序列分析方法評估目的低豐度蛋白質的假想功能。此類方法是本領域熟知的并且涉及在桌面電腦或者工作站本地可以得到或者可以通過網絡，如萬維網可以得到的計算機軟件，其使用算法比較目的氨基酸序列(例如，“查詢序列”)與數據庫中所含氨基酸序列以鑒定與功能已知多肽序列相似的多肽。該一般方法可以鑒定為“同源性搜索”。同源性搜索不是肯定鑒定查詢序列的功能，而是建立特定序列具有相同或相似序列的可能性?？梢赃M行實驗以進一步證實或驗證目的蛋白質，例如，低豐度蛋白質的功能。
從而，本發(fā)明的低豐度蛋白質可以基于與多種數據庫，例如GenBank、Swiss-Prot、和Protein Data Bank等中的蛋白質序列的比較序列分析(例如，同源性搜索)可以將預測的功能分配給本發(fā)明的低豐度蛋白質。術語“百分數同一性”在氨基酸序列上下文中指當進行最大對應比對時兩個序列中相同的殘基。本領域公知的多種不同的算法可用于測量序列相似性或同一性。例如，使用NCBI BLASTp和/或GCG版本6.1中的程序可以比較多肽序列。FASTA提供了查詢和搜索序列之間最佳重疊的區(qū)域的比對和百分數同一性。
備選地，在DNA或RNA上下文中，使用可以從NCBI得到的Myers和Miller，(″Optimal Alignments in Linear Space″，CABIOS 4，11-17，1988)的“Align”程序可以確定核苷酸序列相似性或同源性或同一性。術語“相似性”或“同一性”或“同源性”例如當關于核苷酸序列時，意在表示兩種序列之間同源性的定量測量。百分數序列相似性可以計算為(Nref-Ndif)*100/Nref，其中Ndif是兩種序列比對時不同一殘基的總數，并且其中Nref是序列之一中的殘基數。因此，DNA序列AGTCAGTC將與序列AATCAATC具有75％的序列相似性(Nref＝8；Ndef＝2)。備選地或者額外地，對于序列，“相似性”指相同核苷酸的位置數除以兩條序列的較短者中核苷酸數，其中可以根據Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman，1983 PNAS USA 80726)確定兩條序列的比對，例如，使用20個核苷酸的窗口大小，字長4個核苷酸和空位罰分4，和計算機輔助分析并且包括比對的序列數據解釋可以使用通過商業(yè)途徑可獲得的程序(例如，IntelligeneticsTMSuite，Intelligenetics Inc.CA)方便地進行。當提到RNA序列與DNA序列相似或者具有一定的序列同一性程度時，認為DNA序列中胸苷(T)等于RNA序列中尿嘧啶(U)。
一旦對給定目的蛋白質，特別是低豐度蛋白質確定了假想或者預測的功能，可以起草專利申請并提交合適的國家和/或國際專利局。該申請可以涉及例如，目的蛋白質，從同源性搜索預測所述蛋白質的功能。權利要求可以涉及例如，目的蛋白質的氨基酸序列，其基于預測功能的用途，或者攜帶編碼所述目的蛋白質的DNA的任意克隆載體或者表達載體。
如圖19(C)(8)中所見，本發(fā)明還考慮證實目的蛋白質，如低豐度蛋白質的所預測的功能?？梢允褂蒙锘瘜W、免疫學、生理化學、蛋白質結構和遺傳技術或者本領域技術人員公知的任意技術進行證實。在一個實施方案中，如圖19(B)(7)中所見，本發(fā)明考慮克隆編碼目的蛋白質的核酸序列。可以用不同的策略克隆編碼目的蛋白質的基因、基因片段或者核苷酸序列。例如，基于目的蛋白質的序列可以設計簡并核苷酸探針并用于從DNA或者cDNA文庫篩選攜帶DNA編碼片段的質粒或者載體克隆。在另一實例中，通過PCR使用基于目的蛋白質的序列的引物可以擴增編碼目的蛋白質的核苷酸序列。此外，可以隨后進行克隆步驟以得到編碼核苷酸序列的轉錄控制區(qū)。不僅可以從生物材料的最初來源，還可以從含有相似序列的生物材料的另一來源得到核苷酸序列。
一旦克隆了編碼核苷酸序列，其可以進一步工程化到表達載體中，在宿主細胞中表達，分離，并進一步分析，以通過對目的蛋白質的功能的實驗法進行評估和證實。從而，本發(fā)明的多肽，如所檢測的低豐度蛋白質，可以重組產生并在單細胞宿主中表達。為了得到外源DNA序列在宿主中的高水平表達，序列通常可以可操作性連接到轉錄和翻譯表達控制序列，其在所選宿主中是有功能的。優(yōu)選地，表達載體可以含有表達控制序列和目的基因，還含有選擇標記。
編碼本發(fā)明的多肽的DNA序列可以編碼或不編碼信號序列。如果表達宿主是真核的，通常優(yōu)選編碼信號序列從而成熟糖蛋白從真核宿主分泌。
本發(fā)明組合物中的所表達的多肽上可以存在或不存在氨基末端甲硫氨酸。如果末端甲硫氨酸不被表達宿主切割，其可以(如果希望)通過標準技術用化學方法除去。
多種表達宿主/載體組合可用于表達編碼WNV多肽的DNA序列，WNV多肽可以用于本發(fā)明的藥物組合物和疫苗?？捎糜谡婧怂拗鞯谋磉_載體包括，例如，含有來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、巨細胞病毒和逆轉錄病毒(包括慢病毒屬)的表達控制序列的載體?？捎糜谠诩毦拗髦斜磉_的載體包括細菌質粒，如來自大腸桿菌的質粒，如pBluescript、pGEX-2T、pUC載體、colE1、pCR1、pBR322、pMB9和它們的衍生物、pET-15、更寬宿主范圍的質粒，如RP4、噬菌體DNA，例如，λ噬菌體的多種衍生物，如λGT10和λGT11，和其他噬菌體?？捎糜诮湍讣毎谋磉_載體包括2μ質粒及其衍生物。可用于昆蟲細胞的載體包括pVL 941。
此外，多種表達控制序列——控制與其可操作性連接的DNA序列表達的序列的任意一種可以用于這些載體中表達用于本發(fā)明組合物的多肽。此類有用的表達控制序列包括結合前面的表達載體的結構基因的表達控制序列。有用的表達控制序列的實例包括，例如，SV40或腺病毒的早期和晚期啟動子、trp系統(tǒng)、TAC或者TRC系統(tǒng)、T3和T7啟動子、λ噬菌體主要操縱基因和啟動子區(qū)、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油激酶或者其他糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子，例如，Pho5，酵母交配系統(tǒng)的啟動子和其他組成性和可誘導的啟動子序列，公知所述啟動子序列控制原核或真核細胞或者它們的病毒的基因的表達，和所述表達控制序列的多種組合。
術語“宿主細胞”指導入重組DNA分子的一種或多種細胞。本發(fā)明的宿主細胞包括，但不限于，細菌、酵母、動物、昆蟲和植物細胞。宿主細胞可以是單細胞的，或者可以以組織培養(yǎng)作為液體培養(yǎng)物、單層等等生長。宿主細胞還可以直接或間接來源于組織。
多種單細胞宿主細胞可用于表達編碼用于本發(fā)明的藥物組合物的多肽的DNA序列。這些宿主可以包括熟知的真核和原核宿主，如大腸桿菌、假單胞菌屬、芽孢菌屬、鏈霉菌屬、真菌、酵母菌株，昆蟲細胞，如草地夜蛾(SF9)、動物細胞，如CHO和小鼠細胞，非洲綠猴細胞，如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10，和人細胞，以及植物細胞。
當核酸從細胞外環(huán)境轉移到細胞中時，宿主細胞被核酸“轉化”。可以使用用于轉移核酸的任意方法；除非另外說明，該術語不暗含將核酸遞送到細胞的任何具體方法，也不暗含任何用于轉化的具體細胞類型。
“表達控制序列”是調節(jié)基因表達(即，轉錄、RNA形成和/或翻譯)的核酸序列。表達控制序列可以取決于例如，所選的宿主細胞或生物體(例如，原核和真核宿主之間)、轉錄單位類型(例如，哪一種RNA聚合酶必須識別該序列)、基因通常在其中表達的細胞類型(和通常存在于該細胞類型中的生物學因子)而改變。
“啟動子”是一種這樣的表達控制序列，和如本文所用的，指控制、調節(jié)和/或指導下游(3’)核酸序列轉錄的一組核酸序列。文中所用啟動子包括轉錄起始位點附近的必要核酸序列，對于II型聚合酶啟動子，為TATA元件。
“組成性”啟動子是在多數環(huán)境和發(fā)育條件下具有活性的啟動子?！翱烧T導的”啟動子是在至少一種環(huán)境或者發(fā)育條件下無活性并且可以通過改變所述條件“開啟”的啟動子?！敖M織特異”啟動子在生物體的某些組織類型下是有活性的，但是在來自同一生物體的其他組織類型中是無活性的。類似地，發(fā)育調節(jié)的啟動子在宿主生物體的某些但不是所有發(fā)育階段是有活性的。
表達控制序列還包括遠端增強子或者抑制子元件，其可以距離轉錄起始位點幾千個堿基對。它們可以包括RNA形成(例如，適宜時，加帽、剪接、3’末端形成和多腺苷酸化)；翻譯(例如，核糖體結合位點)；和翻譯后修飾(例如，糖基化、磷酸化、甲基化、異戊二烯化，等等)所需的序列。
術語“可操作性連接”指核酸表達控制序列(如啟動子，或者轉錄因子結合位點排列)和第二核酸序列之間的功能連接，其中表達控制序列指導相應于第二序列的核酸的轉錄。
當然應該理解不是所有載體和表達控制序列相等地發(fā)揮功能以表達所提到的多肽。也不會所有宿主對相同的表達系統(tǒng)相等地發(fā)揮功能。然而，技術人員將在這些載體、表達控制序列和宿主之間進行選擇而不用過多實驗并且不背離本發(fā)明范圍。例如，選擇載體時，通常應該考慮宿主，因為載體在宿主中復制。還應該考慮載體的拷貝數、控制該拷貝數的能力、控制整合的能力(如果存在)，和載體編碼的任意其他蛋白質，如抗生素或其他選擇標記的表達。
在選擇表達控制序列時，還應該考慮多種因素。這些因素包括例如，啟動子序列的相對長度，其可控制性，和其與本發(fā)明描述的肽的DNA序列，尤其與潛在二級結構的相容性。應該通過考慮單細胞宿主與所選宿主的相容性、編碼用于藥物組合物的糖蛋白的DNA序列編碼的產物的毒性、它們的分泌特征，它們正確折疊成多肽的能力，它們的發(fā)酵或者培養(yǎng)要求，和從DNA序列編碼的產物純化它們的容易性來選擇單細胞宿主。
在這些參數中，技術人員可以選擇多種載體/表達控制序列/宿主組合，其將表達發(fā)酵或者其他大規(guī)模培養(yǎng)產生的用于藥物組合物的DNA序列編碼產物。
使用本文別處描述的多種常規(guī)方法可以從發(fā)酵或者細胞培養(yǎng)分離并純化本發(fā)明描述的多肽。本發(fā)明技術人員可以選擇最合適的分離和純化技術而不背離本發(fā)明的范圍。如果多肽是膜結合的或者懷疑為脂蛋白，那么可以使用本領域公知的用于此類蛋白質的方法，如使用多種適宜的去污劑分離所述多肽。
一旦通過實驗了解或者證實了目的蛋白質的功能，那么人們可以具有有價值的知識產權，其可以通過申請國家或者國際專利來保護，所述專利涉及目的蛋白質，例如低豐度密度蛋白質、其氨基酸序列、其功能和/或生物活性、其伴隨的核苷酸序列，和含有該伴隨核苷酸序列的克隆載體和表達載體。具體地，目的蛋白質的經證實的功能可以實際上建立得到國家或者國際專利的實用性要求。通過上面的步驟產生的信息，尤其目的蛋白質，如低豐度蛋白質的經證實的功能可以分發(fā)或者傳輸到第三方用戶，例如，制藥公司、生物技術公司、數據庫部門、生物信息公司，或者私人或者公共研究所。如圖20(C)(11-12)所指出的，本發(fā)明考慮涉及分析和分離細胞器蛋白質和檢測和/或鑒定其低豐度蛋白質的信息可以提供給或者傳輸到或者儲存在數據庫，該數據庫可以在以后由相同或者另一使用者使用。
本發(fā)明還包括傳輸信息數據，例如公開所鑒定的蛋白質的氨基酸序列或者編碼所鑒定蛋白質的核酸分子、關于特定一種或幾種細胞器的疾病相關的蛋白質組譜的信息、關于應用特定刺激，例如藥物時特定一種或幾種細胞器的蛋白質組譜中的改變的信息的方法，所述每種信息都通過數字方法，如通過傳真、電子郵件、電話或者全球通訊網絡，如萬維網傳輸。例如，可以通過網站錄入，如通過預約或選擇/保護對網站的進入和/和通過電子郵件和/或通過電話、IR、收音機、電視或者其他頻率信號，和/或通過電纜和/或衛(wèi)星傳輸電子信號和/或通過磁盤、光盤(CDs)、計算機、硬驅或者含有電子形式的信息的其他裝置傳輸，和/或通過信息的書寫形式傳輸，例如，通過傳真?zhèn)鬏數鹊取亩?，本發(fā)明包括用于根據本發(fā)明進行和傳輸信息；例如，傳輸到一個或多個用戶，所述用戶然后再利用一些或者全部所述數據或者信息，例如，用于生產產品，如治療劑、測定法和診斷試驗等等。本發(fā)明包括用于儲存或接受或傳輸含有來自本發(fā)明方法和/或使用本發(fā)明方法得到的信息的數據或者信息的唱片、CD、計算機或者其他裝置或方法。從而，本發(fā)明包括傳輸信息的方法，其包括實施如本文討論的方法并傳輸其結果。
此外，本發(fā)明包括商業(yè)方法，其包括實施或者使用一些或者所有本文的方法或者從該方法得到的細胞器、蛋白質、化合物、組合物或者產品，和通信或傳輸或者公布其一個或多個結構，有利地用于交換補償，如費用。有利地，信息的通信、傳輸或者公布是通過電子方式，例如，通過因特網或者電子郵件，或者通過本文討論的任意其他傳輸方法。從而，本發(fā)明包括商業(yè)的方法，其包括從本發(fā)明方法得到的細胞器、蛋白質、組合物、化合物和產物，和本發(fā)明的方法。
從而，第一方“客戶”可以通過例如，本文提到的傳輸方法的任意一種向第二方“廠家”要求以前準備的信息或者專門定購關于所檢測的低豐度蛋白質的具體氨基酸序列的信息，例如通過電子方式如通過因特網(例如，要求輸入網站)或者通過電子郵件要求信息。廠商可以通過例如本文提到的傳輸方法的任意一種，有利地通過電子方式，如通過因特網(例如，保護或者預定或者選擇進入網站)或者電子郵件傳輸所述信息。信息可從根據要求進行本文提到的部分或所有方法或者使用本發(fā)明的方法得到，或者從進行本文提到的部分或所有方法，并產生進行本文提到的部分或所有方法或者使用本文的算法得到的信息的文庫。然后通過響應要求允許客戶存取文庫或者從該文庫選擇數據可以滿足所述要求。
因此，本發(fā)明甚至還包括通過進行或者使用本文方法或者裝置得到的例如電子形式(如上面討論的傳輸形式)的信息集。
此外通過下面的闡明性非限制性實施例描述本發(fā)明，所述實施例提供了對本發(fā)明以及其優(yōu)點的更好的理解。
實施例給出下面的實施例用以闡明根據本發(fā)明的多種實施方案。然而，下面的實施例絕不限制本發(fā)明。
實施例1.從肝細胞平行分離、純化和富集線粒體、高爾基體、內質網和質膜肝臟勻漿。組織分離前從禁食過夜的Wistar大鼠(150-200g)收獲約100g大鼠肝臟。用Waring攪拌器(10秒低、10秒高和10秒低)將肝臟在5體積的勻漿緩沖液(補加無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的0.5M蔗糖、20mM HEPES-KOH、5mM MgCl2)中勻漿。勻漿后，通過以4-5000×g離心10分鐘得到核后(post-nuclear)上清液。第一次核后旋轉后，小心傾析上清液。通過加入等體積稀釋緩沖液(20m MHEPES-KOH，pH7.2，5mM MgCl2)將核后上清液平衡到等滲條件。
連續(xù)流動離心。對于連續(xù)流動離心，在PK3-800轉子中建立蔗糖梯度，之后將大鼠肝勻漿物進料到機器。使用約20ml/分鐘的流速并且PKII對于第一次通過最初使用20,000rpm，然后對于第二次通過使用最大速度40,000rpm。捕獲流出的樣品并以后進行分析以確定對靶細胞器的捕獲效率。所有勻漿物都進料入系統(tǒng)給予細胞器額外的時間以達到它們的成帶密度。將轉子進行受控的停止并以25ml等分試樣從底部除去轉子內含物。
在另一實驗中，將緩沖液(250mM蔗糖、20mM HEPES-KOH，pH7.2，5mM MgCl2)裝入PK3-800轉子并通過將轉子以10,000rpm從系統(tǒng)除去空氣。通過管線的流量增加到300ml/分鐘并且通過轉子的流量減小到幾分之一直到從系統(tǒng)除去了空氣。停止轉子并將梯度材料(即蔗糖)泵入以裝填轉子體積的一半(約400ml)。
轉子在自動運行條件下加速到最大速度(35,000rpm或40,000rpm)。在梯度形成期間允許緩沖液流量持續(xù)為約40ml/分鐘。一旦勻漿物合并物可以進行處理，將轉子速度降低到20,000rpm。勻漿物以20ml/分鐘進料并收集流出材料，并保留樣品用于以后分析。
將裝入物轉換回緩沖液并且轉子速度增加到35,000rpm或40,000rpm。然后將從20,000rpm裝入物收集的流出物再以20ml/分鐘裝入PKII。收集流出物并保留樣品用于以后分析。
將裝入物轉換回緩沖液并且管線變得清澈。然后關掉物流并允許轉子中的材料在45分鐘或2小時內成帶。停止轉子并立即收集級分。制備等分試樣并保存在-80℃。工作等分試樣保存在4℃用于立即分析。
離心后鑒定細胞器。離心后，通過蛋白質印跡、酶測定法和電子顯微術測定所分離細胞器的完整性、分離和富集。這些實驗的結果在圖3-6中總結。
圖3顯示了如上所述分離和積累這些細胞器后蔗糖梯度的不同級分中線粒體、高爾基體、內質網和質膜和它們的亞型的分布。該圖的X軸相應于用于測量細胞器含量的每個級分。Y軸指出相對于檢測這些細胞器和它們的亞型的每一種的梯度范圍內的群體，在相應蔗糖梯度級分中檢測的這四種細胞器和其亞型的百分數。Y2軸顯示了每種相應的梯度級分的蔗糖百分數。圖3指出了這些細胞器和它們的亞型的每一種在梯度中不同且明確的位置分布。
圖4顯示了如上面描述的分離和積累如下細胞器后，線粒體、高爾基體、內質網和質膜和它們的亞型在蔗糖梯度的不同級分中的相對富集。圖的X軸對應于用于測量相對細胞器標記應答的每種級分。Y軸指出在相應蔗糖梯度級分中檢測的相對于對這些細胞器和它們的亞型的每一種檢測的梯度范圍內的群體，這四種細胞器和它們的亞型的相對于細胞器標記應答(象素)。Y2軸顯示每種相應的梯度級分的蔗糖百分數。圖4表明使用本發(fā)明的方法，這些細胞器和它們的亞型的每一種在梯度中不同且明確的位置中的相對富集。
圖5顯示了分離的細胞器的高度完整性水平-高于本領域中通常見到的值。數據表明內質網、線粒體、高爾基體和質膜和它們的亞型分別達到76.3％(內質網)、72.6％(線粒體)、89.3％(高爾基體)和72.7％(質膜)的完整性水平。通過比較本發(fā)明的細胞器制備物的可溶和不可溶相之間的細胞器特異酶活性確定完整性。將不可溶級分(細胞器)的酶活性相對于對可溶(上清液)和不可溶級分確定的總的酶活性進行比較。
通過定量酶測定、對細胞器特異標記蛋白質的蛋白質印跡和電子顯微術實驗一起測定內質網的完整性。具體地，平行測定沉淀和上清液的細胞器特異標記酶和蛋白質。檢測到沉淀中標記水平＞60％表明是完整的。相比，在上清液中檢測到標記蛋白質表明細胞器的外周受到損傷。對于蛋白質印跡，用與用于測定純度的方法相同的抗體檢測細胞器特異標記。即，用抗-BiP/GRP78抗體(BD BIOSCIENCES)檢測內質網。
用發(fā)射電子顯微術(TEM)通過細胞器的形態(tài)(大小、形狀、結構組織)定性地表征細胞器的完整性，所述形態(tài)與功能相關。為了通過電子顯微術確定細胞器完整性，離心運行后立即從分級分離步驟收集樣品以避免進一步操作的潛在損害?；谖墨I中關于各自細胞器報導的預期的密度范圍選擇樣品。所選的級分經沉淀并在溶于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)的4％甲醛、1％戊二醛的溶液中固定，并在4℃保存直到需要制備。將樣品包埋、切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并使用Zeiss電子顯微鏡觀察。
圖6比較粗提樣品和按照上述方法分級分離后內質網級分的TEM。如與粗提物的TEM相比的，可以看出ER級分中存在的亞細胞結構幾乎僅是內質網。該觀察定性地闡明了通過本發(fā)明的分級分離方法得到的高純度和富集。進一步檢查時，粗樣品和ER樣品中細胞器的超結構看上去很完整，與定量確定的高水平完整性(圖2)相一致。
實施例2從HeLa細胞平行分離、純化和富集用于蛋白質組分析的線粒體、內質網、高爾基體和質膜將HeLa細胞培養(yǎng)在補加碳酸氫鈉(Amresco#0865)、10％胎牛血清(Paragon BioServices，#30101121)和50μg/ml慶大霉素(Amresco，#0304)的Joklik改良的SMEM(Sigma，#61100-103)中。將細胞從滾瓶按比例增加到40L完全控制的生物反應器以接種到200L生物反應器中。反應器以1.0×105個細胞/ml接種。
三天后，從反應器收獲細胞并通過切向流過濾濃縮到8升體積，將其隨后以2000rpm離心12分鐘。洗滌細胞沉淀并重懸浮在DPBS(Invitrogen，#14190-136)中，然后再次以2000rpm離心12分鐘。除去上清液并在-80℃下以30g等分試樣保存細胞沉淀。從-80℃保存物除去Hela細胞沉淀。將沉淀解凍，合并并在5體積勻漿緩沖液(0.25M蔗糖，20mM HEPES-KOH，pH7.2，5mM MgCl2，無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(Roche))中使用Dounce勻漿器(25沖程)勻漿。勻漿后，通過以4000×g離心10分鐘得到核后上清液。第一次核后旋轉后，傾析上清液。然后用混合器(10秒低、10秒高，和10秒低)(以5體積緩沖液)并使用上面相同的離心參數再處理核沉淀以產生第二次核后上清液。傾析第二次核后上清液并與第一次核后上清液合并。所得合并的勻漿物用于PKII中進行細胞器的分級分離。將粗品勻漿物的等分試樣在-80℃保存用于以后分析。
為了測量給定級分的總體細胞器含量和比較級分，使用Abbe折光儀測定每個樣品的折射率。從折射率測量可以計算蔗糖百分數(％)。備選地，通過參考教科書如CRC Handbook of Chemistry and Physics(Ed.R.Weast，CRC Press Inc.，第58版)中的折射率向蔗糖百分數的轉化表可以得到蔗糖百分數。圖11描繪了HeLa細胞經勻漿和離心后收集的離心后級分的蔗糖百分數含量。該圖直接與圖7和8(下文描述)和本實施例中闡明的級分相關。
為了測試所分離的細胞器的完整性和富集，將分離的級分進行電子顯微術分析、蛋白質印跡和琥珀酸脫氫酶酶測定的聯合分析。
為了測試分離細胞器的完整性，運行后立即從分級分離收集樣品以避免進一步操作的潛在損害?；谖墨I中關于各自細胞器報導的預期的密度范圍選擇樣品。所選的級分經沉淀并在溶于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)的4％甲醛、1％戊二醛的溶液中固定，并在4℃保存直到需要制備。將樣品包埋、切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并使用Zeiss電子顯微鏡觀察。
為了標準化蛋白質印跡和酶測定法，通過Bradford測定法(BIO-RAD，#500-0006)測定含有細胞器的級分中蛋白質濃度。將樣品與考馬斯試劑在室溫下孵育5分鐘，測量吸收(595nm)。使用BSA(Pierce#23210)產生標準曲線。
測定含有細胞器的級分的蛋白質濃度后，使用針對已知的細胞器特異標記的抗體通過用蛋白質印跡(免疫印跡)篩選每種級分確定級分的細胞器組成。從含有細胞器的級分提取的等量蛋白質提取物經聚丙烯酰胺凝膠電泳分析分辨后使用適宜的抗體檢測細胞器特異標記。例如，用抗-Tom20抗體(BD BIOSCIENCES)檢測線粒體、抗GM130/P115抗體(BD BIOSCIENCES)用于檢測高爾基體、抗-BiP/GRP78抗體(BDBIOSCIENCES)用于檢測內質網，抗NaKATPase抗體(US.OF IOWA)用于檢測質膜。
為實施聚丙烯酰胺凝膠電泳，將樣品與4×NuPAGE SDS樣品緩沖液(INVITROGEN #NP0007)和50mM DTT混合后裝入1.0mm×10孔或者1.5mm×15孔4-12 Bis-Tris梯度微型凝膠(INVITROGEN，#NP0335或NP0323)。使用MES SDS電泳緩沖液，在150V下電泳樣品約40分鐘。對于總蛋白質分析，將凝膠在溶于40％甲醇、10％乙酸的考馬斯藍溶液中染色0.5小時，隨后在10％甲醇、10％乙酸溶液中脫色。使用ECL檢測(#RPN2108，ECL Western Blotting AnalysisSystem，AMERSHAM，INC.)檢測免疫反應性條帶并使用Kodak DigitalScience 1D Image Analysis軟件(KODAK)分析。
除了蛋白質印跡，還用酶測定法，例如，琥珀酸脫氫酶酶測定法進一步評估所回收的級分中分離的細胞器的完整性。對于這些實驗，每50μl細胞器級分樣品與溶于0.05M磷酸緩沖液(pH7.5)中的的0.1M琥珀酸鈉(Sigma，#S2378)溶液0.3ml孵育。在37℃孵育10分鐘后，加入溶于0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)的0.1ml 2.5mg/ml對-碘硝基四唑紫(INT)溶液。將管在37℃孵育10分鐘。以5∶5∶1(v，v，w)的比例加入1.0ml乙酸乙酯∶乙醇∶三氯乙酸停止反應。將管以15,000rpm離心1分鐘后測量490nm處的吸收。這些實驗的結果在圖7-11中總結。
圖7顯示了如上所述分離和積累這些細胞器后蔗糖梯度的不同級分中線粒體、內質網和質膜和它們的亞型的相對分布。該圖的X軸相應于用于測量細胞器含量的每個級分。Y軸指出相對于檢測這些細胞器和它們的亞型的每一種的梯度范圍內的群體，在相應蔗糖梯度級分中檢測的這三種細胞器和其亞型的百分數。Y2軸顯示了每種相應的梯度級分的蔗糖百分數。圖7指出這些細胞器和它們的亞型的每一種分布在梯度中不同且明確的位置。
圖8顯示了如上面描述的分離和積累如下細胞器后，線粒體、內質網和質膜和它們的亞型在蔗糖梯度的不同級分中的相對富集。圖的X軸對應于用于測量相對細胞器標記應答的每種級分。Y軸指出在相應蔗糖梯度級分中檢測的相對于對這些細胞器和它們的亞型的每一種檢測的梯度范圍內的群體，這三種細胞器和它們的亞型的相對細胞器標記應答(象素)。Y2軸顯示每種相應的梯度級分中蔗糖百分數。圖8表明使用本發(fā)明的方法，這些細胞器和它們的亞型的每一種在梯度中不同且明確的位置中的相對富集。
實施例3使用HeLa細胞進行比較富集研究參考上面的實施例2中給出的實驗條件，根據下面的數據研究了比較富集。
圖9和10闡明了通過本發(fā)明方法實現的富集的比較水平。使用細胞器特異標記和/或酶的蛋白質印跡或者酶測定法，將來自具體目的級分的信號/活性與另一級分或者分級分離前生物樣品的最初粗提物的信號/活性向對照，可以定性確定富集?；诩毎骷壏种袠擞浀鞍踪|相對于另一種細胞器級分的積累可以確定相對富集。此外，目的細胞器的細胞器特異標記的活性與另一級分或者粗勻漿物中相同標記酶的活性的比較可以測量富集。圖9顯示了通過生物樣品的每種級分的抗NaKATPase抗體檢測的NaKATPase的蛋白質印跡。
圖10顯示了來自樣品的每種級分得到NAKATPase的測量水平。圖9和10的比較表明級分14和15具有NaKATPase的最高相對水平。因為NaKATPase是質膜的細胞器特異標記，所以該數據表明級分14和15具有最大濃度的質膜。
為通過蛋白質印跡和/或酶測定法確定細胞器完整性和富集，首先，通過基于Bradford的測定法(Bio-Rad，#500-0006)測定蛋白質含量。將樣品與考馬斯試劑在室溫下孵育5分鐘，測量吸收(595nm)。使用BSA(Pierce#23210)產生標準曲線。
蛋白質印跡之前，將樣品與4×NuPAGE SDS樣品緩沖液(INVITROGEN，#NP0007)和50mM DTT混合后裝入1.0mm×10孔或者1.5mm×15孔4-12 Bis-Tris梯度微型凝膠(INVITROGEN，#NP0335或NP0323)。使用MES SDS電泳緩沖液，在150V下電泳樣品約40分鐘。對于總蛋白質分析，將凝膠在溶于40％甲醇、10％乙酸的考馬斯藍溶液中染色0.5小時，隨后在10％甲醇、10％乙酸溶液中脫色。
為實施聚丙烯酰胺凝膠電泳，將樣品與4×NuPAGE SDS樣品緩沖液(INVITROGEN #NP0007)和50mM DTT混合后裝入1.0mm×10孔或者1.5mm×15孔4-12 Bis-Tris梯度微型凝膠(INVITROGEN，#NP0335或NP0323)。使用MES SDS電泳緩沖液，在150V下電泳樣品約40分鐘。對于總蛋白質分析，將凝膠在溶于40％甲醇、10％乙酸的考馬斯藍溶液中染色0.5小時，隨后在10％甲醇、10％乙酸溶液中脫色。使用ECL檢測(#RPN2108，ECL Western Blotting AnalysisSystem，AMERSHAM，INC.)檢測免疫反應性條帶并使用Kodak DigitalScience 1D Image Analysis軟件(KODAK)定量。對于琥珀酸脫氫酶酶測定法，每50μl勻漿物與溶于0.05M磷酸緩沖液(pH7.5)中的的0.1M琥珀酸鈉(Sigma，#S2378)溶液0.3mi孵育。在37℃孵育10分鐘后，加入溶于0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)的0.1ml 2.5mg/ml對-碘硝基四唑紫(INT)溶液。將管在37℃孵育10分鐘。以5∶5∶1(v，v，w)的比例加入1.0ml乙酸乙酯∶乙醇∶三氯乙酸停止反應。將管以15,000rpm離心1分鐘后測量490nm處的吸收。
實施例4通過二維凝膠電泳和質譜法分析細胞器級分的亞細胞蛋白質組揭示了新蛋白質對實施例1和2中提供的級分的細胞器的亞細胞蛋白質組通過二維凝膠電泳和質譜法進一步分析。為了分析亞細胞細胞器蛋白質組，通過二維凝膠電泳(“2D-GE”)分離蛋白質。本領域技術人員將理解2D-GE是分離蛋白質復雜混合物的有效方法。電場中的所有蛋白質遷移到限定的距離，該距離取決于蛋白質的構象、分子大小和電荷。2D-GE使用分子大小和電荷以允許高分辨率分離蛋白質。在第一維中，用等電聚焦基于蛋白質的等電點將它們分離。在第二維中，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳根據它們的分子量分級分離蛋白質。所得結果是蛋白質點陣列，將它們分配X和Y坐標。
這里，通過2D-GE進行細胞器裂解后細胞器蛋白質提取物的分離，并通過考馬斯藍、銀染或者Sypro RubyTM(MOLECULAR PROBES)檢測。在2D-GE凝膠上將細胞器蛋白質提取物與未分離的粗提物相比較，其中所有凝膠都用考馬斯藍、銀染或者Sypro RubyTM染色。用Z3TM軟件(COMPUGEN)或者ProgenesisTM軟件(NON LINEAR)產生并注解2E凝膠的數字圖像。將所得圖像重疊以鑒定普通和新的點，特別是低豐度蛋白質。
用Bio-Rad 7cm IPG條板在完整pH范圍(3-10)內進行等電聚焦步驟。然后使用預制NuPAGE 4-12％ Bis-Tris ZOOM明膠與分子量標準進行SDS-PAGE。樣品以一式兩份進行，一個凝膠用考馬斯染色，另一個凝膠用銀染。用2D凝膠介質將細胞器級分和粗勻漿物進行質譜法并通過MALDI分析。
圖12比較了實施例1的大鼠肝臟組織的粗提物(A)和內質網級分(B)的蛋白質點圖案。與粗提物凝膠相比，內質網凝膠顯示出更多的蛋白質含量，即更多的可見和/或可檢測的蛋白質或者多肽點。
除了圖12中顯示的關于分析內質網級分的二維凝膠的結果，對含有線粒體、質膜和高爾基體的級分也進行了類似的2D凝膠分析(數據未顯示)。通過質譜法進一步分析了所得2D凝膠。通過質譜法分析了圖12(A)的許多點，以及線粒體、質膜和高爾基體級分的凝膠。為每個點所測定的所得肽圖與已知肽圖數據庫，例如GENBANK和SWISS-PROT相比較以確定蛋白質點的身份(如果存在)。
所得結果表明可以在線粒體、內質網、高爾基體和質膜級分中可以檢測到許多蛋白質，它們在粗提物的2D凝膠中不存在或者不可檢測。此外，在每個細胞器級分的2D凝膠上發(fā)現的蛋白質鑒定為具有寬范圍的分子量，即約80-125kD的高分子量到約小于20kD的低分子量。從而，所得結果表明本發(fā)明的方法不是有偏的或者局限于任何特定分子量。通過質譜法分析了在起始生物材料的2D凝膠上觀察不到或者在含有細胞器的級分的2D凝膠上為低強度的許多蛋白質點。檢查了來自HeLa細胞(數據未顯示)和大鼠肝臟組織的樣品。在對大鼠肝臟組織所檢查的蛋白質點中，發(fā)現約50％與SWISS-PROT中存入的蛋白質匹配。而且，通過序列分析和與GENEBANK中已知序列比較證實了約50％蛋白質點的身份。需要時，對非大鼠數據庫實施同源性搜索。從大鼠肝臟組織得到的結果在圖21A和21B中顯示。
基于與現有數據庫中已知蛋白質匹配的蛋白質的身份，本發(fā)明的方法檢測了多種蛋白質，包括代謝酶、蛋白酶體組分、翻譯因子、受體、免疫組分(補體)和核糖體蛋白質。
實施例5通過二維凝膠電泳和質譜法分析高爾基體和質膜級分的亞細胞蛋白質組表明檢測到翻譯后肽基脯氨酸順反異構酶(環(huán)孢菌素A-結合蛋白質)或者其他變體通過2D凝膠電泳和質譜法分析了根據實施例2從HeLa細胞分離的含有高爾基體和質膜的分離級分以及HeLa粗提物。裂解級分以釋放含有蛋白質的細胞器。用Bradford測定法(Bio-Rad，#500-0006)測定高爾基體樣品、質膜樣品和粗提樣品中蛋白質濃度。然后，如上面概述的，對來自每種樣品的等量蛋白質進行2D凝膠電泳。如前面描述的，對2D凝膠適當染色以顯現蛋白質點，然后通過ProgenesisTM軟件LINEAR)成像。
圖13B顯示了粗提物、高爾基體級分和質膜級分的二維凝膠電泳結果。每個結果以來自三個單獨2D凝膠的一式三份提供。圖13A顯示了高爾基體樣品3的特寫鏡頭并指出蛋白質點12、13和14。點12、13和14在高爾基體和質膜級分中都是可見的，然而所述相同點在粗提樣品中布明顯。同樣，點12、13和14可能代表低豐度蛋白質。
對點12、13和14進行了質譜法以鑒定其中的多肽。圖14顯示了每個肽點的質譜數據。該表為每個點列出了所檢測的肽片段的序列(從左到右為N末端到C末端方向)和每個片段的平均分子量。檢查圖14時，可以注意到檢測到相同或基本上重疊的肽片段，這與每個2、13和14是相同的蛋白質吻合。從而，每種蛋白質是相同或基本上相同的分子量，則會與它們從凝膠頂部遷移相同距離吻合。然而，因為2D凝膠電泳以二維分辨蛋白質，即一個方向基于分子量，另一個方向基于電荷，所以蛋白質的總體電荷與電泳所分辨的程度不同。從而，該觀察表明蛋白質點12、13和14是相同蛋白質的三種不同的翻譯后或者其他變體?？赡?，一個點代表未修飾的蛋白質產物，剩下的點代表兩種獨特的翻譯后修飾的或者氨基酸替換變體?？赡芩腥N都代表不同的變體。
所述結果證明了本發(fā)明的兩個優(yōu)點。第一，所述結果表明了在檢測低豐度蛋白質中的增強的靈敏性，所述低豐度蛋白質為例如在粗提物中檢測不到但是在通過本發(fā)明方法制備的細胞器級分中可檢測到的蛋白質。第二，所述結果表明本發(fā)明的分級分離方法提供了對低豐度蛋白質的不同變體的增強的分離和檢測，考慮到蛋白質組的大部分復雜性來自蛋白質翻譯后或者期間發(fā)生的蛋白質的多種修飾，所述增強的分離和檢測是有利的，其中所述蛋白質修飾改變蛋白質特征，例如，酶活性、溶解性和穩(wěn)定性。
實施例6通過二維凝膠電泳和質譜法分析多種細胞器級分的亞細胞細胞組對根據本發(fā)明方法制備的多種細胞器級分實施二維凝膠電泳。對所得凝膠適當染色并通過前述ProgenensisTM軟件成像。如前對多個蛋白質點進行質譜法。為每個蛋白質點鑒定的所得肽片段與現有數據庫(包括GENBANK和SWISS-PROT)中所含蛋白質的序列比較。
圖15、圖16、圖17和圖18分別顯示了內質網、線粒體、高爾基體和質膜的結果。對于每個圖，圖片A顯示了對每個細胞器級分所分辨的亞細胞蛋白質組的完整2D凝膠圖像。未顯示完整粗提物凝膠。圓圈顯示通過質譜法檢測的蛋白質點的位置。對于每個圖，圖片B一式三份地顯示了對于三個單獨的2D凝膠圖片A中凝膠的局部部分。圖片B的最上面排顯示了粗提物2D凝膠的相應的局部圖片，也以三個單獨2D凝膠的一式三份顯示。
從粗提物和細胞器級分2D凝膠的局部圖像的比較可以看出在細胞器級分圖片可以看到多種蛋白質點，而從粗提物圖片卻不能看到。具體地，在各自細胞器的2D凝膠中缺少的蛋白質點在每種細胞器級分凝膠圖像中以圓圈圈出。從而，這表明存在于細胞器級分凝膠中的蛋白質點為在粗提物樣品中檢測不到的蛋白質。在圖片A中，通過前述質譜法分析了每個圖的凝膠中每個點。
該實施例表明本發(fā)明的分級分離方法提供了對通過本發(fā)明制備的亞細胞級分中蛋白質的檢測，所述蛋白質在相應粗提物中檢測不到。
實施例7從健康和患病胰腺組織平行分離、純化和富集內質網和質膜用于進一步蛋白質組比較研究胰腺勻漿。對于這些實驗，將20只健康和糖尿病Wister大鼠(每只150-200g)禁食過夜后處死、解剖并收獲胰腺。將胰腺(共100g)在5體積勻漿緩沖液中勻漿并通過機械剪切方法使用Waring攪拌器勻漿。
勻漿后，通過以4-10,000×g勻漿10-20分鐘得到核后上清液。然后通過加入等體積補加蛋白酶抑制劑的稀釋緩沖液將上清液調節(jié)到等滲條件。
連續(xù)流動離心。將大鼠胰腺勻漿物裝入其中具有預先建立的蔗糖梯度的PK3-800轉子中。使用約10-30ml/分鐘的流速并且在第一次通過PKII以約15,000-25,000rpm運行，然后對于第二次通過使用最大速度40,500rpm。在離心運行結束時，從轉子底部除去轉子內含物，其為25ml級分。分析每個級分的樣品以確定靶細胞器，如ER和質膜的捕獲效率。
通過蛋白質印跡、酶測定法和電子顯微術確定分離的細胞器的完整性和富集。對于這些實驗，將含有質膜和ER的級分裂解并通過Bradford測定法(Bio-Rad，#500-0006)測定其中的蛋白質。將樣品與考馬斯試劑在室溫孵育5分鐘并測量595nm的吸收。使用BSA(Pierce，#23210)產生標準曲線。
確定含有質膜和ER的級分的蛋白質濃度后，將樣品與4xNuPAGESDS樣品緩沖液(INVITROGEN，#NP0007)和50mM DTT混合后裝入1.0mm×10孔或1.5mm×15孔，4-12％ Bis-Tris梯度微型凝膠(INVITROGEN#NP)335或NP0323)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用MESSDS電泳緩沖液，樣品在150V下電泳約40分鐘。對于總蛋白質分析，將凝膠在溶于40％甲醇、10％乙酸的考馬斯藍溶液中染色0.5小時，隨后在10％甲醇、10％乙酸溶液中脫色。對于質膜使用抗-NaKATPase抗體，對于內質網檢測使用抗-BiP/GRP78，通過蛋白質印跡篩選每種級分測量級分的細胞器組分富集。使用ECL檢測(#RPN2108，ECLWestern Blotting Analysis System，AMERSHAM，INC.)表征級分并使用Kodak Digital Science 1D Image Analysis軟件定量。
為了估計分離的細胞器的完整性，使用躍遷電子顯微術(TEM)。
為了通過電子顯微術確定細胞器的完整性，離心運行后立即收集分級分離步驟的樣品以避免進一步操作的潛在損害。基于文獻中關于ER和質膜報導的預期的密度范圍選擇樣品。所選的級分經沉淀并在溶于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)的4％甲醛、1％戊二醛的溶液中固定，并在4℃保存直到進一步制備。選擇后，將樣品包埋、切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并使用Zeiss電子顯微鏡觀察。
額外地，為確定細胞器完整性，進行琥珀酸脫氫酶酶測定法。對于這些實驗，將50μl細胞器級分與0.3ml溶于0.05M磷酸緩沖液(pH7.5)的0.01M琥珀酸鈉(Sigma，#S2378)溶液孵育。在37℃孵育10分鐘后，加入溶于0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)的0.1ml 2.5mg/ml對-碘硝基四唑紫(INT)(Sigma，#I8377)溶液。將管在37℃孵育10分鐘。以5∶5∶1(v，v，w)的比例加入1.0ml乙酸乙酯∶乙醇∶三氯乙酸停止反應。將管以15,000rpm離心1分鐘后測量490nm處的吸收。
為確定胰島素受體是否定位于健康對糖尿病大鼠的胰腺組織的質膜或者ER中，將分離的細胞器裂解并如實施例9中描述的將所得蛋白質進行2D PAGE分析。然后比較健康和糖尿病大鼠的凝膠以確定胰島素受體的定位。
實施例8羅格列酮處理糖尿病大鼠前后分析胰島素受體的細胞定位羅格列酮(Rosiglitazone ameleate)(也稱作Avandia，GSK)是公知的施用于II型糖尿病患者用于糖控制的藥物。該藥物作用的潛在分子基礎還未知并且最近研究暗示羅格列酮與改善胰島素分泌和胰島素豐度和信號轉導的改變有關(Diabetes，卷52，1943-1948頁，2003)。該實施例闡明本發(fā)明用于進一步闡明羅格列酮的分子基礎，特別是該藥物改變胰島素受體的細胞定位的作用。
對于這些實驗，將成年Wistar大鼠四只一籠圈養(yǎng)，可以隨時得到食物和水。沒有一種藥物治療是設計用于影響動物的一般健康的。將羅格列酮以飲用水施用于大鼠。最后結束時，通過斷頭處死大鼠。從有和沒有藥物治療的約20只糖尿病大鼠收獲胰腺(共100g)。沒有羅格列酮治療的糖尿病大鼠用作對照。
胰腺勻漿。通過機械剪切方法使用Waring攪拌器勻漿羅格列酮治療前后得到的胰腺。勻漿后，通過以4-10,000×g勻漿10-20分鐘得到核后上清液。然后通過加入等體積補加蛋白酶抑制劑的稀釋緩沖液將上清液調節(jié)到等滲條件。
使用與上述相同的破壞和相同的離心條件再處理所得SI勻漿物以產生第二次核后上清液。將第二次核后上清液平衡到等滲條件并用作PKII(Alfa Wasserman)離心的加樣材料。
連續(xù)流動離心。對于這些實驗，在PK3-800轉子中建立蔗糖梯度，之后將大鼠胰腺勻漿物裝入離心機。使用約10-30ml/分鐘的流速，并且在第一次通過PKII以約15,000-25,000rpm運行，然后對于第二次通過使用最大速度40,500rpm。捕獲來自流出物的樣品并確定ER和和質膜的捕獲效率。所有勻漿物送入系統(tǒng)后對這些細胞器給以額外的時間以達到它們的密度。控制轉子停止并以25ml等分試樣從底部取出內含物。
離心后，通過如實施例7中描述的蛋白質印跡、酶測定法和電子顯微術確定分離的ER和質膜的完整性和富集。
為確定羅格列酮處理前后胰島素受體的細胞定位的不同，將分離的細胞器裂解并如實施例9中描述的進一步進行2D PAGE。
實施例9通過2D凝膠電泳分析質膜和ER蛋白質組通過2D凝膠電泳進一步分析實施例7和8提供的級分的ER和質膜的亞細胞蛋白質組。為了分析亞細胞蛋白質組，通過二維凝膠電泳分離蛋白質。細胞器裂解后ER和質膜提取物的分離通過2D-PAGE進行并通過考馬斯藍、銀染或者Sypro Ruby(Molecular Probes)檢測。使用Z3軟件(Compugen)或者Progenesis軟件(Nonlinear)產生并注解2E凝膠的數字圖像。將所得圖像重疊以鑒定相應于胰島素受體的點。
從而，分析ER和質膜的蛋白質點圖案并將羅格列酮處理前后糖尿病胰腺組織中的胰島素受體定位與健康胰腺組織中胰島素受體定位比較。
該實施例闡明通過PKII系統(tǒng)與2D凝膠電泳得到的組合亞細胞組分是怎樣允許本領域技術人員實現亞細胞蛋白質組學的一個主要目的，即監(jiān)測蛋白質轉運事件的。
實施例10相對于蛋白質在細胞中的拷貝數檢測蛋白質所需的生物材料的理論量的估計圖22A和22B闡明使用本發(fā)明的連續(xù)流動方法的優(yōu)點。例如，所述圖表明相對于細胞中蛋白質的拷貝數，達到50ng檢測限通常所需的起始生物材料的具體量。在一個實施方案中，參考圖22A，假定1×109個細胞起始生物材料，將需要使用細胞數增加819倍來達到在每個細胞以一個拷貝存在的蛋白質的50ng檢測限。
本領域技術人員將將不用過度實驗就能夠認識到，或者能夠確定本文描述的實施方案的多種等同方案。認為所有這些等同方案都在本發(fā)明的范圍內并且被后面的權利要求所包括。
除非另外解釋，本文所用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬的領域中普通技術人員通常理解的意思。盡管本文描述的那些方法和材料相似或等價的方法和材料也可用于本發(fā)明的實踐或者試驗中，但是下面描述的適宜的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都完整引用作為參考。如果出現沖突，將以本說明書，包括術語的解釋為準。此外，所述材料、方法和實施例僅是闡明性的而非限制性的。
盡管已經在本文詳細描述的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案和其修改方案，但是應該理解本發(fā)明不限于這些精確的實施方案和修改方案，并且本領域技術人員可以實現其他修改或變更而不背離所附權利要求書限定的本發(fā)明范圍的精神和范圍。
權利要求
1.從含有細胞器的樣品收集細胞器的方法，其包括步驟a)從樣品釋放細胞器；b)將細胞器導入連續(xù)流動離心機內的密度梯度；c)應用足夠至少兩種類型的細胞器遷移到密度梯度內的離心力；和d)從密度梯度收集所述至少兩種類型的細胞器。
2.權利要求1的方法，其中所述細胞器含有細胞器的亞型。
3.權利要求1的方法，其中所述樣品是生物樣品。
4.權利要求3的方法，其中所述生物樣品包括器官、體液、血液、血清、血漿、唾液、淚液、糞便、尿、精液、粘液、組織、組織勻漿物、細胞提取物或者脊髓液或者它們的組合。
5.權利要求1的方法，其中所述連續(xù)流動離心機是連續(xù)流動超速離心機。
6.權利要求1的方法，其中所述連續(xù)流動離心機包分區(qū)轉子。
7.權利要求1的方法，其還包括步驟通過出售細胞器、出租細胞器、許可細胞器、保護細胞器中的知識產權利益、將細胞器的信息存入數據庫、或者查看關于存入數據庫的細胞器的信息而利用所收集的至少兩種類型的細胞器。
8.權利要求1的方法，其中密度梯度選自氯化銫、硫酸銫、非電解質溶質、多糖、碘化非電解質和用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠。
9.權利要求1的方法，其中釋放步驟包括勻漿和/或裂解。
10.權利要求1的方法，其中所述至少兩種類型的細胞器每一種都具有浮力密度并且其中所述離心力足夠導致所述至少兩種類型的細胞器的每一種遷移到密度梯度內與每種各自浮力密度基本上相等的密度。
11.權利要求1的方法，其中所述至少兩種類型的細胞器在一次運行中遷移到所述密度梯度內。
12.權利要求1的方法，其中收集的所述至少兩種類型的細胞器至少約60％完整。
13.權利要求1或者權利要求10的方法，其還包括裂解至少兩種類型的細胞器以形成含有蛋白質的蛋白質組；和從蛋白質組收集蛋白質的步驟。
14.權利要求13的方法，其中收集的蛋白質是低豐度蛋白質。
15.權利要求14的方法，其中所收集的蛋白質以小于每個細胞約100個拷貝的量存在于細胞中。
16.權利要求15的方法，其中所收集的蛋白質以每個細胞約1個拷貝的量存在于細胞中。
17.權利要求1或10的方法，其中所述至少兩種類型的細胞器在密度梯度中富集和積累。
18.權利要求5的方法，其中連續(xù)流動超速離心機包含容積為約100ml到約8升的轉子。
19.從細胞器群體獲得低豐度蛋白質的方法，其包括步驟應用離心力時將細胞器群體導入連續(xù)流動離心機內的密度梯度，應用的離心力足夠細胞器類型在密度梯度的部分內富集和積累，所富集和積累的量足夠在收集細胞器類型的量時含有可檢測量的低豐度蛋白質。
20.權利要求19的方法，其還包括在將細胞器群體導入密度梯度前從來自勻漿和/或裂解生物樣品的生物樣品釋放細胞器群體的步驟。
21.權利要求19的方法，其還包括收集低豐度蛋白質的步驟。
22.權利要求21的方法，其中低豐度蛋白質的收集包括裂解細胞器。
23.權利要求22的方法，其中低豐度蛋白質以基本上純的形式分離。
24.權利要求19或21的方法，其中當連續(xù)對密度梯度應用離心力時將細胞器群體連續(xù)或者間歇地導入。
25.權利要求24的方法，其還包括步驟通過出售低豐度蛋白質、出租低豐度蛋白質、許可低豐度蛋白質、保護低豐度蛋白質中的知識產權利益、將關于低豐度蛋白質的信息存入數據庫、或者查看關于存入數據庫的低豐度蛋白質的信息而利用低豐度蛋白質。
26.從生物樣品分離至少兩種類型細胞器的方法，其包括步驟a)勻漿生物樣品和/或裂解細胞材料以形成勻漿物；b)連續(xù)或間歇地將勻漿物進料和再循環(huán)至含有密度梯度的旋轉的連續(xù)流動超速離心機中；c)在向超速離心機中的密度梯度進料步驟期間和之后應用離心力使得至少兩種類型的亞細胞細胞器的每一種在密度梯度內的一個位置富集和積累；和d)從密度梯度中各自位置收集至少兩種類型的亞細胞細胞器的每一種。
27.獲得細胞器類型的方法，其包括以下步驟使含有多種細胞器類型的生物樣品通過旋轉的連續(xù)流動離心機以從生物樣品富集和積累一種單獨的細胞器類型，所富集和積累的量足夠分離和檢測來自所述單獨的細胞器類型的低豐度蛋白質。
28.權利要求27的方法，其中低豐度蛋白質以小于每個細胞約100個拷貝的量存在于細胞中。
29.權利要求28的方法，其中低豐度蛋白質以小于每個細胞約10個拷貝的量存在于細胞中。
30.權利要求28的方法，其中低豐度蛋白質以小于每個細胞約1個拷貝的量存在于細胞中。
31.分析至少兩種不同類型的細胞器的蛋白質組譜方法，其包括步驟a)獲得含有至少第一種和第二種類型細胞器的第一種生物樣品，所述第一和第二種細胞器類型為不同的細胞器類型，第一種細胞器類型含有第一種細胞器，第二種細胞器類型含有第二種細胞器，第一種和第二種細胞器類型的每一種都具有浮力密度；b)從第一種生物樣品釋放第一和第二種細胞器；c)應用離心力時將第一種和第二種細胞器導入連續(xù)流動離心機內的密度梯度，應用的離心力足夠第一種細胞器遷移到密度梯度內的第一個位置，在該位置的密度梯度的密度基本上等于第一種細胞器的浮力密度，并且應用的離心力足夠第二種細胞器遷移到密度梯度內的第二個位置，其可以與第一個位置相同或不同，在所述第二個位置的密度梯度的密度基本上等于第二種細胞器的浮力密度；d)收集第二種細胞器和第二種細胞器；e)從第一種細胞器分離第一種蛋白質并從第二種細胞器分離第二種蛋白質；和f)分析第一種能和第二種蛋白質的蛋白質組譜。
32.權利要求31的方法，其還包括步驟a)獲得含有至少第三種和第四種類型細胞器的第二種生物樣品；所述第三和第四種細胞器類型是不同類型的細胞器，第三種細胞器類型含有第三種細胞器，第四種細胞器類型含有第四種細胞器，第三和第四種細胞器的每一種都具有浮力密度；b)使用第三種和第四種細胞器代替第一和第二種細胞器重復權利要求31的步驟b)、c)和d)；c)從第三種細胞器分離第三種蛋白質，從第四種細胞器分離第四種蛋白質；和d)分析第三種細胞器和第四種細胞器的蛋白質組譜。
33.權利要求32的方法，其中第一種細胞器類型與第三種細胞器類型相同，第二種細胞器類型與第四種細胞器類型相同。
34.權利要求33的方法，其中將第一種細胞器的蛋白質組譜與第三種細胞器的蛋白質組譜比較，將第二種細胞器的蛋白質組譜與第四種細胞器的蛋白質組譜比較。
35.權利要求34的方法，其中在第一時間從來源獲得第一種生物樣品并且在第二時間從相同來源獲得第二種生物樣品。
36.權利要求35的方法，其中相同來源是一種或多種活的宿主。
37.權利要求36的方法，其中相同來源是一種活宿主。
38.分析含有第一種和第二種細胞器的生物樣品中蛋白質在第一時間和第二時間轉運的方法，其包括步驟a)獲得生物樣品的第一種細胞器中的蛋白質，所述生物樣品在第一時間通過以下步驟獲得i)在足夠釋放具有一種密度的第一種細胞器到勻漿物的條件下勻漿第一種生物樣品，所述第一種細胞器包括第一種蛋白質；ii)將勻漿物導入旋轉的連續(xù)流動超速離心機的密度梯度；iii)從超速離心機對勻漿物應用離心力，使得第一種細胞器在密度梯度內遷移到密度梯度中基本上等于第一種細胞器的密度的位置；iv)從密度梯度除去第一種細胞器；v)檢測和表征第一種生物樣品的第一種細胞器中的第一種蛋白質；b)從生物樣品獲得第二種細胞器中的第二種蛋白質，其與第一種類型的蛋白質類型相同，所述生物樣品在第二時間獲得，包括使用在第二時間獲得的生物樣品實施上面的步驟(a)(i)到(a)(v)；和c)比較第一和第二種蛋白質的位置。
39.權利要求38的方法，其中所述第一種細胞器包括許多第一種細胞器并且第二種細胞器包括許多第二種細胞器，并且所述第一種蛋白質包括許多第一種蛋白質，所述第二種蛋白質包括許多第二種蛋白質。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過從生物樣品分離和積累亞細胞細胞器進行蛋白質組分級分離的方法，通過所述方法亞細胞細胞器高度富集、基本上純并且良好地保留細胞完整性和功能。本發(fā)明的方法提供了如此方式，通過其減小蛋白質組的復雜性和方便檢測和分離難以研究的蛋白質，如低豐度蛋白質。通過使用連續(xù)流動超速離心從生物樣品平行分開和分離亞細胞細胞器預先分級分離生物樣品的蛋白質組的本發(fā)明方法可以通過調節(jié)超速離心參數，如轉子速度、轉子大小和轉子幾何形狀可以容易而有效地縮放。
文檔編號G01N33/543GK1842706SQ200480013646
公開日2006年10月4日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權日2003年3月19日
發(fā)明者Z·G·勒維 申請人:阿爾法沃塞曼公司