專(zhuān)利名稱：神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有鹽酸多奈哌齊的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑。
背景技術(shù)：
鹽酸多奈哌齊是通過(guò)可逆地抑制分解乙酰膽堿的酶乙酰膽堿酯酶而使腦內(nèi)的乙酰膽堿量增加，激活腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的物質(zhì)。該物質(zhì)作為阿耳茨海默氏型老年癡呆、阿耳茨海默病的治療藥而被廣泛應(yīng)用(日本專(zhuān)利第2578475號(hào)公報(bào))，各研究機(jī)構(gòu)對(duì)鹽酸多奈哌齊進(jìn)行著研究。Jin Zhou等發(fā)表了乙酰膽堿酯酶抑制劑對(duì)于大鼠PC12細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)的缺血性細(xì)胞損傷具有保護(hù)效果的論文，使用鹽酸多奈哌齊作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的一例(Zhou，J，.Fu，Y.，Tang，X.C.，2001.Huperzine A and donepezil protect rat pheochromocytoma cellsagainst oxygen-glucose deprivation.Neurosci.Lett.306，53-56))。
但是，鹽酸多奈哌齊對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)效果的詳細(xì)情況尚不明確。
上述文獻(xiàn)中使用的PC12細(xì)胞是嗜鉻細(xì)胞瘤(褐色細(xì)胞腫)，也稱為嗜鉻性細(xì)胞瘤，是由腎上腺髓質(zhì)或交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等嗜鉻細(xì)胞產(chǎn)生的兒茶酚胺生成腫瘤。因此，已知PC12細(xì)胞不是腦神經(jīng)細(xì)胞，在細(xì)胞間不形成突觸，此外也沒(méi)有對(duì)興奮性物質(zhì)反應(yīng)的功能(Sucher，N.J，1993.Expression of Endogenous NMDAR1 Transcripts without ReceptorProtein Suggests Post-transcriptional Control in PC12 Cells.Thejournal of Biological Chemistry.Vol.268，No.30，22299-22304.)。即，上述文獻(xiàn)中僅對(duì)于癌變的細(xì)胞進(jìn)行了研究，但完全沒(méi)有進(jìn)行使用通過(guò)腦神經(jīng)細(xì)胞新制備的原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的研究。因此，證明鹽酸多奈哌齊對(duì)實(shí)際的神經(jīng)細(xì)胞中的缺血性傷害的保護(hù)效果的數(shù)據(jù)尚不為人所知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提供保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞(尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞)的藥物。
本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了刻苦研究，結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)鹽酸多奈哌齊具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞(尤其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞)的作用，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如下。
(1)含有以下(i)～(vii)表示的任一化合物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑(包括日本特開(kāi)平1-79151號(hào)公報(bào)所述的化合物)。優(yōu)選這些化合物的鹽為鹽酸鹽。
(i)以下述化學(xué)式表示的1-芐基-4-[(5，6-二甲氧基-1-茚滿酮)-2-基]甲基哌啶或其可藥用鹽。
(特許2578475號(hào)權(quán)利要求項(xiàng)(以下稱為[c1.])1)(ii)以下的通式(I)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J表示選自以下式 茚滿酮基 茚基
茚滿二酮基 亞茚滿酮基(インダノリテニル)
(式中，S表示碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基、鹵原子或羥基。t表示0或1～4的整數(shù)。(S)t可以在結(jié)合的苯環(huán)的相鄰碳原子間形成亞甲二氧基或亞乙二氧基。式(1)中的Y表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基，式(k)中V表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基，式(n)中W1及W2相互獨(dú)立、相同或不同，表示氫原子、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基，W3表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基。式(a)～(e)、(g)、(j)、(l)以及(q)中的苯環(huán)A可以被碳原子數(shù)1～6的烷基或碳原子數(shù)1～6的烷氧基取代。)表示的基團(tuán)的一價(jià)或二價(jià)基團(tuán)。B為以式-(CHR2)n-(式中，n表示0或1～10的整數(shù)，R2分別獨(dú)立地表示氫原子或甲基)表示的基團(tuán)、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數(shù))表示的基團(tuán)、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數(shù))表示的基團(tuán)、或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數(shù))表示的基團(tuán)。K作為取代基，表示可以被鹵代的碳原子數(shù)1～6的烷基、碳原子數(shù)1～6的烷氧基、硝基、鹵原子、羧基、芐氧基、碳原子數(shù)1～6的烷氧基羰基、氨基、碳原子數(shù)1～6的單烷基氨基、碳原子數(shù)1～6的二烷基氨基、氨基甲?；?、碳原子數(shù)1～6酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、碳原子數(shù)1～6的烷基氨基羰基、碳原子數(shù)1～6的烷基羰基氧基、羥基、可以具有甲酰基或烷氧基(碳原子數(shù)1～6)烷基(碳原子數(shù)1～6)的苯基烷基。 表示單鍵或雙鍵。
(iii)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。

(特許2733203號(hào)c1.7)(iv)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。
(特許2733203號(hào)cl.8)
(v)以下通式(I-1)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J1-1表示碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基(以下簡(jiǎn)稱為低級(jí)烷基)；環(huán)己基；可以具有低級(jí)烷基、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基(以下簡(jiǎn)稱為低級(jí)烷氧基)、硝基、鹵素、羧基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基、單低級(jí)烷基氨基、二低級(jí)烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子數(shù)1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、低級(jí)烷基氨基羰基、低級(jí)烷基羰基氧基、鹵代低級(jí)烷基、羥基、甲?；虻图?jí)烷氧基低級(jí)烷基作為取代基的苯基、吡啶基或吡嗪基(ピラジル基)；式 (式中，G表示式 表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)、式-O-表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)、式-CH2-O-表示的基團(tuán)、式-CH2-SO2-表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)或式 表示的基團(tuán)。B表示碳原子或氮原子。)ピ表示的基團(tuán)；喹啉基；喹喔啉基；呋喃基或式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氫原子或低級(jí)烷氧基羰基)表示的基團(tuán)。B表示式-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-NR2-(CH2)n-(式中R2表示氫原子、低級(jí)烷基、苯基或低級(jí)烷基磺酰基)表示的基團(tuán)、式-CONR3-(CH2)n-(式中，R3表示氫原子、低級(jí)烷基、可以具有低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、鹵素或羥基作為取代基的苯基、芐基或吡啶基)表示的基團(tuán)、式-NH-CO-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-CH2-CO-NH-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-CO-CH2-CH(OH)-CH2-表示的基團(tuán)、式-CO-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-C(OH)-(CH2)n-表示的基團(tuán)或式-CO-CH＝CH-CH2-表示的基團(tuán)(以上的式中，n表示0或1～10的整數(shù))。T1表示碳原子。K表示苯基可以具有低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基、鹵素、羧基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基、單低級(jí)烷基氨基、二低級(jí)烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子數(shù)1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、低級(jí)烷基氨基羰基、低級(jí)烷基羰基氧基、鹵代低級(jí)烷基、羥基、甲酰基或低級(jí)烷氧基低級(jí)烷基作為具代基的苯基烷基(烷基的碳原子數(shù)1～2)；肉桂基；低級(jí)烷基；吡啶基甲基；環(huán)烷基(環(huán)烷基的碳原子數(shù)3～6)烷基；金剛烷甲基；糠基；碳原子數(shù)3～6的環(huán)烷基或酰基。q表示1或2(特許3078244號(hào)cl.1)(vi)以下通式(I-2)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J1-2表示可以具有碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基作為取代基的茚滿酮基。T2表示氮原子。B、K以及q含義如上所述。](特許3078244號(hào)cl.2)(vii)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。


(特許3078244號(hào)cl.4)(2)含有以下(i)～(vii)表示的任一化合物的，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防劑和/或治療劑。
(i)以下述化學(xué)式表示的1-芐基-4-[(5，6-二甲氧基-1-茚滿酮)-2-基]甲基哌啶或其可藥用鹽。鹽優(yōu)選鹽酸鹽。
(特許2578475號(hào)cl.1)(ii)以下的通式(I)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J表示選自下式 茚滿酮基 茚基
茚滿二酮基 亞茚滿酮基(インダノリテニル)
(式中，S表示碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基、鹵原子或羥基。t表示0或1～4的整數(shù)。并且(S)t也可以在結(jié)合的苯環(huán)的相鄰碳原子間形成亞甲二氧基或亞乙二氧基。式(1)中的Y表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基，式(k)中V表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基，式(n)中W1及W2相互獨(dú)立，相同或不同，表示氫原子、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基，W3表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基。式(a)～(e)、(g)、(j)、(l)以及(q)中的苯環(huán)A可以被碳原子數(shù)1～6的烷基或碳原子數(shù)1～6的烷氧基取代。)表示的基團(tuán)的一價(jià)或二價(jià)基團(tuán)。B為式-(CHR2)n-(式中，n表示0或1～10的整數(shù)，R2表示分別獨(dú)立地為氫原子或甲基)表示的基團(tuán)、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數(shù))表示的基團(tuán)、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數(shù))表示的基團(tuán)、或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數(shù))表示的基團(tuán)。K表示具有可以被鹵代的碳原子數(shù)1～6的烷基、碳原子數(shù)1～6的烷氧基、硝基、鹵原子、羧基、芐氧基、碳原子數(shù)1～6的烷氧基羰基、氨基、碳原子數(shù)1～6的單烷基氨基、碳原子數(shù)1～6的二烷基氨基、氨基甲?；?、碳原子數(shù)1～6酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、碳原子數(shù)1～6的烷基氨基羰基、碳原子數(shù)1～6的烷基羰基氧基、羥基、甲?；蛲檠趸?碳原子數(shù)1～6)烷基(碳原子數(shù)1～6)作為取代基的苯基烷基。 表示單鍵或雙鍵。(特許2733203號(hào)cl.1)(iii)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。

(特許2733203號(hào)c1.7)(iv)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。

(特許2733203號(hào)cl.8)(v)以下通式(I-1)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J1-1表示碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基(以下簡(jiǎn)稱為低級(jí)烷基)；環(huán)己基；可以具有低級(jí)烷基、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基(以下簡(jiǎn)稱為低級(jí)烷氧基)、硝基、鹵素、羧基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基、單低級(jí)烷基氨基、二低級(jí)烷基氨基、氨基甲?；?、由碳原子數(shù)1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、低級(jí)烷基氨基羰基、低級(jí)烷基羰基氧基、鹵代低級(jí)烷基、羥基、甲?；虻图?jí)烷氧基低級(jí)烷基作為取代基的苯基、吡啶基或ピラジル基；式 (式中，G表示式 表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)、式-O-表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)、式-CH2-O-表示的基團(tuán)、式-CH2-SO2-表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)或式 表示的基團(tuán)。B表示碳原子或氮原子。)表示的基團(tuán)；喹啉基；喹喔啉基；呋喃基或式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氫原子或低級(jí)烷氧基羰基)表示的基團(tuán)。B表示式-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-NR2-(CH2)n-(式中R2表示氫原子、低級(jí)烷基、苯基或低級(jí)烷基磺酰基)表示的基團(tuán)、式-CONR3-(CH2)n-(式中，R3表示氫原子、低級(jí)烷基、可以具有低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、鹵素或羥基作為取代基的苯基、芐基或吡啶基)表示的基團(tuán)、式-NH-CO-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-CH2-CO-NH-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-CO-CH2-CH(OH)-CH2-表示的基團(tuán)、式-CO-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-C(OH)-(CH2)n-表示的基團(tuán)或式-CO-CH＝CH-CH2-表示的基團(tuán)(以上式中，n表示0或1～10的整數(shù))。T1表示碳原子。K表示苯基可以具有低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基、鹵素、羧基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基、單低級(jí)烷基氨基、二低級(jí)烷基氨基、氨基甲?；⒂商荚訑?shù)1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、低級(jí)烷基氨基羰基、低級(jí)烷基羰基氧基、鹵代低級(jí)烷基、羥基、甲酰基或低級(jí)烷氧基低級(jí)烷基作為取代基的苯基烷基(烷基的碳原子數(shù)1～2)；肉桂基；低級(jí)烷基；吡啶基甲基；環(huán)烷基(環(huán)烷基的碳原子數(shù)3～6)烷基；金剛烷甲基、糠基；碳原子數(shù)3～6的環(huán)烷基或?；表示1或2(特許3078244號(hào)cl.1)(vi)以下通式(I-2)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J1-2表示可以具有碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基作為取代基的茚滿酮基。T2表示氮原子。B、K以及q含義如上所述。](特許3078244號(hào)cl.2)(vii)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽。


(特許3078244號(hào)cl.4)在上述(1)以及(2)中，化合物的鹽優(yōu)選鹽酸鹽，特別優(yōu)選如下式所示的鹽酸多奈哌齊。
此外，在上述(2)中，作為神經(jīng)細(xì)胞障礙可以列舉由腦缺血、興奮性毒性或Aβ毒性誘發(fā)的障礙，上述腦缺血以及興奮性毒性，可以列舉伴隨腦中風(fēng)、腦梗塞或腦栓塞的任意一種的毒性。此外，上述Aβ毒性可以是伴隨阿耳茨海默病或唐氏病的毒性。
在上述(1)或(2)中，細(xì)胞為來(lái)源于腦的成熟神經(jīng)細(xì)胞，特別可以列舉來(lái)源于選自大腦皮質(zhì)、中隔區(qū)域以及海馬中的任意一種的成熟神經(jīng)細(xì)胞。此外，該神經(jīng)細(xì)胞也可以是原代培養(yǎng)細(xì)胞。
(3)含有上述(1)所述的保護(hù)劑、或(2)所述的預(yù)防劑和/或治療劑的腦中風(fēng)、腦梗塞或腦栓塞中任一疾病的預(yù)后改善劑。
(4)一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方法，其特征在于，給予患者上述(1)所述的保護(hù)劑的有效劑量。
(5)一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防方法和/或治療方法，其特征在于，給患者施用有效劑量的上述(2)所述的預(yù)防劑和/或治療劑。
在上述(5)中，作為神經(jīng)細(xì)胞障礙，可以列舉由腦缺血、興奮性毒性或Aβ毒性誘發(fā)的障礙，上述腦缺血以及興奮性毒性，可以列舉伴隨腦中風(fēng)、腦梗塞或腦栓塞的任意一種的毒性。此外，作為興奮性毒性，可以列舉例如由NMDA或紅藻氨酸引起的毒性。進(jìn)而，上述Aβ毒性，也可以是伴隨阿耳茨海默病或唐氏病的毒性。
(6)一種腦中風(fēng)、腦梗塞或腦栓塞的任一疾病的預(yù)后改善方法，其特征在于，給予患者上述(3)所述的預(yù)后改善劑的有效劑量。
(7)使用用于制備下述藥物的(1)所示化合物，該藥物選自上述(1)所述的保護(hù)劑、(2)所述的預(yù)防劑和/或治療劑，以及(3)所述的預(yù)后改善劑的任意一種。
(8)在Aβ存在下使候選化合物作用對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)細(xì)胞，以檢測(cè)或測(cè)定Aβ凝聚量為特征的，具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選方法。
本發(fā)明的篩選方法，用上述Aβ凝聚量的檢測(cè)或測(cè)定結(jié)果，通過(guò)與在不存在上述候選化合物的情況下的Aβ凝聚量比較，可以判定上述候選化合物是否具有Aβ凝聚抑制作用，是否為目標(biāo)化合物。
(9)用于在上述(8)所述的方法中使用的，具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒。
(10)在Aβ存在下使候選化合物作用對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)細(xì)胞，以檢測(cè)細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡為特征的在由Aβ毒性誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防和/或在治療中有效的化合物或其可藥用鹽的篩選方法。
在本發(fā)明的方法中，用上述細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡檢測(cè)的結(jié)果，通過(guò)與在不存在上述候選化合物的情況下的細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡程度比較，可以判定上述候選化合物是否具有對(duì)Aβ毒性的細(xì)胞保護(hù)作用，是否為目標(biāo)化合物。
上述細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡，可以通過(guò)乳酸脫氫酶(LDH)的測(cè)定濃度或MTT測(cè)定檢測(cè)。
(11)用于在上述(10)所述的方法中使用的，在由Aβ毒性誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防和/或在治療中有效的化合物或可藥用鹽的篩選試劑盒。


圖1是表示在進(jìn)行氧-葡萄糖(OGD)剝奪的12小時(shí)前，1小時(shí)前以及OGD處理1小時(shí)后向細(xì)胞中添加多奈哌齊情況下的大鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞的LDH釋放的直方圖。OGD(-)表示沒(méi)有進(jìn)行OGD處理，OGD(+)表示進(jìn)行了OGD處理。Cont以及Vehi為未給藥組。采用Dunnett’s test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖1中[***]表示P＜0.005(以‘未給藥組’作為對(duì)照)。
圖2表示有無(wú)OGD處理時(shí)的大鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，分別表示下述狀態(tài)的顯微鏡照片，A為對(duì)照，B為實(shí)施OGD處理的照片，C為12小時(shí)前添加多奈哌齊后進(jìn)行了OGD處理的照片。比例標(biāo)尺表示0.1mm。
圖3是表示從進(jìn)行OGD處理12小時(shí)前添加各種乙酰膽堿酯酶抑制劑的情況與添加多奈哌齊的情況下的大鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞的LDH釋放的直方圖。OGD(-)表示沒(méi)有進(jìn)行OGD處理，OGD(+)表示進(jìn)行了OGD處理。Cont以及Vehi為未給藥組。采用Dunnett’s test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖3中[*]表示P＜0.05，[**]表示P＜0.01，[***]表示P＜0.005(以‘未給藥組’作為對(duì)照)。
圖4是表示從進(jìn)行OGD處理12小時(shí)前添加多奈哌齊的同時(shí)添加莨菪胺(Sco)或異莰胺(Mec)情況下的大鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞的LDH的釋放的直方圖。OGD(-)表示沒(méi)有進(jìn)行OGD處理，OGD(+)表示進(jìn)行了OGD處理。Cont以及Vehi為未給藥組。采用ANOVA和Welch’st-test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖4中[*]表示P＜0.05，[**]表示P＜0.01，[***]表示P＜0.005(以‘未給藥組’作為對(duì)照)。
圖5為表示多奈哌齊對(duì)通過(guò)NMDA處理的大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的LDH的釋放的效果的直方圖。多奈哌齊從12小時(shí)前添加。Cont以及Vehi為未給藥組。采用Dunnett’s test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖5中[***]表示P＜0.005(以‘未給藥組’作為對(duì)照)。
圖6表示多奈哌齊對(duì)通過(guò)紅藻氨酸處理的大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的LDH釋放的效果。多奈哌齊從24小時(shí)前添加。Cont以及Vehi為未給藥組。采用Dunnett’s test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖6中[***]表示P＜0.005(以‘未給藥組’作為對(duì)照)。
圖7為將培養(yǎng)的大鼠中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞用抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶抗體免疫染色的圖。
圖8為以LDH作為指標(biāo)評(píng)價(jià)多奈哌齊對(duì)Aβ(1-40)毒性的保護(hù)效果的結(jié)果的圖。
圖9為將培養(yǎng)大鼠中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞用抗MAP2抗體免疫染色的圖。
圖10為表示采用CD的變化作為指標(biāo)測(cè)定Aβ的凝聚的結(jié)果的圖。
圖11為表示siRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿活性的效果的圖。
圖12為表示siRNA對(duì)Aβ(1-40)毒性的保護(hù)效果的圖。
圖13為表示siRNA對(duì)Aβ的凝聚的凝聚抑制效果的圖。
具體實(shí)施例方式
1.概述本發(fā)明為含有如下所示的任一化合物(以下，稱為“化合物Q”)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)劑、該神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防劑和/或治療劑。此外，通過(guò)本發(fā)明提供以適量給予預(yù)防劑和/或治療劑為特征的，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)方法和/或該神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防方法和/或治療方法。以下，對(duì)在本發(fā)明的保護(hù)劑、預(yù)防劑、治療劑、預(yù)后改善劑中使用的化合物Q進(jìn)行如下說(shuō)明。
2.化合物Q以下的通式(I)表示的環(huán)狀胺衍生物以及其可藥用鹽(參照特開(kāi)平1-79151號(hào)公報(bào)、特開(kāi)平07-252216號(hào)公報(bào)、特開(kāi)平10-067739號(hào)公報(bào))。
[式中，J表示(a)取代或未取代的如下所示的基團(tuán)；①苯基、②吡啶基、③吡嗪基(ピラジル基)、④喹啉基、⑤環(huán)己烷基、⑥喹喔啉基或⑦呋喃基，(b)選自苯基可以被取代的如下組的一價(jià)或二價(jià)基團(tuán)；①二氫化茚基、②茚滿酮基、③茚基、④二氫化茚酮基、⑤茚滿二酮基、⑥四氫萘酮基、⑦苯并環(huán)庚酮基⑧茚滿醇基⑨式 表示的基團(tuán)，(c)由環(huán)狀胺化合物衍生的一價(jià)基團(tuán)，(d)低級(jí)烷基，或(e)式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氫原子或低級(jí)烷氧基羰基)表示的基團(tuán)。
B為式 表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)、式 (式中，R3表示氫原子、低級(jí)烷基、?；?、低級(jí)烷基磺?；?、可以被取代的苯基或芐基)表示的基團(tuán)，式 (式中，R4表示氫原子、低級(jí)烷基或苯基)表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán){在以上式中，n表示0或1～10的整數(shù)。R2表示氫原子或甲基，即式 表示的亞烷基不具有取代基，或具有1個(gè)或1個(gè)以上的甲基的形式。)，式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數(shù))表示的基團(tuán)，式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數(shù))表示的基團(tuán)，式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數(shù))表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán)，式 表示的基團(tuán)，式-NH-表示的基團(tuán)，式-O-表示的基團(tuán)，式-S-表示的基團(tuán)，二烷基氨基烷基羰基或低級(jí)烷氧基羰基。
T表示氮原子或碳原子。
Q表示氮原子、碳原子或式 表示的基團(tuán)。
K表示氫原子、取代或未取代的苯基、苯基可以被取代的芳基烷基、苯基可以被取代的肉桂基、低級(jí)烷基、吡啶基甲基、環(huán)烷基烷基、金剛烷甲基、呋喃甲基、環(huán)烷基、低級(jí)烷氧基羰基或?；?。
q表示1～3的整數(shù)。
式中， 表示單鍵或雙鍵。]化合物(I)中的上述定義中，在J，K，R3，R4中可見(jiàn)的所謂低級(jí)烷基表示碳原子數(shù)1～6的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1，2-二甲基丙基、己基、異己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基等。其中作為優(yōu)選基團(tuán)，可以列舉甲基、乙基、丙基、異丙基等，最優(yōu)選甲基。
在J中的所謂‘取代或未取代的如下所示的基團(tuán)；①苯基、②吡啶基、③吡嗪基(ピラジル基)、④喹啉基、⑤環(huán)己烷基、⑥喹喔啉基或⑦呋喃基’的定義中，作為取代基，可以列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基等碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基；甲氧基、乙氧基等上述低級(jí)烷基對(duì)應(yīng)的低級(jí)烷氧基；硝基；氯、溴、氟等鹵素；羧基；甲氧基羰基、乙氧基羰基、異丙氧基羰基、正丙氧基羰基、正丁氧基羰基等，與上述低級(jí)烷氧基對(duì)應(yīng)的低級(jí)烷氧基羰基；氨基；單低級(jí)烷基氨基；二低級(jí)烷基氨基；氨基甲?；?；乙?；被?、丙?；被⒍□；被?、異丁?；被?、戊?；被?、新戊酰氨基等由碳原子數(shù)1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的?；被?；環(huán)己基氧基羰基等環(huán)烷基氧基羰基；甲基氨基羰基、乙基氨基羰基等低級(jí)烷基氨基羰基；甲基羰基氧基、乙基羰基氧基、正丙基羰基氧基等上述定義的低級(jí)烷基對(duì)應(yīng)的低級(jí)烷基羰基氧基；以三氟甲基等為代表的鹵代低級(jí)烷基；羥基；甲酰基；乙氧基甲基、甲氧基甲基、甲氧基乙基等低級(jí)烷氧基低級(jí)烷基等。在上述取代基的說(shuō)明中，所謂“低級(jí)烷基”、“低級(jí)烷氧基”包含由上述定義派生的全部基團(tuán)?？梢员幌嗤虿煌?～3個(gè)取代基取代。
進(jìn)而，苯基為包含在如下情況下被取代的苯基。即，表示 所示的基團(tuán)時(shí)(式中，G表示 所示的基團(tuán)、式 所示的基團(tuán)、式-O-所示的基團(tuán)、式 所示的基團(tuán)、式-CH2-O-所示的基團(tuán)、式-CH2-SO2-所示的基團(tuán)、式 所示的基團(tuán)或式 所示的基團(tuán)。E表示碳原子或氮原子。
其中，作為苯基上優(yōu)選的取代基，可以列舉低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基、鹵代低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基羰基、甲酰基、羥基、低級(jí)烷氧基低級(jí)烷基、鹵素、苯甲?；⑵S基磺?；?，取代基相同或不同可以為2個(gè)以上。
作為吡啶基上優(yōu)選的基團(tuán)，可以列舉低級(jí)烷基、氨基、鹵原子等。
作為吡嗪基(ピラジル基)上優(yōu)選的基團(tuán)，可以列舉低級(jí)烷氧基羰基、羧基、?；被?、氨基甲?；h(huán)烷基氧基羰基等。
此外，作為J的吡啶基，優(yōu)選2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，吡嗪基(ピラジル基)優(yōu)選2-吡嗪基，喹啉基優(yōu)選2-喹啉基或3-喹啉基，喹喔啉基優(yōu)選2-喹喔啉基或3-喹喔啉基，呋喃基優(yōu)選2-呋喃基。
在J的定義中，對(duì)于(b)組中所述的①～⑨，其代表例如下所示。
2，3-二氫化茚基 茚滿酮基 茚基 二氫化茚酮基 茚滿二酮基 四氫萘酮基 苯并環(huán)庚酮基 茚滿醇基 亞茚滿酮基在上述一系列的式中，t表示0或1～4的整數(shù)，S表示相同或不同的在上述J(a)的定義中的取代基中的一種或者氫原子，可以優(yōu)選列舉氫原子(未取代)、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基。進(jìn)而，在苯環(huán)相鄰碳原子間可以被亞甲基二氧基、亞乙基二氧基等亞烷基二氧基取代。
其中最優(yōu)選的情況為，未取代或取代1～3個(gè)甲氧基。
此外，上述的亞茚滿酮基為在J(b)的定義中的苯基可以被取代的二價(jià)基團(tuán)的示例。即由J(b)中②的茚滿酮基衍生的代表性二價(jià)基團(tuán)。
在J的定義中，所謂由環(huán)狀胺化合物衍生的一價(jià)基團(tuán)，可以列舉例如喹唑啉酮、四氫異喹啉酮、四氫苯并二氮雜酮(テトラハイドロベンゾジアゼピン-オン)、六氫苯并苯偶氮萘乙二胺(ヘキサハイドロベンツアゾシン-オン)，結(jié)構(gòu)式中只要存在環(huán)狀酰胺即可，并非僅限于此。
可以是由單環(huán)或稠合雜環(huán)衍生的環(huán)狀酰胺，作為稠合雜環(huán)，優(yōu)選與苯環(huán)的稠合雜環(huán)。此時(shí)，苯環(huán)可以被碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基，優(yōu)選甲基，碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基，優(yōu)選甲氧基或鹵原子取代。
列舉優(yōu)選例如下所示。

在上述式中，式(i)，(1)中的Y表示氫原子或低級(jí)烷基，式(k)中的V表示氫原子或低級(jí)烷氧基，式(m)，(n)中的W1、W2表示氫原子、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基，W3表示氫原子或低級(jí)烷基。
此外，在式(j)，(1)中，右側(cè)的環(huán)為7元環(huán)，式(k)中右側(cè)的環(huán)為8元環(huán)。
J在上述定義中最優(yōu)選的為，由苯環(huán)可以被取代的茚滿酮衍生的一價(jià)基團(tuán)、由環(huán)狀酰胺化合物衍生的一價(jià)基團(tuán)。
在B的定義中，式 表示的基團(tuán)，R2為氫原子時(shí)以式-(CH2)n-表示，進(jìn)而在亞烷基鏈的任一碳原子上也可以鍵合一個(gè)或一個(gè)以上的甲基。此時(shí)，n優(yōu)選1～3。
此外，在B的一系列基團(tuán)中，在基團(tuán)內(nèi)具有酰氨基的情況也為優(yōu)選基團(tuán)的一例。
作為更優(yōu)選的基團(tuán)，可以列舉式＝(CH·CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數(shù))表示的基團(tuán)、式＝CH·(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數(shù))表示的基團(tuán)、式＝(CH·CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數(shù))表示的基團(tuán)、式-NH-表示的基團(tuán)、式-O-表示的基團(tuán)或式-S-表示的基團(tuán)。
環(huán) 可以為5～7元環(huán)。具體可以列舉 等，特別優(yōu)選的環(huán)為式 (T＝C、Q＝N)表示的哌啶。
在K的定義中的‘取代或未取代的苯基’、‘取代或未取代的芳基烷基’中，取代基與上述J的定義中的(a)的①～⑦中被定義的取代基相同。
所謂芳基烷基表示苯環(huán)被上述取代基取代，或未取代的芐基、苯乙基等。
所謂吡啶基甲基具體可以列舉2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基等。
對(duì)于K，最優(yōu)選苯基可以被取代的芳基烷基、取代或未取代的苯基、苯基可以被取代的肉桂基。
優(yōu)選的芳基烷基具體可以為例如芐基、苯乙基等，這些苯基也可以被碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基、羥基等取代。
表示單鍵或雙鍵。
作為雙鍵時(shí)的示例，可以列舉由上述苯環(huán)可以被取代的茚滿酮衍生的二價(jià)基團(tuán)，即為亞茚滿酮基。
在本發(fā)明中，作為可藥用鹽，可以列舉例如鹽酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽等無(wú)機(jī)酸鹽；甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、酒石酸鹽、甲基磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽等有機(jī)酸鹽。
此外依據(jù)取代基的選擇不同，有時(shí)也會(huì)形成例如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽的堿土類(lèi)金屬鹽；三甲基胺鹽、三乙基胺鹽、吡啶鹽、甲基吡啶鹽、二環(huán)己基胺鹽、N，N’-二芐基亞乙基二胺鹽等有機(jī)胺鹽；銨鹽等。
此外，在本發(fā)明中上述化合物依據(jù)取代基的種類(lèi)而具有手性碳，可能存在光學(xué)異構(gòu)體，這些當(dāng)然也應(yīng)是屬于本發(fā)明的范圍。
作為具體的一例，當(dāng)J具有茚滿酮骨架時(shí)，由于具有手性碳可能存在幾何異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體等，均包含在本發(fā)明的范圍中。
綜合這些定義作為特別優(yōu)選的化合物組如下所述。
[式中，J1表示選自苯基可以被取代的如下組的一價(jià)或二價(jià)基團(tuán)；①二氫化茚基、②茚滿酮基、③茚基、④二氫化茚酮基、⑤茚滿二酮基、⑥四氫萘酮基、⑦苯并環(huán)庚酮基⑧茚滿醇基⑨式 表示的基團(tuán)。
B，T，Q，q，K具有與上述相同的意義。]表示的環(huán)狀胺或可藥用鹽。
在上述J1的定義中，作為最優(yōu)選的基團(tuán)，可以列舉苯基可以被取代的茚滿酮基、茚滿二酮基、亞茚滿酮基。此外，此時(shí)，最優(yōu)選苯基未被取代，或被相同或不同的羥基、鹵素、低級(jí)烷氧基取代的情況。作為低級(jí)烷氧基，可以為碳原子數(shù)1～6的例如甲氧基、乙氧基、異丙氧基、正丙氧基、正丁氧基等，可以為1～4取代，但優(yōu)選2取代的情況。最優(yōu)選甲氧基2取代的情況。
作為包含在(A)式中的化合物中更優(yōu)選的化合物，可以列舉以下通式表示的化合物(B)。
[式中，J1表示選自苯基可以被取代的以下組的一價(jià)或二價(jià)基團(tuán)；①二氫化茚基、②茚滿酮基、③茚基、④二氫化茚酮基、⑤茚滿二酮基、⑥四氫萘酮基、⑦苯并環(huán)庚酮基⑧茚滿醇基⑨式 表示的基團(tuán)。
B1表示式 (式中，n表示0或1～10的整數(shù)。R2表示氫原子或甲基即式 表示的亞烷基為不具有取代基，或具有1個(gè)或1個(gè)以上的甲基的形式。)表示的基團(tuán)、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數(shù))表示的基團(tuán)，式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數(shù))表示的基團(tuán)或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數(shù))表示的基團(tuán)。
T，Q，q，K具有與上述相同的意義。]作為包含在(B)式中的化合物中更優(yōu)選的化合物組，可以列舉以下通式表示的化合物(C)。
(式中，J1，B1，K具有與上述相同的含義。)即，式 表示的基團(tuán)為式 表示的基團(tuán)，即哌啶。作為包含在(C)式中的化合物中更優(yōu)選的化合物組，可以列舉以下通式表示的化合物(D)。
(式中，J2表示選自苯基可以被取代的茚滿酮基、茚滿二酮基、亞茚滿酮基的基團(tuán)。
K1表示取代或未取代的苯基、可以被取代的芳基烷基、可以被取代的肉桂基。
B1具有與上述相同的意義。)3.神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)在本發(fā)明中，所謂中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞，表示來(lái)源于腦的成熟神經(jīng)細(xì)胞(優(yōu)選取自神經(jīng)回路并且機(jī)能成熟的來(lái)源于人或人以外的哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞)，為來(lái)源于選自大腦皮質(zhì)、中隔區(qū)域以及海馬的任意一種的細(xì)胞。
在本發(fā)明中，所謂中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)是指對(duì)以下負(fù)荷的保護(hù)作用，由對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞的腦缺血等缺血樣作用產(chǎn)生的負(fù)荷、NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)、由紅藻氨酸等興奮性物質(zhì)產(chǎn)生的興奮性毒性引起的負(fù)荷、由肽或蛋白質(zhì)的凝聚體毒性(包括Aβ毒性、朊病毒毒性)產(chǎn)生的負(fù)荷、由NO(一氧化氮)或活性氧引起的負(fù)荷，以及其他各種負(fù)荷。此外，在由腦缺血誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中，包含如下腦神經(jīng)的變性疾病等的傷害，例如腦中風(fēng)、腦梗塞、腦栓塞(最近也被認(rèn)為是阿耳茨海默病的病因)等。該肽或蛋白質(zhì)的凝聚體毒性，特別是Aβ毒性包括阿耳茨海默病或唐氏病伴隨誘發(fā)的毒性。
該神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)用于包含下述作用的廣泛含義中，除了可以切實(shí)地防止由對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞的負(fù)荷(例如，由緊張狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)障礙、疾病、外傷、手術(shù)等引起的體力下降、衰弱、老化等不利于維持穩(wěn)態(tài)的物理或化學(xué)障礙或細(xì)胞毒性作用)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞死亡的作用之外，還有防止神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)能降低的作用。
為了研究神經(jīng)細(xì)胞是否被保護(hù)，有必要制備神經(jīng)細(xì)胞。此時(shí)，細(xì)胞沒(méi)有特殊限定，也可以是由生物體試樣制備的原代培養(yǎng)細(xì)胞。作為來(lái)源于生物體試樣的原代培養(yǎng)細(xì)胞的制備方法，例如來(lái)源于大腦皮質(zhì)的原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞可以由大腦皮質(zhì)得到，來(lái)源于中隔區(qū)域細(xì)胞的原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞可以由中隔部位，即包括中隔區(qū)域以及前腦基底核的部位得到。
作為細(xì)胞采集源的動(dòng)物種類(lèi)，可以為小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、家兔等的任意一種，沒(méi)有特殊限定。細(xì)胞可以采集自胎兒到成體的任意生長(zhǎng)過(guò)程，優(yōu)選由胎兒(例如胎生18日齡)制備。將采集到的組織，通過(guò)胰蛋白酶處理或采用膠原酶等處理，可以得到神經(jīng)細(xì)胞。
細(xì)胞培養(yǎng)可以采用通常的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法進(jìn)行，操作者可以設(shè)定適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。
4.神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑、保護(hù)方法上述化合物Q對(duì)神經(jīng)細(xì)胞(尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞)障礙具有保護(hù)作用。此外，乙酰膽堿酯酶基因(AChE基因)的siRNA抑制AChE基因的表達(dá)而損害AChE的機(jī)能，抑制Aβ的產(chǎn)生。因此，作為上述腦中風(fēng)、腦梗塞、腦栓塞等腦神經(jīng)的變性疾病的中樞神經(jīng)保護(hù)劑、神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防劑、治療劑和/或預(yù)后改善劑(以下，稱為‘本發(fā)明的保護(hù)劑等’)的有效成分，本發(fā)明中化合物Q或下述的AChE基因的siRNA是有效的，本發(fā)明提供阿耳茨海默病或唐氏病等的治療劑、治療方法、預(yù)后改善劑以及預(yù)后改善方法。
本發(fā)明的保護(hù)劑等的有效成分(例如，鹽酸多奈哌齊)可以為無(wú)水物；也可以形成水合物。此外，例如在上述多奈哌齊中可能存在多晶型但并非僅限與此，任意結(jié)晶形可以為單一的，也可以為結(jié)晶形混合物。
在本發(fā)明中使用的化合物Q(例如鹽酸多奈哌齊)，可以采用公知的方法制備。作為代表例，可以按照特開(kāi)平1-79151號(hào)公報(bào)、特許2578475號(hào)公報(bào)、特許2733203號(hào)公報(bào)、或特許3078244號(hào)公報(bào)中公開(kāi)的方法容易地制備。此外，鹽酸多奈哌齊也可以作為細(xì)粒劑等制劑得到。
在本發(fā)明中使用的siRNA為按照下述方法設(shè)計(jì)，操作者可以使用采用核酸合成裝置等的公知方法制備。
在本發(fā)明的保護(hù)劑等中，化合物Q或AChE基因的siRNA可以直接使用，也可以配合公知的可藥用的擔(dān)體等進(jìn)行制劑。作為這種可藥用的擔(dān)體，可以列舉例如賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、著色劑、矯味矯臭劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、pH調(diào)整劑、防腐劑、抗氧化劑等。作為進(jìn)行制劑的劑型，可以列舉在口服給藥方式中使用的片劑、散劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑等，或在非口服給藥方式中使用的栓劑、注射劑、軟膏劑、糊劑等。
此外，本發(fā)明的保護(hù)劑等給藥方式?jīng)]有特殊限定，可以口服或非口服給藥。例如，作為口服給藥方式，鹽酸多奈哌齊的細(xì)粒劑可以得到商品名アリセプト細(xì)粒(エ一ザイ株式會(huì)社)、片劑可以得到商品名アリセプト片(エ一ザイ株式會(huì)社)?；蛘?，作為非口服給藥的形式，可以列舉經(jīng)皮吸收、靜脈注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射或腹腔注射等，優(yōu)選靜脈注射。此外，注射劑可以作為非水性的稀釋劑(例如丙二醇、聚乙二醇等乙二醇、橄欖油等植物油、乙醇等醇類(lèi)等)、懸濁劑或乳濁劑進(jìn)行配制。注射劑的無(wú)菌處理可以通過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾減菌，或通過(guò)配合殺菌劑等進(jìn)行。此外，注射劑可以以用時(shí)制備的形式進(jìn)行制備。即，可以通過(guò)冷凍干燥法等得到無(wú)菌的固體組合物，在使用前溶解至無(wú)菌的注射用蒸餾水或其他的溶劑中而使用。通過(guò)經(jīng)皮吸收作為貼劑給藥時(shí)，優(yōu)選不形成鹽的，所謂游離體。
在口服給藥中的化合物Q的給藥量，舉鹽酸多奈哌齊為例，優(yōu)選0.1～100mg/日，進(jìn)而優(yōu)選1.0～50mg/日，此外作為AChE基因的siRNA的優(yōu)選給藥量，為0.01～100mg/日，進(jìn)而優(yōu)選0.1～50mg/日。
在非口服給藥中，對(duì)于貼劑，作為優(yōu)選的給藥量為5～50mg/日，進(jìn)而優(yōu)選10～20mg/日。此外，對(duì)于注射劑可以通過(guò)如下方法制備，在生理鹽水或市售的注射用蒸餾水等可藥用的擔(dān)體中溶解或懸濁以使成為0.1μg/mL擔(dān)體～10mg/mL擔(dān)體的濃度。如此制備的注射劑的給藥量，對(duì)于需要治療的患者為0.01～5.0mg/日，進(jìn)而優(yōu)選0.1～1.0mg/日，可以每日分1～3次給藥。
5.機(jī)能評(píng)價(jià)方法本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑，對(duì)保護(hù)缺血性傷害神經(jīng)細(xì)胞的效果，可以通過(guò)OGD(Oxygen Glucose Deprivation除去氧、葡萄糖)試驗(yàn)評(píng)價(jià)。此外，本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑，對(duì)保護(hù)興奮毒性神經(jīng)細(xì)胞的效果，可以通過(guò)NMDA或紅藻氨酸刺激試驗(yàn)評(píng)價(jià)。進(jìn)而，本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑，對(duì)保護(hù)Aβ毒性神經(jīng)細(xì)胞的效果，可以通過(guò)Aβ毒性試驗(yàn)或Aβ凝聚試驗(yàn)評(píng)價(jià)。以下對(duì)各試驗(yàn)方法進(jìn)行說(shuō)明。
(1)OGD試驗(yàn)在OGD試驗(yàn)中，使用所謂對(duì)大鼠原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)氧·葡萄糖剝奪給予負(fù)荷而誘發(fā)缺血樣細(xì)胞損傷的模型。從而，使用該模型，進(jìn)行鹽酸多奈哌齊對(duì)上述缺血樣傷害是否具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的研究。
在本實(shí)施例中，原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞可以由大鼠胎兒(胎生17-19日齡)的大腦皮質(zhì)得到。細(xì)胞在通常的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下，例如可以使用在37℃、5％CO2環(huán)境下，培養(yǎng)7日以上的細(xì)胞。OGD處理如下進(jìn)行，將培養(yǎng)的大鼠原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞放置到?jīng)]有加入葡萄糖的緩沖液中，然后轉(zhuǎn)移到密封室中，在進(jìn)行氮置換的低氧環(huán)境下進(jìn)行。將沒(méi)加入葡萄糖的緩沖液置換為細(xì)胞培養(yǎng)用溶液，OGD處理后的細(xì)胞在37℃下，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)一晚。
(A)化合物Q，例如在確認(rèn)多奈哌齊是否具有保護(hù)缺血性傷害神經(jīng)細(xì)胞的效果時(shí)，首先，可以在OGD處理前后添加該化合物的條件下進(jìn)行本實(shí)施例。例如比較從OGD處理12小時(shí)前添加多奈哌齊的Pre-12h，從OGD處理1小時(shí)前添加多奈哌齊的Pve-1h，和OGD處理1小時(shí)后添加多奈派齊的Post-1h，和沒(méi)有進(jìn)行OGD處理的Cont以及在OGD處理前后沒(méi)有添加多奈哌齊的Vehicle的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。作為神經(jīng)保護(hù)作用的指標(biāo)，可以使用LDH的釋放抑制率。LDH乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase)為存在于細(xì)胞質(zhì)中的氧化還原酶，將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，與此伴隨而使細(xì)胞內(nèi)的NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)(nicotinamide adenine dinucleotide)量減少。因此，如果細(xì)胞受到由OGD產(chǎn)生的傷害則LDH從細(xì)胞內(nèi)流到細(xì)胞外的溶液中，在該溶液中依據(jù)細(xì)胞的傷害度(細(xì)胞死亡)存在LDH。此外，在溶液中存在的LDH量可以通過(guò)在該溶液中加入丙酮酸、NADH，使用吸光光度計(jì)測(cè)定NADH的減少率而知道。由本試驗(yàn)例表明從OGD處理12小時(shí)前添加多奈哌齊(Pre-12h)的情況最能起到神經(jīng)保護(hù)效果。
(B)此外，通過(guò)對(duì)如上OGD處理的大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)顯微鏡觀察形態(tài)，可以觀察細(xì)胞受到的傷害程度，或化合物的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)程度。與對(duì)照細(xì)胞相比較，Vehicle處置細(xì)胞不能得到正常的形態(tài)。另一方面，在OGD處理前進(jìn)行多奈哌齊處置的情況，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)如Vehicle處置細(xì)胞那樣的細(xì)胞損傷，顯示與OGD處理前的神經(jīng)細(xì)胞相近的形態(tài)。因此，從細(xì)胞形態(tài)的角度也表明通過(guò)在OGD處理前添加多奈哌齊，神經(jīng)細(xì)胞受到了保護(hù)。
(C)進(jìn)而，通過(guò)與上述的試驗(yàn)同樣的操作，將大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行OGD處理，這時(shí)可以使用各種乙酰膽堿酯酶抑制劑(雪花胺(galantamine)、他克林、雷司替明(Revastigmine))以及多奈哌齊并變化各自的濃度添加至細(xì)胞中，對(duì)此時(shí)的LDH釋放所產(chǎn)生的影響進(jìn)行試驗(yàn)。在該試驗(yàn)中，多奈哌齊的乙酰膽堿酯酶50％抑制濃度與雷司替明基本相等，但雷司替明或其他乙酰膽堿酯酶抑制劑沒(méi)有顯示神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。因此，提示了由多奈哌齊引起的對(duì)OGD處置神經(jīng)的神經(jīng)保護(hù)作用是基于與乙酰膽堿酯酶抑制作用不同的作用機(jī)制的。
(D)然后，為了研究上述多奈哌齊的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用是否介入了乙酰膽堿受體，研究了將作為乙酰膽堿受體拮抗劑的莨菪胺(蕈毒堿受體拮抗劑)以及異莰胺(煙堿受體拮抗劑)添加至細(xì)胞中時(shí)多奈哌齊的保護(hù)作用如何受到影響。通過(guò)本試驗(yàn)表明多奈哌齊的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用沒(méi)有因?yàn)樘砑虞馆邪芬约爱愝ò范艿接绊?，因此，表明多奈哌齊的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用并沒(méi)有介入乙酰膽堿受體。
(2)興奮性毒性試驗(yàn)(A)NMDA毒性在興奮性毒性試驗(yàn)中，研究對(duì)在原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中的NMDA(N-methyl-D-aspartate)毒性的化合物(例如多奈哌齊)的細(xì)胞保護(hù)作用。使用通過(guò)給予大鼠原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞NMDA刺激而誘發(fā)細(xì)胞損傷的模型。方法可以如下進(jìn)行，在如上得到的大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中添加NMDA(例如9小時(shí)添加100μM)，然后測(cè)定在培養(yǎng)液中存在的LDH量即可。在施加NMDA刺激前例如12小時(shí)前添加多奈哌齊至細(xì)胞中。然后，在添加NMDA后，例如在9小時(shí)后，測(cè)定在培養(yǎng)液中存在的LDH量，可以以此作為神經(jīng)保護(hù)作用的指標(biāo)。
通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證明多奈哌齊對(duì)NMDA興奮性毒性顯示濃度依存性神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效果。
(B)紅藻氨酸毒性紅藻氨酸被稱為增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞死亡，該神經(jīng)細(xì)胞死亡是由作為阿耳茨海默病的病因因子之一的β-淀粉狀蛋白誘發(fā)的。在本試驗(yàn)中，研究在大鼠原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中，化合物(例如多奈哌齊)對(duì)紅藻氨酸誘發(fā)的細(xì)胞損傷的細(xì)胞保護(hù)作用。
紅藻氨酸處置如下，例如在培養(yǎng)7日以上的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加紅藻氨酸，在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)一晚。化合物Q(例如多奈哌齊)在施加紅藻氨酸刺激之前添加，例如從24小時(shí)前添加。然后添加紅藻氨酸后測(cè)定在培養(yǎng)液中存在的LDH量，例如24小時(shí)后測(cè)定，可以將其作為神經(jīng)保護(hù)作用的指標(biāo)。在本試驗(yàn)中，由于多奈哌齊用量依存性地抑制神經(jīng)細(xì)胞的LHD釋放，證明多奈哌齊對(duì)紅藻氨酸興奮性毒性顯示濃度依存性保護(hù)效果。
(3)Aβ毒性試驗(yàn)或Aβ凝聚試驗(yàn)(A)培養(yǎng)中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞Aβ被認(rèn)為是阿耳茨海默病的病因，此外，阿耳茨海默病中，涉及記憶或?qū)W習(xí)中樞的膽堿能神經(jīng)脫落。
而且，膽堿能神經(jīng)從中隔區(qū)域投射到海馬等阿耳茨海默病中易于受到損傷的區(qū)域中?？紤]到以上認(rèn)知和由給予鹽酸多奈哌齊抑制阿耳茨海默病引起的海馬體積減少，優(yōu)選解釋為在膽堿能神經(jīng)中，化合物(例如多奈哌齊)對(duì)Aβ毒性的保護(hù)效果以及Aβ凝聚抑制效果。
由于具有作為乙酰膽堿合成酶的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)，多數(shù)中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞被認(rèn)為是膽堿能神經(jīng)。在本發(fā)明中，作為膽堿能神經(jīng)的上述中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞中，首次發(fā)現(xiàn)由多奈哌齊引起的對(duì)Aβ凝聚作用引起的膽堿能神經(jīng)細(xì)胞毒性的細(xì)胞保護(hù)效果。
中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞采集自生物體，可以通過(guò)培養(yǎng)而得到，其來(lái)源可以是小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、家兔等，對(duì)種類(lèi)沒(méi)有限定。細(xì)胞可以采集自從胎兒到成體的任一成長(zhǎng)過(guò)程，但優(yōu)選由胎兒(例如胎生18日齡)制備。切取腦的中隔部位，即含有中隔區(qū)域以及前腦基底核的部位，可以通過(guò)進(jìn)行胰蛋白酶處理得到細(xì)胞。
中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞可以如下培養(yǎng)，將如上得到的細(xì)胞在培養(yǎng)板上以適當(dāng)?shù)臐舛炔シN進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)板優(yōu)選涂覆聚D-賴氨酸的板，濃度優(yōu)選例如在96孔聚D-賴氨酸涂覆板上以每孔1.2×105細(xì)胞進(jìn)行播種。培養(yǎng)基可以使用含有5％胎牛血清的DMEM，DMEM更優(yōu)選含有5μg/mL胰島素、30nmol/L亞硒酸鈉、100μmol/L腐胺、20nmol/L黃體酮、15nmol/L生物素、100單位/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1mmol/L丙酮酸鈉等。
確認(rèn)培養(yǎng)中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞為膽堿能神經(jīng)可如上使用ChAT的表達(dá)作為指標(biāo)。有無(wú)ChAT表達(dá)可將培養(yǎng)的中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞用抗ChAT抗體進(jìn)行免疫染色而確認(rèn)。
(B)Aβ凝聚檢測(cè)在本發(fā)明中，可使用Aβ的β-片狀結(jié)構(gòu)形成而引起的在215～260nm的CD(圓二色性)色譜變化作為指標(biāo)研究Aβ凝聚。如果Aβ形成α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-片狀結(jié)構(gòu)，則在215～260nm下的CD(圓二色性)色譜減少。特別是，已知形成β-片狀結(jié)構(gòu)則使215nm附近的CD光譜減少。
此外，為了簡(jiǎn)便地研究培養(yǎng)液中的Aβ凝聚，作為其他方式，可以使用硫代黃素T測(cè)定Aβ的熒光。在細(xì)胞中添加Aβ(1-42)48小時(shí)后，采取培養(yǎng)基并加入10μmol/L的硫代黃素T，立即在激發(fā)波長(zhǎng)450nm、發(fā)射波長(zhǎng)490nm下進(jìn)行熒光測(cè)定(Wall J.，Schell M.，MurphyC.，Hrncic R.，Stevens F.J.，Solomon A.(1999)Thermodynamicinstability of human lambda 6 light chainscorrelation withfibrillogenicity.Biochemistry.38(42)，14101-14108.)。
(C)Aβ毒性檢測(cè)已知如果Aβ形成β-片狀結(jié)構(gòu)則變得易于形成Aβ纖維固化，形成毒性。在本發(fā)明中Aβ毒性的檢測(cè)可以在中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞中添加Aβ后，使用測(cè)定細(xì)胞障礙的公知方法進(jìn)行，以下記述優(yōu)選的代表例，但并非僅限于此。例如，與上述(1)同樣地使用培養(yǎng)基中的LDH量作為指標(biāo)進(jìn)行研究?；蛘撸诒景l(fā)明中，Aβ毒性在中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞中添加Aβ后，通過(guò)MTT(二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)測(cè)定進(jìn)行研究。MMT測(cè)定的方法可以如下進(jìn)行，例如，在培養(yǎng)基中添加MTT(シグマ社制)以使終濃度為1mg/mL，在37℃下培育1小時(shí)后，去除培養(yǎng)基，將細(xì)胞用DMSO溶解，測(cè)定其吸光度(550nm)。或通過(guò)alamar blue細(xì)胞障礙測(cè)定方法進(jìn)行研究。通過(guò)alamar blue的該方法為添加10分之1培養(yǎng)基量的alamar blue(和光純藥社制)，使其在5％CO2環(huán)境下反應(yīng)。4小時(shí)后，在激發(fā)波長(zhǎng)530nm，熒光波長(zhǎng)590nm，增益35下進(jìn)行測(cè)定。以只含培養(yǎng)基作為0％，對(duì)照作為100％進(jìn)行換算。
在細(xì)胞中添加的Aβ，可以使用全長(zhǎng)Aβ，也可以使用從N末端開(kāi)始只具有40個(gè)殘基的Aβ(1-40)，只要是具有β片狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)型，可以使用任一長(zhǎng)度的Aβ。
此外，Aβ毒性引起的細(xì)胞死亡程度也可以通過(guò)由抗MAP2抗體的免疫染色進(jìn)行研究。上述MAP2為神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記，因此由表達(dá)MAP2的細(xì)胞量，可以確認(rèn)Aβ毒性引起的神經(jīng)細(xì)胞的脫落程度?；蛘撸ㄟ^(guò)使用錐蟲(chóng)藍(lán)的細(xì)胞障礙測(cè)定方法進(jìn)行研究。加入錐蟲(chóng)藍(lán)(和光純藥公司制)，以沒(méi)有被染色為深藍(lán)色的細(xì)胞作為活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
(D)對(duì)中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的Aβ毒性的神經(jīng)保護(hù)劑以及Aβ凝聚抑制劑如果將乙酰膽堿酯酶(AChE)基因的siRNA添加到中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞中，則細(xì)胞內(nèi)的AChE活性降低。siRNA處置緩和Aβ毒性引起的中隔區(qū)域細(xì)胞障礙這一點(diǎn)，可以通過(guò)測(cè)定上述(C)的LDH表明。
此外，在添加該siRNA的中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞中，siRNA處置抑制Aβ凝聚作用的情況，可以通過(guò)測(cè)定上述(B)的CD光譜表明。
由上可知，在中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的Aβ毒性以及Aβ凝聚中，涉及AChE。因此本發(fā)明含有Aβ凝聚抑制劑，該Aβ凝聚抑制劑為具有抑制乙酰膽堿酯酶機(jī)能作用的化合物，并含有同時(shí)具有實(shí)際上抑制乙酰膽堿酯酶與Aβ間的相互作用的化合物。
所謂‘相互作用’表示乙酰膽堿酯酶與Aβ結(jié)合。所謂‘實(shí)際上抑制乙酰膽堿酯酶與Aβ間的相互作用’表示在乙酰膽堿酯酶存在下抑制Aβ的凝聚被促進(jìn)。并且，只要Aβ毒性被抑制，則可以稱為‘實(shí)際上’相互作用被抑制。
乙酰膽堿的機(jī)能降低作用，可以是乙酰膽堿酯酶的活性抑制引起的，也可以是乙酰膽堿酯酶基因表達(dá)抑制引起的。
AChE的活性抑制，只要抑制乙酰膽堿與Aβ間的相互作用，只要抑制AChE的酶活性，則可以為任意化合物(例如下式的鹽酸多奈哌齊)，此外，也可以是抗AChE抗體。

AChE基因的表達(dá)抑制，抑制只要是乙酰膽堿與Aβ間的相互作用，并且，抑制AChE基因的表達(dá)，可以為生成RNAi的任意核酸(siRNA或shRNA)。通過(guò)RNAi抑制AChE基因的表達(dá)，例如設(shè)計(jì)和合成AChE基因?qū)?yīng)的siRNA(small interfering RNA)或shRNA(short hairpinRNA)，使其作用生成RNAi即可。siRNA為在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)Dicer處理產(chǎn)生的短鏈RNA。而shRNA為折疊為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNA分子，具有有意義鏈和反義鏈以環(huán)連接的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
siRNA的設(shè)計(jì)基準(zhǔn)如下。
(a)選擇編碼AChE的基因的起始密碼子的下游區(qū)域。只要是起始密碼子下游的序列即沒(méi)有特殊限定，任意的區(qū)域都可能成為候選。
(b)在選擇區(qū)域方面，選擇以aa開(kāi)始的連續(xù)11～30堿基，優(yōu)選21～25的序列。
具體地可將以下堿基序列作為靶序列，使用含有該靶序列，并且30堿基以下，例如11～30堿基長(zhǎng)度(優(yōu)選21～25堿基長(zhǎng)度)的序列作為siRNA((i-1)和(i-2)，以及(ii-1)和(ii-2))。
(i-1)5′-AAUGUCAGUGACUCUGUUUTT-3′(序列編號(hào)1)(i-2)5′-AAACAGAGUCACUGACAUUTT-3′(序列編號(hào)2)(ii-1)5′-GCUGCCUCAAGAAAGUAUCTT-3′(序列編號(hào)3)(ii-2)5′-GAUACUUUCUUGAGGCAGCTT-3′(序列編號(hào)4)本發(fā)明的AChE基因的siRNA，優(yōu)選使用(i-1)與(i-2)組合，以及(ii-1)與(ii-2)組合而形成的雙鏈RNA的形式。
此外，shRNA的設(shè)計(jì)基準(zhǔn)如下。
(a)在RNAi中使用的AChE對(duì)應(yīng)的shRNA序列，從基因上特異性的5’末端區(qū)域開(kāi)始至300堿基的范圍進(jìn)行設(shè)計(jì)(Elbashir，S.M.et.al.Genes Dev.15，188-200(2001))。
(b)從各自基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’末端附近的區(qū)域開(kāi)始，選擇和設(shè)計(jì)以aa或a開(kāi)始的mRNA序列作為靶序列。目標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度沒(méi)有被特殊限制，優(yōu)選30bp以下，更優(yōu)選21～25bp左右。
將siRNA以及shRNA導(dǎo)入培養(yǎng)的中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞中時(shí)，可以采用將體外合成的siRNA以及shRNA連接至質(zhì)粒DNA上而將其導(dǎo)入到細(xì)胞中的方法，將雙鏈RNA復(fù)性的方法等。
此外，由顯示Aβ凝聚抑制效果的siRNA或shRNA的結(jié)構(gòu)解析而預(yù)見(jiàn)的化合物，并且具有Aβ凝聚抑制效果的化合物也被包含在本發(fā)明中。
(E)由膽堿酯酶抑制劑或膽堿酯酶基因的siRNA產(chǎn)生的Aβ凝聚抑制作用以及對(duì)Aβ毒性的保護(hù)作用的檢測(cè)本發(fā)明提供具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選方法。即通過(guò)測(cè)定在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞中，在Aβ存在下添加被檢化合物(候選化合物)時(shí)在215～260nm，特別是215nm處的CD光譜的減少，可以進(jìn)行抑制Aβ凝聚的化合物的篩選。判斷被檢化合物是否具有Aβ凝聚抑制作用，可以通過(guò)比較由被檢化合物引起的Aβ凝聚量，與在不存在候選化合物的條件下的Aβ凝聚量而進(jìn)行。本發(fā)明還提供用于在上述方法中使用的具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒。
在本發(fā)明的試劑盒中，包含通過(guò)上述(B)的CD光譜法測(cè)定Aβ凝聚抑制的必要試劑。在Aβ凝聚中所必要的Aβ、CD光譜測(cè)定時(shí)使用的試劑種類(lèi)優(yōu)選使用下述實(shí)施例6以及實(shí)施例7中使用的試劑。
此外，本發(fā)明提供如下篩選方法，該方法篩選由Aβ毒性誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防和/或治療上有效的化合物或其可藥用鹽。即，通過(guò)檢測(cè)在培養(yǎng)的中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞中添加被檢化合物以及Aβ時(shí)的細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡，可以進(jìn)行由Aβ毒性誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防和/或治療上有效的化合物的篩選。上述細(xì)胞障礙或細(xì)胞死亡，可以通過(guò)測(cè)定上述(C)中所述的LDH量，或通過(guò)MTT測(cè)定等檢測(cè)。本發(fā)明還提供用于在上述方法中使用的由Aβ毒性誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防和/或治療上有效的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒。
此外，在本發(fā)明的試劑盒中，包含在以上述(C)的細(xì)胞外以LDH量為指標(biāo)測(cè)定由Aβ毒性誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞障礙時(shí)的必要試劑，或用于實(shí)施MTT測(cè)定等的必要試劑。用于以LDH測(cè)定由Aβ毒性誘發(fā)的細(xì)胞障礙程度的必要試劑可以優(yōu)選在下述實(shí)施例1，2，3，5以及7中使用的試劑，可以列舉例如NADH、丙酮酸。此外，用于通過(guò)MTT測(cè)定由Aβ毒性誘發(fā)的細(xì)胞障礙程度的必要試劑種類(lèi)，可以列舉例如MTT。
構(gòu)成這些試劑盒的各成分可以分別準(zhǔn)備，或在不發(fā)生問(wèn)題的限度下共存。試劑盒可以包含溶液，或者可以是用于配制這種溶液的成分的濃縮形態(tài)。
進(jìn)而根據(jù)需要，該試劑盒還可以包含輔助劑、專(zhuān)用容器、其他必要的附件、說(shuō)明書(shū)等。
在本發(fā)明中，如多奈哌齊這樣的乙酰膽堿酯酶抑制劑或乙酰膽堿酯酶基因的siRNA引起的Aβ凝聚抑制作用可以通過(guò)如下測(cè)定進(jìn)行確認(rèn)，在添加Aβ前(例如24小時(shí))添加乙酰膽堿酯酶抑制劑，在添加Aβ后(例如48小時(shí)后)，測(cè)定上述的CD光譜。
此外，在同樣處置的細(xì)胞中，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)基中的LDH量，可以確認(rèn)如多奈哌齊這樣的乙酰膽堿酯酶抑制劑或乙酰膽堿酯酶基因的siRNA引起的對(duì)Aβ毒性的保護(hù)作用。
以下，通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明并非僅限于本實(shí)施例。
實(shí)施例1OGD試驗(yàn)在本實(shí)施例中，使用通過(guò)對(duì)大鼠原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)氧·葡萄糖剝離施予負(fù)荷而誘發(fā)缺血樣細(xì)胞損傷的模型。對(duì)鹽酸多奈哌齊對(duì)上述缺血樣傷害是否具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用進(jìn)行研究。
在本實(shí)施例中，原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞由大鼠胎兒(胎生17-19日齡)的大腦皮質(zhì)得到。培養(yǎng)液使用在DMEM(Gibco BRL)中含有10％胎牛血清(Gibco BRL)、10％馬血清(Gibco BRL)、5μg/mL胰島素(Sigma)、30nM亞硒酸鈉(Sigma)、100μM腐胺(Sigma)、20nM黃體酮(Sigma)、15nM生物素(Sigma)、100單位/mL青霉素(GibcoBRL)、100μg/mL鏈霉素(Gibco BRL)、8mM葡萄糖和1mM丙酮酸(Sigma)(參照文獻(xiàn)Scholtz et al.，1988)，細(xì)胞在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)7日以上后，實(shí)施OGD處理。OGD處理如下進(jìn)行，將大鼠原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞放置到?jīng)]有加入葡萄糖的緩沖液中，然后轉(zhuǎn)移到密封室中，氮置換，在低氧環(huán)境下進(jìn)行處理，上述緩沖液組成如下Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液(5.36mM KCl，1.26mMCaCl2，0.44mM KH2PO4，0.49mM MgCl2，0.41mM MgSO4，137mMNaCl，4.17mM NaHCO3，0.34mM Na2HPO4，10mM HEPES(pH7.4))。將沒(méi)加入葡萄糖的緩沖液置換為細(xì)胞培養(yǎng)用溶液，將OGD處理后的細(xì)胞在37℃下，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)一晚。首先，通過(guò)在OGD處理前后添加多奈哌齊研究是否有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效果，或是否變化。比較OGD處理12小時(shí)前添加多奈哌齊的Pre-12h，OGD處理1小時(shí)前添加多奈哌齊的Pre-1h以及OGD處理1小時(shí)后添加多奈哌齊的Post-1h，和沒(méi)有進(jìn)行OGD處理的Cont以及在OGD處理前后沒(méi)有添加多奈哌齊的Vehicle的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。作為神經(jīng)保護(hù)作用的指標(biāo)，可以使用LDH的釋放抑制率。LDH(乳酸脫氫酶)為存在于細(xì)胞質(zhì)中的氧化還原酶，將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，使與此相伴存在的NADH(煙堿胺腺嘌呤二核苷酸)(nicotinamide adenine dinucleotide)量減少。因此，如果細(xì)胞受到由OGD產(chǎn)生的傷害則LDH從細(xì)胞內(nèi)流到細(xì)胞外的溶液中，在該溶液中依據(jù)細(xì)胞的傷害度(細(xì)胞死亡)而存在LDH。此外，在溶液中存在的LDH量可以通過(guò)在該溶液中加入丙酮酸、和NADH，使用吸光光度計(jì)測(cè)定NADH的減少率而知道。結(jié)果如圖1所示。由圖1清楚地表明Pre-12h顯示最大的LDH釋放抑制作用，以下依次為Pre-1h、Post-1h。由該結(jié)果可知，在OGD處理12小時(shí)前添加多奈哌齊的情況下，有效地保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。在以后的OGD試驗(yàn)中多奈哌齊的添加時(shí)間均固定在Pre-12h。
然后，通過(guò)與上述試驗(yàn)相同的操作將OGD處理大鼠原代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖2所示。由圖2清楚地表明與對(duì)照(A)相比較V’ehicle(B)中細(xì)胞不能維持正常的形態(tài)，顯然因OGD受到了傷害。另一方面，在OGD處理前添加多奈哌齊的情況，未見(jiàn)如(B)中見(jiàn)到的那樣的神經(jīng)細(xì)胞損傷，明顯為與OGD處理前的神經(jīng)細(xì)胞的狀態(tài)相近的狀態(tài)(C)。因此，表明通過(guò)在OGD處理前添加多奈哌齊，神經(jīng)細(xì)胞被保護(hù)。
然后，通過(guò)與上述的試驗(yàn)同樣的操作，將大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行OGD處理，這時(shí)可以使用各種乙酰膽堿酯酶抑制劑(雪花胺、他克林、雷司替明)以及多奈哌齊并變化各自的濃度添加至細(xì)胞中，對(duì)此時(shí)的LDH釋放所產(chǎn)生的影響進(jìn)行試驗(yàn)。添加的濃度定為，多奈哌齊、他克林以及雷司替明0.1，1.0，10μM，雪花胺1.0，10，100μM。結(jié)果如圖3所示。如圖3A所示可知僅多奈哌齊用量依存性地抑制神經(jīng)細(xì)胞的LHD釋放，該抑制是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地抑制。此處，在各自的大鼠腦破碎懸濁液中的乙酰膽堿酯酶抑制劑的50％抑制濃度(IC50)如表1所示。
表1

Ogura et al.2000.Comparison of inhibitory activities of Donepeziland other cholinesterase inhibitors on acetylcholinesterase andbutyrylcholinesterase in vitro.Methods Find Exp Clin Pharmacol.22，609-613如表1所示可知多奈哌齊的乙酰膽堿酯酶50％抑制濃度與雷司替明基本相等。但雷司替明或其他乙酰膽堿酯酶抑制劑沒(méi)有顯示神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。該結(jié)果提示神經(jīng)保護(hù)作用是基于與乙酰膽堿酯酶抑制作用不同的作用機(jī)制的。
然后，通過(guò)以下試驗(yàn)研究了在將作為乙酰膽堿受體拮抗物的莨菪胺(蕈毒堿受體拮抗物)以及異莰胺(煙堿受體拮抗物)添加至細(xì)胞中時(shí)，多奈哌齊的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用如何受到影響。
與上述試驗(yàn)同樣地，OGD處理的12小時(shí)前在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中添加多奈哌齊、莨菪胺、異莰胺、多奈哌齊和莨菪胺、或多奈哌齊和異莰胺，對(duì)由OGD處理引起的LDH釋放的影響進(jìn)行試驗(yàn)。添加的濃度設(shè)為，多奈哌齊、莨菪胺、異莰胺均為10μM。
結(jié)果如圖4所示。如圖4清楚表明多奈哌齊的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，在Cont(沒(méi)有OGD處理)、Vehi(沒(méi)有添加多奈哌齊)以及添加多奈哌齊的任意的試樣中并沒(méi)有因?yàn)槭欠裉砑幼鳛橐阴Ｄ憠A受體拮抗物的莨菪胺(圖4A)或異莰胺(圖4B)而受到影響。這表明多奈哌齊顯示保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用與是否抑制乙酰膽堿受體無(wú)關(guān)。因此，通過(guò)本試驗(yàn)認(rèn)為多奈哌齊通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶作用以外的作用機(jī)制發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用。
實(shí)施例2興奮性毒性試驗(yàn)在本實(shí)施例中，研究多奈哌齊對(duì)NMDA毒性的細(xì)胞保護(hù)作用。使用通過(guò)對(duì)大鼠原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)施予NMDA刺激而誘發(fā)細(xì)胞損傷的模型。對(duì)如實(shí)施例1操作而得到的大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞添加100μM NMDA，在9小時(shí)后測(cè)定培養(yǎng)液中存在的LDH量。
在本實(shí)施例中，原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞由大鼠胎兒(胎生17-19日齡)的大腦皮質(zhì)得到。培養(yǎng)液使用在MEM(invitrogen公司制)中添加葡萄糖(1g/L)、青霉素/鏈霉素(100單位/mL)、10％FCS的培養(yǎng)液。每2，3天進(jìn)行培養(yǎng)基交換。表達(dá)KA毒性時(shí)，培養(yǎng)基使用添加B-27和0.25mM谷氨酰胺的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(invitrogen公司制)。細(xì)胞在37℃下，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天以上后，在培養(yǎng)基中添加100μMNMDA，在37℃下，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)一晚。施加NMDA刺激12小時(shí)前在細(xì)胞中添加多奈哌齊。然后，在添加NMDA 9小時(shí)后測(cè)定在培養(yǎng)液中存在的LDH量，作為神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的指標(biāo)。
本實(shí)施例的結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，從0.1μM到10μM的范圍內(nèi)多奈哌齊用量依存性地抑制神經(jīng)細(xì)胞的LDH釋放。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可知多奈哌齊對(duì)NMDA興奮性毒性顯示濃度依存性神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效果。
實(shí)施例3興奮性毒性試驗(yàn)紅藻氨酸被稱為增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞死亡，該神經(jīng)細(xì)胞死亡是由作為阿耳茨海默病的病因因子之一的β-淀粉狀蛋白(Aβ)誘發(fā)的。在實(shí)施例中，使用通過(guò)對(duì)大鼠原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞施予紅藻氨酸而誘發(fā)細(xì)胞損傷的模型。
在本實(shí)施例中，原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞由大鼠胎兒(胎生17-19日齡)的大腦皮質(zhì)得到。細(xì)胞在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)7日以上后，在培養(yǎng)基中加入NMDA或紅藻氨酸，在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)一晚。施加紅藻氨酸刺激24小時(shí)前在細(xì)胞中添加多奈哌齊。然后，在添加紅藻氨酸24小時(shí)后測(cè)定在培養(yǎng)液中存在的LDH量，作為神經(jīng)保護(hù)作用的指標(biāo)。
本實(shí)施例的結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，從0.1μM到1μM的范圍內(nèi)多奈哌齊用量依存性地抑制神經(jīng)細(xì)胞的LDH釋放。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可知多奈哌齊對(duì)紅藻氨酸興奮性毒性顯示濃度依存性保護(hù)效果。
在以下的實(shí)施例4～7中使用的試劑以及統(tǒng)計(jì)分析方法如下。
Aβ(人，1-40)由ペプチド研(Osaka，Japan)購(gòu)入。胰蛋白酶溶液、青霉素、鏈霉素、Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)、HEPES由Life Technologies Inc.(Grand Island，NY)購(gòu)入。胰島素、亞硒酸鈉、腐胺、DNase I、異莰胺、莨菪胺由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)購(gòu)入。胎牛血清和熱滅活馬血清由Nichirei Co.(Tokyo，Japan)購(gòu)入。ChAT、微管相關(guān)蛋白-2(MAP2)由Chemicon InternationalInc.(Temecula，CA)購(gòu)入。Alexa Fluor 546由Molecular Probes(Eugene，OR)購(gòu)入。Vecstain Elite ABC試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒由Vector Laboratories，Inc.(Burlingame，CA)購(gòu)入。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine 2000)由Invitrogen Co.(Carlsbad，CA)購(gòu)入。SiRNA委托日本バイオサ一ビス(Saitama，Japan)合成。
統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。比較檢驗(yàn)使用Welch’st-test。P＜0.05為具有顯著性差異。統(tǒng)計(jì)分析軟件使用SAS 8.1(SASInstitute Japan Ltd.，Tokyo，Japan)。
實(shí)施例4中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)以及膽堿能神經(jīng)的確認(rèn)中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞由Wister大鼠(日本チヤ一ルズリバ一)的胎兒(胎生18日齡)制備。由胎兒腦切取中隔部位(包括中隔區(qū)域和前腦基底核)，在含有0.25％胰蛋白酶和0.2mg/mL DNase I的Ca2+/Mg2+freeHank’s balanced salt solution中，在37℃下培育15分鐘。在得到的細(xì)胞中，加入已加入10％胎牛血清、10％馬血清的DMEM(含有5μg/mL胰島素、30nmol/L亞硒酸鈉、100μmol/L腐胺、20nmol/L黃體酮、15nmol/L生物素、100單位/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1mmol/L丙酮酸鈉)而使胰蛋白酶失活，洗滌細(xì)胞2次。在96-孔的涂覆聚-D-賴氨酸培養(yǎng)板上，以1.2×105細(xì)胞/孔的濃度播種細(xì)胞。播種的細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱(5％CO2，37℃)中培養(yǎng)。一天后，用含有5％胎牛血清的上述DMEM交換3分之2培養(yǎng)基。3天后，再用含有5％胎牛血清的上述DMEM交換3分之2培養(yǎng)基。6天后，用不含血清的上述DMEM(但不含谷氨酰胺)全量交換培養(yǎng)基。
將用以上方法培養(yǎng)的中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞，用抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)抗體進(jìn)行免疫染色。首先，將培養(yǎng)的中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞用中性福爾馬林溶液固定60分鐘。用5％山羊血清培育30分鐘后，在1％山羊血清存在下用稀釋500倍的ChAT抗體培育1天。然后，將細(xì)胞用稀釋500倍的山羊抗-兔IgG以及HRP標(biāo)記的親合素-生物素復(fù)合物培育1小時(shí)后，使用DAB作為過(guò)氧化物酶的基質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞染色。
用抗ChAT抗體免疫染色培養(yǎng)大鼠中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)果如圖7所示。圖7的標(biāo)尺表示0.1mm。通過(guò)免疫染色表明大多的培養(yǎng)大鼠中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞具有作為乙酰膽堿合成酶的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)。這意味著培養(yǎng)大鼠中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞為膽堿能神經(jīng)。即，可以確認(rèn)該細(xì)胞為膽堿能神經(jīng)。
以往，報(bào)道了在阿耳茨海默病患者腦中的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的減少與識(shí)別障礙的嚴(yán)重程度有關(guān)(Perry E.K.，Tomlinson B.E.，Blessed G.，Bergman K.，Gibson P.H.and Perry R.H.(1978)Correlation ofcholinergic abnormalities with senile senile plaques and mental testscores in senile dementia.Br.Med.J.2，1457-1459.)。因此，可以說(shuō)中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞損傷的抑制程度與抑制阿耳茨海默病患者的識(shí)別機(jī)能降低相關(guān)。
實(shí)施例5多奈哌齊對(duì)Aβ(1-40)毒性的保護(hù)效果以及細(xì)胞死亡試驗(yàn)作為細(xì)胞障礙指標(biāo)，測(cè)定LDH(乳酸脫氫酶)。細(xì)胞使用按照如實(shí)施例4的培養(yǎng)方法培養(yǎng)7天的中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞。在中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加15μmol/L的Aβ(1-40)，在CO2培養(yǎng)箱(5％CO2，37℃)中培養(yǎng)。在添加Aβ(1-40)24小時(shí)前加入多奈哌齊(0.01，0.1，1，10μmol/L)、異莰胺(10μmol/L)、莨菪胺(10μmol/L)。在添加Aβ(1-40)48小時(shí)后，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。同時(shí)，將細(xì)胞用含有0.5％Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶解，并測(cè)定細(xì)胞中的LDH。計(jì)算在全部LDH(細(xì)胞內(nèi)以及培養(yǎng)基中)中，在培養(yǎng)基中漏出的LDH量，以％表示(Koh J.Y.and Choi D.W.(1987)Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronalinjury in cell culture by lactate dehydrogenase efflux assay.J.Neurosci.Meth.20，83-90.)。數(shù)據(jù)用ANOVA以及Welch’s t-test分析方法進(jìn)行分析。
結(jié)果如圖8所示。在圖8中，白色直方表示沒(méi)有加Aβ的細(xì)胞，灰色直方表示加Aβ的細(xì)胞。求出各值以平均值±S.E.M.(n＝23-25)表示并將其圖形化。圖8的[*]表示P＜0.05，[**]表示P＜0.01，以及[***]表示P＜0.001(以‘Control cells’作為對(duì)照)。
培養(yǎng)的中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞易于受到由Aβ(1-40)引起的障礙(圖8[control細(xì)胞])。與添加Aβ(1-40)48小時(shí)時(shí)的毒性相比，多奈哌齊從0.1μmol/L開(kāi)始顯示顯著地保護(hù)效果(圖8)。由多奈哌齊產(chǎn)生的Aβ(1-40)毒性的抑制效果沒(méi)有被作為乙酰膽堿受體拮抗劑的異莰胺以及莨菪胺抑制(圖8)。
然后，將如上用Aβ(1-40)處置的培養(yǎng)小鼠中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞用抗MAP2抗體免疫染色。MAP2被用作神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記(Herzog W.andWeber K.(1978)Fractionation of brain microtubule-associated proteins.Isolation of two different proteins which stimulate tubulinpolymerization in vitro.Eur J Biochem.92(1).1-8)。MAP2染色按照上述實(shí)施例4的免疫染色方法進(jìn)行，在中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞中添加15μmol/L的Aβ(1-40)48小時(shí)后，固定細(xì)胞并進(jìn)行免疫染色。添加Aβ(1-40)24小時(shí)前加入多奈哌齊。固定細(xì)胞后，用稀釋至300倍的抗MAP2抗體培育一天，用Alexa Fluor546作為熒光基質(zhì)檢測(cè)。
結(jié)果如圖9所示。標(biāo)尺表示0.1mm。A表示沒(méi)有加入Aβ(1-40)的對(duì)照細(xì)胞。B表示加入Aβ(1-40)的細(xì)胞。C、D、E分別表示加入Aβ(1-40)和多奈哌齊(0.1，1，10μmol/L)的細(xì)胞。左側(cè)的照片為Hoffman modulation的明視野照片。右側(cè)的照片為熒光照片。如果48小時(shí)加入Aβ(1-40)，則被MAP2染色的神經(jīng)細(xì)胞減少(圖9B)。確認(rèn)了多奈哌齊抑制由Aβ(1-40)引起的MAP2染色細(xì)胞的障礙(圖9)。
實(shí)施例6多奈哌齊對(duì)Aβ(1-40)凝聚的效果為了研究在培養(yǎng)液中的Aβ(1-40)結(jié)構(gòu)狀態(tài)而測(cè)定CD光譜。已知如果Aβ形成β-片狀結(jié)構(gòu)則變得易于形成Aβ纖維固化，顯示毒性(Howlett D.R.，Jennings K.H.，Lee D.C.，Clark M.S.，Brown F.，Wetzel R.，Wood S.J.，Camilleri P.and Roberts G.W.(1995)Aggregation state and neurotoxic properties of Alzheimer beta-amyloidpeptide.Neurodegeneration.4，23-32.)。此外，已知如果Aβ(1-40)形成α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-片狀結(jié)構(gòu)，則從205到225nm下的CD(圓二色性)色譜減少(Sreerama N.，Venyaminov S.Y.and Woody R.W.(2000)Estimation of peptide secondary structure from circular dichroismspectrainclusion of denatured peptides with native peptides in theanalysis.Anal.Biochem.287，243-251；Bokvist M.，Lindstrom F.，WattsA.and Grobner G.(2004)Two types of Alzheimer’s beta-amyloid(1-40)peptide membrance interactionsaggregation preventingtransmembrance anchoring versus accelerated surface fibril formation.J.Mol.Biol.335，1039-49.)。特別是，已知形成β-片狀結(jié)構(gòu)使215nm附近的CD光譜減少。因此測(cè)定CD作為Aβ凝聚指標(biāo)。
在培養(yǎng)的中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞中添加15μmol/L Aβ(1-40)，在添加48小時(shí)后采取培養(yǎng)基，測(cè)定215～260nm的CD光譜。在CD光譜測(cè)定時(shí)使用JASCO(日本分光，J-720WI)。
結(jié)果如圖10所示。A表示沒(méi)有加入多奈哌齊的細(xì)胞。B表示添加多奈哌齊(10μM)的細(xì)胞。實(shí)線表示沒(méi)加入Aβ的細(xì)胞，虛線表示加入Aβ的細(xì)胞。此外，A2以及B2分別表示由A以及B圖的虛線值減去實(shí)線值。通過(guò)添加10μmol/L多奈哌齊，從215nm到225nm的CD光譜的減少被抑制。因此，通過(guò)本實(shí)施例，表明多奈哌齊抑制了Aβ形成α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-片狀結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例7siRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿活性的效果以及對(duì)Aβ(1-40)毒性的保護(hù)效果(1)siRNA處理作為乙酰膽堿酯酶的雙鏈siRNA使用下述2組低聚核苷酸((i)以及(ii))。
(i)；5′-AAUGUCAGUGACUCUGUUUTT-3′(序列編號(hào)1)、5′-AAACAGAGUCACUGACAUUTT-3′(序列編號(hào)2)以及(ii)；5′-GCUGCCUCAAGAAAGUAUCTT-3′(序列編號(hào)3)、5′-GAUACUUUCUUGAGGCAGCTT-3′(序列編號(hào)4)。
在中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)第6日和第7日，在培養(yǎng)基中加入1μmol/L的上述(i)以及(ii)的siRNA和lipofectamine 2000(0.4μL/mL)。在培養(yǎng)第9日，溶解細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的乙酰膽堿酯酶活性(AChE活性)。
(2)乙酰膽堿酯酶活性的測(cè)定乙酰膽堿酯酶活性的測(cè)定按照Ellman等的方法進(jìn)行(EllmanG.L.，Courtney K.D.，Anders V.J.，F(xiàn)eather-Stone R.M.(1961)A newand rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity.Biochem.Pharmacol.7，88-95)。將細(xì)胞用含有0.5％Triton X-100的磷酸緩沖液(pH 8.0)溶解。離心分離得到的細(xì)胞溶液，上清液用磷酸緩沖液(pH 8.0)稀釋3倍。在稀釋的上清液中，添加5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(0.33mmol/L)和碘化乙酰硫代膽堿(AthCh)(0.5mmol/L)，攪拌后，測(cè)定在412nm下的吸光度的增加(MolecularDevices，SpectraMax 190EXT)。數(shù)據(jù)用ANOVA和Welch’s t-test分析。
結(jié)果如圖11所示。各值以平均值±S.E.M.(n＝11)的形式圖形化(n＝11)。在圖11中，相對(duì)沒(méi)有添加siRNA的細(xì)胞，[**]表示P＜0.01，[***]表示P＜0.001。
確認(rèn)了研究2種siRNA、(i)以及(ii)的，結(jié)果都有AChE活性抑制效果(圖11)。
(3)siRNA對(duì)Aβ(1-40)毒性的保護(hù)效果測(cè)定LDH(乳酸脫氫酶)作為細(xì)胞障礙的指標(biāo)。在培養(yǎng)第7日在中隔區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞中添加15μmol/L的Aβ(1-40)，培育48小時(shí)。在添加Aβ(1-40)的24小時(shí)前和添加之前立即加入1μmol/L siRNA。白色直方表示沒(méi)有加入Aβ(1-40)的細(xì)胞?；疑狈奖硎炯尤階β(1-40)的細(xì)胞。采用ANOVA和Welch’s t-test分析數(shù)據(jù)。
結(jié)果如圖12所示。各值以平均值±S.E.M.的形式圖形化(n＝7)。在圖12中，相對(duì)沒(méi)有添加siRNA的細(xì)胞，[***]表示P＜0.001。
研究了上述2種siRNA((i)以及(ii))的效果，結(jié)果都抑制Aβ毒性(圖12)。
在LDH測(cè)定同時(shí)，用在215nm～260nm下的CD光譜變化分析Aβ的凝聚。
結(jié)果如圖13所示。A表示加入RNAi的細(xì)胞。實(shí)線表示沒(méi)加入Aβ的細(xì)胞，虛線表示加入Aβ的細(xì)胞。B表示由A的虛線值減去實(shí)線值的數(shù)值。通過(guò)添加siRNA從215nm到225nm的CD光譜減少被抑制(圖13)。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明中的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑，對(duì)由缺血樣細(xì)胞損傷和興奮性毒性引起的傷害發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。因此，通過(guò)本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑可以防止、抑制由腦梗塞或腦血栓等誘發(fā)的缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡以及由興奮性毒性誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞死亡。
序列表フリ一テキスト序列編號(hào)1siRNA序列編號(hào)2siRNA序列編號(hào)3siRNA序列編號(hào)4siRNA
序列表<110>Eisai Co.，Ltd.
<120>神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑<130>G05-0066CN<150>JP 2003-167744<151>2003-06-12<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA<400>1aaugucagug acucuguuut t21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA<400>2aaacagaguc acugacauut t21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA<400>3gcugccucaa gaaaguauct t21
<210>4<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>siRNA<400>4gauacuuucu ugaggcagct t211權(quán)利要求
1.含有以下(i)～(vii)表示的任一化合物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑，(i)以下述化學(xué)式表示的1-芐基-4-[(5，6-二甲氧基-1-茚滿酮)-2-基]甲基哌啶或其可藥用鹽， (ii)以下的通式(I)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽， [式中，J表示選自以下式 茚滿酮基 茚基 茚滿二酮基 亞茚滿酮基 (式中，S表示碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基、鹵原子或羥基；t表示0或1～4的整數(shù)；并且，進(jìn)而(S)t也可以在結(jié)合的苯環(huán)的相鄰碳原子間也可以形成亞甲二氧基或亞乙二氧基；式(1)中的Y表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基，式(k)中V表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基，式(n)中W1及W2相互獨(dú)立，相同或不同，表示氫原子、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基，W3表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基；式(a)～(e)、(g)、(j)、(l)以及(q)中的苯環(huán)A可以被碳原子數(shù)1～6的烷基或碳原子數(shù)1～6的烷氧基取代；)表示的基團(tuán)中的一價(jià)或二價(jià)基團(tuán)；B為式-(CHR2)n-(式中，n表示0或1～10的整數(shù)，R2分別獨(dú)立地表示氫原子或甲基)表示的基團(tuán)、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數(shù))表示的基團(tuán)、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數(shù))表示的基團(tuán)、或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數(shù))表示的基團(tuán)；K表示具有可以被鹵代的碳原子數(shù)1～6的烷基、碳原子數(shù)1～6的烷氧基、硝基、鹵原子、羧基、芐氧基、碳原子數(shù)1～6的烷氧基羰基、氨基、碳原子數(shù)1～6的單烷基氨基、碳原子數(shù)1～6的二烷基氨基、氨基甲?；?、碳原子數(shù)1～6酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、碳原子數(shù)1～6的烷基氨基羰基、碳原子數(shù)1～6的烷基羰基氧基、羥基、甲?；蛲檠趸?碳原子數(shù)1～6)烷基(碳原子數(shù)1～6)作為取代基的苯基烷基； 表示單鍵或雙鍵，(iii)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽， (iv)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽， (v)以下通式(I-1)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽， [式中，J1-1表示碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基(以下簡(jiǎn)稱為低級(jí)烷基)；環(huán)己基；可以具有低級(jí)烷基、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基(以下簡(jiǎn)稱為低級(jí)烷氧基)、硝基、鹵原子、羧基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基、單低級(jí)烷基氨基、二低級(jí)烷基氨基、氨基甲?；?、由碳原子數(shù)1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、低級(jí)烷基氨基羰基、低級(jí)烷基羰基氧基、鹵代低級(jí)烷基、羥基、甲?；虻图?jí)烷氧基低級(jí)烷基作為取代基的苯基、吡啶基或吡嗪基；式 (式中，G表示式 表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)、式-O-表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)、式-CH2-O-表示的基團(tuán)、式-CH2-SO2-表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)或式 表示的基團(tuán)；E表示碳原子或氮原子；)表示的基團(tuán)；喹啉基；喹喔啉基；呋喃基或式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氫原子或低級(jí)烷氧基羰基)表示的基團(tuán)；B表示式-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-NR2-(CH2)n-(式中R2表示氫原子、低級(jí)烷基、苯基或低級(jí)烷基磺?；?表示的基團(tuán)、式-CONR3-(CH2)n-(式中，R3表示氫原子、低級(jí)烷基、可以具有低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、鹵素或羥基作為取代基的苯基、芐基或吡啶基)表示的基團(tuán)、式-NH-CO-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-CH2-CO-NH-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-CO-CH2-CH(OH)-CH2-表示的基團(tuán)、式-CO-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-C(OH)-(CH2)n-表示的基團(tuán)或式-CO-CH＝CH-CH2-表示的基團(tuán)(以上式中，n表示0或1～10的整數(shù))；T1表示碳原子；K表示苯基可以具有低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基、鹵素、羧基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基、單低級(jí)烷基氨基、二低級(jí)烷基氨基、氨基甲?；⒂商荚訑?shù)1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、低級(jí)烷基氨基羰基、低級(jí)烷基羰基氧基、鹵代低級(jí)烷基、羥基、也可具有甲?；虻图?jí)烷氧基低級(jí)烷基作為取代基的苯基烷基(烷基的碳原子數(shù)1～2)；肉桂基；低級(jí)烷基；吡啶基甲基；環(huán)烷基(環(huán)烷基的碳原子數(shù)3～6)烷基；金剛烷甲基、糠基；碳原子數(shù)3～6的環(huán)烷基或?；?，q表示1或2，(vi)以下通式(I-2)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽， [式中，J1-2表示可具有碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基作為取代基的茚滿酮基；T2表示氮原子；B、K以及q含義如上所述；](vii)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽；
2.權(quán)利要求1所述的保護(hù)劑，其中鹽為鹽酸鹽。
3.含有以下(i)～(vii)表示的任一化合物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防劑和/或治療劑，(i)下述化學(xué)式表示的1-芐基-4-[(5，6-二甲氧基-1-茚滿酮基)-2-基]甲基哌啶或其可藥用鹽， (ii)以下通式(I)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽， [式中，J表示選自下式 茚滿酮基 茚基 茚滿二酮基 亞茚滿酮基 (式中，S表示碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基、鹵原子或羥基；t表示0或1～4的整數(shù)；并且，(S)t也可以在結(jié)合的苯環(huán)的相鄰碳原子間形成亞甲二氧基或亞乙二氧基；式(1)中的Y表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基，式(k)中V表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基，式(n)中W1及W2相互獨(dú)立，相同或不同，表示氫原子、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基，W3表示氫原子或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基，式(a)～(e)、(g)、(j)、(l)以及(q)中的苯環(huán)A可以被碳原子數(shù)1～6的烷基或碳原子數(shù)1～6的烷氧基取代；)表示的基團(tuán)中的一價(jià)或二價(jià)基團(tuán)；B為式-(CHR2)n-(式中，n表示0或1～10的整數(shù)，R2分別獨(dú)立地表示氫原子或甲基)表示的基團(tuán)、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數(shù))表示的基團(tuán)、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數(shù))表示的基團(tuán)、或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數(shù))表示的基團(tuán)；K表示可以具有可以被鹵代的碳原子數(shù)1～6的烷基、碳原子數(shù)1～6的烷氧基、硝基、鹵原子、羧基、芐氧基、碳原子數(shù)1～6的烷氧基羰基、氨基、碳原子數(shù)1～6的單烷基氨基、碳原子數(shù)1～6的二烷基氨基、氨基甲?；?、碳原子數(shù)1～6酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、碳原子數(shù)1～6的烷基氨基羰基、碳原子數(shù)1～6的烷基羰基氧基、羥基、甲酰基或烷氧基(碳原子數(shù)1～6)烷基(碳原子數(shù)1～6)作為取代基的苯基烷基； 表示單鍵或雙鍵，(iii)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽， (iv)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽， (v)以下通式(I-1)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽， [式中，J1-1表示碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基(以下簡(jiǎn)稱為低級(jí)烷基)；環(huán)己基；可以具有低級(jí)烷基、碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基(以下簡(jiǎn)稱為低級(jí)烷氧基)、硝基、鹵素、羧基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基、單低級(jí)烷基氨基、二低級(jí)烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子數(shù)1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、低級(jí)烷基氨基羰基、低級(jí)烷基羰基氧基、鹵代低級(jí)烷基、羥基、甲?；虻图?jí)烷氧基低級(jí)烷基作為取代基的苯基、吡啶基或吡嗪基；式 (式中，G表示式 表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)、式-O-表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)、式-CH2-O-表示的基團(tuán)、式-CH2-SO2-表示的基團(tuán)、式 表示的基團(tuán)或式 表示的基團(tuán)；E表示碳原子或氮原子；)表示的基團(tuán)；喹啉基；喹喔啉基；呋喃基或式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氫原子或低級(jí)烷氧基羰基)表示的基團(tuán)；B表示式-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-NR2-(CH2)n-(式中R2表示氫原子、低級(jí)烷基、苯基或低級(jí)烷基磺?；?表示的基團(tuán)、式-CONR3-(CH2)n-(式中，R3表示氫原子、低級(jí)烷基、也可以具有低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、鹵素或羥基作為取代基的苯基、芐基或吡啶基)表示的基團(tuán)、式-NH-CO-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-CH2-CO-NH-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-CO-CH2-CH(OH)-CH2-表示的基團(tuán)、式-CO-(CH2)n-表示的基團(tuán)、式-C(OH)-(CH2)n-表示的基團(tuán)或式-CO-CH＝CH-CH2-表示的基團(tuán)(以上式中，n表示0或1～10的整數(shù))；T1表示碳原子；K表示苯基可以具有低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基、鹵素、羧基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基、單低級(jí)烷基氨基、二低級(jí)烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子數(shù)1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環(huán)己基氧基羰基、低級(jí)烷基氨基羰基、低級(jí)烷基羰基氧基、鹵代低級(jí)烷基、羥基、甲?；虻图?jí)烷氧基低級(jí)烷基作為取代基的苯基烷基(烷基的碳原子數(shù)1～2)；肉桂基；低級(jí)烷基；吡啶基甲基；環(huán)烷基(環(huán)烷基的碳原子數(shù)3～6)烷基；金剛烷甲基、糠基；碳原子數(shù)3～6的環(huán)烷基或酰基，q表示1或2，(vi)以下通式(I-2)表示的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽， [式中，J1-2表示可以具有碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷基或碳原子數(shù)1～6的低級(jí)烷氧基作為取代基的茚滿酮基；T2表示氮原子；B、K以及q含義如上所述；](vii)選自下式表示的化合物組的環(huán)狀胺衍生物或其可藥用鹽；
4.權(quán)利要求3所述的預(yù)防劑和/或治療劑，其中，鹽為鹽酸鹽。
5.權(quán)利要求3或4所述的預(yù)防劑和/或治療劑，其中，神經(jīng)細(xì)胞障礙是由腦缺血、興奮性毒性或Aβ毒性誘發(fā)的。
6.權(quán)利要求3或4所述的預(yù)防劑和/或治療劑，其中，神經(jīng)細(xì)胞障礙是由伴隨腦中風(fēng)、腦梗塞或腦栓塞中任意一種的腦缺血、興奮性毒性誘發(fā)的。
7.權(quán)利要求6所述的預(yù)防劑和/或治療劑，其中，興奮性毒性是由NMDA或紅藻氨酸引起的。
8.權(quán)利要求3或4所述的預(yù)防劑和/或治療劑，其中，神經(jīng)細(xì)胞障礙是由伴隨阿耳茨海默病或唐氏病的Aβ毒性誘發(fā)的。
9.權(quán)利要求1～8任意一項(xiàng)所述的預(yù)防劑和/或治療劑，其中，細(xì)胞來(lái)源于腦的成熟神經(jīng)細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9所述的預(yù)防劑和/或治療劑，其中，神經(jīng)細(xì)胞來(lái)源于選自大腦皮質(zhì)、中隔區(qū)域以及海馬的任意一種。
11.權(quán)利要求9或10所述的預(yù)防劑和/或治療劑，其中，神經(jīng)細(xì)胞是原代培養(yǎng)細(xì)胞。
12.腦中風(fēng)、腦梗塞或腦栓塞中任一疾病的預(yù)后改善劑，其包含權(quán)利要求1或2所述的保護(hù)劑或權(quán)利要求3或4所述的預(yù)防劑和/或治療劑。
13.一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方法，其特征在于，給患者施用有效劑量的權(quán)利要求1或2所述的保護(hù)劑。
14.一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防方法和/或治療方法，其特征在于，給患者施用有效劑量的權(quán)利要求3或4所述的預(yù)防劑和/或治療劑。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中，神經(jīng)細(xì)胞障礙是由腦缺血、興奮性毒性或Aβ毒性誘發(fā)的。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中，興奮性毒性是由NMDA或紅藻氨酸引起的。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中，神經(jīng)細(xì)胞障礙是由伴隨腦中風(fēng)、腦梗塞或腦栓塞中任意一種的腦缺血或興奮性毒性誘發(fā)的。
18.權(quán)利要求14所述的方法，其中，神經(jīng)細(xì)胞障礙是由伴隨阿耳茨海默病或唐氏病的Aβ毒性誘發(fā)的。
19.腦中風(fēng)、腦梗塞或腦栓塞中任一疾病的預(yù)后改善方法，其特征在于，給患者施用有效劑量的權(quán)利要求12所述的預(yù)后改善劑。
20.權(quán)利要求1或2中所示化合物的用途，其用于制備選自權(quán)利要求1或2所述的保護(hù)劑、權(quán)利要求3～8中任意一項(xiàng)所述的預(yù)防劑和/或治療劑、以及權(quán)利要求12所述的預(yù)后改善劑中的任意一種藥物。
21.具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選方法，其特征在于，在Aβ存在下使候選化合物作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)細(xì)胞，并檢測(cè)或測(cè)定Aβ凝聚量。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，使用Aβ凝聚量的檢測(cè)或測(cè)定結(jié)果，通過(guò)與不存在候選化合物的情況下的Aβ凝聚量相比較，判定候選化合物是否具有Aβ凝聚抑制作用。
23.具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒，其用于權(quán)利要求21或22所述的方法中。
24.一種在由Aβ毒性誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防和/或治療中有效的化合物或其可藥用鹽的篩選方法，其特征在于，在Aβ存在下使候選化合物作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，使用細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡的檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)與不存在候選化合物的情況下的細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡程度相比較，判定候選化合物是否具有對(duì)Aβ毒性的細(xì)胞保護(hù)作用。
26.權(quán)利要求24或25所述的方法，其中，細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡的檢測(cè)是通過(guò)測(cè)定乳酸脫氫酶的濃度或MTT測(cè)定實(shí)現(xiàn)的。
27.在由Aβ毒性誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防和/或治療中有效的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒，其用于權(quán)利要求24或25所述的方法中。
全文摘要
本發(fā)明涉及中樞神經(jīng)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞障礙的預(yù)防劑和/或治療劑，其含有以鹽酸多奈哌齊為代表的化合物。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1802155SQ200480016009
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2004年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
發(fā)明者赤祖父盛, 木村真奈美 申請(qǐng)人:衛(wèi)材株式會(huì)社