專利名稱：使用微球體檢測(cè)和多重定量樣品中分析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用功能化微球體檢測(cè)和/或多重定量樣品中分析物的方法，在樣品和這些微球體接觸的步驟后，將這些微球體磁化。本發(fā)明的方法尤其適于通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)檢測(cè)和多重定量數(shù)種分析物。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)和/或定量數(shù)種分析物的試劑盒，以便實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法，該試劑盒包括功能化非磁性微球體的懸浮液，鐵磁流體的溶液和至少一種綴合物的溶液。
背景技術(shù)：
體外診斷的發(fā)展和多樣化日益需要建立快速檢測(cè)和鑒定各種化合物和微生物的方法。這同時(shí)需要涉及人或動(dòng)物健康部門，例如來(lái)找尋或測(cè)試特定抗原或病原體，農(nóng)業(yè)食品部門，例如質(zhì)量控制和篩選打算作為食品的產(chǎn)品中可能的污染物，或環(huán)境部門，當(dāng)包括時(shí)，例如，預(yù)防任何生物風(fēng)險(xiǎn)或檢測(cè)雜質(zhì)、殺蟲(chóng)劑或各種污染物質(zhì)。
微珠上的免疫測(cè)定結(jié)合流式細(xì)胞儀型分析系統(tǒng)的使用構(gòu)成最適于這些需要的技術(shù)途徑之一，且在本領(lǐng)域的評(píng)述中已經(jīng)提出了許多基于該原理的方法。
例如，公開(kāi)號(hào)為WO 98/51435，WO 94/09368和WO 90/15666的國(guó)際專利申請(qǐng)，和公開(kāi)號(hào)為EP 180384的歐洲專利申請(qǐng)，描述了可以用于診斷方法中的特定類型的磁性或熒光顆粒。
現(xiàn)有技術(shù)的其它文件提出了用于鑒定和/或測(cè)定磁珠上的多重分析物的各種實(shí)驗(yàn)方案。因此，例如，公開(kāi)號(hào)為WO 90/05305的國(guó)際申請(qǐng)，涉及通過(guò)使用數(shù)個(gè)亞群熒光珠的凝集方法來(lái)檢測(cè)和/或測(cè)定樣品中數(shù)種分析物的方法及其相應(yīng)的試劑盒。通過(guò)流式細(xì)胞儀、成像分析或激光掃描系統(tǒng)可以測(cè)量所形成凝集物的熒光。
授權(quán)號(hào)為US 4,665,020的美國(guó)專利涉及通過(guò)流式細(xì)胞儀使用兩群不同直徑的球體來(lái)測(cè)定抗原的方法，最大的涂覆抗原特異性抗體，最小的是熒光的。根據(jù)三明治方法的原理或根據(jù)連接熒光球體的配體(抗體或抗原)的競(jìng)爭(zhēng)方法進(jìn)行測(cè)定。
公開(kāi)號(hào)為WO 97/14028的國(guó)際申請(qǐng)涉及通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)種所關(guān)心分析物的分析方法，其中該使用包括多個(gè)亞群的珠子，其中至少一個(gè)分類參數(shù)可以通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)分析，從而使一個(gè)亞群與另一個(gè)亞群區(qū)分開(kāi)來(lái)。每個(gè)亞群連接與一種待測(cè)定分析物特異性反應(yīng)的化合物。通過(guò)細(xì)胞計(jì)量術(shù)，通過(guò)分析每個(gè)亞群的所有分類參數(shù)，來(lái)鑒定珠子的亞群，并因此鑒定與相應(yīng)分析物反應(yīng)的化合物的性質(zhì)。
公開(kāi)號(hào)為WO 98/20351的國(guó)際申請(qǐng)涉及測(cè)定樣品中一種或多種分析物存在的方法，其中使用包括“測(cè)試”群微粒，每個(gè)群攜帶分析物特異性配體，且參照微粒不與任何待研究的分析物反應(yīng)。通過(guò)計(jì)數(shù)每個(gè)“測(cè)試”群中的游離微粒的數(shù)量并將其與參照微粒的數(shù)量相比較來(lái)進(jìn)行該測(cè)定。根據(jù)各種方法來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)，優(yōu)選包括細(xì)胞計(jì)量術(shù)。
公開(kāi)號(hào)為WO 96/31777的國(guó)際申請(qǐng)涉及檢測(cè)樣品中微生物的方法，使用至少一種攜帶待研究微生物特異性配體的可檢測(cè)顆粒。然后使用攜帶熒光標(biāo)記的第二種配體來(lái)顯示連接顆粒的微生物。
授權(quán)號(hào)為US 6,280,618的美國(guó)專利涉及單個(gè)檢測(cè)多個(gè)分析物的方法，其中使用包括磁微粒群的混合，該磁性顆?？梢韵嗷^(qū)分開(kāi)來(lái)，且每種攜帶不同的配體。從介質(zhì)中分離每組微粒，然后懸浮于第二種液體介質(zhì)中，其中通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)分析。
公開(kāi)號(hào)為WO 93/02260的國(guó)際申請(qǐng)涉及流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)同時(shí)檢測(cè)相同樣品中數(shù)種分析物的方法，以及實(shí)施該方法的試劑。該試劑由數(shù)個(gè)亞群的微球體構(gòu)成，每個(gè)亞群表面攜帶能夠于待檢測(cè)的一種分析物形成特異性結(jié)合對(duì)的特異性抗體。在加入攜帶熒光染料的能夠結(jié)合所形成的結(jié)合對(duì)試劑后，進(jìn)行連接微球體的分析物的檢測(cè)。
同時(shí)檢測(cè)相同樣品中數(shù)種分析物的方法還包括一個(gè)或多個(gè)磁分離步驟。
實(shí)際上，這樣的磁分離步驟可能有助于特定復(fù)雜培養(yǎng)基中的測(cè)定，其中所關(guān)心的抗原必需特異性分離(可以使用細(xì)胞計(jì)量分析來(lái)檢驗(yàn)在特定微粒存在下不可能進(jìn)行的)。例如，這是用于分析農(nóng)業(yè)食品、造紙和廢水處理中的情況，其中研究各種液化的磨碎材料中的分子/顆粒(果肉、葡萄汁、乳制品乃至干酪、果汁、磨碎的蔬菜原料、發(fā)酵酒等)，由于失去待測(cè)定分析物的風(fēng)險(xiǎn)，其制備物不能過(guò)濾。
這還可以是用于分析環(huán)境和人健康科學(xué)的情況，其中通過(guò)生物取樣器將大體積空氣的顆粒內(nèi)容物濃縮于液體中。在這種情況下，還必須除去空氣懸浮液中的所有顆粒、灰塵、微纖維、花粉等，其的大小i)覆蓋捕獲珠子(1至30μm)且使其僅通過(guò)光散射參數(shù)難以或甚至不可能鑒定，ii)或通過(guò)阻塞細(xì)胞計(jì)量?jī)x使得分析矛盾(從100μm開(kāi)始為高風(fēng)險(xiǎn))，并在生物收集后發(fā)現(xiàn)其在液體中濃縮。
此外，還必需除去與細(xì)胞計(jì)量?jī)x流控的校正功能不相容的油質(zhì)(油性)顆粒。
此外，使用磁分離還使得可以快速濃縮待測(cè)定的試劑并避免了必須使用離心步驟來(lái)洗滌捕獲珠子。
磁珠特異性捕獲步驟和磁分離步驟這樣的結(jié)合已經(jīng)描述于現(xiàn)有技術(shù)中，尤其是授權(quán)號(hào)為US 6,280,618的專利中。
然而，在鑒定和分析樣品中含有的分析物的方法中使用磁性微球體存在各種工業(yè)局限，并妨礙了操作和懸浮液取樣的均一性。這是因?yàn)椴煌笮?且通常具有不同含量的可磁化材料)的磁性微球體在磁分離過(guò)程中可以具有不同的行為，即，較長(zhǎng)或較短的磁化時(shí)間。根據(jù)存在的磁珠族從其產(chǎn)生了可變的分離產(chǎn)量，因此產(chǎn)生了結(jié)果的不均一性或延長(zhǎng)磁性分離階段。為了克服這個(gè)問(wèn)題，需要根據(jù)大小調(diào)節(jié)磁性微球體的可磁化材料含量。就制造或供應(yīng)而言，這當(dāng)然產(chǎn)生了工業(yè)極限。
此外，磁性微球體是致密的，其在儲(chǔ)存中存在沉淀和在重懸浮和快速沉淀分析過(guò)程中具有沉淀的實(shí)際問(wèn)題。實(shí)際上，磁珠的密度通常大于1.15，且根據(jù)磁鐵的量，在1.15至1.50之間變化，導(dǎo)致非?？斓某恋砺?，尤其是對(duì)于較大直徑的顆粒(＞2μm)(比較公開(kāi)號(hào)為EP1248110的歐洲專利申請(qǐng))。
因此，目前需要發(fā)展新的特異性方法來(lái)鑒定和測(cè)定液體樣品中所含有的數(shù)種分析物，且該方法包括一個(gè)或多個(gè)磁分離步驟，所述方法能夠避免與使用磁性微球體相關(guān)的缺陷。
美國(guó)專利US 5,998,224(1999年12月7日公開(kāi)，申請(qǐng)者AbbottLaboratories)的主題是檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或含量的方法。
根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案，該方法包括使測(cè)試樣品與移動(dòng)固相和磁性試劑接觸，以致形成反應(yīng)混合物，其中所述分析物結(jié)合所述移動(dòng)固相和所述磁性試劑，使得形成復(fù)合物，然后運(yùn)用磁場(chǎng)。
根據(jù)第二個(gè)實(shí)施方案，該方法包括使分析物和磁性試劑接觸來(lái)形成第一種復(fù)合物，并使磁性試劑接觸移動(dòng)固相來(lái)形成第二種復(fù)合物，然后運(yùn)用磁場(chǎng)。
根據(jù)該第二個(gè)實(shí)施方案的可替換實(shí)施方案，分析物結(jié)合移動(dòng)相來(lái)形成第一種復(fù)合物，磁性試劑結(jié)合移動(dòng)相來(lái)形成第二種復(fù)合物，然后運(yùn)用磁場(chǎng)。
2001年12月27日公開(kāi)的公開(kāi)號(hào)為US 2001/0054580的美國(guó)專利申請(qǐng)(Bio-Rad Laboratories，Inc，與EP 1248110相關(guān))的主題是區(qū)分樣品中數(shù)種分析物的多重測(cè)試。該測(cè)試使用磁性顆粒作為固相并使每個(gè)分析物產(chǎn)生單獨(dú)的結(jié)果。通過(guò)可以以組區(qū)分的特征將磁性顆粒相互區(qū)分開(kāi)來(lái)，每組攜帶與顆粒表面結(jié)合的試劑，該試劑不同于存在于其它組顆粒上的試劑。
該多重測(cè)試中，使含有所述分析物的樣品接觸磁性顆粒。
1987年8月5日公開(kāi)的公開(kāi)號(hào)為EP 230768的歐洲專利申請(qǐng)(Syntex Inc)的主題是從液體介質(zhì)中分離物質(zhì)的方法。該方法使用磁性或非磁性顆粒。
可以將該非磁性顆粒功能化來(lái)結(jié)合特異性結(jié)合對(duì)的成分，或結(jié)合磁性顆粒。
被描述鐵磁流體為磁性流體，其中懸浮液中的顆粒是鐵磁顆粒。磁性流體的膠體磁性顆粒可以涂覆蛋白質(zhì)原料如鐵蛋白白蛋白、γ球蛋白等?？梢酝ㄟ^(guò)物理結(jié)合例如吸收或化學(xué)結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)磁性顆粒的蛋白質(zhì)涂覆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及使用功能化微球體檢測(cè)和/或多重定量樣品中分析物的方法，在樣品和這些微球體接觸的步驟后，將這些微球體磁化。本發(fā)明的方法尤其適于通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)檢測(cè)和多重定量數(shù)種分析物。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)和/或定量數(shù)種分析物的試劑盒，以便實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法，該試劑盒包括功能化非磁性微球體的懸浮液，鐵磁流體的溶液和至少一種綴合物的溶液。
體外診斷的發(fā)展和多樣化日益需要建立快速檢測(cè)和鑒定各種化合物和微生物的方法。這同時(shí)需要涉及人或動(dòng)物健康部門，例如來(lái)找尋或測(cè)試特定抗原或病原體，農(nóng)業(yè)食品部門，例如質(zhì)量控制和篩選打算作為食品的產(chǎn)品中可能的污染物，或環(huán)境部門，當(dāng)包括時(shí)，例如，預(yù)防任何生物風(fēng)險(xiǎn)或檢測(cè)雜質(zhì)、殺蟲(chóng)劑或各種污染物質(zhì)。
微珠上的免疫測(cè)定結(jié)合流式細(xì)胞儀型分析系統(tǒng)的使用構(gòu)成最適于這些需要的技術(shù)途徑之一，且在本領(lǐng)域的評(píng)述中已經(jīng)提出了許多基于該原理的方法。
例如，公開(kāi)號(hào)為WO 98/51435，WO 94/09368和WO 90/15666的國(guó)際專利申請(qǐng)，和公開(kāi)號(hào)為EP 180384的歐洲專利申請(qǐng)，描述了可以用于診斷方法中的特定類型的磁性或熒光顆粒。
現(xiàn)有技術(shù)的其它文件提出了用于鑒定和/或測(cè)定磁珠上的多重分析物的各種實(shí)驗(yàn)方案。因此，例如，公開(kāi)號(hào)為WO 90/05305的國(guó)際申請(qǐng)，涉及通過(guò)使用數(shù)個(gè)亞群熒光珠的凝集方法來(lái)檢測(cè)和/或測(cè)定樣品中數(shù)種分析物的方法及其相應(yīng)的試劑盒。通過(guò)流式細(xì)胞儀、成像分析或激光掃描系統(tǒng)可以測(cè)量所形成凝集物的熒光。
授權(quán)號(hào)為US 4,665,020的美國(guó)專利涉及通過(guò)流式細(xì)胞儀使用兩群不同直徑的球體來(lái)測(cè)定抗原的方法，最大的涂覆抗原特異性抗體，最小的是熒光的。根據(jù)三明治方法的原理或根據(jù)連接熒光球體的配體(抗體或抗原)的競(jìng)爭(zhēng)方法進(jìn)行測(cè)定。
公開(kāi)號(hào)為WO 97/14028的國(guó)際申請(qǐng)涉及通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)種所關(guān)心分析物的分析方法，其中該使用包括多個(gè)亞群的珠子，其中至少一個(gè)分類參數(shù)可以通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)分析，從而使一個(gè)亞群與另一個(gè)亞群區(qū)分開(kāi)來(lái)。每個(gè)亞群連接與一種待測(cè)定分析物特異性反應(yīng)的化合物。通過(guò)細(xì)胞計(jì)量術(shù)，通過(guò)分析每個(gè)亞群的所有分類參數(shù)，來(lái)鑒定珠子的亞群，并因此鑒定與相應(yīng)分析物反應(yīng)的化合物的性質(zhì)。
公開(kāi)號(hào)為WO 98/20351的國(guó)際申請(qǐng)涉及測(cè)定樣品中一種或多種分析物存在的方法，其中使用包括“測(cè)試”群微粒，每個(gè)群攜帶分析物特異性配體，且參照微粒不與任何待研究的分析物反應(yīng)。通過(guò)計(jì)數(shù)每個(gè)“測(cè)試”群中的游離微粒的數(shù)量并將其與參照微粒的數(shù)量相比較來(lái)進(jìn)行該測(cè)定。根據(jù)各種方法來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)，優(yōu)選包括細(xì)胞計(jì)量術(shù)。
公開(kāi)號(hào)為WO 96/31777的國(guó)際申請(qǐng)涉及檢測(cè)樣品中微生物的方法，使用至少一種攜帶待研究微生物特異性配體的可檢測(cè)顆粒。然后使用攜帶熒光標(biāo)記的第二種配體來(lái)顯示連接顆粒的微生物。
授權(quán)號(hào)為US 6,280,618的美國(guó)專利涉及單個(gè)檢測(cè)多個(gè)分析物的方法，其中使用包括磁微粒群的混合，該磁性顆?？梢韵嗷^(qū)分開(kāi)來(lái)，且每種攜帶不同的配體。從介質(zhì)中分離每組微粒，然后懸浮于第二種液體介質(zhì)中，其中通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)分析。
公開(kāi)號(hào)為WO 93/02260的國(guó)際申請(qǐng)涉及流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)同時(shí)檢測(cè)相同樣品中數(shù)種分析物的方法，以及實(shí)施該方法的試劑。該試劑由數(shù)個(gè)亞群的微球體構(gòu)成，每個(gè)亞群表面攜帶能夠于待檢測(cè)的一種分析物形成特異性結(jié)合對(duì)的特異性抗體。在加入攜帶熒光染料的能夠結(jié)合所形成的結(jié)合對(duì)試劑后，進(jìn)行連接微球體的分析物的檢測(cè)。
同時(shí)檢測(cè)相同樣品中數(shù)種分析物的方法還包括一個(gè)或多個(gè)磁分離步驟。
實(shí)際上，這樣的磁分離步驟可能有助于特定復(fù)雜培養(yǎng)基中的測(cè)定，其中所關(guān)心的抗原必需特異性分離(可以使用細(xì)胞計(jì)量分析來(lái)檢驗(yàn)在特定微粒存在下不可能進(jìn)行的)。例如，這是用于分析農(nóng)業(yè)食品、造紙和廢水處理中的情況，其中研究各種液化的磨碎材料中的分子/顆粒(果肉、葡萄汁、乳制品乃至干酪、果汁、磨碎的蔬菜原料、發(fā)酵酒等)，由于失去待測(cè)定分析物的風(fēng)險(xiǎn)，其制備物不能過(guò)濾。
這還可以是用于分析環(huán)境和人健康科學(xué)的情況，其中通過(guò)生物取樣器將大體積空氣的顆粒內(nèi)容物濃縮于液體中。在這種情況下，還必須除去空氣懸浮液中的所有顆粒、灰塵、微纖維、花粉等，其的大小i)覆蓋捕獲珠子(1至30μm)且使其僅通過(guò)光散射參數(shù)難以或甚至不可能鑒定，ii)或通過(guò)阻塞細(xì)胞計(jì)量?jī)x使得分析矛盾(從100μm開(kāi)始為高風(fēng)險(xiǎn))，并在生物收集后發(fā)現(xiàn)其在液體中濃縮。
此外，還必需除去與細(xì)胞計(jì)量?jī)x流控的校正功能不相容的油質(zhì)(油性)顆粒。
此外，使用磁分離還使得可以快速濃縮待測(cè)定的試劑并避免了必須使用離心步驟來(lái)洗滌捕獲珠子。
磁珠特異性捕獲步驟和磁分離步驟這樣的結(jié)合已經(jīng)描述于現(xiàn)有技術(shù)中，尤其是授權(quán)號(hào)為US 6,280,618的專利中。
然而，在鑒定和分析樣品中含有的分析物的方法中使用磁性微球體存在各種工業(yè)局限，并妨礙了操作和懸浮液取樣的均一性。這是因?yàn)椴煌笮?且通常具有不同含量的可磁化材料)的磁性微球體在磁分離過(guò)程中可以具有不同的行為，即，較長(zhǎng)或較短的磁化時(shí)間。根據(jù)存在的磁珠族從其產(chǎn)生了可變的分離產(chǎn)量，因此產(chǎn)生了結(jié)果的不均一性或延長(zhǎng)磁性分離階段。為了克服這個(gè)問(wèn)題，需要根據(jù)大小調(diào)節(jié)磁性微球體的可磁化材料含量。就制造或供應(yīng)而言，這當(dāng)然產(chǎn)生了工業(yè)極限。
此外，磁性微球體是致密的，其在儲(chǔ)存中存在沉淀和在重懸浮和快速沉淀分析過(guò)程中具有沉淀的實(shí)際問(wèn)題。實(shí)際上，磁珠的密度通常大于1.15，且根據(jù)磁鐵的量，在1.15至1.50之間變化，導(dǎo)致非常快的沉淀率，尤其是對(duì)于較大直徑的顆粒(＞2μm)(比較公開(kāi)號(hào)為EP1248110的歐洲專利申請(qǐng))。
因此，目前需要發(fā)展新的特異性方法來(lái)鑒定和測(cè)定液體樣品中所含有的數(shù)種分析物，且該方法包括一個(gè)或多個(gè)磁分離步驟，所述方法能夠避免與使用磁性微球體相關(guān)的缺陷。
美國(guó)專利US 5,998,224(1999年12月7日公開(kāi)，申請(qǐng)者AbbottLaboratories)的主題是檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或含量的方法。
根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案，該方法包括使測(cè)試樣品與移動(dòng)固相和磁性試劑接觸，以致形成反應(yīng)混合物，其中所述分析物結(jié)合所述移動(dòng)固相和所述磁性試劑，使得形成復(fù)合物，然后運(yùn)用磁場(chǎng)。
根據(jù)第二個(gè)實(shí)施方案，該方法包括使分析物和磁性試劑接觸來(lái)形成第一種復(fù)合物，并使磁性試劑接觸移動(dòng)固相來(lái)形成第二種復(fù)合物，然后運(yùn)用磁場(chǎng)。
根據(jù)該第二個(gè)實(shí)施方案的可替換實(shí)施方案，分析物結(jié)合移動(dòng)相來(lái)形成第一種復(fù)合物，磁性試劑結(jié)合移動(dòng)相來(lái)形成第二種復(fù)合物，然后運(yùn)用磁場(chǎng)。
2001年12月27日公開(kāi)的公開(kāi)號(hào)為US 2001/0054580的美國(guó)專利申請(qǐng)(Bio-Rad Laboratories，Inc，與EP 1248110相關(guān))的主題是區(qū)分樣品中數(shù)種分析物的多重測(cè)試。該測(cè)試使用磁性顆粒作為固相并使每個(gè)分析物產(chǎn)生單獨(dú)的結(jié)果。通過(guò)可以以組區(qū)分的特征將磁性顆粒相互區(qū)分開(kāi)來(lái)，每組攜帶與顆粒表面結(jié)合的試劑，該試劑不同于存在于其它組顆粒上的試劑。
該多重測(cè)試中，使含有所述分析物的樣品接觸磁性顆粒。
1987年8月5日公開(kāi)的公開(kāi)號(hào)為EP 230768的歐洲專利申請(qǐng)(Syntex Inc)的主題是從液體介質(zhì)中分離物質(zhì)的方法。該方法使用磁性或非磁性顆粒。
可以將該非磁性顆粒功能化來(lái)結(jié)合特異性結(jié)合對(duì)的成分，或結(jié)合磁性顆粒。
被描述鐵磁流體為磁性流體，其中懸浮液中的顆粒是鐵磁顆粒。磁性流體的膠體磁性顆?？梢酝扛驳鞍踪|(zhì)原料如鐵蛋白白蛋白、γ球蛋白等?？梢酝ㄟ^(guò)物理結(jié)合例如吸收或化學(xué)結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)磁性顆粒的蛋白質(zhì)涂覆。


圖1根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)和/或定量(多重測(cè)定)方法的原理圖，使用不同大小的珠子來(lái)檢測(cè)和/或定量三種抗原。
圖2根據(jù)本發(fā)明方法的原理圖，使用不同大小的珠子來(lái)多重測(cè)定三種熒光PCR產(chǎn)物。
圖3根據(jù)本發(fā)明方法的多重測(cè)定的原理圖，運(yùn)用至分子遺傳學(xué)來(lái)探尋SNP。
圖4上述相同原理的示意圖，其中就觀察探針的移接獲得了另外程度的特異性。
圖5A、5B、5C根據(jù)大小為3、8、10和15μm珠子混合物的FCM分析。
R1Estapor 3μm+Polymer Laboratories 8和15μm+Dynal Particles10μm；R2和R6Estapor 3μm；R3和R7Polymer Laboratories 8μm；R4和R8Dynal Particles 10μm；R5和R9Polymer Laboratories 15μm。
圖6A、6B、6C和6D根據(jù)大小為3、4.4、8、10和15μm以及熒光的珠子混合物的FCM分析。
R1Estapor 3μm+Bangs QuantumPlex 4.4μm+PolymerLaboratories 8和15μm+Dynal Particles 10μm；R2和R6Estapor 3μm+Bangs QuantumPlex 4.4μm；R3和R7Polymer Laboratories 8μm；R4和R8Dynal Particles 10μm；R5和R9Polymer Laboratories15μm；R10Estapor 3μm；R11Bangs QuantumPlex#3；R12BangsQuantumplex#5(R10、R11和R12包含于R2中)。
圖7A和7B初始非磁性的4.4、8、10和15μm珠子混合物的FCM分析。
圖8通過(guò)FS LOG，在與FF-SAs結(jié)合過(guò)程中各種珠子-生物素群分布的改變。
圖9抗B.globigii 15μm微球體上B.globigii的測(cè)定。
圖10A和10B抗卵清蛋白4.4μm QuantumPlex#3微球體上卵清蛋白的測(cè)定。
圖11二元混合物的FCM分析通過(guò)雙重離散分析通過(guò)大小來(lái)區(qū)分兩種珠子，μS-FV(直徑6.7μm)，位于區(qū)域R1中和μS-FII(直徑9.6μm)，位于區(qū)域R2中。在以下所有的圖中重復(fù)該基于大小的選擇性分析。
圖12和13雙重正檢驗(yàn)二元混合物的FCM分析使珠子同時(shí)接觸表示2個(gè)基因的兩種O.N.。圖12顯示了熒光含量隨大小的函數(shù)，μS-FV(R4區(qū)域)和μS-FII(R3區(qū)域)。圖13顯示了，重疊，每種珠子各自的綠色熒光直方圖，實(shí)線曲線為μS-FV珠子，虛線曲線為μS-FII珠子。在各自窗口M1和M2測(cè)量平均綠色熒光強(qiáng)度(MFI)。
圖14和15二元混合物的FCM分析；負(fù)對(duì)照使同時(shí)接觸兩種O.N.的珠子通過(guò)熱去雜交，顯示非特異性背景噪音標(biāo)記。圖14顯示了熒光含量隨大小的函數(shù)，μS-FV(R4區(qū)域)和μS-FII(R3區(qū)域)。圖15顯示了，重疊，每種珠子各自的綠色熒光直方圖，實(shí)線曲線為μS-FV珠子，虛線曲線為μS-FII珠子。在各自窗口M1和M2測(cè)量MFI。
圖16和17FV單個(gè)正檢驗(yàn)的二元混合物的FCM分析使珠子接觸單個(gè)O.N.，對(duì)應(yīng)于FV。圖16顯示了隨大小函數(shù)的熒光水平，μS-FV(R4區(qū)域)和μS-FII(R3區(qū)域)。圖17顯示了，重疊，每種珠子各自的綠色熒光直方圖，實(shí)線曲線為μS-FV珠子，虛線曲線為μS-FII珠子。在各自窗口M1和M2測(cè)量MFI。
圖18和19FII單個(gè)正檢驗(yàn)的二元混合物的FCM分析使珠子接觸單個(gè)O.N.，對(duì)應(yīng)于FII。圖18顯示了隨大小函數(shù)的熒光水平，μS-FV(R4區(qū)域)和μS-FII(R3區(qū)域)。圖19顯示了，重疊，每種珠子各自的綠色熒光直方圖，實(shí)線曲線為μS-FV珠子，虛線曲線為μS-FII珠子。在各自窗口M1和M2測(cè)量MFI。
圖20通過(guò)各自等位基因特異性觀察探針攜帶決定性堿基(SNP特異性)，每個(gè)探針攜帶不同的熒光(或可以用熒光抗標(biāo)簽MAb觀察到的半抗原/標(biāo)簽)。該系統(tǒng)具有可以通過(guò)FCM進(jìn)行多色分析的優(yōu)勢(shì)。每種珠子可以進(jìn)行突變的差異檢測(cè)。
圖21通過(guò)各自等位基因特異性捕獲探針攜帶決定性堿基(SNP特異性)，每個(gè)探針連接不同類型的珠子(例如通過(guò)大小區(qū)分的)。對(duì)于通過(guò)FCM的信號(hào)分析，該系統(tǒng)儀需要一種熒光，使其可以使用更簡(jiǎn)單和不太昂貴的設(shè)備，或在多色分析中利用其他顏色將珠子族從另一種中區(qū)分出來(lái)。
圖22二元混合物的FCM分析使用雙重散射分析通過(guò)它們的大小來(lái)區(qū)分2種類型的珠子，μS-FVwt(直徑6.7μm)，位于區(qū)域R1中)，和μS-FVmut(直徑9.6μm)，位于區(qū)域R2中)。在以下所有的圖中重復(fù)該基于大小(FS)和顆粒團(tuán)(SS)的選擇性分析。
圖23和24負(fù)對(duì)照二元混合物的FCM分析使珠子接觸對(duì)所研究突變非特異性的擴(kuò)增子，但是在“Ampli-Mix”PCR混合物存在下作為負(fù)對(duì)照。圖23顯示了隨大小函數(shù)的熒光水平，μS-FVwt(R4區(qū)域)和μS-FVmut(R3區(qū)域)。圖24顯示了，重疊，每種珠子各自的綠色熒光直方圖，實(shí)線曲線為μS-FVwt珠，虛線曲線為μS-FVmut珠。在窗口M1和M2測(cè)量的平均熒光強(qiáng)度(MFI)表明各種類型的珠子。
圖25至28野生型等位基因單個(gè)正檢驗(yàn)二元混合物的FCM分析使珠子接觸單個(gè)等位基因的擴(kuò)增子(FVwt)。圖25顯示了隨大小函數(shù)的熒光水平，μS-FVwt(R4區(qū)域)和μS-FVmut(R3區(qū)域)。圖26顯示了，重疊，每種珠子各自的綠色熒光直方圖，實(shí)線曲線為μS-FVwt珠，虛線曲線為μS-FVmut珠。
圖27顯示了，對(duì)于μS-FVwt，測(cè)試(右手曲線)和BN(左手曲線，圖24的重復(fù))的直方圖。
圖28顯示了，對(duì)于μS-FVmut，測(cè)試(右手曲線)和BN(左手曲線，圖24的重復(fù))的直方圖。
圖29至32突變等位基因單個(gè)正檢驗(yàn)二元混合物的FCM分析使珠子接觸單個(gè)等位基因的擴(kuò)增子，這種情況下為FVmut。圖29顯示了隨大小作用的熒光水平，μS-FVwt(R4區(qū)域)和μS-FVmut(R3區(qū)域)。圖30顯示了，重疊，每種珠子各自的綠色熒光直方圖，實(shí)線曲線為μS-FVwt珠，虛線曲線為μS-FVmut珠。
圖31顯示了，對(duì)于μS-FVwt，測(cè)試(右手曲線)和BN(左手曲線，圖24的重復(fù))的直方圖。
圖32顯示了，對(duì)于μS-FVmut，測(cè)試(右手曲線)和BN(左手曲線，圖24的重復(fù))的直方圖。
圖33至36雙重正檢驗(yàn)二元混合物的FCM分析使珠子同時(shí)接觸兩個(gè)等位基因的擴(kuò)增子。圖33顯示了隨大小函數(shù)的熒光水平，μS-FVwt(R4區(qū)域)和μS-FVmut(R3區(qū)域)。圖34顯示了，重疊，每種珠子各自的綠色熒光直方圖，實(shí)線曲線為μS-FVwt珠，虛線曲線為μS-FVmut珠。
圖35顯示了，對(duì)于μS-FVwt，測(cè)試(右手曲線)和BN(左手曲線，圖24的重復(fù))的直方圖。
圖36顯示了，對(duì)于μS-FVmut，測(cè)試(右手曲線)和BN(左手曲線，圖24的重復(fù))的直方圖。
圖37與圖21中一樣，通過(guò)每個(gè)等位基因-特異性捕獲探針攜帶決定性堿基(SNP特異性)，每個(gè)探針連接不同類型的珠子(通過(guò)大小來(lái)區(qū)分)。對(duì)于通過(guò)FCM的信號(hào)分析，該系統(tǒng)僅需要通過(guò)基于大小和結(jié)構(gòu)參數(shù)來(lái)計(jì)數(shù)珠子的分析，使其可以使用不具有熒光檢測(cè)儀的設(shè)備，因此不太昂貴，或利用其他大小將珠子族從另一種中區(qū)分出來(lái)。
圖38二元混合物的FCM分析在雙重離散分析中通過(guò)它們的大小來(lái)區(qū)分2種類型的珠子，μS-FV(直徑6.7μm位于區(qū)域R1中)，和FVmut(直徑9.6μm位于區(qū)域R2中)。在以下所有的圖中重復(fù)該基于大小(FS)和顆粒團(tuán)(SS)的選擇性分析。
圖39和40負(fù)對(duì)照二元混合物的FCM分析使珠子接觸對(duì)所研究突變非特異性的擴(kuò)增子，在“Ampli-Mix”PCR混合物存在下作為負(fù)對(duì)照。圖39顯示了隨大小函數(shù)的μS數(shù)量的水平，μS-FVwt(R1區(qū)域)和μS-FVmut(R2區(qū)域)。圖40顯示了，重疊，每種珠子各自的μS數(shù)量直方圖。在窗口M1和M2測(cè)量的μS數(shù)量表明各種類型的珠子。
圖41和42野生型等位基因單個(gè)正檢驗(yàn)二元混合物的FCM分析使珠子接觸單個(gè)等位基因(FVwt)的擴(kuò)增子。圖41顯示了隨大小函數(shù)的μS數(shù)量的水平，μS-FVwt(R1區(qū)域)和μS-FVmut(R2區(qū)域)。圖42顯示了，重疊，每種珠子各自的μS數(shù)量直方圖。在窗口M1和M2測(cè)量的μS數(shù)量表明各種類型的珠子。
圖43和44突變等位基因單個(gè)正檢驗(yàn)二元混合物的FCM分析使珠子接觸單個(gè)等位基因的擴(kuò)增子，該情況下為FVmut。圖43顯示了隨大小作用的μS數(shù)量的水平，μS-FVwt(R1區(qū)域)和μS-FVmut(R2區(qū)域)。圖44顯示了，重疊，每種珠子各自的μS數(shù)量直方圖。在窗口M1和M2測(cè)量的μS數(shù)量表明各種類型的珠子。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1通過(guò)FCM根據(jù)大小的函數(shù)識(shí)別微球體族將以下所列的微球體以相似的比例混合，且在EPICS XL流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x(Coulter)上分析(圖5)。
·6群2、3.1、6、7.6、10.2和15.1μm大小珠子混合物的流式細(xì)胞計(jì)量分析表明了各群珠子的單峰可以通過(guò)雙重離散分析來(lái)區(qū)分。在對(duì)數(shù)擴(kuò)增后測(cè)量參數(shù)(FS log/SS log)(FS用于前向光散射；SS用于側(cè)向光散射)。
所用6群微球體的列表

·4群大小約3、8、10和15μm珠子混合物的流式細(xì)胞計(jì)量分析表明各群珠子的單峰通過(guò)FS log/SS log可以容易地區(qū)分開(kāi)來(lái)且可能多峰不代表干擾。
所用4群微球體的列表


參見(jiàn)圖5A至5C實(shí)施例2結(jié)合大小和熒光的作用通過(guò)FCM來(lái)區(qū)分多(6)族微球體將攜帶紅色熒光的4.4μm微球體(在FL4檢測(cè)儀上測(cè)量的)加入實(shí)施例1的混合物中，4.4μm的微球體與上述混合物的組合，使其可以識(shí)別2個(gè)另外的族；上述3μm微球體和4.4μm微球體之間的前向散射差異(log FS)仍然太小以致不能容易地區(qū)分開(kāi)來(lái)(對(duì)照?qǐng)D5A和B)。FL4作為相關(guān)參數(shù)的引入可以完成4.4μm微球體與所有其他微球體的區(qū)分(尤其是3μm)，且可以用于2組4.4μm微球體相互區(qū)分(圖6)。
實(shí)施例3通過(guò)被動(dòng)吸收功能化8、10和15μm的微球體IgG純化從抗模型細(xì)菌B.globigii，B.pseudomallei或Y.pestis或?qū)鼓Ｐ涂扇芸乖亚宓鞍?OVA)和蓖麻蛋白A鏈(Ricin)免疫的兔子中產(chǎn)生多克隆血清。通過(guò)蛋白質(zhì)G親和色譜純化兔子免疫球蛋白G(IgG)。
簡(jiǎn)短地，將50ml稀釋的血清裝載于含有5ml蛋白質(zhì)G瓊脂糖4高流動(dòng)性柱子上(Pharmacia)，柱子在Na2HPO4緩沖液中預(yù)平衡，pH＝7。隨后用0.1M甘氨酸/HCl緩沖液洗脫連接的IgG，pH2.7，然后立即用Tris/HCl緩沖液中和，pH＝9。
將洗脫物在150mM PBS緩沖液中滲析，pH＝7.2，4℃，然后通過(guò)反相滲透來(lái)濃縮。在280nm處讀取吸收值來(lái)測(cè)量IgG濃度(280nm處ε0.1％＝1.41)8、10和15μm珠子的制備將8μm(Polymer Laboratories)、10μm(Dynal Particles)或15μm(Polymer Laboratories)直徑的含有10％固體原料(即，100mg乳膠)的1ml乳膠珠子，在500g離心10分鐘。除去600μl上清液后，加入2ml PBS緩沖液/0.25％曲通X-100/0.09％NaN3(PBS/曲通)。在室溫下將珠子孵育10分鐘，用2.4ml PBS緩沖液洗滌，然后重懸浮于終體積6ml的相同緩沖液中并在4℃放置30分鐘。
抗體(Ab)的制備將Ab稀釋于1ml體積的PBS緩沖液中至濃度為200μg/ml，并在4℃放置30分鐘。還提供了含有1ml 150mM PBS/0.1％BSA/0.09％NaN3(PBS/BSA)的兩個(gè)管子，以便獲得非裝載的珠子。
將BSA-生物素(Sigma，參照A-8594)稀釋于1ml體積的PBS緩沖液中至500μg/ml，并在4℃放置30分鐘。
珠子裝載將1ml珠子(8、10或15μm)加入各種抗體溶液并保持強(qiáng)烈的攪拌(渦旋)。然后將各種混合物在4℃旋轉(zhuǎn)振蕩放置12小時(shí)。該孵育后，將混合物在500g離心10分鐘。除去上清液后，通過(guò)在2ml 500μg/mlBSA-生物素中4℃孵育3小時(shí)將裝載的珠子生物素化。除去上清液后，通過(guò)在2ml PBS緩沖液/2％BSA中孵育2小時(shí)來(lái)飽和裝載的珠子。在用1ml PBS/BA吸收珠子之前進(jìn)行PBS緩沖液的兩次洗滌。對(duì)獲得的懸浮液計(jì)數(shù)并將其濃度調(diào)節(jié)至2.5×104/μl。
實(shí)施例4通過(guò)共價(jià)結(jié)合功能化4.4μm的微球體在珠子COOH-激活后將抗-OVA和抗-Ricin Ab共價(jià)結(jié)合(實(shí)驗(yàn)方案改自Bang’s Labs方法，參照TechNote#205“共價(jià)結(jié)合”)。用于激活珠子的碳化二亞胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺HCl(EDC，Pierce-Brebieres，F(xiàn)R-，參照1853160)。
Ab的制備將抗-OVA(各自，抗-Ricin)IgG稀釋于1ml體積的PBS緩沖液中至濃度為200μg/ml。
珠子激活將1ml直徑4.4μm的Bang’s Labs QuantumPlex#5和#3乳膠珠子，在1900g離心10分鐘。除去上清液后，加入2ml 0.1M MES緩沖液，pH＝5.5。重復(fù)該操作后，加入500μl 0.1M MES緩沖液/10mg/ml EDC，pH＝5.5。然后將獲得的混合物放置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上15分鐘，用2ml PBS緩沖液洗滌兩次，然后在1ml體積的相同緩沖液中吸收。
Ab和珠子的結(jié)合將1ml QuantumPlex#5珠子加入抗-Ricin IgG溶液中，并保持劇烈的攪拌(渦旋)。通過(guò)將QuantumPlex#3珠子和之前制得的抗-OVAIgG溶液混合來(lái)進(jìn)行相同的操作。然后將各種混合物在室溫下旋轉(zhuǎn)振蕩放置4小時(shí)。
珠子的生物素化將混合物在1900g離心10分鐘。除去上清液后，通過(guò)在2mlPBS/0.05％BSA-生物素/30mM甘氨酸中4℃孵育過(guò)夜將裝載的珠子生物素化。
用鏈霉抗生物素-PE標(biāo)記后，隨后將裝載生物素的珠子通過(guò)FCM來(lái)測(cè)定(Sigma，參照S-3402)。
珠子的飽和該孵育后，將珠子在1900g離心10分鐘。除去上清液后，通過(guò)在2ml PBS緩沖液/2％BSA中孵育30分鐘來(lái)飽和裝載的珠子。在用1mlPBS/BA吸收珠子之前進(jìn)行PBS緩沖液的洗滌。對(duì)所獲得懸浮液計(jì)數(shù)并將其濃度調(diào)節(jié)至2.5×104珠子/μl。
實(shí)施例5初始非磁性4.4μm、8、10和15μm微球體的磁分離和差異識(shí)別。
1.目的·為了證明通過(guò)磁化，分離初始非磁性但是當(dāng)通過(guò)鏈霉抗生物素/生物素結(jié)合來(lái)結(jié)合了鐵磁流體的磁性顆粒時(shí)變成磁性的乳膠珠子的可能性。
·為了顯示該結(jié)合沒(méi)有導(dǎo)致任何FS LOG/SS LOG中各種珠子的重疊。
·為了顯示珠子回收產(chǎn)量足夠高可以用于流式細(xì)胞分析。
2.材料-功能化珠子的混合物(每個(gè)特異性5000珠子/μl)，包括4.4μm QuantumPlex#3珠子/抗-OVA Ab/BSA-生物素(批號(hào)#682)。
4.4μm QuantumPlex#5珠子/抗-Ricin Ab/BSA-生物素(批號(hào)#681)。
8μm Polymer Laboratories珠子/抗-Y.pestis Ab/BSA-生物素(批號(hào)#041)。
10μm Dyno珠子/抗-B.pseudomallei Ab/BSA-生物素(批號(hào)#042)。
15μm Polymer Laboratories珠子/抗-B.globigii Ab/BSA-生物素(批號(hào)#043)。
-0.5mg Fe/ml的鐵磁流體-鏈霉抗生物素(FF-SA)分子探針(參照C-21476)(批號(hào)#71A1-1)。
-蒸餾水中200μg/ml的d-生物素。
-PBS緩沖液/0.1％吐溫-PBS緩沖液/BA。
-1ml IMS管。
-Dynal磁鐵。
-5.1μm Duke XPR綠珠(批號(hào)#1938)。
3.實(shí)驗(yàn)方案將790μl PBS/0.1％吐溫(IMS管)或490μl PBS/0.1％BSA/0.09％NAN3(PBS/BA)(參照管)引入1ml IMS管中。
加入10μl功能化珠子混合物(即，每種50000個(gè)珠子)。
將混合物渦旋。
以下僅對(duì)于IMS管加入30μl FF-SA。
將混合物渦旋。
將混合物放置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上5分鐘。
加入100μl 200μg/ml的生物素。
將混合物孵育1分鐘。
將混合物渦旋。
將管磁化2分30秒。
除去緩沖液。
加入800μl PBS/BA。
將管磁化2分30秒。
除去緩沖液。
加入500μl PBS/BA。
將15μl稀釋于PBS/0.1％吐溫中至1/50的Duke XPR珠子(參照在流式細(xì)胞分析過(guò)程中的用于計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)量的珠子)加入。
如下所示在Coulter EPICS XL細(xì)胞計(jì)量?jī)x上分析兩個(gè)管子形成FS LOG/SS LOG直方圖。該直方圖上形成4個(gè)分析區(qū)域(A、B、C和的)(圖7A)。
區(qū)域B、C和D各自對(duì)應(yīng)8、10和15μm珠子。
區(qū)域A對(duì)應(yīng)于由計(jì)數(shù)珠子(5.1μm Duke XPR)和4.4μm捕獲珠子構(gòu)成的群。
形成位于窗口A(圖7b)的FS LOG/FL4LOG直方圖。
形成三個(gè)分析物區(qū)域(E、F和G)。
區(qū)域E和F對(duì)應(yīng)于4.4μm QuantumPlex#3和#5的珠子群。區(qū)域G對(duì)應(yīng)于計(jì)數(shù)珠子群(Duke XPR)。
形成位于區(qū)域G的單參數(shù)直方圖。在10000個(gè)事件加入該直方圖時(shí)停止自動(dòng)化分析。
記錄B、C、D、E和F區(qū)域中計(jì)數(shù)事件的數(shù)量。通過(guò)將IMS管計(jì)數(shù)的事件數(shù)量除以參照管計(jì)數(shù)的來(lái)計(jì)算每種珠子的回收產(chǎn)量。
4.結(jié)果4.1.各種生物素-珠子群在結(jié)合FF-SA過(guò)程中FS LOG的分布改變(圖8)。
FF-SA和生物素-BSA/珠子的結(jié)合導(dǎo)致FS略微的降低。改變沒(méi)有導(dǎo)致各種珠子群的任何重疊。
4.2.回收產(chǎn)量在段落3中所公開(kāi)的條件下，3個(gè)不同測(cè)定中獲得的回收產(chǎn)量(回收珠子的％)，公開(kāi)于下表中。

獲得了50至95％的回收產(chǎn)量。
5.結(jié)論·確定通過(guò)結(jié)合FF-SA磁化制得的生物素化乳膠珠子的磁分離是可行的(足夠的回收產(chǎn)量)。
·該磁分離與多重測(cè)定的進(jìn)行是相容的(沒(méi)有各種微球體種類的重疊)。
·該實(shí)施例優(yōu)選說(shuō)明了系統(tǒng)的適應(yīng)性。
多重微球體和分離毫微球體的分離使用拓寬了具有所需性質(zhì)(大小，自體熒光，密度、原料，表面化學(xué)等等)微球體可獲得的領(lǐng)域。實(shí)際上，在所有上述特性中非常容易獲得非磁性乳膠，而磁性微球體的范圍非常有限(＜1％的種類可參考)。例如意味著必需選擇不同的供應(yīng)商以便產(chǎn)生足夠系列的多重族，或意味著需要特意生產(chǎn)(且因此是昂貴的)。
相反，使用所提出的系統(tǒng)，在非磁性乳膠非常寬的范圍內(nèi)，可以使用任何多重微球體。
實(shí)施例6根據(jù)本發(fā)明試劑盒模型的實(shí)施例試劑1-功能化微球體涂覆待測(cè)定Ag特異性Ab的生物素化微球體的混合物。珠子濃度每個(gè)特異性2500個(gè)微球體/μl(下表)。


試劑2-鐵磁流體-鏈霉抗生物素鏈霉抗生物素，捕獲鐵磁流體綴合物(Molecular Probes，參照C-21476)。
試劑3-觀察試劑待測(cè)定Ag特異性熒光綴合物的混合物(下表)。

試劑4-標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)定6種Ag的濃縮混合物(限定濃度)。
臨時(shí)制得該試劑的連續(xù)稀釋(稀釋于試劑1中)。當(dāng)在與待分析樣品相同條件下處理時(shí)，該范圍(待測(cè)定點(diǎn)的數(shù)量)可以定量樣品中存在的Ag。
試劑5-稀釋緩沖液PBS緩沖液/0.1％吐溫20，pH＝7.2。
試劑6-洗滌緩沖液待測(cè)定的(PBS/0.1％BSA/0.09％NaN3或PBS/0.1％吐溫20，或其他)。
試劑7-平衡緩沖液蒸餾水中200μg/ml的d-生物素溶液。
d-生物素防止了各種生物素化微球體在磁化過(guò)程中聚集(通過(guò)用生物素平衡SA/FF/SA獲得生物素-SA/FF/SA-生物素來(lái)避免微球體/生物素-SA/FF/SA-生物素/微球體聚集，生物素-SA/FF/SA-生物素在各種生物素-微球體之間不能進(jìn)行任何橋接)。
不是必需提供的原料Dynal MPC磁鐵。
實(shí)施例73種細(xì)菌和3種蛋白質(zhì)多重測(cè)定的操作實(shí)驗(yàn)方案的模型1.通過(guò)如下所示混合試劑4和5來(lái)制得標(biāo)準(zhǔn)范圍

2.將800μl待分析的樣品或800μl標(biāo)準(zhǔn)引入1ml管中(管T0至Tn)。
3.加入20μl試劑1。
4.將管渦旋。
5.將管放置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上8分鐘(研究了可以將該時(shí)間縮短至5分鐘)。
6.加入30μl試劑2。
7.將管渦旋。
8.將管放置于旋轉(zhuǎn)振蕩器上5分鐘。
9.加入100μl試劑7。
10.將管渦旋。
11.在室溫孵育1分鐘(該1分鐘的孵育不是必需的)。
12.將管放置于磁鐵上2分30秒(研究可以將該時(shí)間縮短至2分鐘)。
13.除去介質(zhì)。
14.加入200μl試劑3。
15.將管渦旋。
16.在室溫下進(jìn)行孵育10分鐘。
17.加入600μl試劑6。
18.將管放置于磁鐵上2分30秒(研究可以將該時(shí)間縮短至2分鐘)。
19.除去介質(zhì)。
20.加入500μl試劑6。
21.通過(guò)FCM進(jìn)行分析。
實(shí)施例8磁分離后對(duì)15μm微球體上細(xì)菌的檢測(cè)和測(cè)定目的為了檢測(cè)和測(cè)定B.globigii在裝載了抗B.globigii PAb的生物素化珠子上的濃度。
材料和實(shí)驗(yàn)方案對(duì)應(yīng)于實(shí)施例6和7的那些。
樣品分析孢子稀釋于試劑1中。Ag濃度為160000、80000、40000、20000、10000和5000孢子/ml。
結(jié)果

參見(jiàn)圖9實(shí)施例9磁分離后對(duì)熒光4.4μm微球體上的卵清蛋白的多重測(cè)定目的為了檢測(cè)和測(cè)定裝載了抗-卵清蛋白PAb的生物素化熒光4.4μm珠子上的卵清蛋白濃度。
材料和實(shí)驗(yàn)方案所用的材料和實(shí)驗(yàn)方案描述于實(shí)施例6和7中。
樣品分析卵清蛋白稀釋于試劑1中。卵清蛋白濃度為1.6、0.8、0.4、0.2、0.1和0.05ng/ml。
結(jié)果

實(shí)施例10將多重流式細(xì)胞計(jì)量分析運(yùn)用至分子遺傳學(xué)來(lái)研究SNPsOLA-型測(cè)試1)通過(guò)化學(xué)方法將通常為5至100堿基大小的基因特異性捕獲寡核苷酸探針結(jié)合生物素化乳膠微球體(Iannone MA等，2000；Cytometry39131-140)。還可以在將捕獲探針結(jié)合微球體后進(jìn)行乳膠微球體生物素化的步驟。在單個(gè)管中在鏈霉抗生物素鐵磁流體(FF-SA)、觀察探針(圖3實(shí)施例中的A1和A2)以及擴(kuò)增子或從預(yù)先沒(méi)有通過(guò)PCR擴(kuò)增的生物樣品中提取的基因組DNA或源自該預(yù)先沒(méi)有通過(guò)PCR擴(kuò)增的DNA的片段的存在下將乳膠珠子孵育。A1和A2探針可以是用于隨后免疫反應(yīng)的不同熒光探針(例如，Cy3和Cy5)或不同半抗原(例如，用不同的熒光素[FITC對(duì)PE]標(biāo)記的兩種抗體)。通過(guò)乳膠珠子系統(tǒng)的偏差獲得多重，珠子可以是大小可變的和/或具有不同的熒光特性。
2)使用如1)中所說(shuō)的相同原理，根據(jù)將捕獲探針移接至乳膠微球體通過(guò)加入另外程度的特異性來(lái)發(fā)展測(cè)試。可以通過(guò)特異性抗原-抗體對(duì)，特異性半抗原-抗體對(duì)或富含G+C(鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶)的寡核苷酸探針進(jìn)行該移接。該第三種情況下，結(jié)合于微球體的富含G+C的寡核苷酸序列共價(jià)結(jié)合與捕獲探針5’端加入的互補(bǔ)序列雜交(圖4)。此外，在核酸雜交的情況中，錨定核苷酸序列的Tm(熔解溫度)高于60℃和/或包括至少15個(gè)鳥(niǎo)嘌呤或胞嘧啶殘基或兩種核苷酸堿基的混合物。然而，在這些條件下，基因組原料或捕獲擴(kuò)增子的雜交和去雜交(通常在15至40℃進(jìn)行)可以不需要從微球體去雜交捕獲探針。
實(shí)施例11標(biāo)記PCR片段的差異檢測(cè)1材料進(jìn)行PCR的特定方法中，使用標(biāo)記的核苷酸制得熒光的PCR產(chǎn)物。根據(jù)圖11和19中圖示的原理，其涉及3種不同的特異性本發(fā)明提出的使用磁分離的洗滌初始非磁性珠子步驟的技術(shù)方法，可以運(yùn)用至標(biāo)記PCR產(chǎn)物的差異檢測(cè)中。
用鐵磁流體洗滌微球體(μS)后通過(guò)FCM多重分析的可行性說(shuō)明于以下的實(shí)施例中并涉及2種不同的特異性。這種情況下，標(biāo)記的PCR產(chǎn)物是使用熒光素標(biāo)記的寡核苷酸(O.N.)模型化的，其序列與那些各自預(yù)先結(jié)合到珠子表面的捕獲探針的序列互補(bǔ)。實(shí)踐中·直徑6.7μm的珠子(SpheroTM羧基聚苯乙烯顆粒，CP-60-10，Spherotech，Libertyville，IL))攜帶根據(jù)以下結(jié)構(gòu)構(gòu)建的因子V捕獲探針，表示從5’至3’端μS-FVNH2(C6)TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Acc TgT ATTccT c(SEQ ID No 1)；·直徑9.6μm的珠子(PL-Microspheres SuperCarboxyl White10μm，Polymer Laboratories，UK)攜帶根據(jù)以下結(jié)構(gòu)構(gòu)建的因子II的捕獲探針μS-FIINH2(C6)TTT TTT TTT TTT aaT agc act ggg agc att gag gctc(SEQ ID No 2)；在該2個(gè)捕獲探針5’位置構(gòu)建帶有氨基(NH2)，目的在于共價(jià)結(jié)合羧基化的珠子(μS-COOH)。它們含有最多達(dá)6個(gè)碳原子(C6)和12個(gè)胸苷(T)構(gòu)成的支撐臂(或間隔物)。通過(guò)Proligo(Paris，F(xiàn))特異性合成提及的所有寡核苷酸。
·以下實(shí)施例中本發(fā)明系統(tǒng)必需的珠子表面的生物素基團(tuán)，通過(guò)3’位置用生物素標(biāo)記并在5’位置攜帶NH2支撐(C6)的多-(T)30寡核苷酸引入(稱為多聚T-生物素)。根據(jù)以下的結(jié)構(gòu)構(gòu)建NH2(C6)TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-生物素(SEQ ID No 3)同時(shí)以相同的方式結(jié)合每個(gè)捕獲探針。
·根據(jù)以下的結(jié)構(gòu)構(gòu)建與捕獲探針互補(bǔ)的寡核苷酸，并在5’位置的熒光素(Fluor-)標(biāo)記對(duì)于FVFluor-g Agg AAT AcA ggT ATT TTg Tcc(SEQ ID No.4)對(duì)于FIIFluor-g agc ctc aat gct ccc agt gct att(SEQ ID No.5)。
如下用EDAC(N-(二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳化二亞胺HCl，Sigma)激活后進(jìn)行捕獲探針和相應(yīng)直徑的羧基化珠子的結(jié)合對(duì)于每種珠子，通過(guò)離心將10兆珠子在PBS緩沖液中洗滌并將濃度調(diào)節(jié)至5×106μS/ml。通過(guò)加入0.8mg EDAC(80μl 10ml/ml)來(lái)激活珠子并孵育30分鐘。隨后使探針接觸激活的珠子。為了同時(shí)進(jìn)行特異性探針和攜帶生物素探針的結(jié)合，將捕獲寡核苷酸和多聚T-生物素探針的等摩爾混合物接觸激活的珠子(終濃度為17nmol/ml，即全部每O.N.～250pmol)。
用間歇攪拌(渦旋)將珠子在玻璃管中AT(室溫)孵育2小時(shí)。結(jié)合后，通過(guò)加入400μl 0.2M乙醇胺來(lái)中和激活的羧基并在4℃孵育16小時(shí)。
最后，還通過(guò)在PBS-2％BSA中攪拌孵育30分鐘來(lái)飽和珠子的疏水相互作用位點(diǎn)。
為了測(cè)試此后所述的O.N.和珠子的雜交，緩沖液與以下實(shí)施例中所用的那些相同(實(shí)施例12)，其中檢測(cè)有效地涉及雙鏈DNA。這些嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮头菄?yán)謹(jǐn)?shù)?，最佳pH緩沖液，各自分別是i)去雜交成對(duì)擴(kuò)增子，和ii)在適于至少部分再雜交的條件下平衡固定的捕獲探針(§)(對(duì)照實(shí)施例12部分2(材料)的注釋)，都來(lái)自GenecolorTMFV Leiden試劑盒(BioCytex，Marseilles，F(xiàn))，各自名稱為“雜交緩沖液”/和“連接緩沖液”/在此稱為平衡緩沖液。
用于流式細(xì)胞計(jì)量分析的洗滌/稀釋緩沖液是PBS-0.1％吐溫20。
(§)對(duì)照以下實(shí)施例中的注釋(對(duì)照實(shí)施例12部分2(材料)的注釋)。
2.方法將珠子(5μl測(cè)試，即每種100000μS/測(cè)試)和互補(bǔ)寡核苷酸(O.N.)(5μl，即根據(jù)指示每種O.N.最大劑量為3pmol/測(cè)試或稀釋至1/10)在PCR管(Simport，Quebec，C)中的雜交緩沖液中AT孵育15分鐘，然后在AT平衡緩沖液中15分鐘，以致獲得互補(bǔ)鏈的雜交。雜交后，通過(guò)磁分離洗去沒(méi)有結(jié)合珠子的O.N.。為此，將10μl CaptivateTM，裝載鏈霉抗生物素的鐵磁流體(稱為SA-FF，Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)加入反應(yīng)混合物中，將混合物孵育10分鐘，將PCR管中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至FCM管中，加入1ml洗滌緩沖液(PBS-0.1％吐溫20)并將管靠著強(qiáng)磁鐵放置5分鐘(MPC-L，Dynal F，compiegne，F(xiàn))。磁化的珠子保持粘在管壁上，除去液相，并將珠子重懸浮于2ml的洗滌緩沖液中用于下一個(gè)階段(選擇性去雜交)。
為了選擇性去雜交，將管加熱至接近探針的熔點(diǎn)(Tm)，以致僅保留特異性雜交(對(duì)應(yīng)于全序列互補(bǔ)，即100％)并分離非特異性雜交(對(duì)應(yīng)于部分序列互補(bǔ)，即＜35％)。為此，將管在54℃PBS緩沖液/0.1％吐溫20中孵育，該條件使得FV和FII熒光探針各自從“FII”和“FV”的非互補(bǔ)序列上選擇性脫離。將管在所示的溫度下水浴5分鐘，然后立即通過(guò)FMC分析。
為了完全去雜交，將管加熱超過(guò)熔點(diǎn)(Tm)，實(shí)踐中為80℃10分鐘。
3.結(jié)果圖11至19說(shuō)明了在多重細(xì)胞計(jì)量分析中，各自表示FV和FII基因的標(biāo)記寡核苷酸片段的差異檢測(cè)。
所有情況中，F(xiàn)V特異性(μs-FV)的和直徑6.7μm的捕獲珠子定位于R1區(qū)域用于其熒光分析。FII特異性(μs-FII)的和直徑9.6μm的捕獲珠子定位于R2區(qū)域。
a)在兩種標(biāo)記的寡核苷酸同時(shí)存在下，觀察到每種珠子的最大標(biāo)記(圖12和13)，對(duì)應(yīng)于各自最大的平均強(qiáng)度·μS-FV為831任意單位(a.u.)·μS-FII為247任意單位(a.u.)b)當(dāng)相同的珠子接受完全去雜交時(shí)，在80℃加熱10分鐘(圖14和15)，觀察到每種珠子的最小標(biāo)記(圖14和15)，對(duì)應(yīng)于最小平均強(qiáng)度·μS-FV為6a.u.
·μS-FII為18a.u.
因此這些結(jié)果對(duì)應(yīng)于2個(gè)最大范圍的工作范圍，各自·6至840a.u.(μS-FV)·18至250a.u.(μS-FII)c)2種標(biāo)記寡核苷酸中一種(FV)存在減少劑量的(1/10最大劑量)下，觀察到μS-FV強(qiáng)烈的標(biāo)記(圖16和17；266a.u.，即～25％最大可能范圍)，而對(duì)于μS-FII，信號(hào)保持接近于圖15中看到的18a.u.的BN(21a.u.，即＜2％最大可能范圍)。
d)相反，在減少劑量的(1/10最大劑量)僅有2種標(biāo)記寡核苷酸中一種(FII)存在下，觀察到μS-FII的正標(biāo)記(77a.u.，即～30％最大可能范圍)，而對(duì)于μS-FV，保持弱的信號(hào)(11a.u.，即＜2％最大可能范圍)，但是無(wú)論如何高于圖15中看到的6a.u.的BN，其表示少許殘留的非特異性標(biāo)記的存在。
下表總結(jié)了代表關(guān)于因子II和因子V基因的O.N.的多重FCM分析的結(jié)果并顯示了熒光標(biāo)記DNA片段的檢測(cè)是簡(jiǎn)單的并可以在單管中進(jìn)行。

實(shí)施例12SNP突變的差異檢測(cè)1.原理點(diǎn)突變(SNP)的檢測(cè)是基于OLA技術(shù)(Landegren，Science 1988，2411077-80)。該技術(shù)涉及·捕獲探針(這種情況中固定于珠子族上)、源自相應(yīng)基因擴(kuò)增子的互補(bǔ)單鏈DNA鏈以及結(jié)合捕獲探針的觀察探針之間三重復(fù)合物的形成。
·捕獲探針和觀察探針的共價(jià)結(jié)合一與用互補(bǔ)鏈雜交-通過(guò)連接酶的特異性作用，連接酶只連接嚴(yán)格相鄰的且優(yōu)選雜交的鏈。攜帶突變的單個(gè)堿基上互補(bǔ)性的缺失足以證明該結(jié)合(在此稱為連接)。
·在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，DNA雙鏈的解離。
當(dāng)連接酶發(fā)現(xiàn)自身在特異性條件下需要其作用，且僅在這種情況下，觀察探針保持與捕獲探針的連接(共價(jià)結(jié)合)并因此保持與相應(yīng)支持物的連接(這種情況下是珠子)。
通過(guò)圖20和21來(lái)說(shuō)明本發(fā)明文中該原理的運(yùn)用。
注釋FMC可以同時(shí)測(cè)量可以基于另一種參數(shù)(大小或不同波長(zhǎng)的熒光)區(qū)分的珠子群上非常不同水平的熒光強(qiáng)度(從背景噪音至++++標(biāo)記)。
2.材料通過(guò)圖21說(shuō)明其原理的點(diǎn)突變(SNP)的檢測(cè)，需要使用兩種μS來(lái)用于差異檢測(cè)。在此所用的μS裝載捕獲探針，特別如實(shí)施例11中所示的并且以致·直徑6.7μm的珠子攜帶根據(jù)以下結(jié)構(gòu)構(gòu)建的野生型因子V捕獲探針(μS-FVwt)，表示從5’至3’端μS-FVwtNH2(C6)TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Acc TgT ATTccT c(SEQ ID No.1)·直徑9.6μm的珠子攜帶根據(jù)以下結(jié)構(gòu)構(gòu)建的突變因子V捕獲探針(μS-Fvmut)，表示從5’至3’端μS-FvmutNH2(C6)TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Acc TgT ATTccT T(SEQ ID No.6)寡核苷酸引入以下實(shí)施例中本發(fā)明系統(tǒng)需要的珠子表面的生物素基團(tuán)如段落A中通過(guò)多聚-(T)30，并使其特異性結(jié)合鏈霉抗生物素-鐵磁流體(CaptivateTM，Molecular Probes，Eugene，OR，USA)。
與連接可觀察的捕獲探針鄰接的探針在其5’位攜帶磷酸鹽基團(tuán)并在其3’位攜帶熒光素標(biāo)記；通過(guò)Proligo(Paris，F(xiàn))特異性合成并具有以下序列PO42--gcc TgT ccA ggg ATc Tgc Tcc-熒光(SEQ ID No.7)。
用于形成三重復(fù)合物的擴(kuò)增子源自基因組DNA或特異性質(zhì)粒的野生型和/或突變因子V基因片段的PCR擴(kuò)增，在“Ampli-Mix”試劑PCR混合物存在下進(jìn)行該P(yáng)CR，從GenecolorTMFV Leiden試劑盒(BioCytex，Marseilles，F(xiàn))中可獲得“Ampli-Mix”試劑PCR混合物。
捕獲探針和信號(hào)探針之間共價(jià)鍵形成需要的連接酶溶液是“連接溶液”試劑，即，其特異性“連接緩沖液”中的T4連接酶，如GenecolorTMFV Leiden試劑盒(Biocytex，Marseilles，F(xiàn))中所用的。
此后所用的緩沖液是最佳pH的，是嚴(yán)謹(jǐn)性和非嚴(yán)謹(jǐn)性的，各自可以i)使配對(duì)的擴(kuò)增子去雜交并使其與固定捕獲探針部分再雜交(§)(參照實(shí)施例12中部分2(材料)的注釋)，ii)連接酶的作用，且最后，iii)使連接后未配對(duì)的擴(kuò)增子和探針去雜交。
它們也都是源自GenecolorTMFV Leiden試劑盒，各自名稱為“雜交緩沖液”/“連接緩沖液”(在實(shí)施例11中也稱為平衡緩沖液)和“洗滌緩沖液“。
用于流式細(xì)胞計(jì)量的稀釋緩沖液使PBS-0.1％吐溫20。
(§)預(yù)先將化學(xué)計(jì)量的條件最佳化(過(guò)量擴(kuò)增子，過(guò)量信號(hào)探針)，以致獲得2種DNA鏈之一的相當(dāng)大部分與固定捕獲而不是與其互補(bǔ)鏈探針再雜交。
3.實(shí)驗(yàn)方案將兩種珠子(μS-FVwt和μS-FVmut)等量混合并以40000μS/μl的總量稀釋于雜交緩沖液中。將5μl珠子懸浮液(即，每種100000μS/測(cè)試)、擴(kuò)增子(3.75μl/測(cè)試)以及FV觀察探針(1.25μl雜交緩沖液中的1pmol)分配至特定的PCR微管中(PCR T 320-1N，Simport，Quebec，C)。將反應(yīng)介質(zhì)均質(zhì)(渦旋)并在室溫(AT)下孵育30分鐘。
隨后通過(guò)加入100μl連接溶液后孵育1小時(shí)來(lái)進(jìn)行連接步驟。
連接后，通過(guò)磁分離除去沒(méi)有包含于三重復(fù)合物中的過(guò)量擴(kuò)增子和過(guò)量信號(hào)探針。為此，加入含有10μl鐵磁流體懸浮液(SA-FF)的反應(yīng)混合物(Vt＝110μl)。攪拌(渦旋)和孵育10分鐘后，將混合物轉(zhuǎn)移至1ml管(Ringer管)中并用強(qiáng)磁鐵(MPC-S，Dynal，Compiegne F)進(jìn)行5分鐘磁化。通過(guò)吸出液體將粘在管壁的珠子干燥并用100μl洗滌溶液重懸浮。具有合適特性的洗滌溶液使與珠子僅通過(guò)非共價(jià)相互作用(雜交但沒(méi)有連接)而相連的產(chǎn)物選擇性分離，但沒(méi)有分離共價(jià)結(jié)合的探針和SA-FF。重復(fù)該洗滌兩次。
最終將珠子稀釋于1ml稀釋緩沖液中(PBS-吐溫20)，轉(zhuǎn)移至用于細(xì)胞計(jì)量的管中(4ml)并通過(guò)FCM分析。
4.結(jié)果a)存在系統(tǒng)不能識(shí)別的PCR產(chǎn)物的情況下(這種情況下，產(chǎn)物源自野生型等位基因P2Y12基因的擴(kuò)增，用GenecolorTMP2Y12G52T試劑盒的試劑來(lái)生產(chǎn)，BioCytex，Marseilles，F(xiàn))，2種珠子中的每種給予了與其固有背景噪音(BN)相似的標(biāo)記，實(shí)踐中(圖23和24)；·μS-FVwt6.0a.u.
·μS-FVmut15.3a.u.
b)在對(duì)應(yīng)于因子V基因野生型等位基因的PCR產(chǎn)物存在下(FVwt，用GenecolorTM因子V Leiden試劑盒的試劑進(jìn)行PCR，BioCytex，Marseilles，F(xiàn))，μS-FVwt珠子顯示了明顯的正標(biāo)記，而μS-FVmut珠子給予了與其固有背景噪音相似的標(biāo)記，實(shí)踐中(圖25至28)。
·μS-FVwt313a.u.(對(duì)6.0a.u.的BN)·μS-FVmut17.4a.u.(對(duì)15.3a.u.的BN)。
將測(cè)試中每種珠子的信號(hào)疊加于其非特異性的BN上(μS-FVwt圖27；μS-FVmut圖28)。這表明了FVwt的寬工作范圍(從6至高于300的a.u.)和在其特異性配體不存在下(FVmut擴(kuò)增子)，F(xiàn)Vmut珠子實(shí)際上零的非特異性標(biāo)記。
c)在對(duì)應(yīng)于因子V基因突變等位基因的PCR產(chǎn)物存在下(FVmut，用GenecolorTMFV Leiden試劑盒的試劑進(jìn)行PCR，BioCytex，Marseilles，F(xiàn))，μS-FVmut珠子顯示了明顯不同于BN的標(biāo)記，對(duì)應(yīng)于用可獲得原料可能的最大正信號(hào)水平。與最大正信號(hào)相比較μS-FVmut珠子給予了弱的標(biāo)記(14.8對(duì)313a.u.，即＜最大范圍變量的2％)，盡管與其固有背景噪音不同，其表明了在FVmut擴(kuò)增子的存在下這些珠子上弱的但真實(shí)非特異性標(biāo)記的存在。實(shí)踐中(圖29至32)·μS-FVwt14.8a.u.(對(duì)6.0a.u.的BN)·μS-FVmut43.4a.u.(對(duì)15.3a.u.的BN)。
對(duì)于檢測(cè)該FV突變，任意地在其他等位基因的存在下，因此各自最佳的工作范圍(區(qū)域)是FVwt15至300a.u.
FVmut17至43a.u.。
關(guān)于最大強(qiáng)度(300a.u.對(duì)43a.u.)所觀察到的位移可以歸因于μS-FVmut珠子較差的涂覆效率；如實(shí)施例11中，這些9.7μm的珠子給予了較差的涂覆水平。應(yīng)當(dāng)注意到，通過(guò)本發(fā)明原理的優(yōu)點(diǎn)，可以使用其他批號(hào)、類型、來(lái)源和直徑的珠子，以獲得最佳裝載能力和/或固有BN的特性，而不必?fù)?dān)心它們的磁性特征，其顯著拓寬了供應(yīng)的選擇。
d)在對(duì)應(yīng)于因子V基因2個(gè)等位基因的PCR產(chǎn)物同時(shí)存在下(FVmut和FVwt，用GenecolorTMFV Leiden試劑盒的試劑進(jìn)行PCR，BioCytex，Marseilles，F(xiàn))，μS-FVwt珠子和μS-FVmut珠子顯示出明顯的正標(biāo)記，盡管比單獨(dú)使用單個(gè)等位基因特異性擴(kuò)增子觀察到的那些強(qiáng)度水平要弱，實(shí)踐中(圖33至36)。
·μS-FVwt187a.u.(即，～2/3最大特異性標(biāo)記范圍[187-15]/[300/15])·μS-FVmut33a.u.(即，～2/3最大特異性標(biāo)記范圍[33-17]/[43/17])。
下表總結(jié)了因子V Leiden突變的雙重FCM分析的結(jié)果，并表明了FV基因型的確定是簡(jiǎn)單的并可以在單管中進(jìn)行。


5.擴(kuò)充上述實(shí)施例，尤其是No.1、2和5，已經(jīng)說(shuō)明了免疫檢測(cè)的內(nèi)容，使用較大量珠子族的可能性，珠子可以通過(guò)其大小和/或不同于用于測(cè)量的可見(jiàn)水平的第二種熒光容易地區(qū)分開(kāi)來(lái)。所有這些實(shí)施例中一致出現(xiàn)的是單個(gè)管中FV和FII基因的2個(gè)等位基因的多重分析是非常容易的，例如使用·與實(shí)施例12中所示的相同羧基化的珠子(FVmut直徑9.6μm，F(xiàn)Vwt直徑6.7μm)以及4.4μm的羧基化珠子并攜帶兩種不同含量的紅色熒光，如實(shí)施例4和5中所示的，用于攜帶FII野生型和突變等位基因特異性的兩種探針。
·兩種不同熒光，用于根據(jù)圖20的原理來(lái)測(cè)量，其每個(gè)突變僅需要一種珠子。
這兩種方法可以概述為·首先，僅使用一種熒光用于測(cè)量，使其可以同時(shí)檢測(cè)與區(qū)分的珠子族數(shù)一樣多的不同等位基因。
·其次，使用兩種不同的熒光用于測(cè)量，使其可以同時(shí)檢測(cè)與區(qū)分的珠子族數(shù)一樣多的基因型。
所有情況中，本發(fā)明提供的主要優(yōu)勢(shì)是用于多重分析的珠子選擇對(duì)其固有的磁性特征不強(qiáng)加任何限制條件。
實(shí)施例13SNP突變的差異檢測(cè)1.圖37的原理
圖37中，如圖21中，通過(guò)每種等位基因特異性捕獲探針攜帶決定性堿基(SNP特異性)，每個(gè)探針結(jié)合不同類型的珠子(通過(guò)大小來(lái)區(qū)分)。為了通過(guò)FCM的信號(hào)分析，該系統(tǒng)僅需要通過(guò)計(jì)數(shù)基于大小和結(jié)構(gòu)參數(shù)的珠子的分析，使其可以使用不具有熒光檢測(cè)儀的設(shè)備，因此不太昂貴，或?qū)τ诹硪环N珠子利用其他大小來(lái)區(qū)分珠子族。
2.原料點(diǎn)突變(SNP)的檢測(cè)，其原理說(shuō)明于圖37中，需要使用兩種μS來(lái)差異檢測(cè)。在此所用的μS裝載捕獲探針，特別如段落1中所示的且使得·直徑6.7μm珠子攜帶根據(jù)以下結(jié)構(gòu)構(gòu)建的野生型因子V捕獲探針(μS-FVwt)，表示從5’端至3’端μS-FVwtNH2(C6)TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Acc TgT ATTccT c(SEQ ID NO.1)·直徑9.6μm的珠子攜帶根據(jù)以下結(jié)構(gòu)構(gòu)建的突變因子V捕獲探針(μS-FVmut)，表示從5’至3’端μS-FVmutNH2(C6)TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Acc TgT ATTccT T(SEQ ID NO.6)鄰接使其可以觀察到連接的捕獲探針的探針，攜帶5’-磷酸鹽基團(tuán)和3’-生物素基團(tuán)；通過(guò)Proligo(Paris，F(xiàn))特異性合成并具有以下序列PO42--gcc，TgT ccA ggg Atc Tgc Tcc TTT TTT TTT TTT TTT TTT-生物素(SEQ ID NO.8)捕獲探針上的生物素基團(tuán)，是以下實(shí)施例中本發(fā)明系統(tǒng)所必需的，使得鐵磁流體-鏈霉抗生物素特異性結(jié)合(CaptivateTM，MolecularProbes，Eugene，OR，USA)。使三重復(fù)合物形成的擴(kuò)增子源自基因組DNA或特異性質(zhì)粒的野生型和/或突變因子V基因片段的PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR在“Ampli-Mix”試劑PCR混合物存在下進(jìn)行，在GenecolorTMFV Leiden試劑盒(BioCytex，Marseilles，F(xiàn))中可獲得“Ampli-Mix”試劑PCR混合物。
用于形成捕獲探針和信號(hào)探針之間的共價(jià)鍵的連接酶溶液是“連接溶液”試劑，即，在其特異性“連接緩沖液”中的T4連接酶，如GenecolorTMFV Leiden試劑盒中(BioCytex，Marseilles，F(xiàn))所用的。
此后所用的緩沖液是最佳pH的，是嚴(yán)謹(jǐn)性和非嚴(yán)謹(jǐn)性的，且各自可以i)使配對(duì)的擴(kuò)增子去雜交并使其與固定的捕獲探針部分再雜交(§)(對(duì)照以下)，ii)起連接酶的作用，且最后，iii)使連接后未配對(duì)的擴(kuò)增子和探針去雜交。
它們都是源自GenecolorTMFV Leiden試劑盒，各自名稱為“雜交緩沖液”/“連接緩沖液”(在實(shí)施例A中也稱為平衡緩沖液)和“洗滌緩沖液“。
用于流式細(xì)胞計(jì)量的稀釋緩沖液使PBS-0.1％吐溫20。
(§)預(yù)先將化學(xué)計(jì)量的條件最佳化(過(guò)量擴(kuò)增子，過(guò)量信號(hào)探針)，以致獲得2個(gè)DNA鏈之一的相當(dāng)大部分與固定捕獲探針再雜交，而不是與其互補(bǔ)鏈再雜交。
3.實(shí)驗(yàn)方案將兩種珠子(μS-FVwt和μS-FVmut)等量混合并以40000μS/μl的總量稀釋于雜交緩沖液中。將5μl珠子懸浮液(即，每種100000μS/測(cè)定)、擴(kuò)增子(3.75μl/測(cè)試)以及FV觀察探針(1.25μl雜交緩沖液中1pmol)分配至特定的PCR微管中(PCR T 320-1N，Simport，Quebec，C)。將反應(yīng)介質(zhì)均質(zhì)(渦旋)并在室溫(AT)下孵育30分鐘。
隨后加入100μl連接溶液后孵育1小時(shí)來(lái)進(jìn)行連接步驟。
連接后，通過(guò)磁分離除去沒(méi)有包含于三重復(fù)合物中的過(guò)量擴(kuò)增子和過(guò)量信號(hào)探針。為此，加入含有10μl鐵磁流體懸浮液(SA-FF)的反應(yīng)混合物(Vt＝110μl)。攪拌(渦旋)和孵育10分鐘后，將混合物轉(zhuǎn)移至1ml管(Ringer管)中并用強(qiáng)磁鐵(MPC-S，Dynal，Compiegne，F(xiàn))磁化5分鐘。通過(guò)吸出液體將粘在管壁的珠子干燥并用100μl洗滌溶液重懸浮。具有合適特性的洗滌溶液使與珠子僅通過(guò)非共價(jià)相互作用(雜交但沒(méi)有連接)而相連的產(chǎn)物選擇性分離，但沒(méi)有分離共價(jià)結(jié)合的探針和SA-FF。重復(fù)該洗滌兩次。
最終將珠子稀釋于1ml稀釋緩沖液中(PBS-吐溫20)，轉(zhuǎn)移至用于細(xì)胞計(jì)量的管中(4ml)并通過(guò)FCM分析。
4.結(jié)果a)在不能被系統(tǒng)識(shí)別的PCR產(chǎn)物存在下(這種情況下，產(chǎn)物源自野生型等位基因P2Y12基因的擴(kuò)增，使用GenecolorTMP2Y12G52T試劑盒的試劑來(lái)生產(chǎn)，BioCytex，Marseilles，F(xiàn))，2種珠子中的每種給予了與其固有背景噪音(BN)相似的標(biāo)記，實(shí)踐中(圖40)；·μS-FVwt的數(shù)量125·μS-FVmut的數(shù)量15b)在對(duì)應(yīng)于因子V基因野生型等位基因的PCR產(chǎn)物存在下(FVwt，用GenecolorTM因子V Leiden試劑盒的試劑進(jìn)行PCR，BioCytex，Marseilles，F(xiàn))，μS-FVwt珠子顯示了明顯的正標(biāo)記，而μS-FVmut珠子給予了與其固有背景噪音相似的標(biāo)記，實(shí)踐中(圖41和42)·μS-FVwt的數(shù)量2222·μS-FVmut的數(shù)量294c)在對(duì)應(yīng)于因子V基因突變等位基因的PCR產(chǎn)物存在下(FVmut，用GenecolorTMFV Leiden試劑盒的試劑進(jìn)行PCR，BioCytex，Marseilles，F(xiàn))，μS-FVmut珠子顯示了明顯不同于BN的標(biāo)記，對(duì)應(yīng)于用可獲得原料可能的最大正信號(hào)水平，而μS-FVmut珠子給予了與其固有背景噪音相似的標(biāo)記。實(shí)踐中(圖43至44)·μS-FVwt的數(shù)量32·μS-FVmut的數(shù)量600下表總結(jié)了因子V Leiden突變雙重FCM分析的結(jié)果，并顯示了FV基因型的確定是簡(jiǎn)單的并可以在單管中進(jìn)行。

序列表序列表<110>佰賽泰克斯公司<120>多重分析<130>D21243<150>FR 03/06 354<151>2003-05-26<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>34<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>捕獲探針<220>
<221>混雜-結(jié)合<222>(1)..(1)<223>/注＝″包括氨基和含有6個(gè)碳原子的碳鏈的間隔″<400>1tttttttttt ttggacaaaa tacctgtatt cctc 34<210>2<211>37<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>捕獲探針<220>
<221>混雜-結(jié)合<222>(1)..(1)<223>/注＝″包括氨基和含有6個(gè)碳原子的碳鏈的間隔″<400>2tttttttttt ttaatagcac tgggagcatt gaggctc 37<210>3<211>30<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>混雜-結(jié)合
<222>(1)..(1)<223>/注＝″包括氨基和含有6個(gè)碳原子的碳鏈的間隔″<220>
<221>修飾-堿基<222>(30)..(30)<223>/修飾-堿基＝胸腺嘧啶/注＝″生物素結(jié)合在T上″<400>3tttttttttt tttttttttt tttttttttt 30<210>4<211>22<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>捕獲探針<220>
<221>修飾-堿基<222>(1)..(1)<223>/修飾-堿基＝鳥(niǎo)嘌呤/注＝″熒光素結(jié)合在G上″<400>4gaggaataca ggtattttgt cc 22<210>5<211>25<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>捕獲探針<220>
<221>修飾-堿基<222>(1)..(1)<223>/修飾-堿基＝鳥(niǎo)嘌呤/注＝″熒光素結(jié)合在G上″<400>5gagcctcaat gctcccagtg ctatt25<210>6<211>34<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>捕獲探針<220>
<221>混雜-結(jié)合<222>(1)..(1)
<223>/注＝″包括氨基和含有6個(gè)碳原子的碳鏈的間隔″<400>6tttttttttt ttggacaaaa tacctgtatt cctt 34<210>7<211>21<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>捕獲探針<220>
<221>修飾-堿基<222>(1)..(1)<223>/修飾-堿基＝鳥(niǎo)嘌呤/注＝″G上的磷酸基因″<220>
<221>修飾-堿基<222>(21)..(21)<223>/修飾-堿基＝胞嘧啶/注＝″熒光素結(jié)合在C上″<400>7gcctgtccag ggatctgctc c21<210>8<211>39<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>觀察探針<220>
<221>修飾堿基<222>(1)..(1)<223>/修飾-堿基＝鳥(niǎo)嘌呤/注＝″G上的磷酸基因″<220>
<221>修飾-堿基<222>(39)..(39)<223>/修飾-堿基＝胸腺嘧啶/注＝″生物素結(jié)合在T上″<400>8gcctgtccag ggatctgctc cttttttttt ttttttttt 39
權(quán)利要求
1.使用功能化的非磁性微球體檢測(cè)和/或多重定量樣品中含有的分析物的方法，其中適當(dāng)?shù)乜梢杂脴?biāo)記預(yù)先對(duì)所述分析物進(jìn)行標(biāo)記，所述方法的特征在于包括以下步驟a)使所述樣品接觸功能化非磁性微球體群的懸浮液，所述微球體在其表面攜帶-對(duì)于所有的微球體群，形成結(jié)合對(duì)第一種成分的化合物A，所述化合物A的特征還在于不與所述分析物結(jié)合；-對(duì)于每種微球體群，對(duì)每群不同的化合物B，能夠與樣品中所述分析物中的一種形成特異性結(jié)合對(duì)，b)將鐵磁流體加入步驟a)中所獲得的反應(yīng)介質(zhì)中，該鐵磁流體含有在其表面攜帶能夠與化合物A形成特異性結(jié)合對(duì)的第二種結(jié)合成分的磁性顆粒，c)至少一個(gè)通過(guò)步驟b)中磁化微球體磁分離的洗滌步驟，d)其中適當(dāng)?shù)?，?dāng)所述分析物預(yù)先沒(méi)有標(biāo)記時(shí)，使步驟c)中所獲得的磁化微球體懸浮液接觸至少一種綴合物的溶液，所述綴合物包括能夠識(shí)別和特異性結(jié)合一種所述分析物和標(biāo)記的化合物C，該步驟d)優(yōu)選接著至少一個(gè)通過(guò)磁分離洗滌微球體的步驟，e)檢測(cè)和/或定量微球體表面的所述標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，特征在于至少兩種所述微球體群還具有至少一種固有物理特性，該物理特性使其可以從另一種珠子中區(qū)分出來(lái)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，特征在于化合物A與結(jié)合于鐵磁流體表面的第二種成分之間形成的所述結(jié)合對(duì)優(yōu)選選自以下的特異性結(jié)合對(duì)生物素/抗生物素蛋白或生物素/鏈霉抗生物素，酶/輔因子，植物凝集素/碳水化合物或抗體/半抗原型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一的方法，特征在于構(gòu)成微球體的原料選自乳膠、聚合物、共聚物、玻璃或硅石。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一的方法，特征在于標(biāo)記是熒光。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一的方法，特征在于方法步驟e)中所述標(biāo)記的檢測(cè)和/或定量是通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)進(jìn)行的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，特征在于所述的使其可以區(qū)分至少2種微球體群的固有物理特性是所述微球體的大小和/或光學(xué)特性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一的方法，特征在于微球體具有0.3至100μm大小的直徑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，特征在于光學(xué)特性是所述微球體的發(fā)射波長(zhǎng)和/或熒光強(qiáng)度。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一的方法，特征在于所述分析物是蛋白質(zhì)和衍生物型，或是核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一的方法，特征在于所述分析物可以是存在于液體懸浮液中的化合物，或存在于細(xì)胞表面或樣品懸浮液中的顆粒表面上的化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一的方法，特征在于所述化合物是蛋白質(zhì)毒素，或其中所述細(xì)胞或顆粒是微生物，如細(xì)菌或病毒。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一的方法，特征在于所述化合物B選自蛋白質(zhì)和核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一的方法，特征在于用于步驟d)中使用的所述綴合物的所述化合物C選自蛋白質(zhì)和核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一的方法，特征在于所述分析物是核酸，且其中步驟a)中，化合物B是能夠與一種所述分析物特異性雜交的核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，特征在于所述分析物是PCR產(chǎn)物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，特征在于所述PCR產(chǎn)物獲得了標(biāo)記。
18.根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法，特征在于所述綴合物的所述化合物C是能夠與一種所述分析物特異性雜交的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18方法的用途，用于檢測(cè)和/或多重定量SNP。
20.根據(jù)權(quán)利要求19方法的用途，特征在于SNP的檢測(cè)和/或多重定量是通過(guò)OLA方法進(jìn)行的。
21.檢測(cè)和/或多重定量樣品中含有的分析物的試劑盒，特征在于其包括a)試劑1，包括功能化非磁性微球體群的懸浮液，所述微球體在其表面攜帶-形成結(jié)合對(duì)第一種成分的化合物A；-能夠與樣品中所述分析物的一種形成特異性結(jié)合的化合物B，b)試劑2，包括鐵磁流體，其含有在其表面攜帶能夠與所述化合物A形成特異性結(jié)合對(duì)的第二種結(jié)合成分的磁性顆粒，c)試劑3，包括至少一種綴合物的溶液，所述綴合物包括能夠與所述分析物特異性反應(yīng)的化合物C和能夠檢測(cè)到的標(biāo)記。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的試劑盒，特征在于還包括-試劑4，包括包含于樣品中的所述分析物。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的試劑盒，特征在于還包括-試劑5，由稀釋緩沖液構(gòu)成；-試劑6，由洗滌緩沖液構(gòu)成。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23任一的試劑盒，特征在于還包括-試劑7，包括平衡各種微球體聚集的緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用功能化的微球體檢測(cè)和多重定量樣品中分析物的方法，其中所述微球體是在與樣品接觸后磁化的。本發(fā)明的方法尤其適于通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)檢測(cè)和多重定量數(shù)種分析物。本發(fā)明還涉及為了進(jìn)行本發(fā)明的方法，用于檢測(cè)和/或定量數(shù)種分析物的試劑盒，該試劑盒包括功能化非磁性微球體的懸浮液、鐵磁流體和至少一種綴合物的溶液。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1820201SQ200480019376
公開(kāi)日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2004年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月26日
發(fā)明者G·阿凱特, P·蓬斯萊, M·穆拉爾, M·康東 申請(qǐng)人:佰賽泰克斯公司