專利名稱：生物分子檢測元件和利用它分析核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)學(xué)，特別是遺傳檢查領(lǐng)域的技術(shù)，如遺傳學(xué)診斷，DNA序列分析，和基因多形性分析。具體地講，本發(fā)明涉及適合同時(shí)精確地分析多個(gè)不同核酸的生物分子檢測元件，并且涉及使用所述元件分析核酸的方法。
背景技術(shù)：
隨著可以閱讀的諸如人類基因組的各種活有機(jī)體的基因組序列的速度的快速加快，業(yè)已積累了大量的堿基序列數(shù)據(jù)。從現(xiàn)在起可以預(yù)見，將會(huì)澄清基因在活的有機(jī)體中的功能，并且將在多種領(lǐng)域在與基因相關(guān)的技術(shù)中取得重大進(jìn)步，如多種疾病的診斷，藥物開發(fā)，和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)品種的改良。新的領(lǐng)域的上述發(fā)展將取決于基因表達(dá)和功能數(shù)據(jù)，以及堿基序列數(shù)據(jù)。作為用于進(jìn)行大規(guī)?；蚬δ芎捅磉_(dá)分析，以便能夠進(jìn)行基因表達(dá)的技術(shù)。例如，Affymetrix有限公司和Nanogen有限公司業(yè)已開發(fā)出了DNA芯片或DNA微陣列。不過，很多現(xiàn)有的DNA芯片或DNA微陣列的基本原理是基于對(duì)熒光的檢測，因此它們需要激光或復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，導(dǎo)致了該系統(tǒng)尺寸和成本的增加。
為了解決上述問題，業(yè)已報(bào)導(dǎo)了現(xiàn)有檢測類型的若干DNA芯片，其中，組合使用了氧化還原標(biāo)記。例如，Clinical Micro Sensors有限公司業(yè)已開發(fā)了一種系統(tǒng)，其中，將被稱為分子導(dǎo)線的分子的一端固定在金屬電極上，并且將DNA探針結(jié)合在它的另一端?；谂c靶基因的雜交的電子在氧化還原標(biāo)記和所述金屬電極之間的轉(zhuǎn)移是以電流變化形式檢測的，從而檢測所述靶基因(Nature Biotechnology，vol.16，(1998)，p.27 and p.40)。
非專利文獻(xiàn)1Nature Biotechnology，vol.16，(1998)，p.27和p.40發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問題很多現(xiàn)有的DNA芯片/DNA微陣列以基于對(duì)熒光的檢測為基本原理，它們需要激光或復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，導(dǎo)致了該系統(tǒng)尺寸和成本的增加。另外，一般，目前所開發(fā)的DNA芯片/DNA微陣列在使用一次之后就要丟棄。如果它們是可以洗滌和再利用的話，它們最多可以使用兩次或三次。其結(jié)果是，在涉及很多樣品或涉及很多樣本的基因診斷的分析領(lǐng)域，高的運(yùn)行成本的問題是無法忽視的。特別是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，昂貴的檢查的普遍使用從降低成本的角度考慮是不理想的。另一方面，在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，即基因診斷領(lǐng)域，需要高水平的精度和定量。因此，存在可滿足成本降低和高精度標(biāo)準(zhǔn)的需求。
由于上述電化學(xué)檢測方法不需要昂貴的激光或復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，與基于熒光檢測方法的系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)能夠縮小尺寸并且降低成本。不過，作為基本檢測原理，該方法是基于在金屬電極上進(jìn)行的氧化還原反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，如果在樣品中存在氧化物質(zhì)或還原物質(zhì)(如抗壞血酸)，基于氧化或還原流的電流會(huì)妨礙基因檢測，并且會(huì)降低檢測精度。另外，電流的測定與在金屬電極上進(jìn)行的電極反應(yīng)的進(jìn)展相關(guān)。因?yàn)樗鲭姌O反應(yīng)是不可逆轉(zhuǎn)的，并且構(gòu)成了不平衡的反應(yīng)，發(fā)生了對(duì)所述電極的腐蝕，并且產(chǎn)生了氣體，例如。其結(jié)果是，電流測定的穩(wěn)定性受到了負(fù)面影響，并且特別是在重復(fù)測定時(shí)降低了檢測精度。
因此，本發(fā)明的目的是提供能夠以低運(yùn)行成本進(jìn)行高精度測定的廉價(jià)的DNA芯片/DNA微陣列系統(tǒng)。
解決問題的方式根據(jù)本發(fā)明，將包括活體相關(guān)的物質(zhì)，如核酸的探針固定在金屬表面上，該金屬是與場效應(yīng)晶體管的柵極電連接的，然后在所述金屬表面上形成了與目標(biāo)物質(zhì)形成的絡(luò)合物，此時(shí)利用場效應(yīng)檢測表面電荷密度的變化。除了由所述活體相關(guān)的物質(zhì)所攜帶的電荷之外，導(dǎo)入嵌入劑或?qū)⑺鼋j(luò)合物與帶電荷的顆粒如離子結(jié)合，以便表面電荷密度的改變量可以加大，并且可以用大的S/N比例檢測表面電荷電位的改變。
同時(shí)，近年來，無線通信技術(shù)業(yè)已取得了顯著進(jìn)步，并且業(yè)已開發(fā)出了無線通信芯片，其中，整合了等同于條形碼的標(biāo)記。在該技術(shù)中，可以識(shí)別獨(dú)立的無線通信芯片，并且正考慮將它們用作流通管理芯片。在將這種標(biāo)記過的無線通信芯片用作DNA芯片時(shí)，它必須具有低的功耗，因?yàn)殡娏κ且詿o線形式輸送的。比電流測量系統(tǒng)消耗更少能量的電壓測量系統(tǒng)因此適合基于無線通信的DNA芯片。
本發(fā)明提供了生物分子檢測元件，包括具有包埋在絕緣薄膜中的柵電極的絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管；在所述絕緣薄膜的表面上形成的，并且具有固定在它上面的生物分子探針的固定探針的電極；和用于將所述柵電極和所述固定探針的電極電連接在一起的連接線，其中，所述固定探針的電極上的固定所述生物分子探針的部位位于遠(yuǎn)離緊靠所述柵電極的上方的地方。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述固定探針的電極從緊靠所述柵電極的上方沿所述絕緣薄膜的膜表面延伸到固定所述生物分子探針的部位，其中，連接線與緊靠所述柵電極上方的所述固定探針的電極連接。在另一種實(shí)施方案中，所述固定探針的電極安裝在遠(yuǎn)離緊靠所述柵電極的上方的地方，并且，所述連接線沿所述薄膜表面安裝在所述絕緣薄膜內(nèi)。
所述生物分子探針可以包括核酸，多核苷酸，或合成的寡核苷酸。所述生物分子探針的一端固定在所述固定探針的電極的表面上，并且能與樣品中的活體相關(guān)的物質(zhì)專一性地結(jié)合和/或反應(yīng)。所述生物分子探針可以包括單鏈探針，并且相對(duì)探針和互補(bǔ)鏈之間的專一性結(jié)合的檢測靈敏度可以通過在經(jīng)由所述專一性結(jié)合形成的雙鏈部分放入嵌入劑而增強(qiáng)。所述固定探針的電極可以包括金，鉑，鈀，鈦，鉻，鋁，多晶硅，鉭或鉬中的一種或這些材料的組合?？梢栽谒鼋^緣薄膜上形成發(fā)射/接收天線。
本發(fā)明還提供了生物分子檢測元件，包括多個(gè)絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管，各自具有包埋在公用絕緣薄膜中的柵電極；在所述絕緣薄膜的表面上形成的，并且具有固定在它上面的生物分子探針的多個(gè)固定探針的電極；和用于將所述多個(gè)絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管所述柵電極的每一個(gè)和所述多個(gè)固定探針的電極電連接在一起的多個(gè)連接線，其中，所述固定探針的電極上固定所述生物分子探針的部位位于遠(yuǎn)離緊靠所述柵電極的上方的地方?？梢栽诠媒^緣薄膜中形成發(fā)射/接收天線。優(yōu)選的是，還提供了計(jì)算電路、存儲(chǔ)電路、接收電路、發(fā)射電路和電源電路。在這種場合下，所述電源電路優(yōu)選將通過所述天線接收的電磁波轉(zhuǎn)化成電能，并且將電能提供給每一個(gè)部分。上述電路可以通過現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)。
本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的生物分子檢測元件分析核酸的方法，包括以下步驟將單鏈核酸探針作為生物分子探針固定在所述固定探針的電極上；將包含至少一種核酸的樣品溶液導(dǎo)至所述生物分子檢測元件，并且與所述單鏈核酸探針進(jìn)行雜交；將洗滌液導(dǎo)至所述生物分子檢測元件，并且除掉所述生物分子檢測元件上的未反應(yīng)的核酸；將嵌入劑溶液導(dǎo)至所述生物分子檢測元件，并且讓它與業(yè)已成為雙鏈的核酸起反應(yīng)；將洗滌液導(dǎo)至所述生物分子檢測元件，并且除掉所述生物分子檢測元件上的未反應(yīng)的嵌入劑；和將緩沖溶液導(dǎo)至所述生物分子檢測元件，并且測定所述絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管的輸出值。
本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的本發(fā)明的生物分子檢測元件分析核酸的方法，包括以下步驟將多個(gè)生物分子檢測元件和緩沖溶液放入反應(yīng)容器，所述元件包括上面固定了多種不同類型的單鏈核酸探針作為生物分子探針的所述固定探針的電極；并且使用外部接收器接收來自每一個(gè)所述生物分子檢測元件的信號(hào)；將包含至少一種核酸的樣品溶液導(dǎo)入所述反應(yīng)容器，并且與所述單鏈核酸探針進(jìn)行雜交；將嵌入劑溶液導(dǎo)入所述反應(yīng)容器，并且讓它與業(yè)已成為雙鏈的核酸起反應(yīng)；和使用外部接收器接收來自每一個(gè)所述生物分子檢測元件的信號(hào)。
本發(fā)明的效果本發(fā)明的生物分子檢測元件不需要昂貴的激光器或復(fù)雜的光學(xué)檢測系統(tǒng)。由于本發(fā)明的生物分子檢測元件是基于對(duì)穩(wěn)態(tài)表面電位的檢測，與基于電流檢測(測量電流的)的系統(tǒng)不同，不存在因?yàn)榛g或氣體產(chǎn)生，或由于氧化和/或還原物質(zhì)的干擾導(dǎo)致的信號(hào)值不穩(wěn)定性的問題。因此，可以高度精確和穩(wěn)定地進(jìn)行生物學(xué)材料的檢測。
附圖的簡要說明

圖1表示采用本發(fā)明的場效應(yīng)晶體管和浮動(dòng)?xùn)烹姌O的生物分子檢測晶體管。
圖2表示采用本發(fā)明的生物分子檢測晶體管的基因檢測電路。
圖3表示組合了本發(fā)明的生物分子檢測晶體管和嵌入劑的系統(tǒng)。
圖4表示如何整合本發(fā)明的生物分子檢測晶體管和天線。
圖5表示本發(fā)明的生物分子檢測晶體管和天線的平面布置。
圖6表示整合了本發(fā)明的生物分子檢測晶體管和無線通信芯片的系統(tǒng)。
圖7表示采用了本發(fā)明的生物分子檢測晶體管的基因分析系統(tǒng)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行說明。下面，將DNA用作生物分子的例子。
實(shí)施方案1圖1示意性地表示本發(fā)明的生物分子檢測元件(生物分子檢測晶體管)的剖視圖。
絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管是通過在硅基片1的表面上形成柵絕緣薄膜2，源極3，和漏極4，并且在所述源極和漏極之間的柵絕緣薄膜上配置柵電極5而產(chǎn)生的。在柵電極5的表面上還形成了絕緣薄膜，以便柵電極5包埋在絕緣薄膜2內(nèi)。在絕緣薄膜2上形成通孔，用導(dǎo)電材料形成引出電極6，并且使其以與柵電極5電接觸的方式放置。還在所述柵絕緣薄膜上形成了浮動(dòng)電極7，并且使其以與引出電極6電接觸的方式放置。將DNA探針8固定在浮動(dòng)電極7的表面上。由此生產(chǎn)的基因晶體管在使用時(shí)與參考電極9一起浸泡在樣品溶液10中。
柵絕緣薄膜是由二氧化硅(SiO2)，氮化硅(SiN)，氧化鋁(Al2O3)，或氧化鉭(Ta2O5)，單獨(dú)或組合構(gòu)成的。通常，為了確保令人滿意的晶體管工作，讓氮化硅(SiN)，氧化鋁(Al2O3)，或氧化鉭(Ta2O5)在二氧化硅(SiO2)上成層，以便產(chǎn)生雙層結(jié)構(gòu)。柵電極5的材料優(yōu)選是多晶硅，因?yàn)樗峁┝伺c所謂自調(diào)整工藝的良好的兼容性，其中，所述源極和漏極是通過多晶硅柵極離子注射形成的。例如，將引出電極6用作導(dǎo)線的一部分，并因此優(yōu)選用具有低電阻和良好的蝕刻加工能力的材料制成。其例子包括多晶硅、鋁和鉬。與樣品溶液直接接觸的浮動(dòng)電極7優(yōu)選是用化學(xué)上高度穩(wěn)定的并且表現(xiàn)出穩(wěn)定電位的材料制成，并且，它對(duì)固定所述浮動(dòng)電極的生物學(xué)材料具有高親和力。例子包括貴金屬，如金，鉑，銀，和鈀。所述引出電極和浮動(dòng)電極可以用相同的材料，如金，通過使用用于成型浮動(dòng)電極的圖案形成方法，如搬走(liftoff)方法制成。
根據(jù)本實(shí)施方案的所述生物分子檢測晶體管，消除了將DNA探針8固定在晶體管的源極和漏極之間的通道上的必要性，因此，DNA探針8可以通過延長浮動(dòng)電極7或引出電極6在芯片上的任何位置形成，參見圖1。結(jié)果，例如，與所述樣品溶液接觸的DNA探針8的形成部位和形成電路的所述晶體管的部位可獨(dú)立地分布在所述芯片上，這使得可以進(jìn)行高度可靠地測定。通常，在用于生物學(xué)分子檢測目的的芯片中，必須分別固定不同的生物分子。為此，所述生物分子檢測芯片的尺寸比常規(guī)半導(dǎo)體芯片的尺寸大，并且生物分子檢測芯片甚至還做得像載玻片那么大(26mm×76mm)。盡管出于降低價(jià)格的考慮，優(yōu)選將本發(fā)明的生物分子檢測晶體管設(shè)計(jì)成具有大約5mm見方的小的尺寸，但本發(fā)明的構(gòu)思可應(yīng)用于其尺寸大約為載玻片的尺寸的芯片。
使用寡核苷酸片段或cDNA，DNA探針(生物分子探針)8通常包括不超過300個(gè)堿基。在使用寡核苷酸時(shí)，所述核酸片段的長度優(yōu)選不超過80個(gè)堿基，例如，為了將DNA探針8固定在浮動(dòng)?xùn)烹姌O7的表面上，用氨基(NH2基團(tuán))，硫醇基(SH基團(tuán))，或生物素對(duì)所述DNA探針的一端進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，在使用用氨基修飾的DNA探針時(shí)，用氨基丙基乙氧基硅烷或聚賴氨酸對(duì)所述柵電極的表面進(jìn)行化學(xué)修飾，以便將氨基基團(tuán)導(dǎo)入所述柵極表面。然后將用氨基通過與戊二醛或亞苯基二異氰酸酯(PDC)起反應(yīng)而進(jìn)行化學(xué)修飾的DNA探針固定在所述柵極表面上。當(dāng)用硫醇基進(jìn)行化學(xué)修飾的DNA探針被固定在所述柵電極表面上時(shí)，將金用作所述柵電極，并且利用硫醇基和金之間的親和力對(duì)所述DNA探針進(jìn)行固定。另外，在固定用生物素進(jìn)行化學(xué)修飾的所述DNA探針時(shí)，將抗生物素蛋白鏈菌素導(dǎo)至所述柵電極表面上，并且利用生物素和抗生物素蛋白鏈菌素之間的親和力將所述DNA探針固定在所述柵表面上。當(dāng)在實(shí)踐中固定所述DNA探針時(shí)，將含有所述DNA探針的溶液滴加或單獨(dú)點(diǎn)在所述浮動(dòng)電極表面上。
為了穩(wěn)定地測定在所述生物分子檢測晶體管的所述柵電極表面上發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)而導(dǎo)致的電位改變，安裝參考電極9，由它提供電位測量的參考。參考電極通常是通過將銀/氯化銀電極或光敏電極浸泡在具有預(yù)定組成和濃度的內(nèi)在溶液中制備的。由于所述工作點(diǎn)是通過改變所述生物分子檢測晶體管的電學(xué)特征進(jìn)行調(diào)整的，可以在參考電極9上施加預(yù)定的電壓。
如果在包含要測定的靶基因的所述樣品中有多個(gè)基因，并且固定在所述生物分子檢測晶體管的柵極上的DNA探針具有互補(bǔ)于靶基因的堿基序列的話，所述靶基因和DNA探針能在合適的反應(yīng)條件下雜交并形成絡(luò)合物。在用于反應(yīng)的緩沖溶液的合適pH條件下，DNA是帶負(fù)電荷的。因此，通過雜交形成的絡(luò)合物導(dǎo)致了靠近FET的柵極的電荷密度的變化，這種變化導(dǎo)致了所述柵極表面電位的改變。這種改變產(chǎn)生等同于在FET上的柵電壓改變的作用，由此發(fā)生通道導(dǎo)電性變化。因此，所述絡(luò)合物的形成，即所述靶基因的存在，可以經(jīng)由通過源極3和漏極4的漏極電流的變化進(jìn)行檢測。
例如，基因分析是使用本實(shí)施方案所述生物分子檢測晶體管按照以下方法進(jìn)行的，例如，首先，將本發(fā)明的生物分子檢測晶體管和0.5ml的緩沖溶液放入反應(yīng)容器，并且測定晶體管信號(hào)。然后按以下步驟(a)-(e)進(jìn)行基因分析。
(a)將包含至少一種類型DNA的樣品溶液導(dǎo)入反應(yīng)容器，并且在預(yù)定溫度下讓所述DNA與導(dǎo)電電極上的單鏈DNA探針雜交。
(b)將洗滌液導(dǎo)入反應(yīng)容器，并且除掉所述基片上的未反應(yīng)的DNA。
(c)將嵌入劑溶液導(dǎo)入反應(yīng)容器，并且讓它與業(yè)已成為雙鏈的DNA起反應(yīng)。
(d)將洗滌液導(dǎo)入反應(yīng)容器，并且除掉所述基片上的未反應(yīng)的嵌入劑。
(e)將緩沖溶液導(dǎo)入反應(yīng)容器，并且測定所述絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管的輸出值。
為了簡化和加快所述測定，可以跳過步驟(b)和(d)。
實(shí)施方案2圖2示意性地表示基因檢測系統(tǒng)，其中使用了根據(jù)第一種實(shí)施方案所述的所述生物分子檢測晶體管。在該系統(tǒng)中，除了圖1所示生物分子檢測晶體管11之外，還使用了參考晶體管12，并且使用兩個(gè)晶體管進(jìn)行差動(dòng)式測量。
在所述生物分子檢測晶體管的柵極表面上固定了其堿基序列與樣品中的靶基因的堿基序列互補(bǔ)的DNA探針8。另一方面，在所述參考晶體管的柵極表面上，固定了其堿基序列不同于所述靶基因的互補(bǔ)堿基序列的DNA探針13。為了穩(wěn)定地測定所述生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管的表面電位，提供了參考電極9，作為電位測量的參考。所述所述生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管的表面電位是通過驅(qū)動(dòng)電路14測定的，并且通過差動(dòng)式測量電路15將測量信號(hào)反饋給信號(hào)處理電路16。
通過由此進(jìn)行的差動(dòng)式測量，隨著環(huán)境溫度或光學(xué)條件的變化而變化的晶體管的不同的電學(xué)特征導(dǎo)致的輸出值的變化可以得到補(bǔ)償。另外，還可以補(bǔ)償由于樣品中帶電荷的顆粒在所述柵上的非專一性吸收而導(dǎo)致的輸出值的改變，從而使得由于靶基因和DNA探針本身之間的雜交而產(chǎn)生的輸出的變化能夠以高精確度排他性地檢測到。
所述生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管理想的是具有相同的電學(xué)特征。因此，優(yōu)選使用整合在相同基片上的一對(duì)晶體管。當(dāng)多個(gè)生物分子檢測晶體管被整合，以便同時(shí)測定多個(gè)基因時(shí)，所述參考晶體管可以是共用的。在這種場合下，將不同的生物分子檢測晶體管和共同的參考晶體管用于差動(dòng)式測量。
實(shí)施方案3圖3示意性地表示采用圖1所示生物分子檢測晶體管的測量系統(tǒng)的另一種例子的剖視圖。在該測量系統(tǒng)中，整合了三個(gè)FETs。將第一生物分子檢測晶體管17用于檢測第一靶基因。將第二晶體管18用于檢測所述第二靶基因。將第三晶體管19用作所述參考晶體管。在所述第一和第二生物分子檢測晶體管的所述柵電極上，分別固定了具有互補(bǔ)于所述第一和所述第二基因的堿基序列的DNA探針。在參考參考FET的所述柵電極的表面上固定了具有不同于所述第一或第二基因的互補(bǔ)堿基序列的堿基序列的DNA探針。
圖3所述狀態(tài)是這樣的，其中，僅含有所述第一基因的樣品溶液業(yè)已導(dǎo)入上述集成晶體管，并且與所述靶基因雜交，然后添加嵌入劑。所述第一基因只能與第一生物分子檢測晶體管17的DNA探針雜交，以便形成雙鏈。嵌入劑20只能與所述雙鏈DNA本身反應(yīng)并且與它結(jié)合，不能結(jié)合單鏈DNA。由于所述嵌入劑帶電荷，所述第一生物分子檢測晶體管17本身的表面電荷密度發(fā)生了改變，導(dǎo)致其輸出信號(hào)的改變。所述第二生物分子檢測晶體管18和參考晶體管19的表面電荷密度沒有改變，因此它們的輸出信號(hào)沒有變化。因此，通過在所述第一生物分子檢測晶體管17和參考晶體管19之間，以及在所述第二生物分子檢測晶體管18和所述參考晶體管19之間進(jìn)行差動(dòng)式測量，只有前者的輸出信號(hào)會(huì)發(fā)生改變，從而可以檢測所述第一靶基因。例如，作為嵌入劑可以使用溴化乙錠，Hoechst33258，或PicoGreen。
下面將說明測量的一種例子。已知醇脫氫酶-相關(guān)基因具有單一核苷酸多形性(SNPs)。合成了長度為17個(gè)堿基的第一和第二DNA探針，它們各自包括位于SNP位點(diǎn)前面的8個(gè)堿基和位于該位點(diǎn)后面的8個(gè)堿基所述堿基序列如下第一DNA探針5’-CATACACTAAAGTGAAA-3’(SEQ ID NO1)第二DNA探針5’-CATACACTGAAGTGAAA-3’(SEQ ID NO2)從5’末端算起的第九個(gè)位點(diǎn)是SNP位點(diǎn)，對(duì)于所述第一DNA探針來說該位點(diǎn)是A，而對(duì)于所述第二探針來說該位點(diǎn)是G。將所述第一和第二DNA探針固定在浮動(dòng)電極上，浮動(dòng)電極分別與所述第一和第二晶體管的柵極連接。為了固定DNA探針，用硫醇基對(duì)DNA探針的5’-末端進(jìn)行修飾。在本實(shí)施方案中，與所述FET的柵極連接的浮動(dòng)電極包括金浮動(dòng)電極，在它的表面上固定了上述DNA探針。在與所述參考晶體管的柵極連接的浮動(dòng)電極上，合成并且固定了其序列不同于所述第一或第二DNA探針的序列的DNA探針，即長度為17個(gè)堿基的僅僅由A組成的DNA探針?；蛘?，沒有在與所述參考晶體管的柵極連接的浮動(dòng)電極上固定DNA探針。
作為樣品，從血液中的白血細(xì)胞中提取人類基因組，并且擴(kuò)增了包括上述SNP位點(diǎn)的長度為100個(gè)堿基的片段。然后，將該片段導(dǎo)入所述第一和第二生物分子檢測晶體管以及所述參考晶體管，然后在45℃下進(jìn)行雜交8個(gè)小時(shí)。在雜交之后，用緩沖液進(jìn)行洗滌，以便除掉未反應(yīng)的樣品，然后導(dǎo)入嵌入劑。為了測量，將緩沖溶液導(dǎo)入所述第一和第二生物分子檢測晶體管以及所述參考晶體管，并且測定每一個(gè)晶體管的輸出電壓，測量所述第一生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管之間的差分輸出，以及所述第二生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管之間的差分輸出。然后，導(dǎo)入所述樣品，隨后進(jìn)行雜交和洗滌。然后將Hoechst 33258作為嵌入劑導(dǎo)入，并且測定每一個(gè)晶體管的輸出電壓，測量所述第一生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管之間的差分輸出，以及所述第二生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管之間的差分輸出。這樣，測定了在導(dǎo)入所述樣品和嵌入劑之前和之后的輸出電壓的變化。
測量結(jié)果如下對(duì)于具有對(duì)應(yīng)于所述第一DNA探針的堿基序列的堿基序列的樣品(正常)來說，在導(dǎo)入所述樣品溶液之后和在導(dǎo)入嵌入劑之后，所述第一生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管之間的差分輸出分別為15.0mV和-12.0mV。因?yàn)樗鋈芤褐械腄NA是帶負(fù)電荷的，n-通道FET的輸出是向正方向偏移的。另一方面，由于在所述溶液中所述嵌入劑是帶正電荷的，所述FET的輸出是向負(fù)方向偏移的。在導(dǎo)入所述樣品溶液之后和在導(dǎo)入嵌入劑之后，所述第二生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管之間的差分輸出分別為1.5mV和-0.5mV，因此表明了顯著差異。所述嵌入劑只能與雙鏈DNA起反應(yīng)，并且具有與所述DNA相反的電荷，因此，所述嵌入劑不會(huì)對(duì)非專一性吸附在所述浮動(dòng)電極上的單鏈DNA作出反應(yīng)。因此，可以明確區(qū)分由于所述單鏈DNA的非專一性吸附所產(chǎn)生的信號(hào)和由于基于雙鏈DNA的雜交所產(chǎn)生的信號(hào)。
對(duì)于具有對(duì)應(yīng)于所述第二DNA探針的堿基序列的堿基序列的樣品(突變體)來說，在導(dǎo)入所述樣品溶液之后和在導(dǎo)入嵌入劑之后，所述第一生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管之間的差分輸出分別為2.3mV和0.7mV。另一方面，所述第二生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管之間的差分輸出分別為11.0mV和-8.0mV，因此同樣表明了顯著差異。
對(duì)于具有所述第一DNA探針的一半堿基序列和具有所述第二DNA探針的一半堿基序列的樣品(異型)來說，在導(dǎo)入所述樣品溶液之后和在導(dǎo)入嵌入劑之后，所述第一生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管之間的差分輸出分別為6.5mV和-4.8mV。另一方面，所述第二生物分子檢測晶體管和所述參考晶體管之間的差分輸出分別為5.5mV和-4.5mV，因此表現(xiàn)出了幾乎為1∶1的比例。
因此，通過本發(fā)明的SNP分析，成功地鑒定了三種類型的樣品，即正常/正常同型，突變體/突變體同型，和正常/突變體異型。在使用嵌入劑時(shí)，沒有必要為了標(biāo)記目的將標(biāo)記化合物化學(xué)結(jié)合在所述樣品DNA上。
實(shí)施方案4圖4和5示意性地表示本發(fā)明所述生物分子檢測晶體管的另一種實(shí)施例。所述生物分子檢測晶體管等同于圖3所示的生物分子檢測晶體管，在它上面，業(yè)已在柵絕緣薄膜2上增加了發(fā)射/接收天線21。可以是在形成柵電極5的同時(shí)形成的天線21與包埋在芯片中的發(fā)射/接收電路的元件22連接。在本實(shí)施方案中，參考電極9是由Ti組成的，在它上面堆積了Pt，并且是直接在基片上形成的。
在本實(shí)施方案中，將引出電極6包埋在絕緣薄膜2中，并且在它里面擴(kuò)展，浮動(dòng)電極7在它的末端形成。圖5表示所述實(shí)施方案的平面示意圖。晶體管的源極3和漏極4，DNA探針8和13，以及天線21可以分別部署在所述芯片上。所述芯片表面上的唯一的暴露部分是浮動(dòng)電極7，而DNA探針8和13，以及絕緣薄膜2，并且所述晶體管部分和天線部分是通過絕緣薄膜2保護(hù)的。由所述生物分子檢測晶體管檢測的信號(hào)可以通過所述天線發(fā)送到外部接收器，用于信號(hào)加工。由于所述天線包埋在絕緣薄膜2中，它不會(huì)與所述樣品溶液直接接觸，所以所述天線不會(huì)因?yàn)槿芤憾艿礁g或者因?yàn)槲降鞍锥鴮?dǎo)致特征的改變。因此，所述生物分子檢測晶體管可能適合用于高度可靠的測量。
圖6表示一種實(shí)施例，其中，整合了本實(shí)施方案的生物分子檢測晶體管和具有無線通信功能的芯片。在大小為1mm見方的硅基片1上形成了所述生物分子檢測晶體管的源極3和漏極4，并且通過引出電極6連接的浮動(dòng)電極7和所述柵極。將DNA探針8固定在浮動(dòng)電極上。在該硅基片上，業(yè)已整合了天線21，計(jì)算電路23，存儲(chǔ)電路24，接收電路25，發(fā)射電路26，和電源電路27。如果在樣品中存在具有互補(bǔ)序列的靶DNA的話，它會(huì)與浮動(dòng)電極7上的DNA探針雜交形成雙鏈。通過場效應(yīng)晶體管檢測所述雙鏈的形成。在存儲(chǔ)電路24上保存有能夠?qū)⒁环N芯片基片與另一種芯片基片區(qū)分開的ID信息，例如，DNA探針序列信息，和編碼蛋白信息。這些信息，以及有關(guān)雜交反應(yīng)結(jié)果的信息通過天線和發(fā)射電路發(fā)送到外部接收裝置。從所述芯片外面發(fā)送的電磁波被所述天線接收，并且通過所述接收電路和電源電路轉(zhuǎn)化成足夠的電能，這些電能可以被所述芯片利用。然后將所述電能輸送給包括場效應(yīng)晶體管，發(fā)射電路，和存儲(chǔ)電路的獨(dú)立的元件，用于它們的工作。
在本實(shí)施方案中，由于識(shí)別每一個(gè)芯片的信息可與雜交的結(jié)果同時(shí)獲得，多個(gè)芯片可以在所述樣品中同時(shí)起反應(yīng)，參見圖7。首先，將本發(fā)明的生物分子檢測晶體管29和0.5ml的緩沖溶液放入反應(yīng)容器28，并且測量晶體管信號(hào)。將所述測量信號(hào)發(fā)送到外部接收器，然后按照以下步驟(a)-(f)進(jìn)行基因分析(a)將包含至少一種類型DNA的樣品溶液導(dǎo)入反應(yīng)容器，并且在預(yù)定溫度下進(jìn)行與導(dǎo)電電極上的單鏈DNA探針的雜交。
(b)將洗滌液導(dǎo)入反應(yīng)容器，并且除掉所述基片上未反應(yīng)的DNA。
(c)將嵌入劑溶液導(dǎo)入反應(yīng)容器，并且讓它與雙鏈DNA起反應(yīng)。
(d)將洗滌液導(dǎo)入反應(yīng)容器，并且除掉所述基片上未反應(yīng)的嵌入劑。
(e)將緩沖溶液導(dǎo)入反應(yīng)容器，并且測量所述絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管的輸出值。
(f)通過天線將輸出值發(fā)送到所述接收器。
通過上述兩次測量獲得的所述生物分子檢測晶體管的輸出值的差異構(gòu)成了來自通過雜交形成的雙鏈DNA的信號(hào)。為了測量來自所述生物分子檢測晶體管的信號(hào)，例如，在所述晶體管和安裝在外面的發(fā)射/接收裝置30之間使用13.56MHz的電磁波。通過參考保存在存儲(chǔ)電路中的信息，可以分析存在于樣品中的DNA的類型，它的形狀，以及它的序列。另外，由于本發(fā)明的芯片采用無線通信技術(shù)進(jìn)行發(fā)射/接收，并且用于提供電力，可以將所述芯片直接放入樣品進(jìn)行測量，而不需要任何存在于芯片和外部電路之間的導(dǎo)線。因此，可以制造成簡單的樣品測量系統(tǒng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，可以省略洗滌步驟(b)和(d)，并且，所有測量順序可以用浸沒在所述樣品溶液中的所述生物分子檢測晶體管完成。
權(quán)利要求
1.生物分子檢測元件，包括絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管，具有包埋在絕緣薄膜中的柵電極；在所述絕緣薄膜的表面上形成的，并且具有固定在它上面的生物分子探針的固定探針的電極；和用于將所述柵電極和所述固定探針的電極電連接在一起的連接線，其中，所述固定探針的電極上的固定所述生物分子探針的部位位于遠(yuǎn)離緊靠所述柵電極的上方的地方。
2.如權(quán)利要求1的生物分子檢測元件，其中，所述固定探針的電極從緊靠所述柵電極的上方的地方沿所述絕緣薄膜的薄膜表面延伸到固定所述生物分子探針的部位，其中，所述連接線與緊靠所述柵電極上方的固定探針的電極連接。
3.如權(quán)利要求1的生物分子檢測元件，其中，所述固定探針的電極安裝在遠(yuǎn)離緊靠所述柵電極的上方的地方，并且，其中，所述連接線沿所述薄膜表面安裝在所述絕緣薄膜內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的生物分子檢測元件，其中，所述生物分子探針包括核酸，多核苷酸或合成的寡核苷酸。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的生物分子檢測元件，其中，所述固定探針的電極是由選自金，鉑，鈀，鈦，鉻，鋁，多晶硅，鉭，或鉬中的一種或它們的組合形成的。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的生物分子檢測元件，其中，發(fā)射/接收天線是在所述絕緣薄膜中形成的。
7.生物分子檢測元件，包括多個(gè)絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管，各自具有包埋在公用絕緣薄膜中的柵電極；在所述絕緣薄膜的表面上形成的，并且具有固定在它上面的生物分子探針的多個(gè)固定探針的電極；和用于與所述多個(gè)絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管的每一個(gè)的所述柵電極和所述多個(gè)固定探針的電極形成電連接的多個(gè)連接線，其中所述固定探針的電極上固定所述生物分子探針的部位位于遠(yuǎn)離緊靠所述柵電極的上方的地方。
8.如權(quán)利要求7的生物分子檢測元件，其中，發(fā)射/接收天線是在所述公用絕緣薄膜中形成的。
9.如權(quán)利要求6或8的生物分子檢測元件，還包括計(jì)算電路，存儲(chǔ)電路，接收電路，發(fā)射電路和電源電路。
10.如權(quán)利要求9的生物分子檢測元件，其中，所述電源電路能將由所述天線接收的電磁波轉(zhuǎn)化成電力，并且將所述電力輸送到每一個(gè)部分。
11.一種利用權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的所述生物分子檢測元件分析核酸的方法，包括以下步驟將單鏈核酸探針作為所述生物分子探針固定在所述固定探針的電極上；將包含至少一種核酸的樣品溶液導(dǎo)至所述生物分子檢測元件，并且與所述單鏈核酸探針進(jìn)行雜交；將洗滌液導(dǎo)至所述生物分子檢測元件上，并且除去所述生物分子檢測元件上的未反應(yīng)的核酸；將嵌入劑溶液導(dǎo)至所述生物分子檢測元件上，并且使它與業(yè)已成為雙鏈的核酸起反應(yīng)；將洗滌液導(dǎo)至所述生物分子檢測元件上，并且除去所述生物分子檢測元件上的未反應(yīng)的嵌入劑；和將緩沖溶液導(dǎo)至所述生物分子檢測元件上，并且測定所述絕緣的柵極場效應(yīng)晶體管的輸出值。
12.一種利用權(quán)利要求10的生物分子檢測元件分析生物分子的方法，包括以下步驟將多個(gè)生物分子檢測元件和緩沖溶液放入反應(yīng)容器，所述元件包括具有作為生物分子探針固定在它上面的不同類型的單鏈核酸探針的所述固定探針的電極，并且利用外部接收器接收來自每一個(gè)所述生物分子檢測元件的信號(hào)；將包含至少一種核酸的樣品溶液導(dǎo)入所述反應(yīng)容器，并且與所述單鏈核酸探針進(jìn)行雜交；將嵌入劑溶液導(dǎo)入所述反應(yīng)容器，并且讓它與業(yè)已成為雙鏈的核酸起反應(yīng)；和利用外部接收器接收來自每一個(gè)所述生物分子檢測元件的信號(hào)。
全文摘要
能夠以低的運(yùn)行成本，以高精度進(jìn)行測定的廉價(jià)的DNA芯片/DNA微陣列系統(tǒng)。將DNA探針(8)固定在浮動(dòng)電極(7)的表面上，該電極與場效應(yīng)晶體管的柵電極(5)連接。與所述浮動(dòng)電極表面上的靶基因進(jìn)行雜交，其中利用場效應(yīng)檢測表面電荷密度的變化。
文檔編號(hào)G01N27/00GK1826525SQ200480020868
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者宮原裕二, 坂田利彌, 釜堀政男, 矢澤義昭 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人物質(zhì)·材料研究機(jī)構(gòu)