專利名稱：用于識(shí)別改變內(nèi)在膜蛋白表面表達(dá)的試劑的高通量測(cè)定系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于識(shí)別改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中如心臟離子通道這樣的內(nèi)在膜蛋白的表面表達(dá)水平的試劑的高通量測(cè)定系統(tǒng)和方法。本發(fā)明還涉及使用由這種方法識(shí)別的試劑的治療方法。
背景技術(shù)：
A.測(cè)定人乙醚舞蹈樣運(yùn)動(dòng)紊亂的相關(guān)基因(human-Ether-a-go-goRelated Gene)(hERG)是產(chǎn)生心臟再極化電流IKr的孔狀鉀通道亞基，并且由6個(gè)跨膜片段(S1-S6)和細(xì)胞質(zhì)的氨基末端和羧基末端構(gòu)成。已經(jīng)將hERG與先天的和藥物誘導(dǎo)的長(zhǎng)QT綜合征聯(lián)系起來，這是一種嚴(yán)重的并且可能致命的心臟病。
hERG的突變產(chǎn)生功能缺損的通道和/或運(yùn)輸缺陷型通道，它們都減小IKr電流。在不同的長(zhǎng)QT家族中由突變產(chǎn)生的大多數(shù)分子已經(jīng)被識(shí)別。這表明hERG在心臟生理中扮演著重要角色。
大多數(shù)與長(zhǎng)QT綜合征(藥物誘導(dǎo)的)相關(guān)的藥物是hERG阻斷劑。參見Vandenberg et al.，Trends Pharmacol.Sci.22240-246(2001)。由于在1996年將非鎮(zhèn)靜的抗組胺特非那定(Seldane)的心臟毒性與hERG阻斷聯(lián)系起來(參見Roy et al.，Crculation94817-823(1996))，包括抗心律失常藥、抗生素、抗精神病藥物以及抗組胺在內(nèi)的具有不同結(jié)構(gòu)的多種藥物都顯示出是有效的hERG阻斷劑。
因此，hERG成為用于新的治療藥物的心臟安全測(cè)試的一個(gè)重要靶標(biāo)。美國(guó)食品與藥品管理局現(xiàn)在要求為新的治療化合物尋求批準(zhǔn)的制藥公司要對(duì)這些藥物進(jìn)行篩選用以確認(rèn)是否有潛在的hERG阻斷作用。
目前，hERG心臟安全測(cè)試涉及電生理并且包括在穩(wěn)定過表達(dá)hERG的HEK 293細(xì)胞中記錄hERG電流的膜片鉗(patch clamp)。然而，這種測(cè)定費(fèi)用昂貴、耗時(shí)，并且需要相當(dāng)?shù)募寄?。因此，這項(xiàng)工作通常在藥物研發(fā)過程的較晚階段進(jìn)行。不幸的是，在這時(shí)發(fā)現(xiàn)一種新的治療化合物是有效的hERG阻斷劑這將可能損害該化合物被批準(zhǔn)并應(yīng)用于治療的前景。因此，制藥企業(yè)對(duì)于更廉價(jià)、更快速并且可以在藥物研發(fā)過程的早期使用的hERG阻斷劑的測(cè)定相當(dāng)感興趣。
膜片鉗測(cè)定的局限性導(dǎo)致了用于臨床前篩選潛在的hERG作用藥物的替代方法的出現(xiàn)。已經(jīng)描述了幾種方法，但是受限于如靈敏度、通量能力和/或假陽性率(參見Xu et al.，Drug Discovery Today61278-1287(2001))。
例如，一種類型的測(cè)定方法使用膜電位敏感性熒光染料，如DiBAC4或FMP。由于這些測(cè)定是測(cè)量膜電位的改變而沒有hERG活性，因此假陽性的風(fēng)險(xiǎn)(即，改變膜電位但不阻斷hERG的藥物)很大。一個(gè)該測(cè)定方法的最新評(píng)估(Tang et al.，J. Biomol.Sceen.6325-331(2001))表明將假陽性和假陰性降到最小程度有很大問題。另外，靈敏度降低了約100倍。而且，用膜電位測(cè)定方法與膜片鉗測(cè)量的hERG阻斷劑效應(yīng)的排序是不同的，這限制了不用提供作為其效應(yīng)的有用信息而對(duì)潛在的hERG通道阻斷劑識(shí)別的熒光測(cè)定法的使用。最后，在該測(cè)試方法中染料/藥物的相互作用也引起了問題。
建議作為一種用于hERG相互作用的潛在的高通量臨床前篩選方法的第二種測(cè)試方法，它是結(jié)合到用于hERG轉(zhuǎn)染細(xì)胞的膜上的[3H]-多非利特(參見Finlayson et al.，Eur.J. Pharm 430147-148(2001))。這種結(jié)合測(cè)定是非功能性的，并且依賴于藥物與[3H]-多非利特競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于hERG通道的能力。但是，在早期試驗(yàn)中，通過膜片鉗方法識(shí)別的hERG阻斷劑的排序不能被[3H]-多非利特結(jié)合測(cè)定印證。同時(shí)，對(duì)于用作結(jié)合底物的純化的細(xì)胞膜和放射性標(biāo)記的多非利特的需要限制了這種測(cè)定方法的使用。
建議的第三種測(cè)定方法涉及測(cè)量表達(dá)hERG細(xì)胞的銣(Rb)的流量(參見Terstappen，Anal.Biochem.272149-155(1999))。這些細(xì)胞用Rb通道裝載，并用高水平的鉀激活，從而測(cè)定釋放到培養(yǎng)基中的Rb。然而，通過這種方法得到的效應(yīng)的排序與膜片鉗數(shù)據(jù)不對(duì)應(yīng)(參見Tang et al.，J. Biomol.Sceen.，6325-331(2001)。另外，通量受到限制并且靈敏度降低了10倍。
因此，仍然需要識(shí)別包括如hERG這樣的心臟離子通道的內(nèi)在膜蛋白阻斷劑的測(cè)定系統(tǒng)。
B.心律失常藥心房撲動(dòng)和/或心房顫動(dòng)(AF)是臨床上最常見的心律失常，并且其流行主要在年長(zhǎng)人群中增長(zhǎng)?，F(xiàn)在，AF每年影響超過1百萬美國(guó)人，占所有心血管疾病的5％以上，并且每年在美國(guó)引起超過80,000起中風(fēng)。而AF極少是致命性的心律失常，它主要導(dǎo)致頑固性疾病并且可能導(dǎo)致并發(fā)癥，如充血性心力衰竭或血栓栓塞的發(fā)生。目前可以使用的I類和III類抗心律失常藥物減少了AF再次出現(xiàn)的機(jī)率，但是由于包括心室致心律失常作用在內(nèi)的各種潛在的副作用，其使用受到了限制。因?yàn)槟壳暗闹委熓遣怀浞值牟⑶揖哂懈弊饔?，因此顯然需要開發(fā)新的治療方法。
心室纖顫(VF)是與急性心肌梗塞、缺血性冠狀動(dòng)脈疾病和充血性心力衰竭相關(guān)的最常見的原因。同AF一樣，目前的治療也是不充分的并且需要開發(fā)新的治療方法。
盡管現(xiàn)在在市場(chǎng)上有各種抗心律失常藥物，但是具有滿意療效和高安全系數(shù)的藥物還沒有出現(xiàn)。例如，根據(jù)Vaughan-Williams分類體系的I類抗心律失常藥物(“Classification of antiarrhythmicdrug”，Cardiac Arrhythmias，edited byE.Sandoe，E，F(xiàn)lensted-Jensen，K.Olesen；Sweden，Astra，Sodettalje，pp 449-472(1981))，其選擇性抑制動(dòng)作電位的上行支的最大速率(Vmax)，由于它們縮短了心臟動(dòng)作電位的波長(zhǎng)因而不能充分抑制心室纖顫，因此容易復(fù)發(fā)。另外，它們還有安全問題，即這些藥物引起心肌收縮的衰減，并且具有由于搏動(dòng)傳導(dǎo)抑制而誘發(fā)心律失常的傾向。由于I類拮抗劑比對(duì)照安慰劑具有更高的死亡率，因此進(jìn)行中的CAST(冠狀動(dòng)脈抑制測(cè)試)研究被中止。分別屬于II類和IV類的β-腎上腺素受體阻斷劑和鈣通道(ICa)拮抗劑具有缺陷，由于在某些有心血管疾病的病人中它們有心臟抑制作用，因此它們的作用局限于特定類型的心律失常或不適于推薦。然而，它們的安全性比I類抗心律失常藥物高。
III類抗心律失常藥物引起動(dòng)作電位時(shí)程(APD)的選擇性延長(zhǎng)，并且不對(duì)最大的上行支速率(Vmax)造成強(qiáng)烈抑制。因此，它們延長(zhǎng)了提高不應(yīng)可能的心肌動(dòng)作電位的保留長(zhǎng)度，從而阻止復(fù)發(fā)?？捎玫脑擃愃幬锴缚蓴?shù)。如甲磺胺心定和胺碘酮的實(shí)例已經(jīng)顯示出具有令人感興趣的III類的性能(Singh B.N.，Vaughan Williams E.M.，“A third class of anti-arrhythmic actioneffects on atrial andventricular intracellular potentials and other pharmacological actions oncardiac muscle of MJ 1999and AH 3747”，Br.J.Pharmacol 39675-689(1970)，和Singh B.N.，Vaughan Williams E.M.，“The effectof amiodarone，a new anti-anginal drug，on cardiac muscle”，Br.J.Pharmacol 39657-667(1970))，但是這些不是選擇性III類藥物。
甲磺胺心定也具有II類(β-腎上腺素阻斷)效應(yīng)，它可以引起心力衰竭，并且在某些敏感病人中不建議使用。
胺碘酮也不是一種選擇性III類抗心律失常藥物，因?yàn)樗哂卸喾N電生理作用，并且由于副作用而受到嚴(yán)格限制(Nademanee，K.，“The Amiodarone Odyssey”，J.Am.Coll.Cardiol.201063-1065(1992))。預(yù)期這類藥物在阻止心室纖顫方面有效。通過定義可知，選擇性III類藥物被認(rèn)為是不能引起與I類抗心律失常藥物類似的由于動(dòng)作電位傳導(dǎo)的抑制造成的心肌衰竭或引起心律失常。
III類藥物通過延長(zhǎng)心臟動(dòng)作電位時(shí)程(APD)增加了心肌不應(yīng)。理論上說，延長(zhǎng)心臟動(dòng)作電位可以通過增強(qiáng)內(nèi)向電流(即Na+或Ca2+電流，在下文中分別稱為INa和ICa)或通過減少外向再極化鉀K+電流來實(shí)現(xiàn)。該延遲的校正(IK)K+電流是動(dòng)作電位平臺(tái)期與整個(gè)再極化過程相關(guān)的主要的外向電流，而瞬時(shí)外向(ITO)和內(nèi)向校正(IKI)K+電流分別負(fù)責(zé)再極化的快速引發(fā)和中止階段。
細(xì)胞電生理研究發(fā)現(xiàn)IK包括兩個(gè)藥理學(xué)和動(dòng)力學(xué)不同的K+電流亞類，IKr(快速活化和失活)和IKs(慢速活化和失活)。(Sanguinettiand Jurkiewicz，“Two components of cardiac delayed rectifier K+current.Differential sensitivity to block by Class III anti-arrhythmicagent”，J Gen Physiol 96195-215(1990))。IKr也是人乙醚舞蹈樣運(yùn)動(dòng)紊亂基因(hERG)的產(chǎn)物。細(xì)胞系中hERG cDNA的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生hERG電流，它們與IKr幾乎相同(Curran et al.，“A molecular basisfor cardiac arrhythmiahERG mutations cause long QT syndrome，”Cell 80(5)795-803(1995))。
目前在開發(fā)的III類抗心律失常藥物，如果不窮舉的話主要包括右旋-索他洛爾、多非利特(UK-68，798)、阿莫蘭特(H234/09)、E-4031和甲磺氨-N[1’-6-氰基-1，2，3，4-四氫-2-萘基]-3，4-二氫-4-羥螺[2H-1-苯并吡喃-2，4’-哌啶]-6基]，(+)-，一氯化物(MK-499)，它們阻斷IKr。盡管胺碘酮是IKs的阻斷劑(Balser J.R.Bennett，P.B.，Hondeghern，L.M.and Roden，D.M.“Suppression of time-dependentoutward current in guinea pig ventricular myocytesActions ofquinidine and aminodarone”，Cirt.Res.69519-529(1991))，它也阻斷INa和ICa，影響甲狀腺功能，也是一種非特異性的腎上腺素阻斷劑，作為磷脂酶的抑制劑，并且引起肺纖維化(Nademanee，K.“TheAmiodarone Odessey”.J. Am.Coll.Cardiol.201063-1065(1992))。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)折返激動(dòng)(折返性)是造成人室上性心律失常的主要機(jī)制。折返激動(dòng)需要在慢傳導(dǎo)速率和足夠短暫的不應(yīng)期之間的一個(gè)重要平衡，從而保證多種折返電流的引發(fā)和保持，用以同時(shí)共存并且維持AF。通過延長(zhǎng)的APD增加心肌不應(yīng)，防止和/或中止了折返性心律失常。目前正在開發(fā)的III類抗心律失常藥物，如果不窮舉的話主要是右旋-索他洛爾和多非利特，它們更具選擇性地阻斷在人心房和心室中發(fā)現(xiàn)的IK的快速活化部分IKr。
因?yàn)檫@些IKr阻斷劑增加心房和心室中的APD和不應(yīng)，并且不影響傳導(dǎo)本身，因此理論上講，它們代表治療如AF和VF這樣的心律失常的潛在有用的藥物。由于增加慢心律前心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，因此這些藥物具有缺陷。例如，當(dāng)使用這些化合物時(shí)，可以觀察到一種獨(dú)特類型的多態(tài)性心室心動(dòng)過速，torsade de pointes，它通常與心電圖QT間隔的過分延長(zhǎng)相關(guān)，因此被稱為“獲得性長(zhǎng)QT綜合征”(Roden，D.M.“Current status of Class III Antiarrhythmic DrugTherapy”，Am J.Cardiol，7244B-49B(1993))。這種慢心律時(shí)的突出作用被稱為“逆頻率依賴性”，并且與頻率獨(dú)立或頻率依賴作用形成對(duì)比。(Hondeghem，L. M.，“Development of Class IIIAntiarrhythmic Agents”，J.Cardiovasc.Cardiol.20(Suppl.2)S17-S22)。當(dāng)右旋-索他洛爾比對(duì)照的安慰劑具有更高的死亡率時(shí)，這種前心律失常趨勢(shì)導(dǎo)致SWORD測(cè)試的中止。
延遲校正電流的慢速活化部分(IKs)潛在地克服了與心室心律失常相關(guān)的一些IKr阻斷劑的限制。然而，因?yàn)槠涞穆倩罨瘎?dòng)力學(xué)，IKs在心房再極化中的作用可能是有限的，這是由于心房的APD相對(duì)短。因而，盡管IKs阻斷劑可能對(duì)心室心律失常提供獨(dú)特的好處，但是認(rèn)為它們影響上心室心動(dòng)過速(SVT)的能力是很小的。
大多數(shù)目前可用的III類抗心律失常藥物的另一個(gè)主要的缺陷或局限是在心搏徐緩或慢心律時(shí)或期間，它們的作用增加或變得更加明顯，并且這導(dǎo)致它們可能造成前心律失常。另一方面，在心動(dòng)過速或預(yù)期和最需要這些藥劑或藥物的疾病狀態(tài)時(shí)，它們失去了主要的療效。在快心律時(shí)這種療效的喪失或消失被稱作“逆使用依賴性”(Hondeghem and Snyders，“Class III antiarrhythmic agents havea lot of potential but a long way to goReduced effectiveness anddangers of reverse use dependence”，Circulation，81686-690(1990)；Sadanaga et al.，“Clinical evaluation of the use-dependent QRSprolongation and the reverse use-dependent QT prolongation of class IIIanti-arrhythmic agents and their value in predicting efficacy”A mer.Heart Journal 126114-121(1993))，或“逆速率依賴性”(Bretano，“Rate dependence of class III actions in the heart”，F(xiàn)undam.Clin.Pharmacol.751-59(1993)；Jurkiewicz and Sanguinetti，“Rate-dependent prolongation of cardiac action potentials by amethanesulfonanilide class III anti-arrhythmic agentSpecific block ofrapidly activating delayed rectifier K+current by dofetilide”，Circ.Res.7275-83(1993))。因此，具有使用依賴性或速率依賴性圖形的藥物與大多數(shù)現(xiàn)用的III類抗心律失常藥物不同，它們不僅可以提供更高的安全性而且具有更好的療效。
針對(duì)與目前III類抗心律失常藥物相關(guān)的問題而言，需要一種對(duì)哺乳動(dòng)物心律失常的有效治療。

發(fā)明內(nèi)容
相應(yīng)地，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于識(shí)別改變?nèi)缧呐K離子通道這樣的內(nèi)在膜蛋白的表面表達(dá)水平的藥物的測(cè)定和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供阻止或治療心律失常的方法。
根據(jù)這些和其它的目的，本發(fā)明的第一具體實(shí)施方式
涉及一種用于識(shí)別改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中內(nèi)在膜蛋白的表面表達(dá)水平藥物的方法，包括a)制備含有表達(dá)目的膜蛋白的第一突變型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第一培養(yǎng)液，其中該第一突變型在所述細(xì)胞表面的表達(dá)水平低于野生型；b)加入有效量的候選試劑；c)在活性試劑存在下孵育細(xì)胞足夠的時(shí)間；d)加入有效量的至少一種抗體，該抗體與突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合；以及e)測(cè)定結(jié)合水平，其中所述結(jié)合水平的變化表明該候選試劑改變了所述表面表達(dá)的水平。
本發(fā)明的第二具體實(shí)施方式
涉及一種用于阻止或治療心律失常的方法，包括向需要的哺乳動(dòng)物給予有效量的活性試劑，該試劑增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞中hERG第一突變型的表面表達(dá)水平并且不增加通過如下方法測(cè)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的hERG第二突變型的表面表達(dá)水平，包括a)制備含有表達(dá)hERG的第一突變型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第一培養(yǎng)液，其中它在細(xì)胞表面上的表達(dá)水平低于hERG的野生型；b)加入有效量的活性試劑；c)在活性試劑存在下孵育細(xì)胞足夠時(shí)間；d)加入有效量的至少一種抗體，該抗體與hERG的該突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合；e)測(cè)定該抗體的結(jié)合水平；f)制備含有表達(dá)hERG的第二突變型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二培養(yǎng)液，該突變型與第一突變型不同，并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的表達(dá)水平低于hERG的野生型；g)向該第二培養(yǎng)液中加入有效量的活性試劑；h)在活性試劑存在下孵育細(xì)胞足夠的時(shí)間；i)加入有效量的至少一種抗體，該抗體與該第二突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合；以及j)測(cè)定該抗體的結(jié)合水平。
本發(fā)明另外的優(yōu)點(diǎn)、目的和特性一部分將在后面的描述部分給出，而另一部分通過隨后的舉例或通過本發(fā)明實(shí)踐的教導(dǎo)對(duì)于本領(lǐng)域普通人員將變得顯而易見。在所附的權(quán)利要求中特別指出的本發(fā)明的這些目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)可以被認(rèn)識(shí)和實(shí)現(xiàn)。
具體實(shí)施例方式
I.應(yīng)用的測(cè)定和方法本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式包括一種用于識(shí)別結(jié)合如膜離子通道這樣的內(nèi)在膜蛋白，并且由此增加或減少了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表面表達(dá)的試劑的測(cè)定系統(tǒng)和方法。在一些特定的優(yōu)選實(shí)施例中，該測(cè)定和系統(tǒng)測(cè)定了試劑結(jié)合到內(nèi)在膜蛋白突變型的特定位點(diǎn)的能力，并從而改變了其表面表達(dá)。這種表面表達(dá)的改變可以來自于試劑阻斷的在相對(duì)于野生型膜蛋白活性位點(diǎn)的突變型上的一個(gè)位點(diǎn)和/或通過阻斷細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和/或突變膜蛋白的加工?？蛇x替換的，表面表達(dá)的改變可以來自于試劑改善了突變膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。
適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合測(cè)定對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員有很多已知的和可行的形式。根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
，可以在適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基中提供一種或多種表達(dá)膜蛋白的目的細(xì)胞，并且暴露于一種或多種待測(cè)化合物，而在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中該細(xì)胞可以是固定在表面上的。類似地，根據(jù)本發(fā)明的其它具體實(shí)施方式
，一種或多種待測(cè)化合物可以被固定在表面上，并且暴露于含有一種或多種表達(dá)目的膜蛋白的細(xì)胞的液體培養(yǎng)基中，或者該待測(cè)化合物可以包括在合適的液體培養(yǎng)基中并向其中加入一種或多種表達(dá)目的膜蛋白的細(xì)胞。
在至少一種待測(cè)化合物和目的膜蛋白被標(biāo)記的系統(tǒng)中的結(jié)合通常很容易檢測(cè)(例如用熒光、放射性、酶、抗體等、或其組合，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的)。在將待測(cè)化合物暴露于表達(dá)膜蛋白的細(xì)胞并洗掉或除去未結(jié)合的試劑之后，測(cè)量存在的標(biāo)記部分(即，結(jié)合于測(cè)試系統(tǒng)的未標(biāo)記部分)。
各種用于進(jìn)行結(jié)合測(cè)試的方法都是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于如PCT申請(qǐng)US98/18368中所描述的那些測(cè)定系統(tǒng)。各種參考文獻(xiàn)提供了用于蛋白結(jié)合測(cè)定的各種形式的一般描述，包括競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定和直接結(jié)合測(cè)定，(參見Stites and Terr，Basic and ClinicalImmunology，7thed.(1991)；Maggio，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1980)；and Tijssen，Practice and TheoLy of EnzymeImmunoassays，in Laboratory Teelmiques in Biochemistry andMolecular Biology，Elsevier Science Publishers，B.V. Amsterdam，(1985))。
本發(fā)明特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
涉及這樣的測(cè)定系統(tǒng)和方法，其識(shí)別通過阻斷膜蛋白活性和/或阻斷其細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和/或其加工從而增加或減少目的膜蛋白的表面表達(dá)的化合物。
因此，根據(jù)一些特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，提供了免疫測(cè)定，其中一種或多種表達(dá)目的膜蛋白的細(xì)胞通常結(jié)合到適宜的固體支撐物上(例如微量滴定板的孔、微型卡、或?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它類似的形式)并與候選試劑結(jié)合，從而觀察目的膜蛋白的表面表達(dá)水平的變化。因此，在這些優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，一種或多種測(cè)定成分結(jié)合到固體表面。
在一些
具體實(shí)施例方式
中，一種測(cè)定系統(tǒng)可以用于(本領(lǐng)域已知的)檢測(cè)由于候選試劑結(jié)合的膜蛋白表面表達(dá)的變化。例如，如果目的膜蛋白是膜離子通道，則可以使用膜片鉗來測(cè)定檢測(cè)離子通過膜的流量的變化，從而證明離子通道的表面表達(dá)水平的增加。
在另一可選的具體實(shí)施方式
中，使用一種間接免疫測(cè)定系統(tǒng)，其中在細(xì)胞表面上的膜蛋白通過加入一種或多種直接對(duì)抗膜蛋白的細(xì)胞外抗原決定部位的抗體來檢測(cè)，如本領(lǐng)域所已知的。
當(dāng)使用本發(fā)明的方法中的固體支撐物時(shí)，實(shí)際上任何固體表面都是適合的，只要該固體表面與測(cè)定試劑相容并能夠?qū)⒃摮煞纸Y(jié)合到表面上而且不過度改變測(cè)定成分的反應(yīng)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道一些成分在固相測(cè)定中活性減少，但是只要活性足夠進(jìn)行檢測(cè)和/或定量，這一般是可以接受的。
合適的固體支撐物包括但不限于材料或細(xì)胞可以黏附的任何固體表面，如玻璃珠、平板玻璃、可控孔玻璃、塑性多孔塑性金屬、或樹脂等。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在一些具體實(shí)施方式
中，在本發(fā)明的方法中使用的固體支撐物可以是由官能團(tuán)衍生而來的(例如羥基、氨基、羰基、酯和巰基)，該官能團(tuán)為連接部分(連接子)的結(jié)合提供反應(yīng)部位或直接結(jié)合于候選試劑或其它測(cè)定成分。
將測(cè)定成分結(jié)合到固體支撐物上可以是直接的(即，該成分直接與固體表面接觸)或間接的(即，試劑和/或成分(如抗體)結(jié)合到支撐物上，而其它測(cè)定成分結(jié)合到該試劑或成分上而不是結(jié)合到該固體支撐物上)。在一些具體實(shí)施方式
中，該試劑或成分是共價(jià)固定的(例如利用半胱氨酸單獨(dú)的反應(yīng)巰基基團(tuán)固定蛋白質(zhì)成分(參見Bioconjug.Chem.，4528-536(1993))，或非共價(jià)、但是特異性地(例如通過固定的抗體或其它特異性結(jié)合蛋白(參見Adv.Mater.，3388-391(1991)；Anal.Chem.，6783-87(1995)))，生物素/鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)(參見如Biophys.Biochem.Res.Commun.，23076-80(1997))，或金屬鰲合Langmuir-Blodgett膜(參見如Langmuir 114048-4055(1995)；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，35317-320(1996)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 934937-4941(1996)；and J.Struct.Biol.，113117-123(1994))，和金屬鰲合自組裝單層(參見如Anal.Chem.，68490-497(1996))，用于聚組氨酸融合蛋白的結(jié)合。
在一些特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，使用本領(lǐng)域普遍公知的標(biāo)準(zhǔn)的直接或間接ELISA、IFA或RIA方法來檢測(cè)候選試劑與目的膜蛋白的結(jié)合。在一些具體實(shí)施方式
中，在樣品中檢測(cè)到膜蛋白的表面表達(dá)水平增加，而在另一些具體實(shí)施方式
中檢測(cè)到表面表達(dá)水平的減少。因此，本發(fā)明的方法適合于檢測(cè)、識(shí)別和表征多個(gè)要素。
相應(yīng)地，在本發(fā)明方法的一些特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，可以使用由用于捕獲的單抗或多抗(“捕獲抗體”)和用于檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物(例如hERG結(jié)合到抗hERG抗體或hERG突變體結(jié)合到相應(yīng)的抗體)結(jié)合的二抗(“報(bào)道抗體”)構(gòu)成的夾層結(jié)構(gòu)ELISA(酶聯(lián)免疫吸收測(cè)定)。
在一些優(yōu)選的ELISA具體實(shí)施方式
中，使用堿性磷酸酶結(jié)合的方法，而在另外一些優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，使用辣根過氧化物酶結(jié)合的方法。此外，還使用抗生物素蛋白/生物素系統(tǒng)，尤其適用于信號(hào)增加的測(cè)定系統(tǒng)中。在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，適宜使用的酶包括但不限于過氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、以及其兩種或多種混合物。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)例舉的方法中，在阻斷緩沖液中將適當(dāng)稀釋的100μl生物素化的抗體(例如直接對(duì)抗hERG或其突變體)加入到預(yù)涂的抗生物素蛋白的ELISA板的每個(gè)孔中(如可從Pierce商購(gòu)的中性抗生物素蛋白(neutravidin)板)。2小時(shí)后，用清洗緩沖液清洗板子(如0.1％的TBS/Tween 20，含有或不含有阻斷試劑)。通過加入阻斷緩沖液可以抑制進(jìn)一步的非特異性結(jié)合(如根據(jù)制造商的推薦加入300μl SuperBlock(Pierce)兩次)。接著孵育一段時(shí)間以使生物素化的抗體與孔表面結(jié)合，之后根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法清洗板子(如3次)，以除去孔板中任何未結(jié)合的抗體。
如標(biāo)準(zhǔn)樣品和對(duì)照一樣，表達(dá)目的膜蛋白的細(xì)胞樣本可以用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋，并加入到ELISA板的孔中。稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣、對(duì)照和樣品可以加入到ELISA板的孔中(如100μl/孔)。標(biāo)準(zhǔn)樣、對(duì)照和樣品通常進(jìn)行雙孔檢測(cè)。通常，在一個(gè)密閉保濕的容器或類似物中在5RPM的搖床或其它適當(dāng)?shù)恼駝?dòng)裝置上，將孔板孵育例如過夜或持續(xù)其它適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。用本領(lǐng)域已知的清洗緩沖液清洗孔板(如3次左右)。然后可以加入100μl的適當(dāng)稀釋的單抗或多抗報(bào)道抗體(優(yōu)選用涂孔板的抗體預(yù)先吸收)，并且在室溫下孵育優(yōu)選過夜(如18-20小時(shí))或其它適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間。
可以再次清洗孔板，優(yōu)選如上所述，并且可以加入在適當(dāng)?shù)淖钄嗑彌_液中(如在TBS中的BSA阻斷劑)適當(dāng)稀釋的如堿性磷酸酶結(jié)合的抗兔Ig(可由Pierce商購(gòu))這樣的100μl酶標(biāo)記的抗體，并且在搖床或如上所述的類似的攪動(dòng)下孵育足夠的時(shí)間(如2小時(shí))。
然后該孔板可以優(yōu)選用如上所述的方法再次清洗?？梢詫⒚傅孜锛尤氲娇字胁⑹狗磻?yīng)持續(xù)進(jìn)行適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，最后用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法結(jié)束反應(yīng)，并用本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定孔中溶液的光密度。
因?yàn)楸尘靶盘?hào)通常是擴(kuò)增測(cè)定的限制因素，因此在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
中，可以通過采用減少這些測(cè)試中的背景信號(hào)的方法來進(jìn)行測(cè)定。
除了使用固體支撐物的測(cè)定系統(tǒng)之外，本發(fā)明的還提供了將測(cè)定成分懸浮在溶液中的方法。
根據(jù)本發(fā)明的第一特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，提供了一種用于識(shí)別試劑的方法，該試劑如肽、蛋白、抗體或化學(xué)試劑改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中如hERG這樣的內(nèi)在膜蛋白的表面表達(dá)水平。這種方法包括a)制備含有表達(dá)目的膜蛋白第一突變型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第一培養(yǎng)液，其中這種第一突變型在細(xì)胞表面的表達(dá)水平低于該蛋白的野性型；b)加入有效量的候選試劑；c)在候選試劑存在下孵育細(xì)胞足夠的時(shí)間；d)加入有效量的至少一種抗體，該抗體與突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合；以及e)在將細(xì)胞用候選試劑孵育之后，測(cè)定抗體對(duì)蛋白的細(xì)胞外抗原決定部位的結(jié)合水平。
相對(duì)于對(duì)照，在候選試劑存在下結(jié)合水平的任何變化，如增加或減少，都表明候選試劑改變了膜蛋白的第一突變型的表面表達(dá)水平。
根據(jù)本發(fā)明的第二特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，上述方法進(jìn)一步包括f)制備含有表達(dá)目的膜蛋白的第二突變型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二培養(yǎng)液，其中該第二突變型與第一突變型不同，并且在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的表達(dá)水平低于該膜蛋白的野生型；g)加入有效量的候選試劑；h)在所述候選試劑存在下將所述細(xì)胞孵育足夠的時(shí)間；i)加入有效量的至少一種抗體，該抗體與第二突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合；以及j)測(cè)定抗體與細(xì)胞外抗原決定部位的結(jié)合水平。與候選試劑孵育之后，結(jié)合水平的任何變化都表明候選試劑改變了目的膜蛋白的第二突變型的表面表達(dá)水平。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，上述步驟(d)包括加入有效量的至少一種一抗和有效量的至少一種二抗。根據(jù)該具體實(shí)施方式
，該一抗優(yōu)選結(jié)合到目的膜蛋白的第一突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位上。根據(jù)該具體實(shí)施方式
，更優(yōu)選的是二抗結(jié)合到一抗上。
根據(jù)本發(fā)明的其它優(yōu)選具體實(shí)施方式
，上述步驟(i)還包括加入有效量的至少一種一抗和有效量的至少一種二抗。根據(jù)這些具體實(shí)施方式
，該一抗優(yōu)選與目的膜蛋白的第二突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合。根據(jù)這些具體實(shí)施方式
更優(yōu)選的是二抗與一抗結(jié)合。
優(yōu)選地，二抗偶聯(lián)到酶上，以有利于檢驗(yàn)和測(cè)定結(jié)合水平。在本發(fā)明的方法中，適合使用的酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和可以得到的。合適的酶的例子包括但不限于過氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、以及其兩種或多種混合物。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和可行的任何方法和技術(shù)來測(cè)定目的內(nèi)在膜蛋白的表面表達(dá)水平。優(yōu)選通過熒光、發(fā)光、放射性、吸收、或其兩種或多種的組合來測(cè)定結(jié)合水平。
根據(jù)本發(fā)明的一些特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，該內(nèi)在膜蛋白是膜離子通道。適當(dāng)?shù)哪るx子通道的示例性例子包括但不限于鈉通道、鉀通道、鈣通道或氯通道。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，抗體結(jié)合的膜蛋白的第一突變型的細(xì)胞外抗原決定部位優(yōu)選與野生型抗原決定部位一樣，即與在目的膜蛋白的天然存在形式上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外抗原決定部位一樣。不希望受到任何操作性或類似理論的限制，這樣的安排可以潛在地減少由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同而產(chǎn)生的錯(cuò)誤，例如一種或多種蛋白功能性質(zhì)的改變。
根據(jù)本發(fā)明其它優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，抗體結(jié)合的膜蛋白的第二突變型的細(xì)胞外抗原決定部位優(yōu)選與野生型抗原決定部位一樣。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，在膜蛋白的第一和/或第二突變型上的該細(xì)胞外抗原決定部位含有一個(gè)標(biāo)記物。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以得到的。本發(fā)明方法中使用的一個(gè)特別優(yōu)選的標(biāo)記物是血凝素(HA)標(biāo)記物。該標(biāo)記物可以插入到膜蛋白的第一和/或第二突變型的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中、或者可以取代其一部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
根據(jù)本發(fā)明的方法，膜蛋白的第一和第二突變型優(yōu)選與膜蛋白的野生型的氨基酸序列至少有一個(gè)氨基酸殘基不同。而且，第一和第二突變型優(yōu)選彼此的氨基酸序列至少也有一個(gè)氨基酸殘基不同。
根據(jù)一些優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，膜蛋白的第一突變型可以是運(yùn)輸缺陷型突變體，并且其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上的表達(dá)水平低于相應(yīng)的野生型。根據(jù)其它優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，第二突變型可以是運(yùn)輸缺陷型突變體，而根據(jù)另外的優(yōu)選具體實(shí)施方式
，第一和第二突變型可以都是運(yùn)輸缺陷型突變體。
根據(jù)本發(fā)明的某些特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，目的膜蛋白是心臟離子通道，更優(yōu)選的是鉀離子通道。這些離子通道對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。這樣的鉀離子通道的一個(gè)例子是hERG。
本發(fā)明的方法中使用的適當(dāng)?shù)膆ERG第一突變型是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
，當(dāng)在細(xì)胞表面表達(dá)時(shí)，這樣的突變型應(yīng)具有功能，但在細(xì)胞表面的表達(dá)水平應(yīng)低于任意的野生型，更優(yōu)選的是由于運(yùn)輸缺陷。適當(dāng)?shù)耐蛔冃偷氖纠岳影ǖ幌抻贕601S(其識(shí)別于長(zhǎng)QT綜合征家族中)和N470D。G601S是運(yùn)輸缺陷型，其產(chǎn)生很小的但動(dòng)力學(xué)沒有改變的電流的部分缺失性(hypomorphic)通道(參見Furatani et al.，Circulation 992290-2294(1999))而N470D是減效的錯(cuò)義突變體。增加如G601S和N470D這樣突變體的表面表達(dá)的試劑也結(jié)合于hERG離子傳導(dǎo)通路中的高親和性位點(diǎn)，從而成為有效的hERG阻斷劑。
出于舉例說明的目的但不受此限制，在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，在位于跨膜結(jié)構(gòu)域S1和S2之間的連接部分上基因工程化如hERG-G601S這樣的離子通道的突變型以表達(dá)如HA標(biāo)記物這樣的細(xì)胞外標(biāo)記物(這樣的標(biāo)記物優(yōu)選不改變通道的功能性質(zhì))。將穩(wěn)定表達(dá)該標(biāo)記物的突變體(如hERG-G601S-HA)的如HEK 293細(xì)胞的細(xì)胞鋪于如96孔微量滴定板這樣的適當(dāng)?shù)娜萜髦?，并且用一種或多種候選試劑孵育足夠的時(shí)間，如過夜。然后細(xì)胞優(yōu)選用如甲醛進(jìn)行固定，但是優(yōu)選不進(jìn)行滲透并且加入識(shí)別HA標(biāo)記物的抗體。使用優(yōu)選結(jié)合到如辣根過氧化物酶這樣的酶上的二抗與結(jié)合到固定細(xì)胞表面上的抗HA抗體結(jié)合。接著可以用如化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)混合物這些任何適當(dāng)?shù)姆椒ǖ玫郊?xì)胞表面信號(hào)，并且在例如微量滴定板光度計(jì)中測(cè)定表達(dá)水平。對(duì)照細(xì)胞通常用水和/或其它用于與候選試劑結(jié)合的任意液態(tài)載體如DMSO孵育。增加第一突變型的表面表達(dá)的試劑是潛在的hERG(或類似的這種離子通道)的阻斷劑。
在本發(fā)明的方法中使用的hERG的適當(dāng)?shù)牡诙蛔冃鸵彩潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，表達(dá)在表面上的這種突變型的水平低于任意的野生型，更優(yōu)選的是由于運(yùn)輸缺陷，但是當(dāng)表達(dá)于細(xì)胞表面上時(shí)應(yīng)當(dāng)不具有功能。適當(dāng)?shù)膆ERG突變型的示例形例子包括但不限于G601S/F656C和N470D/F656C。不增加如G601S/F656C和N470D/F656C這樣的突變體的表面表達(dá)的試劑是潛在的hERG阻斷劑。
同樣，出于舉例說明的目的且不限于此的是，在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，在跨膜結(jié)構(gòu)域S1和S2之間的連接部分中基因工程化如hERG-G601S/F656C這樣的離子通道的第二突變型，用以表達(dá)如HA標(biāo)記物這樣的細(xì)胞外標(biāo)記物(同樣，這樣的標(biāo)記物優(yōu)選應(yīng)當(dāng)不改變通道的功能性質(zhì))。將穩(wěn)定表達(dá)該標(biāo)記的突變體(如hERG-G601S/F656C-HA)的(如HEK293細(xì)胞這樣的)細(xì)胞鋪于(如96孔微量滴定板這樣的)適當(dāng)?shù)娜萜髦校⑶遗c候選試劑孵育足夠的時(shí)間，優(yōu)選為增加第一突變型的表面表達(dá)的候選試劑。將細(xì)胞優(yōu)選接著進(jìn)行固定并不進(jìn)行滲透，并且加入識(shí)別HA標(biāo)記物的一抗。將優(yōu)選結(jié)合到酶上的二抗然后用于與結(jié)合到固定細(xì)胞表面的抗HA抗體結(jié)合。接著可以用如化學(xué)發(fā)光反應(yīng)混合物這樣的任意適當(dāng)?shù)姆椒ǖ玫郊?xì)胞表面信號(hào)，并且在如微量滴定板光度計(jì)中測(cè)定表達(dá)水平。對(duì)照細(xì)胞通常用水和/或任意用于與候選試劑結(jié)合的液態(tài)載體，如DMSO進(jìn)行孵育。那些不增加第二突變型的表面表達(dá)水平的試劑可能是有效的hERG阻斷劑。增加第一突變型的表面表達(dá)水平而不增加第二突變型的表面表達(dá)水平的試劑更有可能是有效的hERG阻斷劑。
根據(jù)上述方法的更特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，hERG表面表達(dá)通過從培養(yǎng)箱中移出微量滴定板并除去浸泡細(xì)胞的培養(yǎng)液來進(jìn)行測(cè)量。用PBS(100μl)將孔漂洗三次接著用多聚甲醛(如4％在PBS中、pH為7.2、100μl)固定細(xì)胞，再用PBS漂洗。優(yōu)選阻斷在細(xì)胞表面上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，例如用在PBS中的1％羊血清(“阻斷緩沖液”)孵育細(xì)胞。在除去阻斷緩沖液之后，將細(xì)胞在阻斷緩沖液中與例如鼠抗HA這樣的一抗孵育。然后去除一抗，清洗細(xì)胞(如用阻斷緩沖液清洗3次)。加入如在阻斷緩沖液中的辣根過氧化物酶結(jié)合的抗鼠羊抗體這樣的二抗。然后除去二抗，并且優(yōu)選對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗。
根據(jù)該
具體實(shí)施例方式
，用任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)可以開發(fā)出化學(xué)發(fā)光信號(hào)，如SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce Chemical Co.)。加入適量的試劑，如微量滴定板每孔50μl，并且用GloRunner luminometer(Turner Designs)獲得數(shù)據(jù)。
可選地加入熒光反應(yīng)用以監(jiān)測(cè)每孔的細(xì)胞數(shù)量。
II.治療組合物和方法本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
還是通過向需要其的哺乳動(dòng)物(如需要其的人)給予有效量的用上述測(cè)定方法識(shí)別的試劑來阻止或治療心律失常的方法。優(yōu)選地，該阻止或治療心律失常的發(fā)明的方法是通過向需要其的哺乳動(dòng)物如需要其的人給予增加hERG的第一突變型的表面表達(dá)水平的有效量的試劑，如G601S或N470D。更優(yōu)選地，該試劑不增加如G610S/F656C或N470D/F656C這樣的hERG的第二突變型的表達(dá)水平。
本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
還包括用于在哺乳動(dòng)物如人體內(nèi)阻止或治療心律失常的組合物，包括有效量的這樣的試劑以及藥學(xué)可接受的載體。
適用于本發(fā)明的治療方法和組合物的特別優(yōu)選的試劑的示例性例子是伐諾司林(也稱作GBR-12909)。伐諾司林，其制造和/或其一些藥物用途描述于美國(guó)專利第4,202,896號(hào)、第4,476,129號(hào)和第4,874,765號(hào)以及歐洲專利第243,903號(hào)和PCT國(guó)際專利申請(qǐng)第WO91/01732號(hào)。
伐諾司林的藥學(xué)可接受的鹽也可以用于本發(fā)明的方法中。可用于本發(fā)明的方法中的伐諾司林的藥學(xué)可接受的鹽包括但不限于由無毒性的無機(jī)酸或有機(jī)酸生成的伐諾司林的鹽類。例如，藥學(xué)可接受的鹽包括但不限于如下的鹽類由無機(jī)酸衍生的鹽類，如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸和類似物；由有機(jī)酸衍生的鹽類，如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、撲酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、安息香酸、水楊酸、對(duì)氨基苯磺酸、2-乙酸基-安息香酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙磺酸、三氟乙酸和類似物；以及由氨基酸衍生的鹽，如谷氨酸或天冬氨酸。參見美國(guó)專利第6,187,802號(hào)和WO91/01732。
在本發(fā)明的方法中，有用的伐諾司林的藥學(xué)可接受的鹽類可以通過常規(guī)的化學(xué)方法由伐諾司林合成。通常，通過離子交換層析法或在適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉軇└鞣N組合中通過將游離的堿與化學(xué)計(jì)量的或超量的形成鹽所需的無機(jī)酸或有機(jī)酸進(jìn)行反應(yīng)來制備該鹽。
當(dāng)給予哺乳動(dòng)物如人時(shí)，只要它們提供所需要的藥物學(xué)反應(yīng)和適宜于本發(fā)明方法中其它適當(dāng)?shù)挠猛緯r(shí)，如呈現(xiàn)可接受的毒理學(xué)特征，在使用條件下相對(duì)穩(wěn)定等，伐諾司林的藥學(xué)可接受的代謝物可以用于本發(fā)明的方法中?？梢詰?yīng)用于本發(fā)明方法中的適宜的代謝物的示例性例子包括但不限于如下1-[2-(二苯基甲氧基)乙基]-4-(3-苯丙基)哌嗪(其也稱作GBR 12935并且是伐諾司林在人體中主要的代謝物)和藥學(xué)可接受的鹽、類似物和其衍生物。
當(dāng)給予哺乳動(dòng)物如人時(shí)，只要它們具有所需的藥物學(xué)反應(yīng)，和適宜于本發(fā)明方法的其它適當(dāng)?shù)挠猛救绯尸F(xiàn)可以接受的毒理學(xué)特性，在使用條件下相對(duì)穩(wěn)定等，伐諾司林的藥學(xué)可接受的衍生物也可以用于本發(fā)明的方法中。用于本發(fā)明方法中的適宜的衍生物的示例性例子包括但不限于如下GBR13069和GBR12783，它們分別與伐諾司林和GBR12935的結(jié)構(gòu)類似，除了3-苯丙基部分已經(jīng)被3-苯丙烯-2-基部分取代。
其它適宜的衍生物包括伐諾司林的酚衍生物，即其中伐諾司林的未取代的苯基基團(tuán)被一個(gè)或多個(gè)羥基以及其甲氧基同系物基團(tuán)取代的伐諾司林的衍生物。(參見Rice et al.，“Oxygenated analoguesof 1-(2-(diphenylmethoxy)ethyl)-and 1-(2-(bis(4-fluorophenyl)methoxy)ethyl)-4-(3-phenylpropyl)piperazines(GBR 12935andGBR 12909)as Potential Extended-Action Cocaine-Abuse TherapeuticAgents，”J.Med.Chem.42(23)5029-5042(2001)；和Dutta et al.，“Positional Importance of the Nitrogen Atom in Novel PiperidineAnalogs of GBR 12909Affnity and Selectivity for the DopamineTransporter，”Med.Chem.Res.3(4)209-222(1993))。
可以用于本發(fā)明方法中的適宜的衍生物的另外的例子包括4-[2-雙(鹵苯基)甲氧基]-乙基]-α-(取代苯基)-1-哌嗪烷醇衍生物。參見如美國(guó)專利第4,476,129號(hào)。
當(dāng)用于本方法時(shí)，可以用任何能夠?qū)⑺幬锘钚栽噭┮胨枰淖饔貌课坏姆椒?，包括但不限于口腔、舌下、鼻、口、局部、直腸和胃腸外給藥的方法，來給予伐諾司林、或藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或其代謝物?；衔锏妮斔鸵部梢岳闷は轮踩胛锘蛲钙べN劑這樣的可控釋放的劑型。
對(duì)于口服給藥，含有伐諾司林、或藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或其代謝物的適宜組合物可以制成片劑、糖衣丸、膠囊、糖漿和水性或油性混懸劑的形式。用于制備這些組合物的惰性成分是本領(lǐng)域已知的。例如片劑可以通過將活性化合物在如馬鈴薯淀粉或微晶纖維素這樣的崩解劑、和如硬脂酸鎂或滑石粉這樣的潤(rùn)滑劑存在下與如乳糖或磷酸鈣這樣的惰性稀釋液混合來制備，然后用已知的方法將該混合物制成片劑。
片劑也可以用本領(lǐng)域已知的方法制成伐諾司林、或藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或其代謝物的持續(xù)釋放劑型。如果需要，該片劑可以通過已知的方法提供腸衣，例如通過使用醋酸鄰苯二甲酸纖維素。適當(dāng)?shù)恼澈蟿┗虺闪┌ǖ幌抻诿髂z、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或糊精?；⒛z態(tài)硅酸、硬脂酸甘油以及硬脂酸鈣和硬脂酸鎂或類似物可以用作抗粘劑及滑動(dòng)劑。
片劑也可以通過濕法造粒及隨后的壓制法制備。含有伐諾司林、或藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或其代謝產(chǎn)物的混合物與至少一種稀釋劑，以及可選的一部分崩解劑與粘合劑水、乙醇或水-乙醇溶液在適當(dāng)?shù)难b置中一起成粒，然后將顆粒干燥。之后，向干燥的顆粒中混入其它的防腐劑、表面活性劑、分散劑、崩解劑、滑動(dòng)劑和抗粘添加劑，并且將該混合物壓制成片劑或膠囊。
片劑也可以通過將含有活性成分的混合物與所需的添加劑直接壓制在一起來制備。如果需要該片劑可以通過加入制藥工業(yè)中通常使用的如蔗糖、纖維素衍生物(甲基-或乙基纖維素或羧甲基纖維素鈉)、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸鈣、碳酸鈣、食品染料、香味劑、氧化鐵色素和類似物的保護(hù)劑、調(diào)味劑和染色劑變?yōu)樘且峦琛?br> 為了制備膠囊或囊片，將伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物，以及所需的添加劑的混合物填充到如硬質(zhì)或軟質(zhì)明膠的膠囊中。用已知的方法配制膠囊和/或囊片的內(nèi)容物，從而得到持續(xù)釋放的活性化合物。
液態(tài)口服劑型的伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物，可以是酏劑、混懸劑和/或糖漿，其中將該化合物與無毒的懸浮劑混合。液態(tài)口服劑型也可以包括一種或多種甜味劑、調(diào)味劑、防腐劑和/或其混合物。
對(duì)于直腸給藥，含有伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物的合適的組合物可以制成栓劑形式。除了活性成分外，該栓劑可以含有藥物生產(chǎn)中常用的栓劑物質(zhì)，如可可豆油、甘油明膠或高分子量的聚乙二醇。
為了胃腸外給藥，伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物的合適的組合物可以制成注射液或混懸劑形式。對(duì)于活性成分可以溶于水性或非水性等滲滅菌注射液或混懸液中，如乙二醇醚、或可選地在如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸鹽、單油酸鹽或單硬脂酸鹽這樣的增溶劑存在下制備注射液或混懸劑。這些溶液或混懸劑可以由上文提到的在用于口服給藥劑型中使用的含有一種或多種載體或稀釋劑的滅菌粉末或顆粒制備。腸胃外給藥可以通過靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下注射。
含有伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物的組合物也可以經(jīng)鼻給藥，例如通過噴霧、氣溶膠、霧化溶液和/或粉末的形式。也可以使用本領(lǐng)域已知的計(jì)量的劑量系統(tǒng)。
伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物的藥物組合物也可以以這種給藥方式將已知的藥物形式給予口腔(例如舌下)，如緩慢溶解的片劑、口嚼劑、藥片、糖錠劑、錠劑、凝膠、軟膏、嗽口水、洗劑和/或粉劑。
用于局部給藥的含有伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物的組合物可以包括一種基質(zhì)，其中藥物活性化合物被分散到該基質(zhì)中從而保持與皮膚接觸以便透皮給予該化合物。合適的透皮組合物可以通過將伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物與局部用載體如礦物油、礦脂和/或蠟，例如石蠟或蜂蠟，以及潛在的透皮促進(jìn)劑，如二甲基亞砜或丙二醇一起混合來制備。另外一種可替換的方法是，可以將伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物分散到藥學(xué)可接受的乳劑或油膏基底中。包含在局部用劑型中的伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物的量應(yīng)當(dāng)是在皮上使用的局部用配方的時(shí)間段內(nèi)遞送的有效治療量。
伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物也可以通過外源的連續(xù)灌輸如通過靜脈內(nèi)灌輸或通過置于體內(nèi)的化合物源來給藥。內(nèi)源包括植入的伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物的儲(chǔ)庫，為了例如通過滲透能夠連續(xù)釋放的灌輸，該植入物可以是(a)該化合物的藥學(xué)上可接受的油的形式如混懸劑或溶液這樣的液體，例如以非常少量的水溶性衍生物如十二烷酸鹽的形式灌輸，或(b)用于灌輸化合物的植入載體形式的固體，例如合成樹脂或蠟質(zhì)材料。該載體可以是含有所有化合物的單體或一系列的幾個(gè)個(gè)體，其每一個(gè)含有部分待遞送的化合物。在內(nèi)源中存在的伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物的量應(yīng)當(dāng)是保證在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)遞送有效治療量的量。
另外，伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物的注射液可以含有各種添加劑如防腐劑，如苯甲醇、4-羥基安息香酸甲基或丙基酯、苯扎氯銨、硼酸苯汞及類似物；以及抗氧化劑，如抗壞血酸、生育酚、焦硫酸鈉和可選的絡(luò)合物形成試劑，如用于結(jié)合痕量金屬的乙二胺四乙酸鹽，以及用于調(diào)節(jié)pH值的緩沖液和可選的局部麻醉劑，如利多卡因。含有伐諾司林、或其藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物或代謝物的注射液在裝入安瓿前要過濾，而注入后要滅菌。
用于本發(fā)明的這樣的治療方法的其它試劑包括任意已知的hERG阻斷劑，如阿司咪唑、特非那丁、E-4031、西沙必利、氯喹和類似物。
實(shí)施例實(shí)施例1-用阿司咪唑援救hERG-G601S表面表達(dá)將穩(wěn)定表達(dá)hERG-G601S-HA的HEK-293細(xì)胞置于帶有透明底的BIOCOAT聚-D-賴氨酸細(xì)胞培養(yǎng)皿(cellware)的96孔黑色平板中(BD Discovery Labware)。將細(xì)胞鋪于(8×104細(xì)胞/孔)含有10％FBS加上青霉素-鏈霉素和遺傳霉素(geneticin)(G418；0.5mg/ml)的DMEM/F12的完全培養(yǎng)液中，加藥前在37℃/5％CO2下孵育8小時(shí)。制備藥物(阿司咪唑、去甲阿司咪唑、非索非那定)的儲(chǔ)液(200μM、1mM和5mM)。就加入前在含有10％FBS的DMEM/F 12中制備工作稀釋液(200nM、1μM和5μM)。載體由在含有10％FBS的DMEM/F12中的0.1％DMSO構(gòu)成。除去浸泡細(xì)胞的培養(yǎng)液，并且用含有藥物或載體的對(duì)照培養(yǎng)液(100μl/孔)替代。對(duì)于每一種藥物每個(gè)濃度有3個(gè)測(cè)試孔和3個(gè)對(duì)照孔。在表面表達(dá)的測(cè)試開始之前，將孔板在37℃/5％CO2下孵育過夜(約16小時(shí))。
在室溫下，在工作臺(tái)上進(jìn)行表面表達(dá)測(cè)定。將細(xì)胞用100μl的PBS清洗3次，隨后用新制備的冰冷的溶于PBS的4％多聚甲醛(pH為7.2、100μl、20min)固定。去除固定液，并用100μl的PBS清洗細(xì)胞。通過在PBS中與1％的羊血清(阻斷緩沖液、100μl持續(xù)30min)孵育阻斷了細(xì)胞表面上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。除去阻斷緩沖液并用在阻斷緩沖液中稀釋的鼠抗HA(1∶500稀釋、100μl，Roche)孵育細(xì)胞3小時(shí)。移去一抗之后，用1％的羊血清PBS溶液(100μl和10min/洗)清洗細(xì)胞3次。將HRP-結(jié)合的羊抗鼠抗體(1∶2000；Jackson Labs)用阻斷緩沖液稀釋并且與細(xì)胞孵育1小時(shí)(100ul/孔)。在孵育后，將細(xì)胞用100μl的1％羊血清PBS溶液清洗(10min)，然后用100μl的PBS(10min/洗)清洗3次。
用SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce Chemical Co.)測(cè)定化學(xué)發(fā)光信號(hào)。從孔中除去PBS并且用每孔100μl的檢測(cè)試劑取代。用GloRunner luminometer(TurnerDesigns)立即捕獲信號(hào)。
得到的數(shù)據(jù)顯示藥物援救hERG-G601S-HA表面表達(dá)的能力與其阻斷hERG的能力直接相關(guān)。因此，阿司咪唑比更弱的阻斷劑去甲阿司咪唑更多地增加了表面表達(dá)。類似地，根本不阻斷hERG的非索非那定不增加hERG-G601S-HA的表面表達(dá)。
實(shí)施例2-去除在hERG中結(jié)合位點(diǎn)的藥物去除用阿司咪唑的救援將在35mm培養(yǎng)皿中的HEK-293細(xì)胞用編碼hERG-G601S-HA或hERG-G601S/F656C-HA的cDNA短暫轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后在一些平板中加入阿司咪唑(1μM)，而另一些平板中加入載體對(duì)照(DMSO)，將這些平板孵育過夜。
在孵育后，將細(xì)胞用多聚甲醛固定，并且如上所述加工用于表面表達(dá)的HA標(biāo)記物(除了成比例的增大試劑體積)。用TD20/20光度計(jì)(Turner Biosystems)測(cè)量化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
得到的數(shù)據(jù)顯示阿司咪唑不能援救雙突變體hERG-G601S/F656C的表達(dá)，但是確實(shí)可以援救hERG-G601S的表達(dá)，表明它是一個(gè)有效的hERG阻斷劑。
現(xiàn)在已經(jīng)完全描述了本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易理解本發(fā)明的方法可以用于更寬泛和等同范圍內(nèi)的病癥、劑型和其它參數(shù)而不背離本發(fā)明的保護(hù)范圍或其任何具體實(shí)施方式
。
在本文中所引用的所有專利和出版物以引用的方式將其全部?jī)?nèi)容合并于本文中。任何出版物的引用是因其披露先于本申請(qǐng)?zhí)峤蝗?，并不?yīng)當(dāng)認(rèn)為承認(rèn)這些出版物是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)或本發(fā)明不享有憑借已有發(fā)明的公開所具有的更早的申請(qǐng)日。
權(quán)利要求
1.一種識(shí)別改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中內(nèi)在膜蛋白的表面表達(dá)水平的試劑的方法，所述方法包括a)制備含有表達(dá)所述膜蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第一培養(yǎng)液；b)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)液中加入有效量的候選試劑；c)在存在所述候選試劑的情況下將所述細(xì)胞孵育足夠的時(shí)間；d)向所述含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第一培養(yǎng)液中加入有效量的至少一種抗體，所述抗體與所述膜蛋白的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合；以及e)在用所述候選試劑孵育后，測(cè)定所述至少一種抗體對(duì)所述細(xì)胞外抗原決定部位的結(jié)合水平，其中所述結(jié)合水平相對(duì)于對(duì)照的變化表明所述候選試劑改變了所述膜蛋白的表面表達(dá)水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，進(jìn)一步包括如下步驟f)制備含有表達(dá)所述膜蛋白的第二突變型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二培養(yǎng)液，所述第二突變型與所述第一突變型不同，并且在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的表達(dá)水平低于所述膜蛋白的野生型；g)向所述含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二培養(yǎng)液中加入有效量的所述候選試劑；h)在存在所述候選試劑的情況下，將所述細(xì)胞孵育足夠的時(shí)間；i)向所述含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二培養(yǎng)液中加入有效量的至少一種抗體，所述抗體結(jié)合于所述膜蛋白的第二突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位；以及j)在用所述候選試劑孵育后，測(cè)定所述至少一個(gè)抗體與所述膜蛋白的所述第二突變型的細(xì)胞外抗原決定部位的結(jié)合水平，其中所述結(jié)合水平相對(duì)于對(duì)照的變化表明所述候選試劑改變了所述膜蛋白的第二突變型的表面表達(dá)水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟(d)包括加入有效量的至少一種一抗和有效量的至少一種二抗，其中，所述一抗結(jié)合于所述膜蛋白的第一突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位，而所述二抗結(jié)合于所述一抗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述結(jié)合水平是通過熒光、發(fā)光、放射性、吸光度或它們兩種或多種的結(jié)合測(cè)定的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述內(nèi)在膜蛋白是一種膜離子通道。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述膜離子通道是鈉通道、鉀通道、鈣通道或氯通道。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位包括野生型抗原決定部位。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位包括標(biāo)記物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞外標(biāo)記物取代所述內(nèi)在膜蛋白的至少一部分的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞外標(biāo)記物插入到所述膜蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞外標(biāo)記物包括血凝素(HA)標(biāo)記物。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述一抗和/或所述二抗偶聯(lián)到一種酶上。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述酶選自由過氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶以及其兩種或多種混合物構(gòu)成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述第一突變型包括一個(gè)與所述膜蛋白的野生型氨基酸序列至少有一個(gè)氨基酸殘基不同的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第二突變型包括一個(gè)與所述膜蛋白的野生型氨基酸序列至少有一個(gè)氨基酸殘基不同的氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述第一突變型是一運(yùn)輸缺陷型突變體。
17.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第二突變型是一運(yùn)輸缺陷型突變體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述膜蛋白是一種鉀離子通道。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述鉀離子通道是hERG。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述hERG的第一突變型是G601S。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述hERG的第一突變型是N470D。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述hERG的第二突變型是G601S/F656C。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述hERG的第二突變型是N470D/F656C。
24.一種用于阻止或治療心律失常的方法，包括向需要的哺乳動(dòng)物給予有效量的活性試劑，其中所述活性試劑當(dāng)用如下方法測(cè)定時(shí)提高哺乳細(xì)胞中hERG的第一突變型的表面表達(dá)水平，而不提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中hERG的第二突變型的表面表達(dá)水平a)制備含有表達(dá)hERG的所述第一突變型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第一培養(yǎng)液，其中所述第一突變型以低于hERG野生型的水平表達(dá)于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面；b)向所述第一培養(yǎng)液中加入有效量的所述活性試劑；c)在所述活性試劑存在下，將所述細(xì)胞孵育足夠的時(shí)間；和d)向所述含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第一培養(yǎng)液中加入有效量的至少一種抗體，該抗體與hERG的所述突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合，e)測(cè)定所述至少一種抗體與所述細(xì)胞外抗原決定部位的結(jié)合水平，f)制備含有表達(dá)hERG的第二突變型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二培養(yǎng)液，其中所述第二突變型與所述第一突變型不同，并且在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的表達(dá)水平低于hERG的野生型；g)向所述含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二培養(yǎng)液中加入有效量的所述活性試劑；h)在存在所述活性試劑的情況下，將所述細(xì)胞孵育足夠的時(shí)間；i)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第二培養(yǎng)液中加入有效量的至少一種抗體，該抗體與hERG的所述第二突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合；以及j)測(cè)定所述至少一種抗體對(duì)hERG的所述第二突變型的所述細(xì)胞外抗原決定部位的結(jié)合水平。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述活性試劑是伐諾司林或其藥學(xué)可接受的鹽。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟d)包括加入有效量的至少一種一抗和有效的量至少一種二抗，其中所述一抗與hERG的所述第一突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合，并且所述二抗與所述一抗結(jié)合。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述結(jié)合水平是通過熒光、發(fā)光、放射性、吸光度或它們兩種或多種的結(jié)合測(cè)定的。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位含有一個(gè)標(biāo)記物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述細(xì)胞外標(biāo)記物取代了hERG的至少一部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述細(xì)胞外標(biāo)記物插入到hERG的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述細(xì)胞外標(biāo)記物包括血凝素(HA)標(biāo)記物。
32.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述一抗和/或所述二抗偶聯(lián)到一種酶上。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述酶選自由過氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、以及其兩種或多種混合物構(gòu)成的組。
34.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第一突變型是一運(yùn)輸缺陷型突變體。
35.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中hERG的所述第一突變型是G601S。
36.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中hERG的所述第一突變型是N470D。
37.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中hERG的所述第二突變型是G601S/F656C。
38.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中hERG的所述第二突變型是N470D/F656C。
39.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟i)包括加入有效量的至少一種一抗和有效量的至少一種二抗，其中所述一抗與hERG的所述第二突變型的至少一個(gè)細(xì)胞外抗原決定部位結(jié)合，并且所述二抗與所述一抗結(jié)合。
40.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述膜蛋白是一突變型，該突變型在所述細(xì)胞表面的表達(dá)水平低于所述蛋白的野生型。
全文摘要
本發(fā)明披露了用于識(shí)別改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中如心臟離子通道這樣的內(nèi)在膜蛋白的表面表達(dá)水平的試劑的高通量測(cè)定系統(tǒng)和方法。本發(fā)明還披露了使用由該方法識(shí)別的試劑的治療方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1878553SQ200480026304
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2004年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月15日
發(fā)明者阿瑟·M·布朗, ?？斯隆し瓶藸? 芭芭拉·A·威布爾 申請(qǐng)人:錢克斯普瑞斯公司