專利名稱：用于在微流通道網(wǎng)絡(luò)中使用光學(xué)開關(guān)將細(xì)胞分類的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在微流通道網(wǎng)絡(luò)中使用光學(xué)力(optical force)來提供一種光學(xué)開關(guān)的方法和設(shè)備，該光學(xué)開關(guān)使得目標(biāo)細(xì)胞能夠選擇定向穿過(routing through)該網(wǎng)絡(luò)以便將它們從非目標(biāo)細(xì)胞中分選出來并且收集它們。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的熒光激活細(xì)胞分選器(FACS)被廣泛用在研究和臨床應(yīng)用1中。這些儀器能夠進(jìn)行非常迅速的多參數(shù)分析和分選，但是通常需要大量試樣和用于操作和維護(hù)的熟練操作人員，并且難以消毒。FACS能夠分析少至10,000并且多至幾千萬個(gè)細(xì)胞。但是，低于100000個(gè)細(xì)胞，則進(jìn)行分選的能力降低1。其它分離方法例如磁珠不需要與FACS一樣多的細(xì)胞，但是它們會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞和磁珠的非特定粘接、聚集并且出現(xiàn)磁珠自身可能在隨后的處理步驟中干涉(interfere)的問題。因此，為了分選來自初生組織的寶貴較小試樣或細(xì)胞，能夠處理具有較低細(xì)胞數(shù)的小試樣體積并且允許有效恢復(fù)所分選的群體的細(xì)胞分選器具有獨(dú)特的科學(xué)環(huán)境。
微制造的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器具有能在一個(gè)易于使用的封閉系統(tǒng)中分選少至1000個(gè)細(xì)胞并同時(shí)消耗較少的試劑的可能性。后者是重要的，因?yàn)榕c傳統(tǒng)的FACS儀器不同，不會(huì)產(chǎn)生氣溶膠，降低了分選細(xì)胞受污染的風(fēng)險(xiǎn)和與生物毒害性材料一起工作的風(fēng)險(xiǎn)。已經(jīng)描述了幾個(gè)微制造的細(xì)胞分選器，但是大部分作為“概念的證明”。Fu等人2報(bào)導(dǎo)了E.coli在17個(gè)細(xì)胞/秒的通過量下的30倍富集。在分選之后僅有20％的細(xì)菌存活，并且在目標(biāo)容器內(nèi)的分選純度是30％。在后面的研究3中，通過量提高至44個(gè)細(xì)胞/秒，但是目標(biāo)純度降低至小于10％，所報(bào)導(dǎo)的恢復(fù)率為39％。Wolff等人4能夠以100倍的富集，以12000事件/秒的通過量從小雞的紅細(xì)胞中分選出珠(bead)。但是目標(biāo)井中的純度大約是1％。在這些研究中，富集被定義為，與起始濃度相比，在收集井中的目標(biāo)群體濃度的增長。純度指分選的精度，是所分選的目標(biāo)細(xì)胞在分選進(jìn)收集井中的所有細(xì)胞上的百分比。恢復(fù)率被定義為熒光檢測(cè)器所計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)對(duì)從收集井中恢復(fù)的細(xì)胞的比值。后兩項(xiàng)研究在微流設(shè)備中使用了壓力開關(guān)，它切換整個(gè)流體流路，并且因此切換在流體插頭(plug)中含有的任何顆粒。這些開關(guān)中的機(jī)械順應(yīng)性導(dǎo)致流體開關(guān)速度成為通過量的速率限制臺(tái)階3。也已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了動(dòng)電流體控制，例如電滲2，5，6和介電電泳7，8，9，但是高電場(chǎng)梯度和在緩沖溶液的離子強(qiáng)度上的物理化學(xué)限制對(duì)于細(xì)胞來說是非理想條件。
Buican等人9首先提出使用光學(xué)力來檢測(cè)通過流體通道的顆粒。由光束施加在顆粒上的力是顆粒及其周圍流體介質(zhì)的光強(qiáng)度和相對(duì)光學(xué)性能的函數(shù)。對(duì)于直徑大約為10μm的生物細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)大約1pN/mW的力。雖然該光學(xué)力較小，但是使細(xì)胞偏轉(zhuǎn)進(jìn)入附近的細(xì)胞流中所需的力也較小例如為900pN以使直徑為10μm的細(xì)胞在幾個(gè)毫秒內(nèi)橫向越過細(xì)胞流運(yùn)動(dòng)20-40μm。這是以由這個(gè)橫向運(yùn)動(dòng)隱含的速度克服在細(xì)胞上的粘性拖曳力所需的力。
在美國專利6744038中可以找到在這些光學(xué)力和一般背景技術(shù)后面的原理，該文獻(xiàn)其全文在這里被應(yīng)用作為參考。

發(fā)明內(nèi)容
如下面所述，這些光學(xué)力用來實(shí)現(xiàn)可操作作為細(xì)胞分選系統(tǒng)的微流通道網(wǎng)絡(luò)中的光學(xué)開關(guān)。通過檢測(cè)來自在光學(xué)開關(guān)位置上游在微流通道網(wǎng)絡(luò)中流動(dòng)的目標(biāo)細(xì)胞的熒光信號(hào)來觸發(fā)該光學(xué)開關(guān)，雖然同樣可以采用其它檢測(cè)方法例如光散射來促動(dòng)光學(xué)開關(guān)。該光學(xué)開關(guān)用來在不改變下面液流的情況下將細(xì)胞或顆粒引導(dǎo)進(jìn)多條輸出通道液流中的一條，由此收集所期望的細(xì)胞以便另外使用。重要的是，在微流通道中的液流通常以非常低的Reynolds數(shù)分層。因此，在特定層或液流中流動(dòng)的任意細(xì)胞在沒有存在任何與橫越該層的力的情況下將留在那個(gè)液流中。光學(xué)開關(guān)利用在細(xì)胞上的光學(xué)力來正好實(shí)現(xiàn)細(xì)胞橫越該層的這個(gè)運(yùn)輸，從而使細(xì)胞從通過一條輸出通道離開分叉交界處的液流運(yùn)動(dòng)到位于通過第二條輸出通道離開所述分叉交界處的液體。
在前面段落中所述的本發(fā)明詳細(xì)描述了用來形成光學(xué)開關(guān)的方法以及用來優(yōu)化該光學(xué)開關(guān)的方案、微流通道網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)和細(xì)胞或顆粒在微流網(wǎng)絡(luò)中的流動(dòng)性能以便實(shí)現(xiàn)分選性能的提高。該光學(xué)開關(guān)通常通過將光學(xué)照明場(chǎng)投射到在微流通道中建立的液流中的細(xì)胞軌跡附近的微流通道網(wǎng)絡(luò)中來工作。細(xì)胞與光場(chǎng)的相互作用產(chǎn)生出在細(xì)胞上的力，該力使之橫越所建立的液流輸送，從而它在所建立的流中從一條液流運(yùn)動(dòng)到另一條液流，而不會(huì)俘獲該細(xì)胞或明顯改變其在主流中的運(yùn)動(dòng)。
在下面的內(nèi)容中，術(shù)語細(xì)胞和顆粒兩者都應(yīng)該被理解為指的是生物細(xì)胞、生物顆粒、天然有機(jī)或無機(jī)顆粒和人造有機(jī)或無機(jī)顆粒中的任一種。在微流通道網(wǎng)絡(luò)中所分選的細(xì)胞的粒徑范圍大約為1μm至大約50μm。更通常的是，直徑大約為100nm至大約100μm的細(xì)胞為用于通過在微流通道網(wǎng)絡(luò)中的光學(xué)開關(guān)進(jìn)行分選的候選物。
還有，已經(jīng)采用激光器來產(chǎn)生出用在光學(xué)開關(guān)中的光束。當(dāng)前用于光學(xué)開關(guān)的激光器為近IR連續(xù)波激光器，它已知在用來展示光學(xué)開關(guān)的功率密度和曝光時(shí)間下不會(huì)傷害生物細(xì)胞的存活性。針對(duì)不同的用途可以考慮可選的激光源，例如如果對(duì)顆粒的損害不是問題則考慮可見或近UV波長激光器，或者在可以使用較大光通量來使顆粒非常迅速運(yùn)動(dòng)的情況下考慮脈沖激光器。但是，雖然本發(fā)明的進(jìn)一步說明使用了激光器來形成光學(xué)開關(guān)，但是激光束源不必局限于激光器。


圖1是微流通道網(wǎng)絡(luò)的“Y”形分類交界處的平面視圖；圖2是采用用主通道連接的鞘流箍緊交界處(sheath flow pinchjunction)和“Y”形分選交界處的微流通道網(wǎng)絡(luò)的平面圖，在流體中的細(xì)胞50/50的分離，統(tǒng)稱為50/50光學(xué)開關(guān)網(wǎng)絡(luò)；圖3是采用用主通道連接的鞘流箍緊交界處和“Y”形分選交界處的微流通道網(wǎng)絡(luò)的平面圖，通過不同的鞘流使流體中的細(xì)胞偏斜分離，統(tǒng)稱為鞘流偏斜的光學(xué)開關(guān)網(wǎng)絡(luò)，具有光學(xué)開關(guān)；圖4采用用主通道連接的鞘流箍緊交界處和“Y”形分選交界處的微流通道網(wǎng)絡(luò)的平面圖，通過不同的出口通道寬度使流體中的細(xì)胞偏斜分離，統(tǒng)稱為出口流體偏斜的光學(xué)開關(guān)網(wǎng)絡(luò)，具有光學(xué)開關(guān)。
圖5是50/50光學(xué)開關(guān)網(wǎng)絡(luò)，具有雙向激光線光學(xué)開關(guān)。
圖6是50/50光學(xué)開關(guān)網(wǎng)絡(luò)，具有雙向激光點(diǎn)光學(xué)開關(guān)。
圖7是在具有多于兩個(gè)出口通道的微流通道網(wǎng)絡(luò)中的激光線光學(xué)開關(guān)的平面圖。
圖8顯示了用于調(diào)制和/或關(guān)閉光學(xué)開關(guān)的可能的光學(xué)設(shè)計(jì)。
圖9是鞘流偏斜的光學(xué)開關(guān)網(wǎng)絡(luò)的平面圖，具有激光點(diǎn)光學(xué)開關(guān)，該開關(guān)平行于細(xì)胞流或者與細(xì)胞流成一定角度地平移。
圖10顯示了用于細(xì)胞檢測(cè)和觸發(fā)器決定方法的檢測(cè)器布局和使用一個(gè)激光源的時(shí)序/觸發(fā)器圖。
圖11顯示了用于細(xì)胞檢測(cè)和觸發(fā)器決定方法的檢測(cè)器布局和使用兩個(gè)激光源的時(shí)序/觸發(fā)器圖。
圖12是在底部和頂部玻璃基板中的微流通道網(wǎng)絡(luò)的光刻掩模的代表設(shè)計(jì)示意圖，當(dāng)這些基板粘接以形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)的時(shí)候在主通道內(nèi)提供了細(xì)胞流的二維鞘流箍緊。
圖13三維顯示了圖12所述的設(shè)計(jì)。
圖14是微流通道網(wǎng)絡(luò)的側(cè)視圖，提供了沿著豎直方向然后是沿著水平方向的細(xì)胞流的順序鞘流箍緊，導(dǎo)致在主通道內(nèi)的細(xì)胞流的全二維鞘流箍緊。
圖15是圖14所述的微流通道網(wǎng)絡(luò)的三維視圖。
圖16是用于底部和頂部玻璃基板的代表性光刻掩模設(shè)計(jì)的示意圖，當(dāng)所述基板連接在一起的時(shí)候形成圖14和15所示的微流通道網(wǎng)絡(luò)。
圖17是用于完成微流通道網(wǎng)絡(luò)的光刻掩模的代表性實(shí)施方案，具有通向出口的T-箍緊(T-pinch)交界處和T-分叉(T-bifuraction)交界處，以實(shí)施基于細(xì)胞分選方法的光學(xué)開關(guān)。
圖18是用于完成微流通道網(wǎng)絡(luò)的光刻掩模的代表性實(shí)施方案，具有通向出口通道的三角形-箍緊交界處和T-分叉交界處，以實(shí)施基于細(xì)胞分選方法的光學(xué)開關(guān)。
圖19顯示了在完成的微流細(xì)胞分選芯片中的微流通道網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)選實(shí)施方案。
圖20顯示了用于基于微流通道網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞分選器的光學(xué)開關(guān)的獨(dú)立(self-contained)的可丟棄盒的優(yōu)選實(shí)施方案。
圖21顯示了用于基于微流通道網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞分選器的光學(xué)開關(guān)的光學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施方案。
圖22顯示了用于光學(xué)開關(guān)的各種實(shí)施的基于微流通道網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞分選器的光學(xué)開關(guān)的代表性能。
具體實(shí)施例方式
圖1顯示了光學(xué)開關(guān)10的一個(gè)實(shí)施方案，所述光學(xué)開關(guān)用于在1×2微流通道網(wǎng)絡(luò)也就是具有一個(gè)主輸入通道11和兩個(gè)從分叉交界處延伸出來的輸出通道12和13的網(wǎng)絡(luò)中分選細(xì)胞。圖1顯示了用于分叉交界處的“Y”形圖案，但是其他的分叉例如“T”形圖案也可以采用。通常，這些微流通道在光學(xué)透明的基板上制造，以將光學(xué)開關(guān)和其他細(xì)胞檢測(cè)光學(xué)元件投影到通道內(nèi)。該基板通常但是不限于是玻璃、石英、塑料例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等，以及其他可鑄或者可加工的聚合物(例如聚二甲基硅氧烷、PDMS或者SU8)。微流通道的深度通常是但是不限于10μm至100μm的范圍。微流通道的寬度通常是但是不限于深度的1至5倍。截面通常是矩形的，或者在通過玻璃基板光刻掩蔽然后各向同性蝕刻通道而制造微流通道的情況下具有四個(gè)圓角的矩形。
設(shè)定流動(dòng)條件使得在光束(在該情況下是來自激光器的光束)被關(guān)閉或者阻擋而使光束不會(huì)照射到交界處區(qū)域的時(shí)候，所有的細(xì)胞優(yōu)選流入到輸出通道之一中，例如右側(cè)輸出通道13中。當(dāng)打開光束或者不阻擋光束的時(shí)候，光束照射到交界處區(qū)域上，并且通過細(xì)胞與光束之間的相互作用產(chǎn)生的光學(xué)作用力將細(xì)胞導(dǎo)入到左側(cè)輸出通道12中。在該實(shí)施例中，選擇用于引導(dǎo)細(xì)胞的光學(xué)圖案是相對(duì)于流體流動(dòng)方向成某個(gè)角度的激光照明的長細(xì)線。光學(xué)梯度作用力將細(xì)胞橫向移動(dòng)離開細(xì)胞的主流線，從而切換的細(xì)胞離開主通道進(jìn)入到一個(gè)輸出通道，例如12中，而來自細(xì)胞的主流的未切換的細(xì)胞進(jìn)入到另一個(gè)輸出通道，例如13中。通過直接驅(qū)動(dòng)泵作用、氣動(dòng)泵作用、電動(dòng)的、毛細(xì)作用、重力或者其他產(chǎn)生流體流的方式，可以實(shí)現(xiàn)微流通道內(nèi)的流動(dòng)條件的設(shè)定和控制。
就通過量(進(jìn)入到分叉交界處頂部處的分選區(qū)域的細(xì)胞的瞬時(shí)速率)、產(chǎn)率(目標(biāo)細(xì)胞在目標(biāo)輸出通道12中的比例)、以及純度(目標(biāo)細(xì)胞占目標(biāo)輸出通道12中的細(xì)胞總數(shù)量比例)而言，分選機(jī)構(gòu)的性能受到多個(gè)因素的影響，每個(gè)因素影響光學(xué)開關(guān)的實(shí)施。光學(xué)開關(guān)的特征在于幾個(gè)參數(shù)，例如投影到微流通道網(wǎng)絡(luò)的分選交界處區(qū)域中的光學(xué)圖案的形狀，該圖案相對(duì)于分叉交界處的位置，光學(xué)圖案相對(duì)于其最初的位置和形狀的任何運(yùn)動(dòng)，光學(xué)開關(guān)的啟動(dòng)持續(xù)時(shí)間，用于產(chǎn)生光學(xué)開關(guān)圖案的激光源的波長和功率等。給光學(xué)開關(guān)選擇的這些參數(shù)的特定值是在其他事情中的微流通道系統(tǒng)的拓?fù)鋵W(xué)和幾何學(xué)、微流系統(tǒng)中的流速(細(xì)胞速度)、控制在主通道內(nèi)的細(xì)胞流的位置的能力(不論它們是在主通道的中央還是偏離至一側(cè)流動(dòng))、實(shí)現(xiàn)可靠切換必須的細(xì)胞位移量、通道的深度、通道的形狀、以及細(xì)胞與光學(xué)開關(guān)之間的相互作用所產(chǎn)生的作用力的臨界函數(shù)。
通常，當(dāng)細(xì)胞引入到主通道中的流中的時(shí)候，它們?cè)诹鲀?nèi)的任何橫向位置處向通道下方移動(dòng)。因此，由于已知的在微流通道內(nèi)的壓力驅(qū)動(dòng)的流的拋物線(對(duì)于圓柱形微流通道)或者準(zhǔn)拋物線(對(duì)于更普通的截面)速度剖面，細(xì)胞以不同的速度移動(dòng)，這取決于它們的橫向位置。這使其難以將所有細(xì)胞的流偏向一個(gè)輸出通道例如13，如圖1所示。利用這種流的幾何形狀的光學(xué)開關(guān)的任何實(shí)現(xiàn)必須導(dǎo)致低的通過量，并且不能有效地利用可用于制造光學(xué)開關(guān)的激光能量。使用適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)條件可以有助于減少對(duì)光學(xué)開關(guān)的性能的這些限制。
可以通過多種方式來建立適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用圖2所示的鞘流方法，通過夾緊細(xì)胞輸入通道流20以及來自左側(cè)21和右側(cè)22的緩沖器附加流，將細(xì)胞一維聚焦(在所示的平面視圖中沿著水平方向)到主通道中心內(nèi)的一個(gè)行列中。通過使來自每一側(cè)的流量相等來實(shí)現(xiàn)將這些細(xì)胞保持在主通道中心中。該流如圖2所示一樣有效地產(chǎn)生出流體分割面23，并且這最終導(dǎo)致流體和細(xì)胞在分叉交界處的50/50分割。采用這種微流通道設(shè)計(jì)和流動(dòng)條件來實(shí)施用來從混合細(xì)胞群體中分選出目標(biāo)細(xì)胞的光學(xué)開關(guān)需要這樣一種光學(xué)開關(guān)，它主動(dòng)地將目標(biāo)細(xì)胞切換到一條輸出通道即如圖1所示的12，并且將非目標(biāo)細(xì)胞切換到另一條輸出通道，即13。
可選的是，通過將不相等的流投入進(jìn)側(cè)鞘流通道中將聚焦的細(xì)胞行設(shè)置成偏離主通道的中心，圖3a-b。這有效地使得細(xì)胞從輸入通道30歪斜地流向在主通道內(nèi)的分割面33的一側(cè)。細(xì)胞流歪斜流向的主通道的側(cè)面與鞘流具有更高流速的側(cè)面相對(duì)。也就是說，在右鞘緩沖液32比左鞘緩沖液31流得更迅速時(shí)，如圖3a-b所示一樣，細(xì)胞行朝著在主通道的液流左邊歪斜。但是，左鞘流也可以具有更高的流量，這會(huì)將細(xì)胞行推向主通道的右側(cè)。還有在圖3a-b中顯示出熒光檢測(cè)器34和一光學(xué)開關(guān)35。熒光檢測(cè)器用作用來確定所要分選的細(xì)胞的部件，并且將在后面作進(jìn)一步說明。從圖3b中可以看出，有效分選涉及使細(xì)胞從朝著熒光負(fù)性非目標(biāo)細(xì)胞微流通道36離開分叉交界處的液流越過分割面運(yùn)動(dòng)進(jìn)入朝著熒光正性目標(biāo)細(xì)胞微流通道37離開分叉交界處的液流中。可以通過采用直接驅(qū)動(dòng)泵送、氣動(dòng)泵送、電動(dòng)、毛細(xì)作用、重力或其它手段來單獨(dú)控制在相應(yīng)側(cè)通道中的流速以產(chǎn)生出液流或者通過小心平衡在每條微流通道中的壓降以具體設(shè)計(jì)出微流鞘網(wǎng)絡(luò)來確保出現(xiàn)中央流(50/50分割)或偏置流，從而實(shí)現(xiàn)控制鞘緩沖液流速。
用來實(shí)現(xiàn)所有細(xì)胞在熒光檢測(cè)44之前從在主通道中的輸入流40優(yōu)先流進(jìn)一條輸出微流通道即熒光負(fù)性通道46中的可選方案在于采用相等額鞘緩沖液流速41和42來獲得中央箍緊，但是然后優(yōu)選通過讓更大量的液流離開分叉交界處進(jìn)入相對(duì)于熒光正性輸出通道47的熒光負(fù)性輸出通道46來將細(xì)胞流偏壓進(jìn)熒光負(fù)性通道。這在圖4a-b中顯示出，其中左邊輸出通道46比右邊輸出通道47更寬。該結(jié)構(gòu)有效地將分割面43設(shè)置在位于中央的細(xì)胞流的右邊。因此，在細(xì)胞處于所期望的位置中的情況下，然后使用光學(xué)開關(guān)45來使目標(biāo)細(xì)胞越過分隔板移動(dòng)進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞熒光正性右邊輸出通道。通過讓右邊輸出通道比左邊輸出通道更寬使該方案同樣有效，由此通過光學(xué)開關(guān)使目標(biāo)細(xì)胞平移越過目前位于中央細(xì)胞流的左邊的分割面，并且因此目標(biāo)細(xì)胞被分選進(jìn)左邊輸出通道中。因此，通過具體設(shè)計(jì)微流通道輸出網(wǎng)絡(luò)，或者通過積極控制在相應(yīng)輸出通道中的出口背壓，從而可以控制細(xì)胞進(jìn)入所期望的輸出通道的流量。
中央流或偏置流的使用以及聚焦細(xì)胞流離流體分割面的相應(yīng)距離最終決定了實(shí)現(xiàn)可靠切換所需的細(xì)胞的位移大小。這進(jìn)一步?jīng)Q定了實(shí)現(xiàn)可靠切換所需的激光線的長度和激光器功率。細(xì)胞流離分割面越近，則所需的位移量就越短，并且分選過程變得越有效。為了提高所分選群體的純度并且實(shí)現(xiàn)高通過量，在單向布置中的單個(gè)光學(xué)開關(guān)需要試樣流與分割面偏置。這樣，減小誤分選的出現(xiàn)。
該設(shè)計(jì)的一個(gè)可選方案在于使用利用了兩條激光線的雙向光學(xué)開關(guān)。在該方案中，一條激光線將所期望的細(xì)胞分選到一條輸出通道，并且另一條激光線將所有其它細(xì)胞分選進(jìn)另一條輸出通道。該方案可以供50/50(圖2)或者偏置(圖3和4)分割結(jié)構(gòu)使用。在后面的情況中，在細(xì)胞沒有處于切換區(qū)中時(shí)，人們可以選擇將激光器留在其兩個(gè)位置狀態(tài)中的任一個(gè)，或者人們也可以在該期間關(guān)閉該激光器。也可以通過讓兩個(gè)鏡像激光線設(shè)在正好位于分叉交界處上方的切換區(qū)域上來使該光學(xué)開關(guān)成為雙向的，這些激光線單獨(dú)地打開以將細(xì)胞引導(dǎo)至源自分叉交界的兩個(gè)輸出的任一個(gè)中。
在圖5中顯示出在1×2微流網(wǎng)絡(luò)中采用激光線的雙向光學(xué)開關(guān)的示意圖。如圖6所示，也可以用引導(dǎo)至該通道的任一側(cè)上的激光點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)類似的雙向光學(xué)開關(guān)。至于單向光學(xué)開關(guān)，可以在雙向光學(xué)開關(guān)中使用單個(gè)激光源，或者可選的是該雙向光學(xué)開關(guān)可以使用兩個(gè)單獨(dú)的激光源。雙向設(shè)計(jì)潛在地提供了優(yōu)于單向設(shè)計(jì)的一些性能優(yōu)點(diǎn)。第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞由激光引導(dǎo)，所以會(huì)提高純度。第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，因?yàn)榭梢詮膬蓚€(gè)輸出端口的每一個(gè)中導(dǎo)出相等的流，而不是一些預(yù)定比例的流，所以簡化了液流。
雖然迄今在該說明書中只考慮了具有通過一條輸入主通道進(jìn)入通向兩條輸出通道的分叉位置的流的1×2微流通道設(shè)計(jì)，但是也可以采用具有1×N或M×N輸出的微流網(wǎng)絡(luò)。通過具有任意多的單獨(dú)調(diào)制激光線可以在這些更大的網(wǎng)絡(luò)中實(shí)現(xiàn)光學(xué)切換。在圖7a-c中顯示出一些實(shí)施方案。另外，也可以將細(xì)胞多次回送穿過相同的分選器以提高分選純度，或者可選的是，也可以將通道成級(jí)聯(lián)布置以便進(jìn)行多級(jí)分選。
當(dāng)在單向或雙向布置中操作該光學(xué)開關(guān)時(shí)可以考慮兩種不同的促動(dòng)模式無源模式或有源模式。無源模式是這樣的，光學(xué)開關(guān)的狀態(tài)打開或關(guān)閉，而與什么細(xì)胞可以流經(jīng)該通道無關(guān)。在該情況中，不需要知道細(xì)胞什么時(shí)候或者有多少正在進(jìn)入切換區(qū)域，因此根據(jù)激光的狀態(tài)，切換在切換區(qū)域內(nèi)的所有細(xì)胞?？蛇x的是，在有源模式中，在細(xì)胞進(jìn)入檢測(cè)/選擇區(qū)域時(shí)，首先檢測(cè)細(xì)胞，然后根據(jù)一些判斷過程來切換。圖3a-b和圖4a-b顯示出使用正好設(shè)置在切換區(qū)域之前的熒光檢測(cè)器的這種模式的實(shí)施例。在該情況中，所有熒光細(xì)胞被引導(dǎo)至一條輸出通道，并且所有非熒光細(xì)胞被引導(dǎo)至另一條輸出通道。用于判斷過程的其它非熒光檢測(cè)/選擇技術(shù)包括飛行時(shí)間法、散射法、成像法、電容法或任意能夠識(shí)別出所期望的細(xì)胞的檢測(cè)方法。與檢測(cè)/選擇方法無關(guān)，可以利用采用了有源模式的切換來根據(jù)一些判斷過程將一種細(xì)胞群體從另一種分選出。
為了利用有源模式，必須響應(yīng)于判斷過程將光束調(diào)制打開或關(guān)閉。與所使用的激光數(shù)量或者該光學(xué)開關(guān)是單向或雙向的無關(guān)，可以按照許多方式調(diào)制這些激光，包括使用光電調(diào)制器、調(diào)制激光功率、關(guān)閉激光器、使用液晶調(diào)制器、使用電流計(jì)、并且使用聲光調(diào)制器。對(duì)于具有兩個(gè)激光的雙向光學(xué)開關(guān)，可以單獨(dú)地打開和關(guān)閉單獨(dú)的激光器；但是，在使用單個(gè)激光源時(shí)，可以通過使用偏振旋轉(zhuǎn)器(例如液晶調(diào)制器)并且讓兩種不同線圖案的每一個(gè)為兩個(gè)單獨(dú)偏振的每一個(gè)來實(shí)現(xiàn)光學(xué)開關(guān)線的兩個(gè)不同取向。同樣，可以使用聲光調(diào)制器或電流計(jì)鏡子來調(diào)制用作光學(xué)開關(guān)的單個(gè)點(diǎn)的位置或者可以使用雙軸聲光調(diào)制器或雙軸電流計(jì)鏡子來畫出用作雙向光學(xué)開關(guān)的兩種不同線形狀。
圖8顯示出用于進(jìn)行光學(xué)開關(guān)的調(diào)制和/或關(guān)閉的三種不同可能的光學(xué)設(shè)計(jì)。在圖8a中，從朝著液晶調(diào)制器(LCM)引導(dǎo)并且穿過它的單個(gè)光束(激光器)中產(chǎn)生出雙向光學(xué)開關(guān)。該LCM為偏振旋轉(zhuǎn)器，因此如果該光束沿著一個(gè)方向偏振，則它將筆直穿過偏振光束分光器(PBS)，穿過產(chǎn)生出線形狀的圓柱透鏡，穿過另一個(gè)PBS，然后穿過一些用來將光線聚焦到微流切換區(qū)域上的聚焦光學(xué)元件。這有效地產(chǎn)生出用來將細(xì)胞切換進(jìn)分叉通道輸出中的一個(gè)的雙向光學(xué)開關(guān)的一條線。為了將細(xì)胞切換進(jìn)另一個(gè)輸出通道，必須產(chǎn)生出鏡像線。通過使用來改變光束的偏振的LCM旋轉(zhuǎn)來實(shí)現(xiàn)這個(gè)情況。因此，在光束撞擊第一PBS時(shí)，它被引導(dǎo)進(jìn)交替通道，穿過不同的圓柱透鏡(產(chǎn)生線形狀)，通過其它PBS，用來通過將鏡像線聚焦到微流切換區(qū)域上的聚焦光學(xué)元件將光束引導(dǎo)回。要指出的是，圓柱透鏡用來產(chǎn)生出用于雙向光學(xué)開關(guān)的線形狀；可選的是，可以拆除這些圓柱透鏡，從而導(dǎo)致用于光學(xué)開關(guān)的點(diǎn)。在圖8b中，沒有使用LCM和PBS的組合，在有或沒有圓柱透鏡的情況下，可以使用聲光調(diào)制器(AOM)來產(chǎn)生出用在雙向光學(xué)開關(guān)中的線或點(diǎn)。這可以通過將AOM構(gòu)成為獲得所需的規(guī)定線形狀來實(shí)現(xiàn)。還有，可以使用AOM來按照開/關(guān)方式調(diào)節(jié)光束，從而將光束引導(dǎo)至用于光學(xué)開關(guān)關(guān)閉狀態(tài)的光束阻擋件。圖8c顯示出在圖8a和圖8b中所述的系統(tǒng)的組合。在采用AOM來改變光束方向的任意結(jié)構(gòu)中，可以根據(jù)所期望的光束運(yùn)動(dòng)采用電流計(jì)鏡子(單軸或雙軸)來代替AOM。
在優(yōu)化用于單向或雙向光學(xué)開關(guān)的切換效率時(shí)可以考慮用于光學(xué)圖案的許多變型。如上所述，已經(jīng)采用了激光線作為光學(xué)開關(guān)圖案?？梢酝ㄟ^圓柱透鏡、通過掃描電流計(jì)鏡子或聲光調(diào)制器、通過衍射光學(xué)元件、通過普通折射光學(xué)元件或者通過任意其它技術(shù)來產(chǎn)生出該線。到目前位置，已經(jīng)采用了圓柱透鏡、通過掃描電流計(jì)或者通過使用聲光調(diào)制器來產(chǎn)生出該線。該線的長度可以任意長或者與單個(gè)點(diǎn)一樣短。該線可以在線的頂部處具有更高的強(qiáng)度，并且朝著該線的端部其強(qiáng)度逐漸變小。另外，該線可以為曲線，這優(yōu)化了細(xì)胞的輸出方向。另外，該線的角度或線的形狀可以實(shí)時(shí)變化(即，旋轉(zhuǎn)以優(yōu)化輸出)。為了應(yīng)用于多輸出通道，可以產(chǎn)生出在2D空間中的任意隨機(jī)圖案以優(yōu)化每個(gè)輸出細(xì)胞的方向?？蛇x的是，可以通過分散點(diǎn)陣列來產(chǎn)生出該線。
為了進(jìn)一步改善分選機(jī)構(gòu)在通過量、產(chǎn)出率和純度方面的性能，該光學(xué)開關(guān)如此構(gòu)成，從而激光點(diǎn)在它朝著分叉交界處沿著主通道留下時(shí)橫靠所選細(xì)胞掃描，由此增大了在細(xì)胞和激光之間的總相互作用時(shí)間。該光學(xué)開關(guān)采用了這樣一個(gè)激光點(diǎn)，它在筆直線中朝著分叉交界處沿著主通道長度向下移動(dòng)。由該光電掃描的線可以與主通道的壁平行(圖9a)，或者可以相對(duì)于細(xì)胞液流成一些角度(圖9b)。因此，該角度可以為0-90度。采用AOM或掃描電流計(jì)鏡子來實(shí)現(xiàn)掃描該點(diǎn)的能力。通過根據(jù)采用熒光或其它能夠識(shí)別出所期望的細(xì)胞的檢測(cè)方法例如飛行時(shí)間法、散射法、成像法或電容法對(duì)所期望的細(xì)胞的檢測(cè)進(jìn)行判斷來觸發(fā)光學(xué)開關(guān)進(jìn)行掃描。細(xì)胞位置可以在主通道中偏置或?qū)χ?，這決定了由該點(diǎn)掃描的線的長度和用來實(shí)現(xiàn)有效切換/分選的激光功率。因此，在檢測(cè)所期望的細(xì)胞時(shí)，打開光學(xué)開關(guān)，并且該點(diǎn)橫靠所期望的細(xì)胞出現(xiàn)。該點(diǎn)然后橫靠所選細(xì)胞跟蹤，并且使用光學(xué)力來將所選細(xì)胞引導(dǎo)進(jìn)所期望的輸出通道。
下面描述了用來方便光學(xué)開關(guān)的有效觸發(fā)的兩種方案。兩種方法中的典型一種是使用空間信號(hào)來分析運(yùn)動(dòng)細(xì)胞，并且使用該信息來產(chǎn)生切換或不切換的判斷。該空間信號(hào)基本上為信號(hào)的量度或時(shí)間的函數(shù)，它可以產(chǎn)生出在峰值強(qiáng)度和峰值寬度方方面不同的空間指紋。該信號(hào)可以是熒光、散射(例如，向前散射)、電容、成像或任意能夠識(shí)別出所期望的細(xì)胞的檢測(cè)方式。一個(gè)方案在于使用與兩個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器耦合的單個(gè)激光源來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞檢測(cè)和細(xì)胞識(shí)別。圖10a-d顯示出使用與一個(gè)熒光檢測(cè)器和一個(gè)向前散射檢測(cè)器組合的一個(gè)激光源的這個(gè)方案。來自這些檢測(cè)器的空間信號(hào)用作用于開關(guān)判斷的信息。通過向前散射信號(hào)來驗(yàn)證細(xì)胞的存在，并且在該信號(hào)與處于預(yù)定范圍內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度耦合時(shí)；然后將該“選通”信息用于觸發(fā)光學(xué)開關(guān)。要指出的是，只顯示出單個(gè)熒光檢測(cè)器，但是可以使用多個(gè)熒光檢測(cè)器以進(jìn)行更精細(xì)的細(xì)胞識(shí)別。在所述的情況中，通過使用等流速鞘緩沖液來使細(xì)胞流位于中央，并且使用具有不同寬度的輸出通道來產(chǎn)生出通向細(xì)胞流右邊的分割面。但是，可以采用如上所述用來操縱細(xì)胞流和分割面的位置的任意結(jié)構(gòu)。還有，兩種結(jié)構(gòu)的共同之處在于存在誤差檢測(cè)檢測(cè)器，這驗(yàn)證了細(xì)胞是否已經(jīng)切換。在該情況中的檢測(cè)可以基于熒光、散射(例如向前散射)、電容、成像或任意能夠識(shí)別出所期望的細(xì)胞的檢測(cè)方式。
圖10a-b顯示出在分選參數(shù)為負(fù)并且光學(xué)開關(guān)沒有觸發(fā)時(shí)的檢測(cè)器布置和定時(shí)/觸發(fā)圖。細(xì)胞進(jìn)入主流體通道并且通過從兩側(cè)流出的鞘緩沖液聚焦成單個(gè)縱列。在細(xì)胞通過在檢測(cè)/選擇區(qū)域中的激光時(shí)，同時(shí)或近乎同時(shí)地檢測(cè)出熒光和向前散射信號(hào)。雖然通過向前散射信號(hào)(在時(shí)刻t1)成功地檢測(cè)出細(xì)胞的存在，但是熒光信號(hào)低于選通水平，并且光學(xué)開關(guān)沒有觸發(fā)(在時(shí)刻t2)。因此，由于沒有切換任何細(xì)胞，所以沒有獲得任何錯(cuò)誤檢測(cè)信號(hào)(在時(shí)刻t3)。可選的是，圖10c-d顯示出在分選參數(shù)為正并且光學(xué)開關(guān)被觸發(fā)時(shí)檢測(cè)器布置和定時(shí)/觸發(fā)圖。這里，在細(xì)胞通過在檢測(cè)/選擇區(qū)域中的激光時(shí)，同時(shí)或近乎同時(shí)地重新檢測(cè)(在時(shí)刻t1)熒光和向前散射信號(hào)，但是熒光信號(hào)處于選通水平內(nèi)，并且光學(xué)開關(guān)被觸發(fā)(在時(shí)刻t2)。由于細(xì)胞被切換所以獲得錯(cuò)誤檢測(cè)信號(hào)(在時(shí)刻t3)。在該方案中，觸發(fā)時(shí)間(在時(shí)刻t2)為從初始檢測(cè)時(shí)間(t1)測(cè)量出的預(yù)定值(Δt)，并且通過細(xì)胞的速度和光學(xué)開關(guān)相對(duì)于檢測(cè)/選擇區(qū)域的位置來確定該Δt數(shù)值。該方法對(duì)于實(shí)現(xiàn)有效分選而言是令人滿意的；但是作為用來進(jìn)一步改善觸發(fā)精度的手段，可以采用第二方案。
圖11a-d顯示出該第二方案，其中使用兩個(gè)激光源來代替一個(gè)。還有，如同上述單激光方案的情況一樣，來自這些檢測(cè)器的空間信號(hào)用作用于切換判斷的信息。一個(gè)激光器在檢測(cè)區(qū)域中用來在識(shí)別/選擇區(qū)域之前單獨(dú)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞檢測(cè)。在該情況中的檢測(cè)可以基于熒光、散射(例如向前散射)、電容、成像或任意能夠識(shí)別出所期望的細(xì)胞的檢測(cè)方式。第二激光器與兩個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器連接，并且用來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞檢測(cè)和細(xì)胞識(shí)別。還有，在該情況中的識(shí)別可以基于熒光、散射(例如向前散射)、電容、成像或任意能夠識(shí)別出所期望的細(xì)胞的檢測(cè)方式。兩個(gè)順序細(xì)胞檢測(cè)步驟的目的在于，可以從在第一檢測(cè)(在時(shí)刻t1)和第二檢測(cè)(在時(shí)刻t2)之間的時(shí)間差(Δt)中獲得細(xì)胞流速。已知在檢測(cè)器窗口(d)之間的間距將產(chǎn)生出流速(v＝d/Δt)，并且該數(shù)值與光學(xué)開關(guān)和識(shí)別窗口(x)之間的已知距離組合可以用來計(jì)算用于光學(xué)開關(guān)的觸發(fā)時(shí)間(t3＝x/v)。還有切換只是在到達(dá)特定選通水平時(shí)出現(xiàn)以進(jìn)行細(xì)胞識(shí)別步驟。雖然只是顯示出單個(gè)熒光檢測(cè)器用于識(shí)別，但是可以使用多個(gè)熒光檢測(cè)器。在所述的情況中，通過使等流速鞘緩沖液來使細(xì)胞流位于中間，并且使用具有不同寬度的輸出通道來產(chǎn)生出通向細(xì)胞流右邊的分割面。但是，可以采用如上所述任何用來操縱細(xì)胞流和分割面位置的結(jié)構(gòu)。還有，這兩種結(jié)構(gòu)的共同之處在于存儲(chǔ)錯(cuò)誤檢測(cè)檢測(cè)器，它用來驗(yàn)證細(xì)胞是否已經(jīng)被切換。在該情況中的檢測(cè)可以基于熒光、散射(例如向前散射)、電容、成像或任意能夠識(shí)別出所期望的細(xì)胞的檢測(cè)方式。
圖11a-b顯示出在分選參數(shù)為負(fù)并且光學(xué)開關(guān)沒有觸發(fā)時(shí)的檢測(cè)器布置和定時(shí)/觸發(fā)圖。細(xì)胞進(jìn)入主流體通道并且通過來自兩側(cè)的鞘緩沖液流動(dòng)聚集成單個(gè)縱列。在細(xì)胞經(jīng)過檢測(cè)窗口區(qū)域時(shí)通過向前散射信號(hào)(在時(shí)刻t1)驗(yàn)證細(xì)胞的存在。在細(xì)胞穿過識(shí)別/選擇窗口時(shí)，獲得第二向前散射信號(hào)(在時(shí)刻t2)，但是該信號(hào)與沒有處于選通水平內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(在時(shí)刻t2)接合，并且光學(xué)開關(guān)沒有被觸發(fā)(在時(shí)刻t3)。由于沒有切換任何細(xì)胞，所以沒有獲得任何錯(cuò)誤檢測(cè)信號(hào)(在時(shí)刻t4)。即使在沒有分選細(xì)胞的情況下，采用(t1)、(t2)和在檢測(cè)和識(shí)別窗口之間的已知距離(d)獲得細(xì)胞流的流速。這是采用關(guān)系式Δt＝(t2)-(t1)和v＝d/Δt來獲得的。
可選的是，圖11c-d顯示出在分選參數(shù)為正并且光學(xué)開關(guān)被觸發(fā)時(shí)的檢測(cè)器部分和定時(shí)/觸發(fā)圖。在細(xì)胞經(jīng)過檢測(cè)窗口區(qū)域時(shí)由向前散射信號(hào)再次驗(yàn)證細(xì)胞的存在(在時(shí)刻t1)。在細(xì)胞經(jīng)過識(shí)別/選擇窗口時(shí)，獲得第二向前散射信號(hào)(在時(shí)刻t2)，并且該信號(hào)與處于選通水平內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(在時(shí)刻t2)接合(couple with)，并且觸發(fā)光學(xué)開關(guān)(在時(shí)刻t3)。由于切換一個(gè)細(xì)胞，所以現(xiàn)在獲得錯(cuò)誤檢測(cè)信號(hào)(在時(shí)刻t4)。在該方案中，觸發(fā)時(shí)間(t3)不是預(yù)定數(shù)值，而是采用細(xì)胞流流速(v)和在檢測(cè)和識(shí)別窗口之間的已知距離(d)獲得的。這是采用關(guān)系式Δt＝(t2)-(t1)；v＝d/Δt；(t3)＝x/v來獲得的。該方案由于能夠解釋在細(xì)胞流速中的波動(dòng)所以能夠進(jìn)行更有效的分選，因此更精確地觸發(fā)光學(xué)開關(guān)。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)細(xì)胞而言，該方案的額外效果是可以調(diào)節(jié)激光點(diǎn)沿著通道向下平移的速度，從而它與如上所述的細(xì)胞速度相匹配，因此增大了在細(xì)胞和光學(xué)開關(guān)的激光點(diǎn)之間的相互作用時(shí)間。通過改變用于AOM的驅(qū)動(dòng)器來改變激光點(diǎn)的平移速度。
在結(jié)合上述觸發(fā)方案的同時(shí)改善分選效率的另一種方案在于，采用用來產(chǎn)生真實(shí)試樣芯的通道設(shè)計(jì)使細(xì)胞集中在主通道中，由此該芯部完全由鞘緩沖液包圍。細(xì)胞沿著通道高度的位置變化性能夠引起細(xì)胞檢測(cè)和熒光強(qiáng)度的變化。確保細(xì)胞處于在主通道的中央部分中流動(dòng)的芯部中可以改善分選效率，因?yàn)檫@減小了由于細(xì)胞的徑向分布而出現(xiàn)的任何變化，并且控制了細(xì)胞為了進(jìn)行有效分選而需要運(yùn)動(dòng)的距離?？梢圆捎糜们示彌_液2維箍緊輸入液流來實(shí)現(xiàn)這種芯部流。
該方案需要底部基底和頂部基底；每個(gè)具有形成在它們中的微流通道網(wǎng)絡(luò)。圖12a-b和圖13顯示出用來實(shí)現(xiàn)這個(gè)的一個(gè)方法，其中在一個(gè)基底上的通道結(jié)構(gòu)為在另一個(gè)基底上的結(jié)構(gòu)的鏡像。因此，在使這兩個(gè)基底合在一起并且通道結(jié)構(gòu)彼此面對(duì)時(shí)，這些通道網(wǎng)絡(luò)重疊并且形成完整的流體通道。圖12a-b顯示出用在該方案中的一種結(jié)構(gòu)，其中用虛線顯示出試樣通道。該方案的關(guān)鍵特征在于確保試樣通道壁鞘通道更窄，從而在基底合在一起時(shí)，試樣通道看起來作為孔進(jìn)入交界處。這顯示在圖13中，其中可以看到細(xì)胞進(jìn)入交界處，然后從所有側(cè)面被箍緊，從而形成在主通道的中央流動(dòng)的試樣芯部。要指出的是，可以通過濕法化學(xué)蝕刻或激光蝕刻玻璃或石英通過在塑料或聚合物中模制或壓花來形成這些通道。
另一種方法涉及具有一系列如此布置的相交通道，從而在第一交界處/相交部分處，這些細(xì)胞被垂直推向主通道的一個(gè)壁，下一個(gè)交界處/相交部分將該細(xì)胞流垂直壓進(jìn)主通道的中央，然后在第三交界處/相交部分處從兩側(cè)的最終箍緊流產(chǎn)生出包圍著沿著主通道流動(dòng)的試樣芯部的完整鞘緩沖液籠罩(shroud)。這在圖14和圖15中顯示出，并且在圖16中示意性地顯示出一條可能的通道。在該實(shí)施例中，在交界處(A)，試樣從頂部基底流進(jìn)交界處，并且向下流進(jìn)在底部基底中的通道，在那里側(cè)鞘緩沖液流從側(cè)面流進(jìn)交界處。該試樣在它繼續(xù)流向下一個(gè)交界處(B)時(shí)被稍微聚集并且推向底部通道的頂壁。在交界處(B)，試樣沿著底部通道的頂部從交界處A流向交界處(B)。這里，第二鞘緩沖液從頂部基底流進(jìn)交界處(B)，并且試樣被向下推向在底部基底中的通道中間。該試樣繼續(xù)沿著底部通道中間部分朝著下一個(gè)交界處(C)流動(dòng)。這里，第三鞘緩沖液從兩側(cè)流進(jìn)交界處(C)，并且該試樣被箍緊成單個(gè)縱列。該試樣在它繼續(xù)流動(dòng)時(shí)由鞘緩沖液包圍成一試樣芯部，它在主輸入通道內(nèi)水平并且垂直對(duì)中。
采用傳統(tǒng)的光刻掩模和各向同性蝕刻覆有掩模的玻璃基底在玻璃基底中產(chǎn)生出在圖1-16中所述的所有微流通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。該各向同性蝕刻通常生成出這樣的微流通道，它在通道中央處具有一深度de并且在通道的頂部處具有一寬度w＝wp+2×de，其中wp為限定該通道的光刻圖案的寬度。由于各向同性蝕刻，所以通道的底部形狀在每個(gè)邊緣處為具有半徑為de的四分之一圓形狀，并且所蝕刻出的通道的頂部打開。將玻璃基底通常為玻璃蓋片熱粘接在具有蝕刻出的微流通道的基底上，以密封通道的頂部并且完成一微流通道網(wǎng)絡(luò)。通常在熱粘接之前在頂部基底中鉆出孔以提供用于流體流進(jìn)入和離開微流通道網(wǎng)絡(luò)的路徑。這些通道的深度de取決于化學(xué)蝕刻過程的速度和蝕刻步驟的持續(xù)時(shí)間。微流通道的深度通常為但不限于10μm至100μm。微流通道的寬度通常為但不限于深度的2至5倍。這是通過采用通常為但不限于5μm至400μm的在光刻掩模上的線條來實(shí)現(xiàn)的。如前面所述一樣，可以采用其它基底例如塑料或可模制或可鑄聚合物。在這些情況中，微流通道通常具有矩形橫截面，但是也可以與在玻璃基底中的通道類似。其中形成微流通道網(wǎng)絡(luò)的玻璃基底的尺寸通常為但不限于5mm×5mm至25mm×50mm，并且其總厚度為但不限于500μm至2mm。頂部基底通常具有相同尺寸，并且其厚度為但不限于300μm至1mm。這些通路其直徑通常為但不限于200μm至600μm。所完成的具有微流通道網(wǎng)絡(luò)和帶有用于流體流進(jìn)出的流體口的通路的粘接蓋板的基底被簡稱為微流分選芯片或芯片。
在圖1-16中顯示出的微流通道網(wǎng)絡(luò)通常只是描述了入口微流通道、鞘緩沖液箍緊交界處通道、細(xì)胞識(shí)別和光學(xué)開關(guān)主通道以及主通道分叉成出口通道的局部幾何形狀。該說明需要擴(kuò)展以提供給在每個(gè)通道中的區(qū)域，以便形成與在提供了與上述通路的界面的宏觀流體裝置或盒子中的容器的連接，從而使流體流進(jìn)入以及離開網(wǎng)絡(luò)。這些微流通道的每一個(gè)的橫截面和長度通常需要根據(jù)選擇用來實(shí)現(xiàn)在這些通道中的液流的技術(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以確保在整個(gè)微流通道網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的適當(dāng)受控的液流。這些通道的橫截面和長度都由用來形成光刻掩模的圖案確定。
圖17顯示出用于一個(gè)完整微流通道網(wǎng)絡(luò)的掩模的一個(gè)實(shí)施方案，該微流通道網(wǎng)絡(luò)具有一入口通道，兩個(gè)通向T箍緊交界處的兩條鞘通道和來自T分叉交界處的兩條出口通道。該掩模設(shè)計(jì)成提供7∶1的體積箍緊比(鞘流速為細(xì)胞入口流速的七倍)。這些通道的長度設(shè)計(jì)成提供足夠的壓降以使得能夠使用標(biāo)準(zhǔn)低流量注射泵或低壓氣動(dòng)控制器來建立起液流。該設(shè)計(jì)也反映出能夠只是使用兩個(gè)泵所需的壓力平衡，一個(gè)壓力用于細(xì)胞入口通道并且一個(gè)用于兩個(gè)鞘通道，并且這些出口保持在大氣壓下。鞘通道入口處于在該結(jié)構(gòu)頂部出的終端處，細(xì)胞入口通道在兩個(gè)鞘通道的中央部分中在這下面開始，并且足夠長以提供設(shè)定7∶1的箍緊比的適當(dāng)壓降，并且兩個(gè)出口位于在底部左右處的端部處。
圖18顯示出在提供了10∶1體積箍緊比的結(jié)構(gòu)中結(jié)合了用于箍緊分界處和Y分叉分界處的三角形分界處的另一個(gè)實(shí)施方案。另外，該結(jié)構(gòu)其幾何形狀與圖17的類似。顯然可以有許多其它設(shè)計(jì)，但是它們都共享了需要提供流體進(jìn)入和離開并且為選擇用來建立流體流的方法提供適當(dāng)?shù)膲航岛蛪毫ζ胶獾墓餐卣?。采用類似的設(shè)計(jì)條件來生產(chǎn)出用來制作用于前面所述的2維箍緊流網(wǎng)絡(luò)的微流通道網(wǎng)絡(luò)的光刻掩模。
圖19顯示出在所完成的微流分選芯片中的微流通道網(wǎng)絡(luò)的一優(yōu)選實(shí)施方案。兩個(gè)入口，用于細(xì)胞試樣流和用于鞘緩沖液流，兩個(gè)出口用于熒光正目標(biāo)細(xì)胞和用于熒光負(fù)非目標(biāo)細(xì)胞，廢流。芯片為24mm×40mm。蝕刻基底的厚度為1.1mm。粘接蓋板的厚度為550μm。微流通道深為50μm。細(xì)胞入口微流通道寬為110μm。外鞘流和出口微流通道與主微流通道一樣寬為150μm。鞘流箍緊交界處為倒置的等邊三角形，每個(gè)邊長為300μm，在交界處的頂部處通過三角形的底邊連接細(xì)胞入口通道，并且在交界處的底部處兩條鞘流箍緊通道從每個(gè)側(cè)邊通過三角形的頂端通向主通道。優(yōu)化該微流通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而在所有四個(gè)端口處采用液流的氣動(dòng)控制來建立網(wǎng)絡(luò)流。
與芯片的微流連接部分可以按照各種方式制成。一種方法是使用通過膠粘或采用各種可以在端口處安裝在芯片表面上的管接頭直接連接在端口上的柔性微流管道。該管道可以直接連接在注射泵或類似系統(tǒng)上，這提供了用于處理細(xì)胞試樣和鞘緩沖液的體積并且提供了使這些體積流經(jīng)該芯片的壓力。使用注射泵來處理試樣體積需要針對(duì)每個(gè)試樣清潔和重新裝載該泵，并且引起出現(xiàn)從一個(gè)試樣到另一個(gè)試樣的轉(zhuǎn)移或污染的可能性。
用于與芯片微流連接的一種改進(jìn)方法利用了采用可UV固化粘接劑、PSA粘接片或其它傳統(tǒng)的粘接方法直接粘接在芯片上的盒子。該盒子具有四個(gè)內(nèi)置容器，它們分開提供了與細(xì)胞入口通道、兩個(gè)外鞘通道(來自一個(gè)容器)和兩個(gè)出口通道的每一個(gè)的界面連接。這個(gè)盒子提供了無菌操作細(xì)胞試樣和分選目標(biāo)細(xì)胞以及廢流的可能性，因?yàn)樗鼈兡軌蛟诩?xì)胞分選之前和之后完全局限在該盒子的體積內(nèi)。可以通過使用兩個(gè)氣壓控制器來提供用于這種盒子和芯片系統(tǒng)的流體流，這些控制器單獨(dú)加壓細(xì)胞入口和鞘緩沖液容器，從而將穿過芯片的微流通道網(wǎng)絡(luò)的流體流導(dǎo)入到處于大氣壓下的出口容器。
通過使用四個(gè)單獨(dú)對(duì)細(xì)胞入口、外鞘緩沖液、目標(biāo)細(xì)胞收集和廢料收集容器的每一個(gè)加壓的氣動(dòng)控制器來提供改進(jìn)的流體流控制方法。這種流體流控制系統(tǒng)能夠單獨(dú)調(diào)節(jié)在外鞘箍緊交界處的體積箍緊比、在用于熒光分析和光學(xué)開關(guān)的主微流通道中的細(xì)胞流速以及在切換分叉處的分割比，從而形成如前面所述一樣的偏置流。
圖20顯示出一自備一次性盒子的優(yōu)選實(shí)施方案，它提供了分別用于細(xì)胞試樣體積、外鞘緩沖液體積和用于目標(biāo)細(xì)胞和廢料的兩個(gè)出口籌集體積的流體容器。該盒子由丙烯酸塑料制成，并且可以被機(jī)加工出或鑄造出。適當(dāng)?shù)脑?，可以采用其它塑料或合適材料來代替丙烯酸材料。細(xì)胞試樣體積通常形狀為錐形，它從端口朝著入口微流通道逐漸變細(xì)。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，入口容器包含有一聚丙烯插入件，用來減小細(xì)胞附著，因此增大細(xì)胞產(chǎn)出。該芯片用UV粘接劑粘接在光學(xué)窗口區(qū)域上，并且來自該芯片的出口與其相應(yīng)的容器體積鄰接。這些容器體積用搭鎖蓋子密封，該蓋子具有在氣動(dòng)控制器和各個(gè)容器之間連接的鉆孔。該蓋子包含有硅橡膠墊圈，以幫助密封在盒體上。它還結(jié)合有0.1μm聚丙烯過濾器以在盒體積和外部環(huán)境之間形成氣密不透液界面。這保持了在盒子上的無菌條件，并且減少了對(duì)用戶或儀器的生物毒害性污染。
通過首先使用具有Luer接頭的普通注射器用外鞘緩沖溶液通過外鞘端口將微流通道網(wǎng)絡(luò)準(zhǔn)備好(prime)來使該盒子準(zhǔn)備用于細(xì)胞分選工作。這樣，將這些通道準(zhǔn)備好并且外鞘容器填充有800μl，并且每個(gè)出口容器填充有200μl。從這些細(xì)胞試樣容器中將多余的緩沖液體抽出，然后使用移液管將5-25μl的細(xì)胞試樣放置到試樣輸入容器中。然后將盒子蓋搭鎖到適當(dāng)位置中，從而提供了在其中進(jìn)行細(xì)胞分選工作的獨(dú)立系統(tǒng)。
該盒子設(shè)計(jì)成安放在一支架中，該支架使芯片的主通道如此定位，從而用來將光學(xué)開關(guān)光束投射到通道中的光學(xué)成像系統(tǒng)適當(dāng)?shù)貙?duì)準(zhǔn)并且聚集到通道中。盒支架還包括一壓力歧管板，它具有四個(gè)通過外部管道與四個(gè)氣動(dòng)控制器連接的端口。每個(gè)歧管端口用O形環(huán)密封在其相應(yīng)的盒蓋端口上，并且通過用凸輪鎖緊機(jī)構(gòu)將歧管壓在盒蓋上來使這些密封件不漏。
在圖21中顯示出用于光學(xué)開關(guān)的光學(xué)系統(tǒng)的一優(yōu)選實(shí)施方案。具有與搭鎖蓋子連接的氣動(dòng)歧管的盒子如此定位，從而光學(xué)開關(guān)區(qū)域位于從盒子上方看的透鏡系統(tǒng)盒和從下方看的透鏡系統(tǒng)的焦點(diǎn)處。來自488nm激光器的輸出光束通過成像系統(tǒng)投射到正好位于分選區(qū)域上游的主通道中，如在圖3-7和9-11中所示一樣，以提供用于檢測(cè)來自熒光正目標(biāo)細(xì)胞的熒光的刺激。通過相同的透鏡收集熒光發(fā)射，并且通過分色鏡和適當(dāng)?shù)臒晒獍l(fā)射過濾器將它成像到光電倍增器管上。來自光電倍增器管的信號(hào)由電子器件處理以測(cè)量出來自細(xì)胞的熒光的水平并且確定出在主通道中的流體流中熒光正目標(biāo)細(xì)胞的存在。熒光激發(fā)不限于488nm波長，而是可以在適用于用來識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞的熒光基團(tuán)的任意波長下。如果采用不同的激發(fā)照明，必須因此改變熒光發(fā)射過濾器的波長。在識(shí)別出熒光正性細(xì)胞時(shí)，電子器件觸發(fā)AOM以將來自IR激光器的光束通常為在5W至20W輸出功率之間的1070nm激光操作導(dǎo)入進(jìn)在光學(xué)開關(guān)位置處的主通道。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，控制AOM產(chǎn)生出如在圖9b中所述的光學(xué)開關(guān)圖案，但是可以實(shí)施前面所述的光學(xué)開關(guān)方法的任一種。在盒子下面的透鏡將488nm激發(fā)照明成像到光電二極管上。由該光電二極管檢測(cè)到的信號(hào)用來幫助使熒光標(biāo)記的細(xì)胞與可能帶有熒光標(biāo)記的更小碎片區(qū)分開，并且還用來識(shí)別出可能已經(jīng)形成的細(xì)胞群。這些事件被拒絕作為用于分選到目標(biāo)輸出通道的候選物。
還有一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案將采用有適當(dāng)?shù)某上窈凸鈱W(xué)過濾以根據(jù)由用來激發(fā)出熒光的488nm激光器對(duì)細(xì)胞的照明提供向前散射的信號(hào)。這些光學(xué)器件將提供一個(gè)角度敏感范圍，例如但不限于0.8°至10°，以便檢測(cè)向前散射信號(hào)。除了熒光信號(hào)之外，該信號(hào)可以幫助表征細(xì)胞，以及幫助使細(xì)胞與碎片區(qū)分開。向前散射照明不限于熒光激發(fā)激光，而是可以在由適當(dāng)?shù)爻上襁M(jìn)主通道中的附加光源提供的任意其它波長下。
還有一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案將采用有通常采用單個(gè)激發(fā)波長例如但不限于488nm的附加熒光檢測(cè)通道，它們對(duì)在不同波長下的熒光發(fā)射敏感。每個(gè)檢測(cè)通道將結(jié)合有一PMT，它具有適當(dāng)?shù)姆稚R和用于附加熒光團(tuán)的熒光發(fā)射波長的發(fā)射過濾器。二至四個(gè)熒光檢測(cè)通道適合于這種方式。按照這種方式使用多于一個(gè)的熒光團(tuán)能夠針對(duì)多個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)利用光學(xué)開關(guān)識(shí)別用于分選的目標(biāo)細(xì)胞。
還有一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案將采用提供光學(xué)照明的錯(cuò)誤檢測(cè)能力，所述光學(xué)照明通常作為穿過網(wǎng)絡(luò)中的通道之一的窄線，并且通常是在來自固態(tài)激光器的較長的波長，可能是但是不限于785nm，這種波長在用于熒光檢測(cè)和向前散射檢測(cè)的波長范圍之外，但是比通常在1070nm的光學(xué)開關(guān)波長短。這種光源可以適當(dāng)?shù)爻上裨谖⒘魍ǖ谰W(wǎng)絡(luò)中，以提供可以用于檢測(cè)顆粒通過網(wǎng)絡(luò)中的任何豎直平面的通過的線。這樣還能夠檢測(cè)光學(xué)開關(guān)性能，并還能夠?qū)⒐鈱W(xué)開關(guān)的觸發(fā)定時(shí)，如圖11所示。
光學(xué)系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案將采用在750nm但是不限于750nm的附加光學(xué)照明通路，例如通過將來自LED的光帶通濾波并用該光照射在微流通道區(qū)域而產(chǎn)生。該區(qū)域可以通過750nm的帶通過濾器成像到CCD攝像機(jī)上以使在分叉交界處/或在箍緊交界處在微流通道網(wǎng)絡(luò)中的細(xì)胞流的性能可視化。攝像機(jī)前面的過濾器將適合于阻擋與熒光的激發(fā)或檢測(cè)有關(guān)和與向前/側(cè)面散射光學(xué)元件和錯(cuò)誤檢測(cè)光學(xué)元件有關(guān)的任何較短波長輻射。過濾器還阻擋來自光學(xué)開關(guān)的較長波長，1070nm光。
圖20所示的盒的優(yōu)選實(shí)施方案被設(shè)計(jì)為將微流通道網(wǎng)絡(luò)保持在水平構(gòu)造中，從而所有的通道和入口/出口處于同一個(gè)豎直水平上。這樣使得重力對(duì)通過微流通道的壓力下降的影響最小，導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)中的更穩(wěn)定和可控的流動(dòng)。但是重力仍然對(duì)在液流中的細(xì)胞有作用，特別是在細(xì)胞從細(xì)胞試樣容器經(jīng)過到細(xì)胞入口微流通道內(nèi)的時(shí)候。為了幫助控制重力對(duì)在該容器內(nèi)的細(xì)胞沉降的影響，和幫助控制對(duì)它們?cè)诩?xì)胞流在箍緊交界處加速之前在入口微流通道中的較慢液流中的沉降的影響，分選器的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是增加細(xì)胞的浮力，從而可以使細(xì)胞的沉降最小。通過利用試樣緩沖液中的添加物可以實(shí)現(xiàn)浮力的增加。這些流變學(xué)控制添加劑、尤其是那些是擬塑性或者剪切減小或者兩者都是的添加劑的示例是黃原酸膠、卡拉膠、羧甲基纖維素鈉鹽、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基瓜爾、阿拉伯樹膠、黃蓍樹膠、藻朊酸鹽、聚丙烯酸酯、卡波姆。其它的添加劑包括HistopaqueTM，它是聚蔗糖和泛影葡胺鈉的混合物，以及OptiprepTM，它是碘克沙醇的60％的w/v的水溶液。所使用的這些添加劑的濃度取決于要分選的細(xì)胞的密度。例如，在使用OptiprepTM的情況下，濃度范圍是5％至40％。最后，也可以利用試樣緩沖液的鹽度和蔗糖的添加來調(diào)整細(xì)胞的浮力。
用于細(xì)胞試樣容量的和用于鞘流的緩沖液可以是與被分選的細(xì)胞具有生物兼容性并且與用于熒光檢測(cè)模態(tài)和用于光學(xué)開關(guān)的光學(xué)照明兼容的任何緩沖液，也就是該緩沖液在熒光激發(fā)/檢測(cè)波長和光學(xué)開光波長處具有足夠低的吸收率。鞘緩沖液的優(yōu)選實(shí)施方案使用PBS/BSA，pH為7.2的磷酸緩沖液生理鹽液(PBS)和1％的牛血清清蛋白(BSA)(占5％)。細(xì)胞緩沖液的優(yōu)選實(shí)施方案使用PBS/BSA以及14.5％的Optirep用于活的細(xì)胞試樣和27％的Optiprep用于各種福爾馬林固定的細(xì)胞試樣。
如前所述，微流通道網(wǎng)絡(luò)中的細(xì)胞分選的光學(xué)開關(guān)方法的性能用通過量、純度和分選的恢復(fù)性來評(píng)估。圖20所示的盒被優(yōu)化，以允許測(cè)量性能，因?yàn)樗杀┧嶂瞥桑繕?biāo)和廢物收集容器的底部是透明的，分選到這些容器內(nèi)的細(xì)胞可以用一個(gè)倒熒光顯微鏡對(duì)數(shù)量和熒光標(biāo)記進(jìn)行量化。對(duì)圖3-11所述的集中切換構(gòu)造進(jìn)行評(píng)估。利用活的Hela∶Hela GFP細(xì)胞的50∶50混合物來進(jìn)行評(píng)估，所述混合物用1或者2面的靜態(tài)激光點(diǎn)或者0°或8°的1面的激光掃描來進(jìn)行分選。激光按照240Hz進(jìn)行掃描。對(duì)于所有的開關(guān)模式，激光開啟時(shí)間是4毫秒，激光功率是20W。對(duì)于掃描點(diǎn)方法，將聚焦的IR激光點(diǎn)沿著主通道大約平移70μm。
如圖22所示，如圖6所述的利用激光點(diǎn)的雙向光學(xué)開關(guān)對(duì)于目標(biāo)∶非目標(biāo)細(xì)胞的50∶50的混合物在高達(dá)50細(xì)胞/秒的通過量的情況下對(duì)于純度和恢復(fù)性具有良好的結(jié)果。但是在較低的亞群體濃度(數(shù)據(jù)未顯示)，不能有效的利用激光功率來切換非目標(biāo)細(xì)胞，在較高的細(xì)胞通過率時(shí)重合誤差提高。另外，沒有切換的小顆粒會(huì)污染目標(biāo)容器。
圖22也顯示了如圖9所示的利用靜態(tài)激光點(diǎn)或者沿著液流方向與液流平行或者成一個(gè)小角度平移的點(diǎn)的1面的切換方法的性能。試樣芯部流被偏置向廢物出口，從而在默認(rèn)沒有光學(xué)開關(guān)的時(shí)候，所有的細(xì)胞都流向廢物。這兩種方法如圖所示具有改進(jìn)的性能。這兩種方法的性能交叉的這一事實(shí)暗示光學(xué)開關(guān)的觸發(fā)不是最佳的，并暗示圖10和11所示的光學(xué)開關(guān)的有源觸發(fā)會(huì)改善性能。
附錄1.H.M.Shapiro，Practical flow cytometry，Wiley-Liss，New York，2003.
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權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞分選器，它包括一微構(gòu)流動(dòng)通道，用來接收包括細(xì)胞的流體；一檢測(cè)器，用于感測(cè)受檢細(xì)胞的壓力；一光學(xué)開關(guān)，適于根據(jù)對(duì)受檢細(xì)胞的檢測(cè)被選擇地促動(dòng)，該光學(xué)開關(guān)的特征在于，該開關(guān)照明了流動(dòng)通道的至少一部分以使細(xì)胞受到非俘獲力。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分選器，其中所述檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分選器，其中所述照明呈線的形式。
4.如權(quán)利要求3所述的細(xì)胞分選器，其中所述線相對(duì)于細(xì)胞的流動(dòng)通道傾斜。
全文摘要
提供了用于基于光學(xué)開關(guān)的微構(gòu)熒光促動(dòng)細(xì)胞分選器的設(shè)備和方法，用于快速有源控制細(xì)胞選擇路線穿過微流通道網(wǎng)絡(luò)。該分選器能夠低應(yīng)力高效分選少量細(xì)胞群體(即，1000－100000個(gè)細(xì)胞)。本發(fā)明包括將微流通道網(wǎng)絡(luò)包裝在獨(dú)立塑料盒中，這使得微流通道網(wǎng)絡(luò)能夠按照無菌一次性方式與宏觀儀器相互連接。
文檔編號(hào)G01N15/14GK1860363SQ200480028134
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月28日
發(fā)明者威廉·F.·巴特勒, 米麗亞納斯·查齊斯威力思, 羅伯特·迪斯, 諾伯特·哈根, 菲利普·馬錢德, 丹尼爾·E.·雷蒙德, 尤金·杜, 馬克·M.·王, 梁埈模, 楊蓉, 張海川 申請(qǐng)人:賽路拉公司