專利名稱：鑒別胰島素敏化劑治療應(yīng)答者的方法
背景技術(shù)：
脂細(xì)胞可以通過對(duì)全身游離脂肪酸水平的調(diào)節(jié)和通過被統(tǒng)稱為脂肪因子(adipokines)的脂細(xì)胞特異性蛋白或由脂細(xì)胞富集的蛋白的分泌來影響全身代謝。最近的出版物已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了由脂細(xì)胞分泌的分子在能量的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和代謝中的重要性(1-3)。脂肪因子，例如來普汀、抵抗素、脂連蛋白(也被稱為Acrp30、AdipoQ、aPM1和GBP28)、adipsin、白細(xì)胞介素-6、纖溶酶原激活物抑制劑-1和更多的物質(zhì)已被披露會(huì)影響全身性的胰島素作用，碳水化合物和脂類代謝(4)。這些脂肪因子中的某些具有協(xié)同效應(yīng)，而其他脂肪因子例如抵抗素和脂連蛋白則具有競爭作用；藥理學(xué)劑量的抵抗素使得胰島素在抑制糖原異生上的作用消失(5)，而脂連蛋白會(huì)增加胰島素敏感性，導(dǎo)致提高對(duì)肝葡萄糖排出量的抑制(6)。此外，人脂連蛋白基因位于3號(hào)染色體(3q27)上，最近對(duì)與肥胖-代謝綜合征有關(guān)表型的基因組寬掃描揭示了3號(hào)染色體的這個(gè)區(qū)域是新的糖尿病易感性基因座(在(7)中綜述)。其后，數(shù)個(gè)小組已經(jīng)推定并提供證據(jù)證明，在脂連蛋白基因中的遺傳變異導(dǎo)致該蛋白的血清水平變化，并且通常使患者易感胰島素抵抗?，F(xiàn)在認(rèn)為降低的血清脂連蛋白是肥胖癥的一個(gè)特征，并且一般與降低的胰島素敏感性指數(shù)相關(guān)(8，9)。幾項(xiàng)研究已經(jīng)暗示，血清脂連蛋白水平的降低是對(duì)胰島素敏感性下降起作用的因素，而不僅僅是胰島素敏感性下降的結(jié)果。遺傳學(xué)和藥理學(xué)的數(shù)據(jù)證明了該蛋白對(duì)胰島素敏感性有直接的影響(2，10，11)。
由于這種脂肪因子響應(yīng)使用被稱為噻唑烷二酮類(TZDs)的抗糖尿病胰島素敏化劑進(jìn)行的治療而顯著上調(diào)，使得脂連蛋白作為治療靶點(diǎn)的潛在重要性得到加強(qiáng)(12-14)。TZDs在許多遺傳性或獲得性胰島素抵抗動(dòng)物模型中具有活性，暗示這些藥物可改善胰島素敏感性而與基本的病因無關(guān)(15)。臨床研究證實(shí)了TZDs在2型糖尿病患者中的胰島素敏化效應(yīng)，這些藥物降低了這些患者空腹和飯后的葡萄糖和胰島素水平。但是，TZD起作用的分子機(jī)制還沒有被完全了解。TZDs作為PPARγ的外源性配體而起作用，PPARγ是在脂細(xì)胞高度表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，但是在其它組織中也發(fā)現(xiàn)低水平的PPARγ(16)。該主要TZD靶點(diǎn)(PPARγ)在脂肪組織中的高水平表達(dá)暗示脂細(xì)胞在介導(dǎo)TZD作用的至少某些方面可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。該假設(shè)進(jìn)一步得到如下“無脂肪”小鼠研究的支持，該研究顯示出代謝改善響應(yīng)TZD治療而降低(17)；雖然TZD治療有效降低了血清甘油三酯，但是在這種缺乏重要的脂肪組織的動(dòng)物模型中，胰島素敏感性量度沒有受到影響。許多研究已經(jīng)證明在小鼠和人中TZD治療實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)錄的上調(diào)，伴隨有來自脂細(xì)胞的脂連蛋白產(chǎn)生和分泌的增加(2，12-14)。令人感興趣地，循環(huán)脂連蛋白的顯著增加先于用TZD治療db/db小鼠群所實(shí)現(xiàn)的血清葡萄糖和甘油三酯水平的降低(12)。在本領(lǐng)域的研究人員中仍然存在關(guān)于TZD介導(dǎo)的脂連蛋白誘導(dǎo)是否是引起胰島素敏感性改善的成因或只是胰島素敏感性改善的簡單癥候的爭論。胰島素敏感性改善和脂連蛋白誘導(dǎo)之間存在不一致性的報(bào)告已經(jīng)對(duì)成因作用提出質(zhì)疑(13)。雖然大多數(shù)患者響應(yīng)TZD治療而誘導(dǎo)脂連蛋白表達(dá)和分泌(雖然程度不同)，但是只有50-70％的患者顯示臨床改善的胰島素敏感性(在(18)中綜述)。這暗示在任何特定個(gè)體中脂連蛋白的誘導(dǎo)既不預(yù)示胰島素敏感性的定量改善，也不與胰島素敏感性的定量改善相關(guān)。
最近證明了脂連蛋白在血清中至少以兩種形式存在稱為低分子量(LMW)復(fù)合物的三聚體-二聚體(trimer-dimer)形式，和由12-18個(gè)亞單位組成的高分子量(HMW)復(fù)合物的形式(19)。這些低聚復(fù)合物在體外和體內(nèi)都是穩(wěn)定的，并且可以容易地通過速度沉降或凝膠過濾色譜解析。通過各種代謝刺激物對(duì)它們進(jìn)行差異調(diào)節(jié)。當(dāng)對(duì)嚙齒類或人進(jìn)行胰島素治療時(shí)，血清脂連蛋白水平降低(13)。在小鼠中已經(jīng)揭示這是特定的循環(huán)高分子量復(fù)合物降低的結(jié)果(19)。相似的，口服葡萄糖攻擊將會(huì)使來自血清的高分子量復(fù)合物選擇性消失。還沒有認(rèn)識(shí)到在確定或控制胰島素敏感性中HMW以及這兩種低聚形式的比例(HMW與LMW之比)的比例(而不是絕對(duì)量)也是同樣重要的。
匹格列酮和羅格列酮是PPARγ激動(dòng)劑，含有苯甲基噻唑烷二酮(TZD)單元作為其部分結(jié)構(gòu)。在50-70％的施用這些化合物的糖尿病患者中，這些化合物減少胰島素抵抗，因此改善了這些患者的2型糖尿病癥狀。顯示臨床改善胰島素敏感性的患者稱為對(duì)治療的“應(yīng)答者”。沒有顯示臨床改善胰島素敏感性的患者是“非應(yīng)答者”。
在能夠基于臨床應(yīng)答和血紅蛋白AlC改善來鑒別患者是應(yīng)答者或非應(yīng)答者之前，用一TZD或其它胰島素敏化劑進(jìn)行幾個(gè)月的治療是必需的。在短期內(nèi)(例如1-4周)鑒別出可能對(duì)一TZD或其它胰島素敏化劑治療是非應(yīng)答者的患者是有利的，如此可以更早地開始替代的治療方案。
本文公開了在短期內(nèi)鑒別出應(yīng)答者和非應(yīng)答者的方法。依據(jù)本文所述方法，可以容易地在治療開始的四周內(nèi)，優(yōu)選二周內(nèi)，更優(yōu)選一周內(nèi)鑒別出對(duì)TZDs或其它胰島素敏化劑治療的應(yīng)答者。該方法是基于測定患者血清或血漿中脂連蛋白，包括高分子量和低分子量脂連蛋白的量。
發(fā)明概述作為對(duì)胰島素抵抗或一種或多種與2型糖尿病有關(guān)疾病進(jìn)行的治療性治療的應(yīng)答者的患者可以通過下面的方法鑒別出來，包括如下步驟在治療性治療開始之前測定患者組織(通常是血漿或血清)中高分子量脂連蛋白的量和總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量；開始進(jìn)行治療性治療；和在治療性治療開始之后一次或多次測定患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量和總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量。如果治療性治療開始后高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白量或低分子量脂連蛋白的量的比例增加，則預(yù)示該患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
治療性治療通常包括給予有效量的一種或多種胰島素敏化藥物例如一噻唑烷二酮(也稱為一TZD)；非TZD的PPARγ激動(dòng)劑；或通過除PPARγ激動(dòng)作用外的不同機(jī)制起作用的胰島素敏化化合物的步驟。除PPARγ激動(dòng)作用外還具有其他治療活性的PPARγ激動(dòng)劑，例如PPARα/γ雙重激動(dòng)劑也可以通過本文所用方法來測試以確定患者是否是PPARγ激動(dòng)劑治療的應(yīng)答者。該方法還適用于使用PPARγ部分激動(dòng)劑(也被稱為選擇性PPARγ調(diào)節(jié)劑(SPPARM))，PPARα-γ雙重部分激動(dòng)劑(選擇性PPARα-γ雙重選擇性調(diào)節(jié)劑)和PPAR全激動(dòng)劑(pan-agonist)進(jìn)行治療的患者。
具有TZD結(jié)構(gòu)的PPARγ激動(dòng)劑包括匹格列酮、羅格列酮、環(huán)格列酮、達(dá)格列酮、恩格列酮、balaglitazone、isaglitazone、曲格列酮、netoglitazone、MCC-555和BRL-49653。其中一些具有TZD結(jié)構(gòu)的其他PPARγ激動(dòng)劑包括CLX-0921、5-BTZD、GW-0207、LG-100641、LY-300512、NN-2344、LY-818、GW-677954、GW-7282和T-131。優(yōu)選的PPARγ激動(dòng)劑包括羅格列酮和匹格列酮。
PPARα/γ雙重激動(dòng)劑顯示出α和γ激動(dòng)作用，并可用于同時(shí)治療2型糖尿病和減少脂質(zhì)。PPARα/γ激動(dòng)劑包括KRP-297(MK-0767)、muraglitazar(BMS-298585)、法格立他扎、ragaglitazar、tesaglitazar(AZ-242)、JT-501、GW-2570、GI-262579、CLX-0940、GW-1536、GW1929、GW-2433、L-796449、LR-90、SB-219994、LY-578、LY-4655608、LSN-862、LY-510929和LY-929。優(yōu)選的PPARα/γ激動(dòng)劑包括KRP-297(MK-0767)、muraglitazar(BMS-298585)、法格立他扎和tesaglitazar(AZ-242)，本文所公開的方法也期望當(dāng)將TZD或非TZD PPARγ激動(dòng)劑與可以用于治療2型糖尿病或胰島素抵抗的另一種或多種藥物組合(例如固定組合)或相伴隨給藥時(shí)，能夠有效確定患者是否可能是TZD或非TZD PPARγ激動(dòng)劑治療的應(yīng)答者。這類其他藥物是例如雙胍(如二甲雙胍)；磺酰脲；除磺酰脲外的另一化學(xué)類別的胰島素促分泌劑，例如一種氯茴苯酸；胰島素(可以配制成適合皮下或肌肉注射的形式，或是避免需要注射的制劑，例如口服、口腔或鼻用制劑)；DP-IV抑制劑；PTP-1B抑制劑；GLP-1類似物；糖原磷酸化酶抑制劑；胰高血糖素受體拮抗劑；羥甾醇脫氫酶(HSD-1)抑制劑；葡萄糖激酶活化劑；或來自于另一類抗糖尿病化合物的藥物。本文所公開的方法也期望當(dāng)將TZD或非TZD PPARγ激動(dòng)劑與可用于治療同樣具有2型糖尿病或胰島素抵抗的肥胖患者肥胖癥的另一種或多種藥物組合(例如固定組合)或相伴隨給藥時(shí)，能夠有效確定患者是否可能是TZD或非TZD PPARγ激動(dòng)劑治療的應(yīng)答者。所述的其他藥物是例如西布曲明、奧利斯特、苯丁胺、Mc4r激動(dòng)劑、大麻素受體1(CB-1)拮抗劑/反相激動(dòng)劑、β3腎上腺素能激動(dòng)劑、或來自于另一類抗糖尿病化合物的藥物。本方法也期望當(dāng)將TZD或非TZD PPAR激動(dòng)劑與一種或多種用于減少總膽固醇或LDL-膽固醇和/或升高HDL-膽固醇的藥物如HMG-CoA還原酶抑制劑(洛伐他汀、辛伐他汀、羅蘇伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、利伐斯的明、匹伐他汀、ZD-4522和其他他汀類藥物)、煙酸、膽固醇吸收抑制劑(依澤替米貝)、CETP抑制劑(torcetrapib)、PPARα激動(dòng)劑(非諾貝特、吉非貝齊、氯貝特或苯扎貝特)、ACAT抑制劑(阿伐麥布)、抗氧化劑(普羅布考)、或膽汁酸多價(jià)螯合劑(考來烯胺)相伴隨或以固定組合給藥時(shí)，能有效確定患者是否是TZD或非TZD PPAR激動(dòng)劑治療的應(yīng)答者。
優(yōu)選的分析方法是，在治療開始之前和在治療進(jìn)行足夠長時(shí)間之后，測量和比較患者血漿或血清內(nèi)高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例，比較HMW量對(duì)總脂連蛋白量的比例的變化以反映出患者是否將對(duì)治療有應(yīng)答。本文將該比例定義為SA，其為HMW/(HMW+LMW)的計(jì)算比例。HMW對(duì)總HMW+LMW脂連蛋白比例的變化是患者對(duì)胰島素敏化劑治療是否將有陽性應(yīng)答的最好預(yù)示物。開始治療后，對(duì)治療性治療是可能應(yīng)答者的患者在治療期間的高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例會(huì)增加?？赡艿脑摫壤黾宇A(yù)示陽性應(yīng)答，其可以是例如20％，25％，30％，40％，50％和75％。這些增加在治療開始后的四周內(nèi)，優(yōu)選在治療開始后二周內(nèi)，最優(yōu)選在治療開始后的一周內(nèi)就會(huì)被觀察到。
附圖簡述

圖1說明靜脈注射HMW，而不是六聚體的(LMW)脂連蛋白，會(huì)導(dǎo)致血清葡萄糖劑量依賴性的降低。該圖比較了用高分子量脂連蛋白(1或2μg/g體重)，低分子量脂連蛋白(2μg/g體重)或緩沖液注射的脂連蛋白剔除的雄性小鼠的血清葡萄糖變化。
發(fā)明詳述脂連蛋白是脂細(xì)胞特異性分泌蛋白，其在血清內(nèi)以相對(duì)低分子量(LMW)的六聚體和高分子量(HMW)的較大的多聚結(jié)構(gòu)的形式循環(huán)。該蛋白的血清水平與全身的胰島素敏感性相關(guān)。全長蛋白通過改善的胰島素敏感性來影響肝糖原異生，脂連蛋白的蛋白水解片斷刺激肌肉中的β氧化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這兩種低聚形式(HMW對(duì)LMW)之間的比例而不是其絕對(duì)量，對(duì)于確定胰島素敏感性是關(guān)鍵的。新指標(biāo)SA定義為HMW/(HMW+LMW)的比例。在db/db小鼠中，SA的值低于野生型同窩出生小鼠，盡管總脂連蛋白水平是相似的。此外，隨著PPARγ激動(dòng)劑(TZD)的治療SA會(huì)增加。SA的變化可以作為在TZD治療期間獲得的胰島素敏感性改善的定量指示物，而總的血清脂連蛋白水平變化在個(gè)體水平上的相關(guān)性較差。
材料和方法用于分離脂連蛋白復(fù)合物的速度沉降/凝膠過濾色譜——將在10mM pH 8HEPES、125mM NaCl中的5-20％蔗糖梯度液逐步(5％，10％，15％，20％)加入到2ml薄壁超速離心管(Becton Dickinson)中，在4℃平衡過夜。隨后樣品在頂部分層(在血清的情況下，用10mM pH 8的HEPES、125mM NaCl以1∶10稀釋)，4℃在Beckman TL-100臺(tái)式超速離心機(jī)的TLS55轉(zhuǎn)子中以55,000RPM將梯度液離心4小時(shí)。從梯度液頂部順序回收150μL梯度液級(jí)分，通過定量蛋白印跡分析進(jìn)行分析。
免疫印跡——如先前(20)所述，通過SDS-PAGE分離蛋白，然后進(jìn)行熒光自顯影，和免疫印跡。用含有0.05％Tween-20和1％BSA的TBS稀釋一級(jí)抗體和二級(jí)抗體。根據(jù)制造商的說明書(Pierce)，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光來檢測與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二級(jí)抗體。對(duì)于定量蛋白印跡，在SDS-PAGE后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到BA83硝化纖維素(Schleicher Schuell)上。用Ponceau S溶液對(duì)硝化纖維素膜進(jìn)行染色以確保均勻和完全地將所有樣品轉(zhuǎn)移，隨后用含有0.05％Tween-20和5％脫脂乳粉的TBS將其封閉。使用經(jīng)親和純化的抗包含高變區(qū)(EDDVTTTEELAPALV)的肽的兔抗小鼠脂連蛋白抗體；通過蛋白印跡分析該抗體可識(shí)別單條譜帶，這能夠有效地與過多的免疫肽競爭。對(duì)于人血清樣品的分析，使用抗人蛋白高變區(qū)(DQETTTQGPGV)的兔抗人脂連蛋白抗體。使用125I-衍生化的二級(jí)山羊抗兔抗體(Amersham)使所述兩種一級(jí)抗體顯影。用Phosphoimager(Molecular Dynamics)對(duì)印跡進(jìn)行分析，并用ImagequantSoftware對(duì)由速度沉降得到的4-6和9-11級(jí)分(分別為低分子量和高分子量脂連蛋白)進(jìn)行定量。
動(dòng)物體內(nèi)研究——按5只/籠將雄性db/db小鼠和對(duì)照小鼠(分別是Leprdb+/keprdb+和Leprdb+/+m，Jackson Labs)關(guān)入籠中，允許其任意攝取磨碎的Purina嚙齒類食物5001和水。每3天將動(dòng)物及其食物稱重，每天通過管飼法使用介質(zhì)(0.25％羧甲基纖維素)±10mg/kg-天羅格列酮給藥11天或10mg/kg-天PPARα激動(dòng)劑給藥7天(化合物10，(21))。在研究期間，以3-4天的間隔測定由通過尾部取血獲得的血液中血漿脂連蛋白、葡萄糖和甘油三酯水平。以同樣的方式供養(yǎng)用于脂肪提取的野生型動(dòng)物(C57/Bl6J)和用于體內(nèi)脂連蛋白活性研究的脂連蛋白剔除動(dòng)物。所有動(dòng)物試驗(yàn)方案被Albert Einstein AnimalCommittee批準(zhǔn)。
人臨床研究方案——研究A該研究為單中心，雙盲，隨機(jī)，安慰劑對(duì)照，平行組研究，用安慰劑和羅格列酮(4mg每日兩次)治療14天。在該分析中對(duì)20名非糖尿病受試者進(jìn)行治療(n＝10/組)。在第一天(基線)給藥前以及在第14天最后給藥2小時(shí)后獲得用于脂連蛋白濃度測定的血漿。全部20名受試者均為健康男性，年齡為18至42歲(平均年齡24歲)，體重為61至110kg(平均體重89kg)。從試驗(yàn)完成以前的14天起，這些受試者避免使用所有其他藥物。他們均沒有糖尿病征兆和家族史，基線空腹血糖＜110mg/dL，以及空腹基線血脂特征(包括甘油三酯和總膽固醇)在實(shí)驗(yàn)室參考范圍內(nèi)。所有受試者簽署了知情同意書，并且臨床方案由Commissie voor Medische Ethiek，Antwerp，Belgium檢查和批準(zhǔn)。
動(dòng)物研究和研究A的結(jié)果糖尿病小鼠顯示減少的HMW/總脂連蛋白比例，盡管總的血清脂連蛋白水平相當(dāng)。雖然基本上在所有情況下在人胰島素敏感性降低的情形中脂連蛋白水平顯著減少，但是在小鼠中胰島素抵抗經(jīng)常但不是總是與減少的脂連蛋白水平有關(guān)。這對(duì)于單基因損傷例如在db/db和ob/ob小鼠內(nèi)發(fā)現(xiàn)的損傷是特別相關(guān)的。以前證明了db/db小鼠顯示出與消瘦的雜合同窩出生小鼠相當(dāng)?shù)难h(huán)脂連蛋白水平(12)。為了確定是否能夠根據(jù)血清內(nèi)脂連蛋白復(fù)合物的差異分布而對(duì)這些動(dòng)物之間的差異進(jìn)行解釋(至少部分地)，我們對(duì)通過速度沉降后又通過SDS-PAGE從雄性db/db和db/+小鼠獲得的血清進(jìn)行了分析。與先前的發(fā)現(xiàn)相似，消瘦和肥胖動(dòng)物具有相當(dāng)?shù)脑谘鍍?nèi)循環(huán)的脂連蛋白總水平。然而，db/db小鼠顯示出高分子量形式的脂連蛋白百分比顯著降低。在許多其它的糖尿病小鼠模型包括ob/ob小鼠(未顯示)中可以觀察到相似的％HMW脂連蛋白的減少。
噻唑烷二酮治療影響在小鼠和人中循環(huán)HMW/LMW脂連蛋白復(fù)合物的比例。在11天的療程中噻唑烷二酮(TZD)治療導(dǎo)致db/db小鼠模型的血清脂連蛋白的誘導(dǎo)并且改善了高血糖癥、高甘油三酯血癥和胰島素抵抗(12)。為了確定TZD治療是否會(huì)影響血清中脂連蛋白低聚物的相對(duì)循環(huán)濃度，用羅格列酮來治療雄性db/db小鼠群，并且通過速度沉降對(duì)脂連蛋白復(fù)合物進(jìn)行分析。治療前，發(fā)現(xiàn)脂連蛋白主要以LMW(六聚體)形式的脂連蛋白存在，與由野生型雄性小鼠得到的值一致。然而，經(jīng)過11天的羅格列酮治療后，發(fā)現(xiàn)高分子量(HMW)形式的脂連蛋白的百分比幾乎加倍，為總循環(huán)脂連蛋白的約45％。安慰劑治療在脂連蛋白低聚物分布上沒有產(chǎn)生任何顯著變化(沒有顯示)，其使用同等成功減少血清葡萄糖、甘油三酯和胰島素水平(分別為45％，45％和80％)的PPARα激動(dòng)劑進(jìn)行7天治療在脂連蛋白低聚物分布上也沒有產(chǎn)生任何顯著變化。這表明復(fù)合物分布的這種變化可以直接歸因于TZD治療，而不是代謝參數(shù)全身改善的間接結(jié)果。
為了了解能否在用TZDs治療的人受試者中也觀察到高分子量脂連蛋白的這種相對(duì)增加，對(duì)在非糖尿病的男性人群中的效果進(jìn)行了測試(“研究A”，(12))。他們接受了兩個(gè)星期的羅格列酮或安慰劑的治療，在雙盲法中通過速度沉降在治療前和治療后對(duì)脂連蛋白復(fù)合物進(jìn)行了分析。在安慰劑治療的患者中只觀察到總循環(huán)脂連蛋白水平的微小變化或高分子量或低分子量脂連蛋白復(fù)合物的微小變化。通過比較，羅格列酮治療的患者顯示出總脂連蛋白顯著增加(是安慰劑組的大約2倍)。總脂連蛋白的增加主要是循環(huán)高分子量形式顯著增加的結(jié)果。因此，在羅格列酮治療的個(gè)體中，HWM/總脂連蛋白的比例顯著增加，治療后的值為大約45-50％，是治療前的值20-25％的大約2倍。
靜脈注射高分子量脂連蛋白，而不是六聚體(LMW)脂連蛋白，會(huì)導(dǎo)致小鼠血清葡萄糖降低。先前的工作已經(jīng)證明，當(dāng)通過腹膜內(nèi)或靜脈注射引入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，正確折疊和組裝的全長脂連蛋白會(huì)導(dǎo)致血清葡萄糖水平顯著降低。為了確定是否存在關(guān)于高分子量和低分子量脂連蛋白復(fù)合物具有不同生化活性的任何證據(jù)，使用純化的高分子量(1或2μg/g體重)或低分子量(2μg/g體重)脂連蛋白注射到雄性動(dòng)物中。為了避免不同的循環(huán)內(nèi)源性復(fù)合物的任何混雜效應(yīng)，在脂連蛋白基因座上帶有染色體缺失的小鼠中進(jìn)行注射，以使小鼠完全沒有任何內(nèi)源性循環(huán)脂連蛋白。
數(shù)據(jù)在圖1中列出。經(jīng)由尾部靜脈給10-12周齡的雄性脂連蛋白剔除動(dòng)物注射2μg/g體重的HMW脂連蛋白(n＝6)(實(shí)心圓)，2μg/g的LMW脂連蛋白(n＝6)(空心正方形)，1μg/g的HMW脂連蛋白(n＝6)(實(shí)心三角)或緩沖液(n＝6)(空心圓)。注射后在不同時(shí)間點(diǎn)通過血糖測量儀測定血清葡萄糖。任意地將每個(gè)群組起始葡萄糖水平設(shè)為100％，所有群組平均為150±5mg/dl。注射后將葡萄糖變化以基線(起始)葡萄糖的百分?jǐn)?shù)相對(duì)于時(shí)間(小時(shí))作圖。顯著不同于緩沖液對(duì)照的值以星號(hào)表示(p＜0.05)。圖1中的曲線說明高分子量脂連蛋白的劑量依賴性地減少血漿葡萄糖水平，而與注射緩沖液相比，純化的六聚體(LMW)脂連蛋白沒有誘導(dǎo)血漿葡萄糖水平降低的能力。由于雄性小鼠通常顯示它們的脂連蛋白大約80％為LMW形式(相當(dāng)于12到15倍摩爾過量)，因此有關(guān)于純化復(fù)合物的可溶性問題會(huì)妨礙將有效模擬這種低分子量復(fù)合物極度摩爾過量的所述兩種復(fù)合物的混合物的注射。
在脂肪組織水平上調(diào)節(jié)脂連蛋白復(fù)合物分泌。先前證明碘化的脂連蛋白復(fù)合物在血清中是穩(wěn)定的，并且在分泌后沒有互變。最近在脂連蛋白剔除動(dòng)物中使用非衍生化的完全天然的脂連蛋白復(fù)合物證實(shí)了這些觀察結(jié)果(數(shù)據(jù)沒有顯示)。這支持了TZD治療后增加高分子量脂連蛋白的機(jī)制是由脂細(xì)胞通過兩種低聚形式的差異分泌來介導(dǎo)的假說。通過速度沉降對(duì)來自雄性和雌性小鼠的不同脂肪組織和血清進(jìn)行分析以確定這些動(dòng)物中的復(fù)合物分布。如先前所報(bào)道，雄生和雌性小鼠在血清中顯示出不同的脂連蛋白復(fù)合物水平，雄性動(dòng)物顯示大約25％的血清脂連蛋白為高分子量形式，而雌性小鼠具有的高分子量形式比該百分?jǐn)?shù)的兩倍稍多(～50％HMW)。令人驚奇地，在雄性和雌性動(dòng)物的脂肪組織之內(nèi)具有相似比例的高分子量脂連蛋白，70-90％與脂肪組織相關(guān)的脂連蛋白為高分子量形式，與其在同一小鼠中的血清分布形成鮮明對(duì)照。對(duì)組織相關(guān)脂連蛋白和血清脂連蛋白比例之間的差異進(jìn)行了定量，雄性小鼠差異特別驚人，盡管在兩種性別的小鼠中都觀察到脂肪組織中高分子量脂連蛋白的顯著增加。在人血清和脂肪組織中觀察到相似的模式。
參考文獻(xiàn)1.Zhang，Y.，Proenca，R.，Maffel，M.，Barone，M.，Leopold，L.，和Friedman，J.M.1994.Posional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.Nature 372425-432.
2.Berg，A.H.，Combs，T.，Du，X.，Brownlee，M.，和Scherer，P.E.2001.TheAdipocyte-Secreted Protein Acrp 30 Enhances Hepatic Insulin Action.Nat Med 7947-953.
3.Steppan，C.M.，Bailey，S.T.，Bhat，S.，Brown，E.J.，Banerjee，R.R.，Wright，C.M.，Patel，H.R.，Ahima，R.S.，和Lazar，M.A.2001.The hormone resistin links obesity to diabetes.Nature 409307-312.
4.Lyon，C.J.，Law，R.E.，和Hsueh，W.A.2003.Minireviewadiposity，inflammation，and atherogenesis.Endocrinology 1442195-2200.
5.Rajala，M.W.，Obici，S.，Scherer，P.E.，和Rossetti，L.2003.Adipose-derivedresistin and gut-derived resistin-like molecule-beta selectively impair insulin action on glucoseproduction.J Clin Invest 111225-230.
6.Combs，T.P.，Berg，A.H.，Obici，S.，Scherer，P.E.，和Rossetti，L.2001.Endogenous Glucose Production is Inhibited by the Adipose-Derived Protein Acrp 30.J.Clin.Inv.1081875-1881.
7.Vasseur，F(xiàn).，Lepretre，F(xiàn).，Lacquemant，C.，和Froguel，P.2003.The genetics ofadiponectin.Curr Diab Rep 3151-158.
8.Weyer，C.，F(xiàn)unahashi，T.，Tanaka，S.，Hotta，K.，Matsuzawa，Y.，Pratley，R.E.，和Tataranni，P.A.2001.Hypoadiponectinemia in obesity and type 2 diabetescloseassociation with insulin resistance and hyperinsulinemia.J Clin Endocrinol Metab 861930-1935.
9.Cnop，M.，Havel，P.J.，Utzschneider，K.M.，Carr，D.B.，Sinha，M.K.，Boyko，E.J.，Retzlaff，B.M.，Knopp，R.H.，Brunzell，J.D.，和Kahn，S.E.2003.Relationship of adiponectin tobody fat distribution，insulin sensitivity and plasma lipoproteinsevidence for independent rolesof age and sex.Diabetologia 46459-469.
10.Yamauchi，T.，Kamon，J.，Waki，H.，Terauchi，Y.，Kubota，N.，Hara，K.，Mori，Y.，Ide，T.，Murakami，K.，Tsuboyama-Kasaoka，N.，et al.2001.The fat-derived hormoneadiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity.Nat.Med.7941-946.
11.Fruebis，J.，Tsao，T.S.，Javorschi，S.，Ebbets-Reed，D.，Erickson，M.R.，Yen，F(xiàn).T.，Bihain，B.E.，和Lodish，H.F.2001.Proteolytic cleavage product of 30-kDa adipocytecomplement-related protein increases fatty acid oxidation in muscle and causes weight loss inmice.Proc Natl Acad Sci USA 982005-2010.
12.Combs，T.P.，Wagner，J.A.，Berger，J.，Doebber，T.，Wang，W.J.，Zhang，B.B.，Tanen，M.，Berg，A.H.，O′Rahilly，S.，Savage，D.B.，et al.2002.Induction of adipocytecomplement-related protein of 30 kilodalton s by PPARgamma agonistsa potential mechanismof insulin sensitization.Endocrinology 143998-1007.
13.Yu，J.G.，Javorschi，S.，Hevener，A.L.，Kruszynska，Y.T.，Norman，R.A.，Sinha，M.，和Olefsky，J.M.2002.The effect of thiazolidinediones on plasma adiponectin levels in normal，obese，and type 2 diabetic subjects.Diabetes 512968-2974.
14.Maeda，N.，Takahashi，M.，F(xiàn)unahashi，T.，Kihara，S.，Nishizawa，H.，Kishida，K.，Nagaretani，H.，Matsuda，M.，Komuro，R.，Ouchi，N.，et al.2001.PPARgamma ligands increaseexpression and plasma concentrations of adiponectin，an adipose-derived protein.Diabetes502094-2099.
15.Day，C.1999.Thiazolidinedionesa new class of antidiabetic drugs.Diabet Med16179-192.
16.Lehmann，J.M.，Moore，L.B.，Smith-Oliver，T.A.，Wilkison，W.O.，Willson，T.M.，和Kliewer，S.A.1995.An antidiabetic thiazolidinedione is a high affinity ligand forperoxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR gamma).J Biol Chem 27012953-12956.
17.Chao，L.，Marcus-Samuels，B.，Mason，M.M.，Moitra，J.，Vinson，C.，Arioglu，E.，Gavrilova，O.，和Reitman，M.L.2000.Adipose tissue is required for the antidiabetic，but notfor the hypolipidemic，effect of thiazolidinediones.J Clin Invest 1061221-1228.
18.Olefsky，J.M.2000.Treatment of insulin resistance with peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.J Clin Invest 106467-472.
19.Pajvani，U.B.，Du，X.，Combs，T.P.，Berg，A.H.，Rajala，M.W.，Schulthess，T.，Engel，J.，Brownlee，M.，和Scherer，P.E.2003.Structure-function studies of the adipocyte-secreted hormone Acrp 30/adiponectinImplications for metabolic regulation and bioactivity.JBiol Chem 2789073-9085.
20.Scherer，P.E.，Lisanti，M.P.，Baldini，G.，Sargiacomo，M.，Corley-Mastick，C.，和Lodish，H.F.1994.Induction of Caveolin during Adipogenesis and Association of GLUT4with Caveolin-rich vesicles.J Cell Biol 1271233-1243.
21.Adams，A.D.，Hu，Z，von Langen，D.，Dadiz，A.，Elbrecht，A.，MacNaul，K.L.，Berger，J.P.，Zhou，G.，Doebber，T.W.，Meurer，R.，et al.2003.O-Arylmandelic acids as highlyselective human PPARalpha/gamma agonists.Bioorg Med Chem Lett in press.
權(quán)利要求
1.確定胰島素抵抗患者是否是對(duì)胰島素抵抗的治療性治療的應(yīng)答者的方法，包括如下步驟測定所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量和總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量；開始進(jìn)行所述治療性治療；以及在所述治療性治療開始之后一次或多次測定所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量和總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量，其中如果所述治療性治療開始后高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量的比例增加則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述治療性治療包括給予有效量的一種或多種胰島素敏化藥物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中如果所述治療性治療開始后高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量的比例增加至少20％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
4.權(quán)利要求2的方法，其中如果所述治療性治療開始后高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量的比例增加至少25％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
5.權(quán)利要求2的方法，其中如果所述治療性治療開始后高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量的比例增加至少30％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
6.權(quán)利要求2的方法，其中如果所述治療性治療開始后高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量的比例增加至少40％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
7.權(quán)利要求2的方法，其中如果所述治療性治療開始后高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量的比例增加至少50％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
8.權(quán)利要求2的方法，其中如果所述治療性治療開始后高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量的比例增加至少75％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述胰島素敏化藥物選自由PPARγ激動(dòng)劑，PPARγ部分激動(dòng)劑和PPARα-γ雙重激動(dòng)劑組成的組。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所述胰島素敏化藥物在其結(jié)構(gòu)中具有TZD基團(tuán)。
11.權(quán)利要求2的方法，其中所述胰島素敏化藥物選自由匹格列酮，羅格列酮，MCC-555，balaglitazone，isaglitazone，netoglitazone，KRP-297(MK-0767)，法格立他扎，tesaglitazar(AZ-242)和muraglitazar(BMS-298585)組成的組。
12.權(quán)利要求2的方法，其中在所述治療性治療開始之前和在所述治療性治療開始之后一次或多次測定所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量和總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量。
13.權(quán)利要求2的方法，其中在所述治療性治療開始之前和在所述治療性治療開始之后一次或多次測定所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量和總脂連蛋白的量，其中如果所述治療性治療開始后所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少20％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
14.權(quán)利要求13的方法，其中如果所述治療性治療開始后所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白量的比例增加至少25％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
15.權(quán)利要求13的方法，其中如果所述治療性治療開始后所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少30％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
16.權(quán)利要求13的方法，其中如果所述治療性治療開始后所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少40％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
17.權(quán)利要求13的方法，其中如果所述治療性治療開始后所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少50％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
18.權(quán)利要求13的方法，其中如果所述治療性治療開始后所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少75％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
19.權(quán)利要求13的方法，其中如果所述治療性治療開始后四周內(nèi)所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少20％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
20.權(quán)利要求19的方法，其中如果所述治療性治療開始后二周內(nèi)所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少20％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
21.權(quán)利要求19的方法，其中如果所述治療性治療開始后一周內(nèi)所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少20％則確定所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
22.預(yù)示對(duì)胰島素抵抗的治療性治療在需要治療一種或多種與胰島素抵抗有關(guān)疾病的患者中是否有效改善所述一種或多種疾病的方法，包括如下步驟測定所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量和總脂連蛋白的量；開始進(jìn)行所述治療性治療；和在所述治療性治療開始之后一次或多次測定患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量和總脂連蛋白的量；其中所述治療性治療包括給予有效量的一種或多種胰島素敏化藥物，其中如果所述治療性治療開始后四周內(nèi)高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少20％則預(yù)示在所述患者中所述治療性治療有效改善所述一種或多種疾病。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的預(yù)示對(duì)胰島素抵抗的治療性治療在需要治療一種或多種與胰島素抵抗有關(guān)的疾病的患者中是否有效改善所述一種或多種疾病的方法，其中所述疾病選自由2型糖尿病，肥胖癥，高血壓和血脂異常組成的組。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述方法用于預(yù)示對(duì)胰島素抵抗的治療性治療在2型糖尿病患者中是否有效改善高血糖癥或血脂異常。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述方法用于預(yù)示對(duì)胰島素抵抗的治療性治療是否有效減少具有削弱的葡萄糖耐量或升高的空腹血漿葡萄糖的非糖尿病患者發(fā)展為2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述方法用于預(yù)示對(duì)胰島素抵抗的治療性治療是否有效改善三種或更多種由Adult Treatment Panel III于JAMA，2002年1月16日，Vol.287，No.3，pp 356-359中所定義的代謝綜合征的癥狀，所述癥狀選自由腹部肥胖癥，高甘油三酯血癥，低HDL，高血壓和升高的空腹葡萄糖組成的組。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述方法用于預(yù)示對(duì)胰島素抵抗的治療性治療是否有效改善三種或更多種WHO所定義的代謝綜合征的癥狀。
28.根據(jù)權(quán)利要求24，25，26或27的方法，其中如果所述治療性治療開始后四周內(nèi)所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少20％則預(yù)示所述治療性治療在所述患者中是有效的。
29.根據(jù)權(quán)利要求24，25，26或27的方法，其中如果所述治療性治療開始后四周內(nèi)所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少25％則預(yù)示所述治療性治療在所述患者中是有效的。
30.根據(jù)權(quán)利要求24，25，26或27的方法，其中如果所述治療性治療開始后四周內(nèi)所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少30％則預(yù)示所述治療性治療在所述患者中是有效的。
31.根據(jù)權(quán)利要求24，25，26或27的方法，其中如果所述治療性治療開始后四周內(nèi)所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少40％則預(yù)示所述治療性治療在所述患者中是有效的。
32.根據(jù)權(quán)利要求24，25，26或27的方法，其中如果所述治療性治療開始后四周內(nèi)所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少50％則預(yù)示所述治療性治療在所述患者中是有效的。
33.根據(jù)權(quán)利要求24，25，26或27的方法，其中如果所述治療性治療開始后四周內(nèi)所述患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白的量的比例增加至少75％則預(yù)示所述治療性治療在所述患者中是有效的。
全文摘要
可通過如下方法鑒別作為對(duì)胰島素抵抗或一種或多種與2型糖尿病有關(guān)疾病進(jìn)行治療性治療的應(yīng)答者的患者在治療性治療開始之前測定患者組織(通常是血漿或血清)中高分子量脂連蛋白的量以及總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量；然后開始進(jìn)行治療性治療；以及最后在治療性治療開始之后一次或多次測定患者血漿或血清中高分子量脂連蛋白的量以及總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量。如果治療性治療開始后高分子量脂連蛋白的量對(duì)總脂連蛋白或低分子量脂連蛋白的量的比例增加，則預(yù)示所述患者是所述治療性治療的應(yīng)答者。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1882363SQ200480032400
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月7日
發(fā)明者J·A·沃納, P·E·謝勒爾, U·B·帕瓦尼 申請(qǐng)人:默克公司, 耶希瓦大學(xué)艾伯塔·愛恩斯坦醫(yī)學(xué)院