專利名稱：從新hcv株衍生的核酸和基因以及使用所述基因的復(fù)制子－復(fù)制細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從新的暴發(fā)性丙型肝炎病毒株衍生的核酸和基因、使用該基因的HCV復(fù)制子和復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞。
背景技術(shù)：
對(duì)于病毒研究和抗病毒藥物的研究和開發(fā)，允許病毒有效擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)體系絕對(duì)是必需的。另外，當(dāng)具有通過使用培養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增病毒的體系或通過使用培養(yǎng)細(xì)胞評(píng)價(jià)病毒增殖的體系時(shí)，病毒研究和抗病毒藥物的研究和開發(fā)顯示出引人注目的進(jìn)展。
丙型肝炎病毒(HCV)是屬于黃病毒科、以單鏈(+)有義鏈RNA為基因組的病毒，并已知其導(dǎo)致丙型肝炎。近來的研究已揭示，可以根據(jù)基因型或血清型將丙型肝炎病毒分類為許多類型。根據(jù)Simmonds等人利用HCV株核苷酸序列所作的系統(tǒng)分析方法(該方法是目前HCV基因型分類的主流方法)，將HCV分成六個(gè)類型，即基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型3a和基因型3b，且這些類型的每一個(gè)進(jìn)一步分為若干亞型(Simmonds，P.等人，Hepatorigy，(1994)10，第1321-1324頁(yè))。目前已經(jīng)確定了許多HCV基因型的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列(Choo等人，Science，(1989)244，第359-362頁(yè)；Kato等人，J.Med.Virol.，(1992)第334-339頁(yè)；Okamoto，H等人，J.Gen.Virol.，(1992)73，第673-679頁(yè)；Yoshioka等人，Hepatorogy，(1992)16，293-299)。
目前主要采用干擾素-α、干擾素-β和干擾素-α與嘌呤核苷衍生物三氮唑核苷(ribabirin)的組合治療來治療丙型肝炎。然而，即使是進(jìn)行這些治療后，在所有接受治療的患者中也僅約60％觀察到治療效果，且停止治療時(shí)，超過半數(shù)的有效果的患者疾病復(fù)發(fā)。已知干擾素的治療效果與HCV基因型相關(guān)，并且據(jù)說其對(duì)基因型1b的效果低而對(duì)基因型2a的效果較高(Mori，S.等人，Biochem.Biophis.Res.Commun.，(1992)183，334-342)。
開發(fā)有效的丙型肝炎治療藥物或預(yù)防藥物是巨大的挑戰(zhàn)，其中丙型肝炎在工業(yè)國(guó)具有高發(fā)病率并最終導(dǎo)致嚴(yán)重結(jié)果，且目前對(duì)其尚無(wú)病因療法。因此，迫切期待HCV特異性化學(xué)療法或疫苗療法的進(jìn)展并開發(fā)抗HCV藥物。作為開發(fā)抗HCV藥物的目標(biāo)，可設(shè)想抑制HCV復(fù)制或抑制HCV感染細(xì)胞。
由于直至最近難以在細(xì)胞培養(yǎng)體系中增殖HCV和用HCV感染培養(yǎng)的細(xì)胞，而且可以被HCV感染而且進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物僅限于黑猩猩，所以對(duì)于HCV復(fù)制機(jī)制和HCV感染機(jī)制的研究仍然困難。然而，近來已制得了衍生自HCV并具有自主復(fù)制能力的RNA這樣的HCV亞基因組RNA復(fù)制子(JP專利公開(Kokai)No.2001-17187(2001)；Lomann等人，Science，(1999)285，110-113；Blight等人，Science，(2000)290，1972-1974；Friebe等人，(2001)75，12047-12057；Ikeda等人，J.Virol.，(2002)76(6)，2997-3006)，由此可以使用培養(yǎng)的細(xì)胞來分析HCV的復(fù)制機(jī)制。這些HCV亞基因組RNA復(fù)制子是這樣的RNA復(fù)制子其中存在于HCV基因組RNA 5′非翻譯區(qū)中HCV IRES下游的結(jié)構(gòu)蛋白被新霉素抗性基因和連接在其下游的EMCV-IRES取代，其中所述HCV基因組RNA來自屬于基因型1b、被稱為Con 1的克隆。已經(jīng)證實(shí)，通過將這些復(fù)制子RNA導(dǎo)入人肝癌Huh7細(xì)胞并在新霉素存在下進(jìn)行培養(yǎng)，它們?cè)贖uh7細(xì)胞中自主復(fù)制。認(rèn)為使用該RNA復(fù)制子系統(tǒng)的HCV復(fù)制評(píng)估體系將成為開發(fā)抗HCV藥物的有力工具。
據(jù)報(bào)道，基因型不同的HCV中編碼的病毒蛋白也不同，且可以想象，僅通過分析衍生自基因型1b HCV的亞基因組RNA復(fù)制子難以充分闡明HCV的復(fù)制機(jī)制。另外，因?yàn)楦蓴_素的治療效果依賴于HCV基因型，所以認(rèn)為僅通過使用含有HCV基因型1b亞基因組RNA復(fù)制子的HCV復(fù)制體系開發(fā)對(duì)多種類型HCV發(fā)揮效果的抗HCV藥物尤其困難。因此，認(rèn)為應(yīng)當(dāng)通過制備許多基因型的HCV RNA復(fù)制子來進(jìn)行關(guān)于HCV復(fù)制機(jī)制和抗HCV藥物的研究。
目前，僅有若干克隆株系能夠作為復(fù)制子在培養(yǎng)的細(xì)胞中復(fù)制。另外，從慢性肝炎克隆并經(jīng)證實(shí)對(duì)黑猩猩有傳染性的克隆并不必要能夠作為復(fù)制子復(fù)制(Lomann等人，Science，(1999)285，110-113)。即，尚未發(fā)現(xiàn)可以以卓越的復(fù)制效率以及高概率產(chǎn)生HCV復(fù)制子的HCV株選擇方法，而當(dāng)建立起這樣的HCV株選擇方法時(shí)，HCV治療藥物的研究和開發(fā)有望得到巨大進(jìn)展。
目前尚未對(duì)HCV開發(fā)出疫苗。對(duì)此的理由之一是不能以體內(nèi)大量存在的形式穩(wěn)定地產(chǎn)生能夠作為疫苗的HCV相關(guān)蛋白。由于在上述HCV復(fù)制子細(xì)胞中表達(dá)HCV相關(guān)蛋白(JP專利公開(Kokai)No.2001-17187(2001))，所以預(yù)期可以使用該HCV復(fù)制子細(xì)胞。然而，有必要使用能夠大量培養(yǎng)用于疫苗工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)胞。從該角度看，目前建立的唯一的HCV RNA復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞Huh7細(xì)胞似乎不適于疫苗生產(chǎn)。對(duì)于適于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞，可以考慮能夠在懸浮培養(yǎng)體系中以非常巨大的量培養(yǎng)的細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞。此外，由于HCV的序列依賴上述基因型而不同，所以需要為每個(gè)基因型生產(chǎn)疫苗。換言之，需要使用適于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞產(chǎn)生多個(gè)基因型的HCVRNA復(fù)制子細(xì)胞。另一方面，因?yàn)閷?duì)HCV感染的易感性尚未得到證實(shí)，所以也認(rèn)為Huh7細(xì)胞不適于建立使HCV能夠自主感染并復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)體系。由此，認(rèn)為使用其它肝癌細(xì)胞建立使HCV自主感染并復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)體系是必需的。
而且，可能通過比較HCV RNA復(fù)制子在多種細(xì)胞中復(fù)制機(jī)制的差異而鑒定對(duì)于HCV復(fù)制所必需的細(xì)胞因子，這有望導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)抗HCV治療藥物的新靶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供具有卓越的高概率復(fù)制效率的HCV復(fù)制子RNA以及能連續(xù)大量產(chǎn)生HCV蛋白的HCV復(fù)制子細(xì)胞。
作為旨在解決上述問題的勤奮研究的結(jié)果，通過發(fā)現(xiàn)可以使用從暴發(fā)性丙型肝炎患者HCV株JFH2.1或JFH2.2衍生的復(fù)制子獲得具有卓越的高概率復(fù)制效率的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供由多核苷酸(a)、(b)或(c)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示核苷酸序列的多核苷酸；及(c)在嚴(yán)格條件下與由同上述(a)或(b)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV蛋白的多核苷酸，
前提是，如果該核酸為DNA，那么序列表中的核苷酸符號(hào)“u”應(yīng)當(dāng)以“t”取代。
本發(fā)明也提供下列核酸(1)至(6)作為上述核酸的實(shí)例。
(1)由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同上述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，(2)由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO3所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同上述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV基因5′非翻譯區(qū)的多核苷酸，(3)由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO4所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同上述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV基因3′非翻譯區(qū)的多核苷酸，(4)由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同上述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，(5)由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO5所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同上述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV基因5′非翻譯區(qū)的多核苷酸，(6)由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同上述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV基因3′非翻譯區(qū)的多核苷酸，前提是，如果在上述(1)至(6)任一項(xiàng)中核酸為DNA，那么序列表中的核苷酸符號(hào)“u”應(yīng)當(dāng)以“t”取代。
本發(fā)明也提供由上述核酸組成的基因以及由該基因編碼的多肽。
本發(fā)明也提供由RNA(a)或(b)組成的復(fù)制子RNA(a)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示核苷酸序列的RNA(b)含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示核苷酸序列的RNA另外，復(fù)制子RNA可以另外含有IRES序列和選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因。
本發(fā)明也提供由RNA(a)或(b)組成的復(fù)制子RNA(a)含有SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示核苷酸序列的RNA(b)在嚴(yán)格條件下與由同上述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的RNA雜交并具有自主復(fù)制能力的RNA本發(fā)明也提供通過將復(fù)制子RNA導(dǎo)入合適細(xì)胞而制備復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞的方法以及由該方法制備的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞。用于復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞的細(xì)胞包括人肝衍生細(xì)胞、人子宮頸衍生細(xì)胞或人胚腎衍生細(xì)胞，更具體為Huh7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、IMY-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或293細(xì)胞。
本發(fā)明也提供篩選刺激或抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的物質(zhì)的方法，該方法包括在測(cè)試物質(zhì)的存在下培養(yǎng)復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞，并在產(chǎn)生的培養(yǎng)物中檢測(cè)復(fù)制子RNA的復(fù)制。
本發(fā)明也提供提高丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA的復(fù)制效率的方法，該方法包括至少實(shí)施一次如下步驟，在所述步驟中從復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞獲得復(fù)制的復(fù)制子RNA，且將得到的復(fù)制的復(fù)制子RNA導(dǎo)入其它細(xì)胞以制備新的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞。在該方法中，期望復(fù)制效率為導(dǎo)入復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞中的復(fù)制子RNA的復(fù)制效率的至少兩倍。
本發(fā)明也提供產(chǎn)生具有更高復(fù)制效率的丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA的方法，該方法包括至少實(shí)施一次如下步驟，在所述步驟中從復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞獲得復(fù)制的復(fù)制子RNA，且將得到的復(fù)制的復(fù)制子RNA導(dǎo)入不同于復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞的細(xì)胞以制備新的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞，并從最終得到的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞獲得復(fù)制的復(fù)制子RNA。
另外，本發(fā)明也提供產(chǎn)生具有更高復(fù)制效率的丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA的方法，該方法包括檢測(cè)由上述方法產(chǎn)生的具有更高復(fù)制效率的復(fù)制子RNA與最初導(dǎo)入復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞中的復(fù)制子RNA之間的核苷酸或氨基酸突變，及將檢測(cè)到的核苷酸或氨基酸突變引入旨在提高復(fù)制效率的復(fù)制子RNA中。
當(dāng)使用本發(fā)明的新HCV RNA基因時(shí)，可以獲得具有卓越的高概率復(fù)制效率的復(fù)制子RNA和復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞?？梢詫⑦@些復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞用于培養(yǎng)體系以連續(xù)產(chǎn)生從HCV衍生的RNA和HCV蛋白。另外，也可以將這些復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞用于檢測(cè)體系以篩選多種對(duì)HCV復(fù)制或HCV蛋白翻譯發(fā)揮作用的物質(zhì)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示質(zhì)粒DNA pJFH-2.1和pJFH-2.2(上面行)和質(zhì)粒DNA pSGREP-JFH2.1和pSGREP-JFH2.2(下面行)結(jié)構(gòu)的圖解；及圖2是顯示以rSGREP-JFH2.1或rSGREP-JFH2.2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的集落形成的圖像。
本說明書含有日本專利申請(qǐng)No.2003-329082說明書中描述的內(nèi)容，本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基于所述日本專利申請(qǐng)No.2003-329082。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明詳述如下。
1.本發(fā)明的從HCV衍生的核酸、基因和復(fù)制子RNA丙型肝炎病毒(HCV)基因組是由約9600個(gè)核苷酸組成的(+)鏈單鏈RNA。該基因組RNA含有5′非翻譯區(qū)(也稱為5′NTR或5′UTR)、由結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)組成的翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)(也稱為3′NTR或3′UTR)。結(jié)構(gòu)區(qū)中編碼HCV結(jié)構(gòu)蛋白，且非結(jié)構(gòu)區(qū)中編碼多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。
HCV的這些結(jié)構(gòu)蛋白(核心、E1和E2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)以連續(xù)的多蛋白從翻譯區(qū)翻譯，然后經(jīng)過蛋白酶有限蛋白酶解產(chǎn)生為游離形式。在這些結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白(即HCV病毒蛋白)中，核心是核心蛋白，E1和E2是包膜蛋白，而非結(jié)構(gòu)蛋白是參與病毒自身復(fù)制的蛋白。已知NS2具有金屬蛋白酶活性，而NS3具有絲氨酸蛋白酶活性(N末端側(cè)三分之一處)和解旋酶活性(C-末端側(cè)三分之二處)。此外，NS4A是NS3蛋白酶活性的輔因子，且已報(bào)道NS5B具有依賴于RNA的RNA聚合酶活性。
本發(fā)明人使用HCV基因組構(gòu)建了具有卓越的高概率復(fù)制效率、并且能夠在細(xì)胞(例如Huh7細(xì)胞)中自主復(fù)制的RNA，其中HCV基因組并非基于HCV的常用基因型分類而是基于從暴發(fā)性肝炎患者分離HCV的準(zhǔn)則進(jìn)行選擇的。
在本說明書中，將具有自主復(fù)制能力、并且通過改變天然HCV病毒基因組而構(gòu)建的RNA稱為“復(fù)制子RNA”或“RNA復(fù)制子”。
在本說明書中，“基因”指核酸中“負(fù)責(zé)參與生命活動(dòng)的特異性功能或信息的核酸”，且包括RNA和DNA兩者。另外，核酸或基因可以是單鏈的(cDNA、cRNA等)或雙鏈的，且是天然存在或人工合成的。此外，其可以經(jīng)過部分修改或可以是衍生物。盡管序列表中的核苷酸序列為了方便以RNA顯示，但當(dāng)涉及的基因是DNA時(shí)，核苷酸符號(hào)“U”應(yīng)當(dāng)由“T”取代。
在本發(fā)明中，“暴發(fā)性肝炎”指在癥狀發(fā)作后8周內(nèi)表現(xiàn)出II期或更晚期腦病、且凝血酶原時(shí)間不高于40％的肝炎，并且分類為在10天內(nèi)發(fā)展為腦病的急性形式和此后發(fā)展為腦病的亞急性形式?！皝碓从诒┌l(fā)性肝炎患者的丙型肝炎病毒”指從表現(xiàn)這種“暴發(fā)性肝炎”癥狀的患者分離的HCV。在本發(fā)明中，“來源于暴發(fā)性肝炎患者的丙型肝炎病毒”或“暴發(fā)性株HCV”不僅包括具有天然來源的HCV基因組RNA的病毒，而且包括具有其中向天然來源的HCV基因組序列添加人工修飾的基因組RNA的病毒。HCV暴發(fā)性株的特定實(shí)例包括病毒例如JFH-1株(JP專利公開(Kokai)No.2002-171978(2002))、JFH-2.1株和JFH-2.2株。
在本申請(qǐng)的說明書中，應(yīng)當(dāng)基于編碼JFH-2.1和JFH-2.2株完整基因組區(qū)域的全長(zhǎng)基因組RNA或含有其部分基因組RNA(JFH-2.1和JFH-2.2克隆)的核苷酸序列(分別為SEQ ID NOS1至6)的多核苷酸確定“5′非翻譯區(qū)(5′NTR或5′UTR)”、“編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”、“編碼核心蛋白的序列(核心區(qū)或C區(qū))”、“編碼E1蛋白的序列(E1區(qū))”、“編碼E2蛋白的序列(E2區(qū))”、“編碼N2蛋白的序列(NS2區(qū))”、“編碼NS3蛋白的序列(NS3區(qū))”、“編碼NS4A蛋白的序列(NS4A區(qū))”、“編碼NS4B蛋白的序列(NS4B區(qū))”、“編碼NS5A蛋白的序列(NS5A區(qū))”、“編碼NS5B蛋白的序列(NS5B區(qū))”和“3′非翻譯區(qū)(3′NTR或3′UTR)”、以及其它特定區(qū)域或位點(diǎn)，其中JFH-2.1和JFH-2.2株是來源于暴發(fā)性丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒。
具體關(guān)于JFH-2.1克隆而言，當(dāng)將特定HCV的RNA序列與SEQID NO1、3和4所示核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列是該RNA的“5′非翻譯區(qū)”，由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列是“編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”，其中第1至1893位核苷酸序列是“編碼NS3蛋白的序列”，第1894至2055位核苷酸序列是“編碼NS4A蛋白的序列”，第2056至2838位核苷酸序列是“編碼NS4B蛋白的序列”，第2839至4236位核苷酸序列是“編碼NS5A蛋白的序列”，第4273至6012位核苷酸序列是“編碼NS5B蛋白的序列”，且由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列是“3′非翻譯區(qū)”。
關(guān)于JFH-2.2克隆，當(dāng)將特定HCV的RNA序列與SEQ ID NO2、5和6所示核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，由SEQ ID NO5所示的核苷酸序列是該RNA的“5′非翻譯區(qū)”，由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列是“編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”，其中第1至1893位核苷酸序列是“編碼NS3蛋白的序列”，第1894至2055位核苷酸序列是“編碼NS4A蛋白的序列”，第2056至2838位核苷酸序列是“編碼NS4B蛋白的序列”，第2839至4236位核苷酸序列是“編碼NS5A蛋白的序列”，第4273至6012位核苷酸序列是“編碼NS5B蛋白的序列”，且由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列是“3′非翻譯區(qū)”。
關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的基因，除了含有上述SEQ ID NOS1至6所示核苷酸序列的多核苷酸，在嚴(yán)格條件下與該基因雜交的多核苷酸也包含在本發(fā)明的基因中，只要這些多核苷酸編碼上述所需蛋白。在此，嚴(yán)格條件是這樣的條件在6X SSC(1X濃度的SSC溶液組合物由150mmol/l氯化鈉和15mmol/l檸檬酸鈉組成)存在下于60攝氏度進(jìn)行雜交，并然后于68攝氏度用含有0.1％SDS的1X SSC洗滌。關(guān)于雜交方法，可以使用集落雜交方法、蝕斑雜交方法、DNA印跡雜交方法等，且可以根據(jù)例如Molecular Cloning，A laboratory manual，20001，編者Sambrook，J.和Russell，DW.Cold Spring HarborLaboratory Press中所述實(shí)施這些方法。
在本發(fā)明的核酸或基因中，其序列中可能存在缺口、添加、缺失、取代等，只要這些序列編碼上述所需蛋白。具體而言，在SEQ IDNOS1至6所示核苷酸序列中，即使當(dāng)這些核苷酸序列是由具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸(即1至50、優(yōu)選1至30、更優(yōu)選1至10、更優(yōu)選1至6、最優(yōu)選一個(gè)至若干(2至5)個(gè)核苷酸)缺失、取代或添加的核苷酸序列組成的多核苷酸時(shí)，只要它們編碼所需蛋白，換言之，只要含有SEQ ID NO1或2所示核苷酸序列的多核苷酸是編碼HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，含有SEQID NO3或5所示核苷酸序列的多核苷酸是編碼HCV基因5′非翻譯區(qū)的多核苷酸，且含有SEQ ID NO4或6所示核苷酸序列的多核苷酸是編碼HCV基因3′非翻譯區(qū)的多核苷酸，那么那些多核苷酸就包含于本發(fā)明的核酸或基因中(有時(shí)以“含有核苷酸序列的核苷酸序列”表示“含有核苷酸序列的多核苷酸”)。
另外，上述“特定HCV”不限于JFH-2.1株和JFH-2.2株，但是包括其衍生物病毒株。
本發(fā)明HCV復(fù)制子RNA的一個(gè)實(shí)施方案是由核苷酸序列組成的復(fù)制子RNA，其中所述核苷酸序列至少含有存在于從暴發(fā)性肝炎來源的丙型肝炎病毒基因組RNA上的5′非翻譯區(qū)，編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列和3′非翻譯區(qū)。該復(fù)制子可以另外含有一個(gè)IRES序列，并且可以在其中另外含有一個(gè)選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因。此外，該復(fù)制子RNA可以含有編碼除了NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B蛋白之外的病毒蛋白、存在于JFH2.1和JFH2.2之外的丙型肝炎病毒基因組RNA上的序列。
本發(fā)明HCV復(fù)制子RNA的另一示例性實(shí)施方案是包含多核苷酸的復(fù)制子RNA，所述多核苷酸含有具有SEQ ID NO3所示核苷酸序列的5′非翻譯區(qū)，至少一個(gè)選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因，至少一個(gè)IRES序列，SEQ ID NO1所示HCV基因組RNA上編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列，和具有SEQ IDNO4所示核苷酸序列的3′非翻譯區(qū)，或含有具有SEQ ID NO5所示核苷酸序列的5′非翻譯區(qū)，至少一個(gè)選擇標(biāo)記基因和/或報(bào)告基因，至少一個(gè)IRES序列，SEQ ID NO2所示HCV基因組RNA上編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列，和具有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的3′非翻譯區(qū)。
本發(fā)明的復(fù)制子RNA優(yōu)選在5′最遠(yuǎn)側(cè)具有SEQ ID NO3或5所示HCV基因組RNA上的5′非翻譯區(qū)并在3′最遠(yuǎn)側(cè)具有SEQ IDNO4或6所示HCV基因組RNA上的3′非翻譯區(qū)。選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因可以連接在IRES序列上游，可以連接在“編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”的上游或下游，或可以插入“編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”中。
本發(fā)明的復(fù)制子RNA更優(yōu)選具有SEQ ID NO3或5所示HCV基因組RNA上的5′非翻譯區(qū)，在5′非翻譯區(qū)下游依次具有選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因、IRES序列和“編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”，并另外在3′最遠(yuǎn)側(cè)具有源自暴發(fā)性肝炎患者的HCV基因組RNA上的3′非翻譯區(qū)。
本發(fā)明HCV復(fù)制子RNA的另一示例性實(shí)施方案是由具有SEQID NO7或8所示核苷酸序列的RNA組成的復(fù)制子RNA。另外，也包括在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO7或8所示核苷酸序列組成的基因雜交的核酸。此外，在SEQ ID NO7或8所示核苷酸序列中，缺失、取代或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸(即1至50，優(yōu)選1至30，更優(yōu)選1至10，更優(yōu)選1至6，最優(yōu)選一個(gè)至若干(2至5)個(gè)核苷酸)的核苷酸序列、并具有自主復(fù)制能力的復(fù)制子RNA也作為示例性實(shí)施方案包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明中“具有自主復(fù)制能力”指在將該復(fù)制子RNA導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，該復(fù)制子RNA能夠在細(xì)胞中復(fù)制其自身全長(zhǎng)復(fù)制子RNA。盡管無(wú)意限制，但可以通過例如將復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)Huh7細(xì)胞、培養(yǎng)Huh7細(xì)胞、從所得培養(yǎng)物中的細(xì)胞提取RNA、使用能夠特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)染的復(fù)制子RNA的探針進(jìn)行RNA印跡雜交、并檢測(cè)該復(fù)制子RNA的存在而證實(shí)所述自主復(fù)制能力?？梢愿鶕?jù)本說明書實(shí)施例中所述的測(cè)量集落形成能力、確定HCV蛋白表達(dá)、檢測(cè)復(fù)制子RNA等的描述來實(shí)施證實(shí)自主復(fù)制能力的特定程序。
本發(fā)明的復(fù)制子RNA可以包括包含期望在用所述復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的任何外源基因的RNA。外源基因可以連接在5′非翻譯區(qū)下游、或連接在選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因的上游或下游、或連接在“編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”的上游或下游、或可以插入“編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”中。當(dāng)含有外源基因的復(fù)制子RNA在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中翻譯時(shí)，它能夠表達(dá)由該外源基因編碼的蛋白。因此，當(dāng)在基因治療等情況下以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生特定基因產(chǎn)物為目標(biāo)時(shí)，也可以期望使用含有外源基因的復(fù)制子RNA。
在本發(fā)明中，“選擇標(biāo)記基因”意指能夠?yàn)榧?xì)胞提供選擇性的基因，由此僅選擇出表達(dá)該基因的細(xì)胞。選擇標(biāo)記基因的一般實(shí)例包括抗生素抗性基因。在本發(fā)明中，優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因、Zeocin抗性基因和嘌呤霉素抗性基因等，其中優(yōu)選新霉素抗性基因和胸苷激酶基因，且更優(yōu)選新霉素抗性基因。應(yīng)當(dāng)指出本發(fā)明中選擇標(biāo)記基因不限于此。
此外在本發(fā)明中，“報(bào)告基因”意指編碼作為該基因表達(dá)指示物的基因產(chǎn)物的標(biāo)記基因。報(bào)告基因的一般實(shí)例包括，催化發(fā)光反應(yīng)或呈色反應(yīng)的酶的結(jié)構(gòu)基因。本發(fā)明中優(yōu)選的報(bào)告基因的實(shí)例包括源自轉(zhuǎn)座子Tn9的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、源自大腸桿菌(E.coli)的β葡糖醛酸糖苷酶或β半乳糖苷酶基因、螢光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、源自水母的水母發(fā)光蛋白基因和分泌型胎盤堿性磷酸酶(SEAP)基因等。應(yīng)當(dāng)指出本發(fā)明中報(bào)告基因不限于此。
復(fù)制子RNA中可以包含上述選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因中之一，或包含其二者。
在本發(fā)明中，“IRES序列”意指允許核糖體在RNA內(nèi)部結(jié)合而引發(fā)翻譯的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)。盡管不限于下列，但本發(fā)明中IRES序列的優(yōu)選實(shí)例包括EMCV IRES(腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn))、FMDV IRES、HCV IRES等，其中更優(yōu)選EMCV IRES和HCVIRES，且最優(yōu)選EMCV IRES。
本發(fā)明的復(fù)制子RNA可以另外包含核酶。插入核酶以使位于復(fù)制子RNA 5′側(cè)的選擇標(biāo)記基因、報(bào)告基因或外源基因與IRES序列和位于前者3′側(cè)的“編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”連接，從而因核酶的自切割活性通過切割使其二者分離。
在本發(fā)明的復(fù)制子RNA中，在正確的讀框中將上述選擇標(biāo)記基因、報(bào)告基因、來源于暴發(fā)性肝炎患者的丙型肝炎病毒基因組RNA上編碼病毒蛋白的序列、外源基因等連接，從而從復(fù)制子RNA翻譯。在這些序列中，編碼蛋白的序列也可以通過蛋白酶切割位點(diǎn)等彼此單獨(dú)連接，從而各個(gè)蛋白在作為融合蛋白表達(dá)之后由蛋白酶分離，其中融合蛋白被融合為從源自暴發(fā)性肝炎患者的丙型肝炎病毒的“編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”翻譯而來的多蛋白。
2.制備本發(fā)明的復(fù)制子RNA可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何基因工程技術(shù)制備本發(fā)明HCV復(fù)制子RNA。盡管無(wú)意加以限制，但可以通過例如下列方法制備HCV復(fù)制子RNA。
首先，通過常規(guī)方法將對(duì)應(yīng)于NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白(SEQ ID NO1或2)和3′非翻譯區(qū)(SEQID NO4或6)的RNA的DNA插入克隆載體中而制備DNA克隆。另一方面，將5′非翻譯區(qū)(SEQ ID NO3或5)插入RNA啟動(dòng)子下游以制備DNA克隆。在此，“對(duì)應(yīng)于RNA的DNA”意指由其中以T(胸腺嘧啶)取代RNA核苷酸序列中U(尿嘧啶)的核苷酸序列組成的DNA。所述RNA啟動(dòng)子優(yōu)選為質(zhì)?？寺≈兴腞NA啟動(dòng)子。盡管無(wú)意加以限制，但優(yōu)選的RNA啟動(dòng)子包括T7RNA啟動(dòng)子、SP6RNA啟動(dòng)子和SP3RNA啟動(dòng)子，且尤其期望T7RNA啟動(dòng)子。
接著，對(duì)于構(gòu)建的5′非翻譯區(qū)DNA克隆，將選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因插入例如5′非翻譯區(qū)下游，且將IRES序列插入其下游。另外，將具有SEQ ID NO1或2所示核苷酸序列的DNA和具有SEQ IDNO4或6所示核苷酸序列的DNA以此順序連接到IRES序列下游。
然后，使用上述構(gòu)建的DNA克隆為模板，通過RNA聚合酶合成RNA。可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從5′非翻譯區(qū)和IRES序列引發(fā)RNA合成。當(dāng)模板DNA是質(zhì)?？寺r(shí)，則用限制酶將上述連接在RNA啟動(dòng)子下游的DNA區(qū)從質(zhì)粒克隆切除，且也可以使用該DNA片段為模板合成RNA。此外，合成的RNA的3′末端期望與病毒基因組RNA的3′非翻譯區(qū)一致，且期望未添加或缺失其它序列。由此合成的RNA即為本發(fā)明的復(fù)制子RNA。
3.制備用本發(fā)明HCV復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞可以通過將如上所述制得的復(fù)制子RNA導(dǎo)入允許復(fù)制子RNA復(fù)制的細(xì)胞而獲得連續(xù)復(fù)制復(fù)制子RNA的細(xì)胞。在本說明書中，將連續(xù)擴(kuò)增復(fù)制子RNA的細(xì)胞稱作“復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞”。
盡管可以使用任何細(xì)胞作為用復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，只要所述細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)，所述細(xì)胞優(yōu)選為真核細(xì)胞，更優(yōu)選為人肝衍生的細(xì)胞、人子宮頸衍生的細(xì)胞或人胚腎衍生的細(xì)胞，以及更優(yōu)選Huh7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、IMY-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或293細(xì)胞。對(duì)于這些細(xì)胞，可以使用可商購(gòu)或從細(xì)胞庫(kù)獲得的細(xì)胞，或者可以使用從任何細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞或干細(xì)胞)建立的細(xì)胞系。
對(duì)于上述細(xì)胞，當(dāng)旨在疫苗生產(chǎn)情況下大量生產(chǎn)HCV蛋白時(shí)，期望使用可以大量培養(yǎng)的細(xì)胞。由此角度看，期望除Huh7以外的細(xì)胞。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)將復(fù)制子RNA導(dǎo)入細(xì)胞。這些導(dǎo)入技術(shù)包括例如電穿孔、基因槍法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣法、微注射法、DEAE瓊脂糖凝膠法等，并尤其優(yōu)選電穿孔法。
關(guān)于復(fù)制子RNA，可以將靶復(fù)制子RNA單獨(dú)或在與其它核酸的混合物中導(dǎo)入細(xì)胞中。當(dāng)需要改變復(fù)制子RNA的量而保持導(dǎo)入的RNA量恒定時(shí)，可以將靶復(fù)制子RNA與從待轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取的總細(xì)胞RNA的混合物用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用于導(dǎo)入細(xì)胞的復(fù)制子RNA的量可以依賴所使用的導(dǎo)入方法而確定，且優(yōu)選使用1皮克至100微克范圍內(nèi)、更優(yōu)選10皮克至10微克范圍內(nèi)的量。
當(dāng)使用包含選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因的復(fù)制子RNA導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，可以利用選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因的表達(dá)來選擇用復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染并且連續(xù)復(fù)制該復(fù)制子RNA的細(xì)胞。具體而言，例如，可以在能夠通過選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因的表達(dá)而進(jìn)行選擇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些用復(fù)制子RNA處理以導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞。
作為實(shí)例，當(dāng)復(fù)制子RNA中含有新霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記基因時(shí)，將用復(fù)制子RNA處理以導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16至24小時(shí)，然后向培養(yǎng)皿中添加濃度為0.05毫克/毫升至3.0毫克/毫升的G418(新霉素)。此后，繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)每周更換兩次培養(yǎng)液。從接種時(shí)間起培養(yǎng)優(yōu)選10天至40天、更優(yōu)選14天至28天后，通過用結(jié)晶紫將存活細(xì)胞染色，可以選擇用復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染并且連續(xù)復(fù)制復(fù)制子RNA的細(xì)胞作為集落。
可以通過常規(guī)方法從形成的集落克隆細(xì)胞。在本說明書中將由此獲得的、連續(xù)復(fù)制靶復(fù)制子RNA的細(xì)胞克隆稱作“復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞克隆”。
關(guān)于所建立的細(xì)胞克隆，需要通過檢測(cè)在細(xì)胞克隆中從轉(zhuǎn)染的復(fù)制子RNA復(fù)制的復(fù)制子RNA、確定轉(zhuǎn)染的復(fù)制子RNA中選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因向宿主基因組DNA中整合的存在或不存在、并證實(shí)HCV蛋白的表達(dá)，以證實(shí)靶復(fù)制子RNA確實(shí)被連續(xù)復(fù)制。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何RNA檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)胞克隆中從轉(zhuǎn)染的復(fù)制子RNA復(fù)制的復(fù)制子RNA(在本說明書下文中方便地稱作“復(fù)制的復(fù)制子RNA”)，且例如，可以使用對(duì)轉(zhuǎn)染的復(fù)制子RNA特異的DNA片段為探針，對(duì)提取自細(xì)胞克隆的總RNA實(shí)施RNA印跡雜交法來檢測(cè)復(fù)制子RNA。
盡管無(wú)意加以限制，但可以通過如下方法確定轉(zhuǎn)染的復(fù)制子RNA中選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因向宿主基因組DNA中的整合，例如，對(duì)提取自細(xì)胞克隆的宿主基因組DNA進(jìn)行PCR以擴(kuò)增至少一部分選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因、并確定擴(kuò)增產(chǎn)物的存在或不存在。盡管認(rèn)為其中檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞克隆已經(jīng)在宿主基因組中導(dǎo)入了選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因，但存在復(fù)制子RNA本身可能沒有在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)復(fù)制的可能性。在這種情況下，可以通過如下所示證實(shí)HCV蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)確定是否連續(xù)復(fù)制復(fù)制子RNA。
可以通過如下方法證實(shí)HCV蛋白的表達(dá)，例如，使針對(duì)應(yīng)當(dāng)從轉(zhuǎn)染的復(fù)制子RNA表達(dá)的HCV蛋白的抗體與提取自細(xì)胞克隆的蛋白反應(yīng)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何蛋白檢測(cè)方法實(shí)施該方法，且具體而言，可以通過例如將提取自細(xì)胞克隆的蛋白樣品印跡到硝化纖維素膜上，使抗HCV蛋白抗體(例如，抗NS3特異性抗體或收集自丙型肝炎患者的抗血清)與該蛋白樣品反應(yīng)，并進(jìn)一步檢測(cè)抗HCV蛋白抗體而實(shí)施。當(dāng)在提取自細(xì)胞克隆的蛋白中檢測(cè)到HCV蛋白時(shí)，則可以認(rèn)為該細(xì)胞克隆通過連續(xù)復(fù)制衍生自HCV的復(fù)制子RNA而表達(dá)HCV蛋白。
如上所述，可以獲得經(jīng)過證實(shí)連續(xù)復(fù)制靶復(fù)制子RNA的細(xì)胞克隆(復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞克隆)。此外，在本發(fā)明中，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種方法從所述復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞獲得復(fù)制子RNA，例如，通過提取RNA并通過電泳等從RNA提取物中分離復(fù)制子RNA。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生復(fù)制子RNA的方法。此外，本發(fā)明的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞可期望用于產(chǎn)生HCV蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)任何人員可以根據(jù)常規(guī)方法從復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞產(chǎn)生HCV蛋白。具體而言，例如，培養(yǎng)復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞、使用常規(guī)方法從所得培養(yǎng)物(包括培養(yǎng)的細(xì)胞和培養(yǎng)基)獲得蛋白。
此外，當(dāng)本發(fā)明的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞連續(xù)復(fù)制含有外源基因的復(fù)制子RNA時(shí)，可以通過使用復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞表達(dá)蛋白而獲得外源基因編碼的蛋白。具體而言，例如，培養(yǎng)復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞、通過常規(guī)方法從所得培養(yǎng)物(包括培養(yǎng)的細(xì)胞和培養(yǎng)基)提取蛋白，且另外，可以通過使用針對(duì)靶蛋白的抗體等檢測(cè)從提取的蛋白中選擇性獲得的由外源基因編碼的蛋白。
4.向本發(fā)明的HCV復(fù)制子RNA中導(dǎo)入提高復(fù)制效率的突變?cè)诒景l(fā)明復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞中通過復(fù)制產(chǎn)生的復(fù)制子RNA(復(fù)制的復(fù)制子RNA)中相當(dāng)頻繁地發(fā)生提高復(fù)制效率的突變。這樣的突變可能是適應(yīng)性突變。
利用這一事實(shí)，在本發(fā)明中，可以將提高復(fù)制效率的突變以高頻率導(dǎo)入本發(fā)明的復(fù)制子RNA中。
具體而言，至少一次、優(yōu)選1至10次、更優(yōu)選1至5次、以及更優(yōu)選1至2次重復(fù)實(shí)施如下方法，在所述方法中通過提取等從第一復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞(優(yōu)選用本發(fā)明復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞)獲得第一復(fù)制的復(fù)制子RNA、之后將第一復(fù)制的復(fù)制子RNA另外再次導(dǎo)入不同細(xì)胞中以制備第二復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞，由此可以將提高復(fù)制效率的突變以高頻率導(dǎo)入復(fù)制子RNA中。
盡管可以使用任何細(xì)胞作為用復(fù)制的復(fù)制子RNA再轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，但細(xì)胞優(yōu)選為源自與用復(fù)制子RNA最初轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相同的生物物種的細(xì)胞，更優(yōu)選源自與用復(fù)制子RNA最初轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相同的生物物種的相同組織的細(xì)胞，且更優(yōu)選與用復(fù)制子RNA最初轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的相同細(xì)胞系的細(xì)胞。
因此在本發(fā)明中，可以使用上述方法產(chǎn)生其中導(dǎo)入了提高復(fù)制效率的突變的復(fù)制子RNA。即，至少一次、優(yōu)選1至10次、更優(yōu)選1至5次、以及更優(yōu)選1至2次重復(fù)實(shí)施如下方法，在所述方法中通過提取等從第一復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞(優(yōu)選用本發(fā)明復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞)獲得第一復(fù)制的復(fù)制子RNA、之后將第一復(fù)制的復(fù)制子RNA另外再次導(dǎo)入不同細(xì)胞中以制備第二復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞，且隨后，通過提取等從重復(fù)方法結(jié)束時(shí)獲得的最終復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞中獲得復(fù)制的復(fù)制子RNA，由此產(chǎn)生提高復(fù)制效率的復(fù)制子RNA。
本發(fā)明中，通過上述方法，復(fù)制子RNA的復(fù)制效率可以提高至少2倍，優(yōu)選10至100倍，且更優(yōu)選100至10000倍。
關(guān)于通過這類方法產(chǎn)生的具有提高的復(fù)制效率的復(fù)制子RNA，期望使用已知方法確定復(fù)制子RNA的核苷酸序列，在所述方法中通過用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA，然后將其進(jìn)行核苷酸序列確定等。此外，通過將確定的核苷酸序列或由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列與最初導(dǎo)入細(xì)胞中的復(fù)制子RNA的核苷酸序列比較，可以鑒定適應(yīng)性突變。對(duì)于提高復(fù)制效率的適應(yīng)性突變，尤其期望導(dǎo)致由復(fù)制子RNA編碼的病毒蛋白中氨基酸突變的非同義取代。
本發(fā)明還提供一種方法，在該方法中，通過常規(guī)方法將如上鑒定的適應(yīng)性突變導(dǎo)入復(fù)制子RNA，產(chǎn)生復(fù)制效率提高的丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA。
如上所述產(chǎn)生的具有更高復(fù)制效率的復(fù)制子RNA可用于產(chǎn)生大量復(fù)制子RNA。
可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定本發(fā)明的復(fù)制子RNA的復(fù)制效率，例如通過以下方法。
例如，分別用0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3和1.0微克的復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，并以類似于上述試驗(yàn)程序的方式用G418選擇培養(yǎng)21天，然后測(cè)量集落形成數(shù)(集落數(shù))。通過比較導(dǎo)入的RNA的量與集落形成數(shù)，確定導(dǎo)入的復(fù)制子RNA量的范圍，在此范圍內(nèi)，集落形成呈劑量依賴性增加，并將該范圍內(nèi)的集落形成數(shù)除以導(dǎo)入的RNA量得到的值定義為每微克的集落形成率。該計(jì)算方程式如下所示。集落形成率[(集落形成單位；CFU)/微克]＝集落形成數(shù)[片]/導(dǎo)入的RNA量[微克]。
將由此計(jì)算出的集落形成率定義為表示轉(zhuǎn)染的復(fù)制子RNA的復(fù)制效率的值。即，集落形成率越高，復(fù)制子RNA的復(fù)制效率越高。
此外，可以通過集落形成能力表示復(fù)制子RNA的復(fù)制效率，其中集落形成能力由每個(gè)形成的集落所轉(zhuǎn)染的復(fù)制子RNA的拷貝數(shù)顯示。即，可以根據(jù)以下計(jì)算方程式計(jì)算集落形成能力。集落形成能力＝轉(zhuǎn)染的復(fù)制子RNA拷貝數(shù)[拷貝]/集落形成數(shù)[片]。
5.本發(fā)明的其它實(shí)施方案本發(fā)明的復(fù)制子RNA-復(fù)制細(xì)胞還可用作，例如，篩選刺激或抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的物質(zhì)的測(cè)試系統(tǒng)。具體而言，例如，在測(cè)試物質(zhì)存在下培養(yǎng)復(fù)制子復(fù)制細(xì)胞，檢測(cè)所得培養(yǎng)物中復(fù)制子RNA的復(fù)制，并考慮測(cè)試物質(zhì)是否刺激或抑制復(fù)制子RNA的復(fù)制，由此可能篩選出刺激或抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的物質(zhì)。在這種情況下，可通過如下方法檢測(cè)所得培養(yǎng)物中復(fù)制子RNA的復(fù)制在提取自復(fù)制子RNA-復(fù)制細(xì)胞的RNA中檢測(cè)復(fù)制子RNA的量或存在或不存在復(fù)制子RNA、或在培養(yǎng)物或存在于培養(yǎng)物中的復(fù)制子RNA-復(fù)制細(xì)胞中的蛋白中檢測(cè)所含HCV蛋白的量或存在或不存在HCV蛋白。
這樣的測(cè)試系統(tǒng)可用于生產(chǎn)或評(píng)估丙型肝炎病毒感染的治療劑或診斷劑。具體而言，可以列舉以下實(shí)例。
(1)篩選抑制HCV增殖的物質(zhì)抑制HCV增殖的物質(zhì)包括例如對(duì)HCV增殖直接或間接發(fā)揮作用的有機(jī)化合物、或通過與HCV基因組中的靶序列或其互補(bǔ)鏈雜交而對(duì)HCV增殖或HCV蛋白翻譯直接或間接發(fā)揮作用的反義寡核苷酸等。
(2)評(píng)價(jià)在細(xì)胞培養(yǎng)物中具有抗病毒作用的多種物質(zhì)多種物質(zhì)包括從使用合理藥物設(shè)計(jì)或高通量篩選等獲得的物質(zhì)(例如分離和純化的酶)等。
(3)鑒定治療HCV感染患者的新攻擊靶本發(fā)明的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞可以用于鑒定例如在HCV病毒增殖中發(fā)揮重要作用的宿主細(xì)胞蛋白。
(4)評(píng)價(jià)HCV病毒獲得對(duì)藥物等抗性的潛能并鑒定涉及該抗性的突變
(5)產(chǎn)生可作為抗原用于開發(fā)、生產(chǎn)和評(píng)估丙型肝炎病毒感染的診斷劑或治療劑的病毒蛋白根據(jù)以下實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的解釋。
復(fù)制子RNA的復(fù)制1.構(gòu)建表達(dá)載體從含有病毒株全長(zhǎng)基因組cDNA的JFH-2.1和JFH-2.2克隆獲得對(duì)應(yīng)于從暴發(fā)性肝炎患者分離的丙型肝炎病毒JFH-2.1株和JFH-2.2株病毒基因組完整區(qū)域的DNA，并將T7RNA啟動(dòng)子序列的合成DNA附著到各克隆的5′末端，然后插入質(zhì)粒(pUC19質(zhì)粒)中。在下文中將由此構(gòu)建的質(zhì)粒DNA分別稱為pJFH-2.1和pJFH-2.2。應(yīng)當(dāng)指出上述JFH-2.1和JFH-2.2克隆是根據(jù)公開的報(bào)道(Lehmann等人，Science，(1999))制備的。
由此構(gòu)建的質(zhì)粒DNA pJFH-2.1和pJFH-2.2的結(jié)構(gòu)顯示于圖1上面行。“T7”表示T7RNA啟動(dòng)子，而“G”表示插入到pJFH-2.1和pJFH-2.2 5′末端上游和T7RNA啟動(dòng)子序列3′末端下游的dGTP?！?′NTR”至“3′NTR”范圍代表對(duì)應(yīng)于丙型肝炎病毒完整基因組區(qū)域的DNA。
接下來，用新霉素抗性基因(neo；也稱作新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)和EMCV-IRES(腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn))取代質(zhì)粒DNA pJFH-2.1和pJFH-2.2的部分結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)，以分別構(gòu)建出質(zhì)粒DNA pSGREP-JFH2.1和pSGREP-JFH2.2(圖1下面行)。根據(jù)已公開的報(bào)道(Lohmann等人，Science，(1999))實(shí)施該構(gòu)建程序。具體而言，用限制酶Age I和Cla I切割質(zhì)粒pJFH2.1和pJFH2.2；通過PCR擴(kuò)增將源自pJFH2.1和pJFH2.2每一個(gè)的5′NTR至核心區(qū)延伸的序列和源自表達(dá)載體pRSV5NEO的新霉素抗性基因連接到切割位點(diǎn)；通過PCR擴(kuò)增將由限制酶Agl I和Pme I切割的片段與EMCV IRES向NS3區(qū)延伸的序列連接；并插入和連接由限制酶Pme I和Cla I切割的片段。
2.制備復(fù)制子RNA為制備用于合成復(fù)制子RNA的模板DNA，用限制酶Xba I分別切割如上所述構(gòu)建的表達(dá)載體pSGREP-JFH2.1和pSGREP-JFH2.2。然后，將10至20μg這些Xba I切割片段分別于30攝氏度與20U綠豆核酸酶溫育30分鐘(反應(yīng)溶液總體積50μl)用于進(jìn)一步處理。綠豆核酸酶是催化雙鏈DNA中的單鏈部分選擇性降解的酶。一般，當(dāng)使用Xba I切割的片段為模板合成RNA時(shí)，會(huì)合成在3’末端另外附加CUGA四個(gè)核苷酸的復(fù)制子RNA，其中CUGA四個(gè)核苷酸是Xba I識(shí)別序列的一部分。因此，在本實(shí)施例中，通過用綠豆核酸酶處理Xba I切割的片段，從Xba I切割的片段中去除CUGA四個(gè)核苷酸。然后，在用綠豆核酸酶處理后，根據(jù)常規(guī)方法通過蛋白去除處理從含有Xba I切割的片段的溶液純化已經(jīng)除去CUGA四個(gè)核苷酸的Xba I切割的片段，并將該純化的片段用作模板DNA。
接著，由此模板DNA體外合成RNA。對(duì)于RNA合成，使用可從Ambion，Inc.獲得的MEGA script。于37攝氏度在20μl含有0.5至1.0微克模板DNA的反應(yīng)溶液中反應(yīng)3小時(shí)至16小時(shí)。
合成RNA之后，向反應(yīng)溶液中加入DNA酶(2U)，并于37攝氏度反應(yīng)15分鐘，然后用酸性苯酚提取RNA以去除模板DNA。將由此從上述源自pSGREP-JFH2.1和pSGREP-JFH2.2的模板DNA合成的RNA(復(fù)制子RNA)分別命名為rSGREP-JFH2.1和rSGREP-JFH2.2。這些復(fù)制子RNA的核苷酸序列，rSGREP-JFH2.1示于SEQ ID NO7和圖1，rSGREP-JFH2.2示于SEQ ID NO8和圖1。
建立復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞克隆對(duì)于實(shí)施例1中制備的各個(gè)合成的復(fù)制子RNA rSGREP-JFH2.1和rSGREP-JFH2.2，將0.01ng至10μg的復(fù)制子RNA與提取自Huh7細(xì)胞的總細(xì)胞RNA混合，以調(diào)整總RNA的量為10μg。然后通過電穿孔將混合RNA導(dǎo)入Huh7細(xì)胞。將經(jīng)過電穿孔處理的Huh7細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，并培養(yǎng)16小時(shí)至24小時(shí)，隨后向皿中添加各種濃度的G418(新霉素)。其后繼續(xù)培養(yǎng)同時(shí)每周更換兩次培養(yǎng)基。從接種時(shí)間培養(yǎng)21天后，用結(jié)晶紫對(duì)存活細(xì)胞染色。結(jié)果如圖2所示證實(shí)集落形成。
對(duì)用rSGREP-JFH2.1和rSGREP-JFH2.2轉(zhuǎn)染、并顯示集落形成的細(xì)胞，培養(yǎng)21天后從培養(yǎng)皿進(jìn)一步克隆存活細(xì)胞集落并繼續(xù)培養(yǎng)。通過所述集落的克隆，可以確立多個(gè)克隆的細(xì)胞系。
本說明書中引用的所有印刷出版物、專利和專利申請(qǐng)都在本說明書中引用作為參考。
工業(yè)適用性可以通過使用本發(fā)明HCV株JFH2.1或JFH2.2衍生的基因產(chǎn)生具有卓越的高概率復(fù)制效率的HCV復(fù)制子RNA，其中HCV株源自暴發(fā)性丙型肝炎患者。用該復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞可以用作培養(yǎng)體系以連續(xù)產(chǎn)生HCV衍生的RNA和HCV蛋白。另外，復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞可以用作測(cè)試系統(tǒng)以篩選多種對(duì)HCV復(fù)制和/或HCV蛋白翻譯發(fā)揮作用的物質(zhì)。
無(wú)文本序列表SEQ ID NO7人工序列描述JFH2.1復(fù)制子RNASEQ ID NO8人工序列描述JFH2.2復(fù)制子RNA
序列表<110>Tokyo Metropolitan Organization for Medical ResearchToray Industries INC.
<120>從新HCV株衍生的核酸和基因以及使用所述基因的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞<130>PH-2254-PCT<140>
<141>
<150>JP 2003-329082<151>2003-09-19<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>6264<212>RNA<213>丙型肝炎病毒<220>
<223>發(fā)明人Wakita，Takaji發(fā)明人Kato，Takanobu發(fā)明人Date，Tomoko<400>1accauggcgc cuaucacugc uuaugcccag cagacacgag gccuauuggg cgccauagug 60gugagcauga cgggccguga caagacagaa caggccgggg agauccaggu ccucuccaca 120gucacucaaa ccuuccucgg gacuaccauc ucaggagucu uguggaccgu cuaccacggg 180gcuggcaaca agacccuagc cggcucgcgg ggcccgguca cacagaugua cuccagcgcc 240gagggagacu ugguagggug gcccaguccu cccgggacua aauccaugga gccgugcacg 300ugcggagcgg ucgaccugua ccuggucacg cggaacgcug acgucauccc ggcucggaga 360cgcggggaca agcggggagc guugcucucc ccgagaccuc ucucaacucu gaaggggucu 420ucggggggac cggugcucug ccccaggggc cacguugucg ggaucuuccg ggcagccaua 480ugcucgcggg gcguggccaa guccauagau uucauccccg uugaggcaau ugacaucguc 540acgcgcuccc ccaccuuuac ugacaacagc acgccaccgg cugugcccca gaccuaucag 600guuggauacu ugcacgcccc gacuggcagc gggaagagca ccaaaguccc ugucgcauau 660gccgcccagg gguauaaggu gcuagugcuc aaucccucgg uggccgccac cuugggguuu 720ggggcguacu uggccaaggc gcacggcauc aauccuaaca uuaggacugg agucaggacu 780
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uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 6120cuuuuccuuc cuuucuuuuu cacuuuacuu cauucuuucc ugguggcucc aucuuagccc 6180uagucacggc uagcugugaa agguccguga gccgcaugac ugcagagagu gccguaacug 6240gucucucugc agaucauguc uaga6264<210>2<211>6018<212>RNA<213>丙型肝炎病毒<400>2accauggcgc cuaucacugc uuaugcccag cagacacgag gccuauuggg cgccauagug 60gugagcauga cgggccguga caagacagaa caggccgggg agauccaggu ccucuccaca 120gucacucaaa ccuuccucgg gacuaccauc ucaggagucu uguggaccgu cuaccacggg 180gcuggcaaca agacccuagc cggcucgcgg ggcccgguca cacagaugua cuccagcgcc 240gagggagacu ugguagggug gcccaguccu cccgggacua aauccaugga gccgugcacg 300ugcggagcgg ucgaccugua ccuggucacg cggaacgcug acgucauccc ggcucggaga 360cgcggggaca agcggggagc guugcucucc ccgagaccuc ucucaacucu gaaggggucu 420ucggggggac cggugcucug ccccaggggc cacguugucg ggaucuuccg ggcagccaua 480ugcucgcggg gcguggccaa guccauagau uucauccccg uugaggcaau ugacaucguc 540acgcgcuccc ccaccuuuac ugacaacagc acgccaccgg cugugcccca gaccuaucag 600guuggauacu ugcacgcccc gacuggcagc gggaagagca ccaaaguccc ugucgcauau 660gccgcccagg gguauaaggu gcuagugcuc aaucccucgg uggccgccac cuugggguuu 720ggggcguacu uggccaaggc gcacggcauc aauccuaaca uuaggacugg agucaggacu 780gugacgaccg gggaggcuau uacguauucc acguauggca aguuucucgc ugaugggggc 840ugcgcaggcg gcgccuauga caucaucaua ugcgaugagu gccaugccac ggaugcuacc 900acccuucucg gcaucggaac aguucuugac caagcagagu cagcuggggu caggcuaacu 960gugcuggcca cggcuacgcc ucccggauca auaacaaccc cucaccccaa cauagaggag 1020guagcucucg gacaggaggg ugagaucccc uucuauggga gagcgauccc ccuggcccac 1080aucaagggag ggaggcaccu gaucuucugc cacucgaaga aaaaguguga cgagcucgcg 1140gcggcccucc gggccauggg cuugaacgcu guggcauacu acagaggguu ggacgucucc 1200auaauaccag cucaaggaga cguggugguu gucgccacug acgcccucau gacaggguac 1260acuggagacu uugacuccgu gauugacugc aacguagcgg uuacucaagu cguggacuuc 1320agcuuggacc ccaccuucac cauauccaca caaaccgucc cccaagacgc cgucucacgc 1380agccagcgcc gggggcgcac gggcagaggg agacugggca uuuacaggua cguuuccacu 1440ggugagcgag cuucgggaau guuugacagc guaacgcucu gcgagugcua cgaugcaggg 1500gcugcauggu augaucucac accagcggaa accaccguca ggcuuagggc guauuucaac 1560acgcccggcc ugcccgugug ccaagaccac cucgaguuuu gggaggcagu uuucaccggc 1620cucacacaca uagaugccca cuaccuuucc caaacaaagc aagcggggga gaauuucgca 1680uaccugacag ccuaucaggc cacagugugu gccagagcca aagccccucc cccgucuugg 1740gacgucaugu ggaagugccu gacucgacuc aaacccacgc ucgugggccc cacaccucuc 1800cuguaccgcc uggguucagu uaccaacgau gucaccuuca cacacccugu gacaaaguac 1860aucgcuacuu gcaugcaagc ugaccucgag gucaugacca gcacgugggu ccuagccggg 1920
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<213>丙型肝炎病毒<400>4agcggcacac auuagcuaca cuccauagcu aacuguucca uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 60uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uucuuuuccu uccuuucuuu 120uucacuuuac uucauucuuu ccugguggcu ccaucuuagc ccuagucacg gcuagcugug 180aaagguccgu gagccgcaug acugcagaga gugccguaac uggucucucu gcagaucaug 240u 241<210>5<211>340<212>RNA<213>丙型肝炎病毒<400>5acccgccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60cuucacgcag aaagcgucua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180aagacugggu ccuuucuugg augaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300ugcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcauc 340<210>6<211>241<212>RNA<213>丙型肝炎病毒<400>6agcggcacac auuagcuaca cuccauagcu aacuguucca uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 60uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uucuuuuccu uccuuucuuu 120uucacuuuac uucauucuuu ccugguggcu ccaucuuagc ccuagucacg gcuagcugug 180aaagguccgu gagccgcaug acugcagaga gugccguaac uggucucucu gcagaucaug 240u 241<210>7<211>8034<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述JFH2.1復(fù)制子RNA
<400>7acccgccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60cuucacgcag aaagcgucua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300ugcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcauc augagcacaa aucccaaacc 360ucaaagaaaa accaacagaa acaccaaccg ucgcccaaug auugaacaag auggauugca 420cgcagguucu ccggccgcuu ggguggagag gcuauucggc uaugacuggg cacaacagac 480aaucggcugc ucugaugccg ccguguuccg gcugucagcg caggggcgcc cgguucuuuu 540ugucaagacc gaccuguccg gugcccugaa ugaacugcag gacgaggcag cgcggcuauc 600guggcuggcc acgacgggcg uuccuugcgc agcugugcuc gacguuguca cugaagcggg 660aagggacugg cugcuauugg gcgaagugcc ggggcaggau cuccugucau cucaccuugc 720uccugccgag aaaguaucca ucauggcuga ugcaaugcgg cggcugcaua cgcuugaucc 780ggcuaccugc ccauucgacc accaagcgaa acaucgcauc gagcgagcac guacucggau 840ggaagccggu cuugucgauc aggaugaucu ggacgaagag caucaggggc ucgcgccagc 900cgaacuguuc gccaggcuca aggcgcgcau gcccgacggc gaggaucucg ucgugaccca 960uggcgaugcc ugcuugccga auaucauggu ggaaaauggc cgcuuuucug gauucaucga 1020cuguggccgg cugggugugg cggaccgcua ucaggacaua gcguuggcua cccgugauau 1080ugcugaagag cuuggcggcg aaugggcuga ccgcuuccuc gugcuuuacg guaucgccgc 1140ucccgauucg cagcgcaucg ccuucuaucg ccuucuugac gaguucuucu gaguuuaaac 1200ccucucccuc cccccccccu aacguuacug gccgaagccg cuuggaauaa ggccggugug 1260cguuugucua uauguuauuu uccaccauau ugccgucuuu uggcaaugug agggcccgga 1320aaccuggccc ugucuucuug acgagcauuc cuaggggucu uuccccucuc gccaaaggaa 1380ugcaaggucu guugaauguc gugaaggaag caguuccucu ggaagcuucu ugaagacaaa 1440caacgucugu agcgacccuu ugcaggcagc ggaacccccc accuggcgac aggugccucu 1500gcggccaaaa gccacgugua uaagauacac cugcaaaggc ggcacaaccc cagugccacg 1560uugugaguug gauaguugug gaaagaguca aauggcucuc cucaagcgua uucaacaagg 1620ggcugaagga ugcccagaag guaccccauu guaugggauc ugaucugggg ccucggugca 1680caugcuuuac auguguuuag ucgagguuaa aaaaacgucu aggccccccg aaccacgggg 1740acgugguuuu ccuuugaaaa acacgaugau accauggcgc cuaucacugc uuaugcccag 1800cagacacgag gccuauuggg cgccauagug gugagcauga cgggccguga caagacagaa 1860caggccgggg agauccaggu ccucuccaca gucacucaaa ccuuccucgg gacuaccauc 1920ucaggagucu uguggaccgu cuaccacggg gcuggcaaca agacccuagc cggcucgcgg 1980ggcccgguca cacagaugua cuccagcgcc gagggagacu ugguagggug gcccaguccu 2040cccgggacua aauccaugga gccgugcacg ugcggagcgg ucgaccugua ccuggucacg 2100cggaacgcug acgucauccc ggcucggaga cgcggggaca agcggggagc guugcucucc 2160ccgagaccuc ucucaacucu gaaggggucu ucggggggac cggugcucug ccccaggggc 2220cacguugucg ggaucuuccg ggcagccaua ugcucgcggg gcguggccaa guccauagau 2280uucauccccg uugaggcaau ugacaucguc acgcgcuccc ccaccuuuac ugacaacagc 2340acgccaccgg cugugcccca gaccuaucag guuggauacu ugcacgcccc gacuggcagc 2400gggaagagca ccaaaguccc ugucgcauau gccgcccagg gguauaaggu gcuagugcuc 2460aaucccucgg uggccgccac cuugggguuu ggggcguacu uggccaaggc gcacggcauc 2520
aauccuaaca uuaggacugg agucaggacu gugacgaccg gggaggcuau uacguauucc 2580acguauggca aguuucucgc ugaugggggc ugcgcaggcg gcgccuauga caucaucaua 2640ugcgaugagu gccaugccac ggaugcuacc acccuucucg gcaucggaac aguucuugac 2700caagcagagu cagcuggggu caggcuaacu gugcuggcca cggcuacgcc ucccggauca 2760auaacaaccc cucaccccaa cauagaggag guagcucucg gacaggaggg ugagaucccc 2820uucuauggga gagcgauccc ccuggcccac aucaagggag ggaggcaccu gaucuucugc 2880cacucgaaga aaaaguguga cgagcucgcg gcggcccucc gggccauggg cuugaacgcu 2940guggcauacu acagaggguu ggacgucucc auaauaccag cucaaggaga cguggugguu 3000gucgccacug acgcccucau gacaggguac acuggagacu uugacuccgu gauugacugc 3060aacguagcgg uuacucaagu cguggacuuc agcuuggacc ccaccuucac cauauccaca 3120caaaccgucc cccaagacgc cgucucacgc agccagcgcc gggggcgcac gggcagaggg 3180agacugggca uuuacaggua cguuuccacu ggugagcgag cuucgggaau guuugacagc 3240guaacgcucu gcgagugcua cgaugcaggg gcugcauggu augaucucac accagcggaa 3300accaccguca ggcuuagggc guauuucaac acgcccggcc ugcccgugug ccaagaccac 3360cucgaguuuu gggaggcagu uuucaccggc cucacacaca uagaugccca cuaccuuucc 3420caaacaaagc aagcggggga gaauuucgca uaccugacag ccuaucaggc cacagugugu 3480gccagagcca aagccccucc cccgucuugg gacgucaugu ggaagugccu gacucgacuc 3540aaacccacgc ucgugggccc cacaccucuc cuguaccgcc uggguucagu uaccaacgau 3600gucaccuuca cacacccugu gacaaaguac aucgcuacuu gcaugcaagc ugaccucgag 3660gucaugacca gcacgugggu ccuagccggg ggaguccugg cugccaucgc cgcguacugc 3720uuggcgacug gguguguuuc caucaucggc cguuugcacg ucaaccagcg aaccgucguu 3780gcaccugaca aggagguccu cuaugaggcu uuugacgaga uggaggagug ugcuuccaga 3840gcggcccuca uugaggaggc gcaacggaua gccgagaugc ugaagucuaa gauccaaggc 3900uuauugcagc aggcuuccaa gcaggcccag gacauacaac caaccgugca ggcuucaugg 3960cccaaggugg agcaauucug ggccaaacac auguggaacu ucauuagcgg cauccaauau 4020cuugcgggac ugucaacgcu gccagggaac cccgcugugg ccucuaugau ggcauucagu 4080gccgccauca ccaguccgcu gucgacuagc accaccaucc uucucaacau caugggaggc 4140uggcuggcgu cucaaauugc gccacccgca ggggccacag gcuucguggu caguggccug 4200gugggggcug ccauaggcag cguaggcuug gguaaggugc ugguggacau cuuggcaggg 4260uacggugcgg gcauuucggg ggcucucguc gcauucaaga ucaugucugg cgagaagccc 4320uccauggagg augucaucaa ccugcugccc ggaauccugu ccccgggcgc ccugguggug 4380ggggucauuu gcgcggccau ucugcgccgu caugugggac cgggggaagg ugcgguccaa 4440uggaugaaua ggcuuauugc cuuugcuucc agaggaaacc acgucgcccc cacccacuau 4500gugacggagu cagaugcguc gcagcgcgug acccaacuac uuggcucucu caccauaacu 4560agccugcuua gaaggcucca caauuggauu acugaggacu gccccacccc augcaauggc 4620ucauggcucc gcgaugugug ggacugggug ugcaccaucc ugacugacuu uaaaaacugg 4680cugaccucca aguuguuccc aaagcugccc ggccuccccu ucaucucuug ccaaaagggg 4740uauaggggcg acugggccgg cacgggcauc auggucacgc ggugcccuug uggcgccaac 4800auuucuggca auguccgcuu cggcucuaug agaaucacag ggccuaagac cugcaugaac 4860accuggcagg ggacuuuccc uaucaacugc uacacggagg gccaaugcau gccgagaccu 4920gcgccaaacu uuaagaccgc caucuggagg guggcggccu cagaguacgc ggaggugacg 4980cggcacgggu cguacucuua cauaacaggg cugaccgcug acaaucugaa gguucccugc 5040caaauaccau cuccagaguu cuuuuccugg guagacggag uacagaucca cagguuugcu 5100cccacuccaa agccguucuu ucgggaugag gucucguuca gcguggggcu caacucauuu 5160
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<223>人工序列描述JFH2.2復(fù)制子RNA<400>8acccgcccca aaggggcgac acccgccaga acacccccgg aggaacacgc cacgcagaaa 60gcgcagccag gcgagagagg cgacagcccc aggccccccc ccccgggaga gccaagggcg 120cggaaccggg agacaccgga agccgggaag acgggcccgg aaaacccacc agcccggcca 180gggcggcccc cgcaagacgc agccgagagc gggggcgaaa ggccgggacg ccgaaggggc 240gcgaggcccc gggaggccga gaccggcaca gagcacaaac ccaaacccaa agaaaaacca 300acagaaacac caaccgcgcc caagagaaca agaggagcac gcaggcccgg ccgcggggga 360gaggcacggc agacgggcac aacagacaac ggcgccgagc cgccggccgg cgcagcgcag 420gggcgcccgg cgcaagaccg accgccgggc ccgaagaacg caggacgagg cagcgcggca 480cgggcggcca cgacgggcgc cgcgcagcgg ccgacggcac gaagcgggaa gggacggcgc 540agggcgaagg ccggggcagg acccgcacca ccgcccgccg agaaagacca caggcgagca 600agcggcggcg caacgcgacc ggcaccgccc acgaccacca agcgaaacac gcacgagcga 660gcacgaccgg aggaagccgg cgcgacagga gacggacgaa gagcacaggg gccgcgccag 720ccgaacgcgc caggccaagg cgcgcagccc gacggcgagg accgcggacc caggcgagcc 780gcgccgaaac aggggaaaag gccgccggac acgacgggcc ggcggggggc ggaccgcaca 840ggacaagcgg gcacccggaa gcgaagagcg gcggcgaagg gcgaccgccc cggcacggac 900gccgccccga cgcagcgcac gcccacgccc gacgagccga gaaacccccc cccccccccc 960caacgacggc cgaagccgcg gaaaaggccg gggcggcaag accaccaagc cgcggcaagg 1020agggcccgga aaccggcccg ccgacgagca ccaggggccc ccccgccaaa ggaagcaagg 1080cggaagcgga aggaagcagc ccggaagccg aagacaaaca acgcgagcga cccgcaggca 1140gcggaacccc ccaccggcga cagggcccgc ggccaaaagc cacggaaaga acaccgcaaa 1200ggcggcacaa ccccaggcca cgggagggaa ggggaaagag caaaggcccc caagcgacaa 1260caaggggcga aggagcccag aaggacccca gagggacgac ggggcccggg cacagcacag 1320gagcgaggaa aaaaacgcag gccccccgaa ccacggggac gggccgaaaa acacgagaac 1380aggcgccaca cgcagcccag cagacacgag gccagggcgc caaggggagc agacgggccg 1440gacaagacag aacaggccgg ggagaccagg cccccacagc accaaacccc cgggacacca 1500ccaggagcgg gaccgcacca cggggcggca acaagaccca gccggccgcg gggcccggca 1560cacagagacc cagcgccgag ggagacggag ggggcccagc ccccgggaca aaccaggagc 1620cggcacggcg gagcggcgac cgaccggcac gcggaacgcg acgcacccgg ccggagacgc 1680ggggacaagc ggggagcggc cccccgagac ccccgaccga aggggcccag ggggaccggg 1740
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1.由多核苷酸(a)、(b)或(c)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示核苷酸序列的多核苷酸；及(c)在嚴(yán)格條件下與由同所述(a)或(b)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV蛋白的多核苷酸，前提是，如果該核酸為DNA，那么序列表中的核苷酸符號(hào)“u”應(yīng)當(dāng)以“t”取代。
2.由以下多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO1所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同所述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，前提是，如果該核酸為DNA，那么序列表中的核苷酸符號(hào)“u”應(yīng)當(dāng)以“t”取代。
3.由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO3所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同所述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV基因5′非翻譯區(qū)的多核苷酸，前提是，如果該核酸為DNA，那么序列表中的核苷酸符號(hào)“u”應(yīng)當(dāng)以“t”取代。
4.由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO4所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同所述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV基因3′非翻譯區(qū)的多核苷酸，前提是，如果該核酸為DNA，那么序列表中的核苷酸符號(hào)“u”應(yīng)當(dāng)以“t”取代。
5.由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO2所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同所述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，前提是，如果該核酸為DNA，那么序列表中的核苷酸符號(hào)“u”應(yīng)當(dāng)以“t”取代。
6.由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO5所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同所述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV基因5′非翻譯區(qū)的多核苷酸，前提是，如果該核酸為DNA，那么序列表中的核苷酸符號(hào)“u”應(yīng)當(dāng)以“t”取代。
7.由多核苷酸(a)或(b)組成的核酸(a)含有SEQ ID NO6所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同所述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交并編碼HCV基因3′非翻譯區(qū)的多核苷酸，前提是，如果該核酸為DNA，那么序列表中的核苷酸符號(hào)“u”應(yīng)當(dāng)以“t”取代。
8.由根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的核酸組成的基因。
9.由根據(jù)權(quán)利要求8的基因編碼的多肽。
10.含有RNA(a)或(b)的復(fù)制子RNA(a)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示核苷酸序列的RNA；及(b)含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示核苷酸序列的RNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的復(fù)制子RNA，另外含有IRES序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的復(fù)制子RNA，另外含有選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因。
13.由RNA(a)或(b)組成的復(fù)制子RNA(a)含有SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示核苷酸序列的RNA；及(b)在嚴(yán)格條件下與由同所述(a)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的RNA雜交并具有自主復(fù)制能力的RNA。
14.通過將權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)的復(fù)制子RNA導(dǎo)入細(xì)胞而制備復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞的方法。
15.通過將權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)的復(fù)制子RNA導(dǎo)入細(xì)胞而制備的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是人肝衍生細(xì)胞、人子宮頸衍生細(xì)胞或人胚腎衍生細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是Huh7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、IMY-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或293細(xì)胞。
18.篩選刺激或抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的物質(zhì)的方法，其包括在測(cè)試物質(zhì)的存在下培養(yǎng)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞，并在所得培養(yǎng)物中檢測(cè)復(fù)制子RNA的復(fù)制。
19.提高丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA的復(fù)制效率的方法，其包括至少實(shí)施一次如下步驟，在所述步驟中從權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞獲得復(fù)制的復(fù)制子RNA，并將由此得到的復(fù)制的復(fù)制子RNA導(dǎo)入其它細(xì)胞以制備新的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中復(fù)制效率是導(dǎo)入復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞中的復(fù)制子RNA的復(fù)制效率的至少兩倍。
21.產(chǎn)生具有更高復(fù)制效率的丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA的方法，其包括至少實(shí)施一次如下步驟，在所述步驟中從根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞獲得復(fù)制的復(fù)制子RNA，且將由此得到的復(fù)制的復(fù)制子RNA導(dǎo)入不同于復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞的細(xì)胞以制備新的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞，并從最終得到的復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞獲得復(fù)制的復(fù)制子RNA。
22.產(chǎn)生具有更高復(fù)制效率的丙型肝炎病毒復(fù)制子RNA的方法，其包括檢測(cè)由權(quán)利要求21的方法產(chǎn)生的具有更高復(fù)制效率的復(fù)制子RNA與最初導(dǎo)入復(fù)制子-復(fù)制細(xì)胞中的復(fù)制子RNA之間的核苷酸或氨基酸突變，并將檢測(cè)到的核苷酸或氨基酸突變引入旨在提高復(fù)制效率的復(fù)制子RNA中。
全文摘要
從新的暴發(fā)性丙型肝炎病毒株來源的基因、使用該基因獲得的具有高復(fù)制效率的HCV復(fù)制子RNA、以及用該復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的HCV復(fù)制子－復(fù)制細(xì)胞。通過使用如上所述的HCV復(fù)制子RNA和HCV復(fù)制子－復(fù)制細(xì)胞，可以連續(xù)大量產(chǎn)生HCV蛋白。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1882690SQ20048003392
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月19日
發(fā)明者脅田隆字, 加藤孝宣, 伊達(dá)朋子, 宮本道子 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人東京都醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu), 東麗株式會(huì)社