專利名稱：采用液體的微芯片裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微(微小)流體裝置與微化學(xué)分析裝置。具體地說，是涉及在微流道內(nèi)用來使微少量的2種或2種以上液體(以下也叫“試劑溶液”)合流，因此效率高的混合之液體混合裝置及液體混合方法。特別是本發(fā)明是涉及通過在微流道內(nèi)進(jìn)行混合的液體間的化學(xué)反應(yīng)，用來效率高的生產(chǎn)例如目的反應(yīng)生成物的微反應(yīng)器等。
進(jìn)而，本發(fā)明是涉及利用分析對(duì)象物的變性劑的濃度梯度，用來進(jìn)行分析對(duì)象物的分離/分析的化學(xué)分析系統(tǒng)。更詳細(xì)地講，本發(fā)明是涉及利用核酸變性劑的濃度梯度，將雙鏈核酸(以下也簡稱“核酸”)根據(jù)堿基排列的不同進(jìn)行分離用的變性劑濃度梯度凝膠電泳法(DGGE)、用于它的變性劑濃度梯度的形成方法及用來在微流道內(nèi)進(jìn)行這種DGGE的微芯片電泳裝置等。
特別是，本發(fā)明是涉及在微流道內(nèi)有效地將上述緩沖劑彼此間進(jìn)行混合且對(duì)DGGE有效的微芯片電泳裝置等。
背景技術(shù)：
具有微流道構(gòu)造的化學(xué)分析裝置之一例是微芯片電泳裝置。以下便以微芯片電泳裝置為例說明本發(fā)明的技術(shù)背景。
將核酸(nucleic acid)或蛋白質(zhì)等生物高分子(biopolymer)進(jìn)行分離/精制或分析的手段大多采用電泳。電泳是對(duì)已填充著電解質(zhì)溶液的瓊脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺等凝膠、或微流道(毛細(xì)管)施加電位，并在其中使荷電粒子移動(dòng)，借助于移動(dòng)速度的不同而分離出粒子。當(dāng)對(duì)雙鏈核酸進(jìn)行電泳時(shí)，對(duì)移動(dòng)速度造成影響的主要原因是因?yàn)閮H為分子量(分子長度)而已，因此便可利用分子量(長度)的差異而進(jìn)行分離。
利用堿基排列的不同而將雙鏈核酸進(jìn)行分離的方法已知有變性劑濃度梯度凝膠電泳(DGGE)。DGGE乃利用在核酸變異檢測(detecting the variation of the nucleic acid)、或單核酸多型性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)的檢測等方面。此外，近年來，在如活性污泥法或甲烷發(fā)酵之類的有機(jī)性排放水/廢棄物處理程序方面，或者在采用微生物對(duì)污染土壤/地下水進(jìn)行凈化修復(fù)的生物治療(bioremediation)等方面活躍的微生物群落之構(gòu)造解析等方面利用DGGE。此微生物群落的構(gòu)造解析中，經(jīng)常利用全部微生物所共同擁有之排列的16S rRNA基因。也就是，從含有對(duì)象微生物群落的試樣中萃取出核酸并利用DGGE進(jìn)行分離。利用DGGE分析的試樣是利用16S rRNA基因中可將多種微生物共同的排列部分進(jìn)行放大之PCR用引物(primer)所放大的放大產(chǎn)物(amplified product)，DGGE是利用16S rRNA基因的堿基排列的不同，來將源自構(gòu)成微生物群落之主要微生物的核酸，在凝膠上進(jìn)行分離。因?yàn)樵谕荒z上的多條泳道間，可判斷具同一泳動(dòng)距離的核酸擁有同一堿基排列，因而可判斷對(duì)象微生物群落構(gòu)成的不同。例如，在同一凝膠上的其他泳道中，對(duì)特定微生物的16S rRNA基因進(jìn)行同樣的操作而進(jìn)行泳動(dòng)。通過比較此核酸條帶的位置，也可判斷此微生物是否存在于對(duì)象的微生物群中。
DGGE的缺點(diǎn)在于因?yàn)槟z準(zhǔn)備與電泳比較耗時(shí)間，因而無法進(jìn)行高產(chǎn)能(高速大量處理)的解析；因?yàn)槟z尺寸大至約20cm×約20cm×約1mm，因而需要大型恒溫槽，導(dǎo)致整體裝置變?yōu)榇笮?；以及與微芯片電泳(microchip electrophoresis)相比較之下，分解能力較差劣等問題。
再者，當(dāng)制作變性劑濃度梯度凝膠時(shí)，需要手工作業(yè)的繁雜操作，很難將凝膠的變性劑濃度梯度形成一定狀態(tài)。所以，當(dāng)利用DGGE對(duì)微生物群落構(gòu)造進(jìn)行解析時(shí)，各個(gè)凝膠間的數(shù)據(jù)恰當(dāng)比較便較為困難。
另一方面，在1990年代初期，自Manz倡導(dǎo)將化學(xué)分析、生化學(xué)分析所必要的全部要件組裝在一片晶片上的微小化學(xué)分析裝置，所謂微全程分析系統(tǒng)(Micro Total Analysis System，TAS)的概念以后，已有開發(fā)各種形式的微全程分析系統(tǒng)。
在隸屬微全程分析系統(tǒng)領(lǐng)域的微芯片電泳方面，是利用細(xì)微加工技術(shù)，在寬度、深度均形成10至100m程度之微小流道的基板上，采用粘接著另一片基板的微芯片。通常，這個(gè)微芯片被用在DNA或RNA的分子量測量。在DNA或RNA的分子量測量方面，是在對(duì)流道表面進(jìn)行化學(xué)修飾，而在抑制電滲透流(electroosmotic flow)的狀態(tài)下，將直鏈聚丙烯酰胺或羥甲基纖維素等高分子基質(zhì)溶液填充在流道內(nèi)，再進(jìn)行DNA或RNA的分離。相對(duì)于傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳需要30分鐘至l小時(shí)的泳動(dòng)時(shí)間，微芯片電泳裝置則在10分鐘以內(nèi)便完成泳動(dòng)，可縮短分析時(shí)間。具有試樣、試劑消耗量較少等優(yōu)點(diǎn)。
以微芯片電泳裝置的更加微全程分析系統(tǒng)化為目標(biāo)，Ramsey(羅馬斯，音譯)(日本專利特表平10-507516號(hào)公報(bào)；專利文獻(xiàn)1)，便提案對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析或合成的微芯片實(shí)驗(yàn)裝置。比微芯片實(shí)驗(yàn)裝置的特征在于，為從已填充著對(duì)象物質(zhì)的儲(chǔ)存區(qū)(reservoir)，朝其他儲(chǔ)存區(qū)搬送對(duì)象物質(zhì)，而同時(shí)控制多個(gè)儲(chǔ)存區(qū)的電位。但是，此提案僅能將雙鏈核酸利用分子量的不同而進(jìn)行分離，并非將雙鏈核酸根據(jù)堿基排列的不同而進(jìn)行分離。
Nap(納普，音譯)(日本專利特表2001-521622號(hào)公報(bào)；專利文獻(xiàn)2)，便提案微流體工學(xué)裝置的核酸分析方法與核酸之融點(diǎn)分析方法。此提案乃利用化學(xué)變性劑的濃度梯度與低(聚)核苷酸探針，檢測出核酸排列的變異。但是，必須預(yù)先對(duì)標(biāo)的核酸試樣設(shè)計(jì)特有的低(聚)核苷酸探針，因而僅能檢測出堿基排列已知的變異，并無法檢測出堿基排列未知的變異。
Beck(別克，音譯)(日本專利特開平8-261986號(hào)公報(bào)；專利文獻(xiàn)3)，提案在微芯片上，采用電滲透流的液體混合方法與液體混合裝置。但是，此提案僅能提供微芯片上的液體混合方法與裝置而已，并未言及變性劑濃度梯度或雙鏈核酸的分離。
Ligeti(里吉迫，音譯)(日本專利特表平10-502738號(hào)公報(bào)；專利文獻(xiàn)4)，提案在微芯片上，檢測出利用粘性聚合體的雙鏈核酸片斷中的點(diǎn)變異的方法。但是，利用時(shí)間變化的溫度梯度，因而需要另設(shè)用來控制溫度的專用電腦程序。
馬場(日本專利特開2003-66003號(hào)公報(bào)；專利文獻(xiàn)5)；提案水溶性高分子賦予濃度梯度，并當(dāng)作泳動(dòng)液而填充在微流道內(nèi)的微芯片電泳裝置。但是，在微芯片上實(shí)現(xiàn)方面，因?yàn)樗苄愿叻肿泳哂袧舛忍荻?，因而可進(jìn)行核酸的分子量測量，但是對(duì)雙鏈核酸卻無法利用堿基排列的不同進(jìn)行分離。特別是在此泳動(dòng)液的濃度梯度形成方面，將有依序填充濃度不同的緩沖液的繁雜作業(yè)。
如上述說明所示，在傳統(tǒng)DGGE方面，將有實(shí)驗(yàn)操作繁雜、分析時(shí)間較長、無法提升高產(chǎn)能分析、需要大型裝置以及相較于毛細(xì)管電泳之下的分解能力較差劣等缺點(diǎn)。此外，當(dāng)利用DGGE對(duì)微生物群落構(gòu)造進(jìn)行解析時(shí)，將有各個(gè)凝膠間的資料比較較為困難的缺點(diǎn)。況且，截至目前為止所提案的包括微芯片電泳裝置在內(nèi)的微全程分析系統(tǒng)，需要核酸分子量測量、或另設(shè)溫度控制用等的專用電腦程序，或設(shè)計(jì)檢測特定堿基排列的低(聚)核苷酸探針，且對(duì)未知雙鏈核酸片斷并無法利用堿基排列的不同進(jìn)行分離。
日本專利特表平10-507516號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)2]日本專利特表2001-521622號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)3]日本專利特開平8-261986號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)4]日本專利特表平10-502738號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)5]日本專利特開2003-66003號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)6]日本專利特開2001-120971號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容液體較難混合的問題，不僅微芯片電泳的情況，在微流道內(nèi)將多個(gè)液體進(jìn)行混合的情況時(shí)也是一般的問題。如前所述，若縮小流道的寬度、深度，相關(guān)流道內(nèi)流動(dòng)的雷諾數(shù)(Reyn01d number)將變得非常小。若雷諾數(shù)達(dá)100以下，流道內(nèi)的流動(dòng)較容易變?yōu)榉€(wěn)定的層流，所合流的液體間較不易發(fā)生亂流擴(kuò)散情況。所以，實(shí)質(zhì)上利用接觸面的分子擴(kuò)散僅使液體混合，這將阻礙迅速的混合。特別是當(dāng)流道內(nèi)的流速較遲緩時(shí)，此傾向?qū)②呌诿黠@。上述問題在全體的分析用微芯片或微反應(yīng)器等微芯片裝置中，將形成阻礙實(shí)驗(yàn)操作簡單化、分析與反應(yīng)時(shí)間縮短化、高產(chǎn)能化、微芯片小型化及高精度化(例如高分解能力化)的主要原因。
上述問題的解決策略有將流道加長的方法。例如在將2條液體導(dǎo)入用微流道連接于1條混合用微流道，單純的將2液進(jìn)行混合的構(gòu)造(圖1或圖29)中，考慮加長混合用微流道以進(jìn)行充分的混合(圖2或圖29)。但是，此時(shí)，因?yàn)榛旌嫌梦⒘鞯勒紦?jù)較大面積，因而裝置小型化變得困難，而且因?yàn)橐后w通過流道頗耗時(shí)間，因而將有分析時(shí)間或反應(yīng)時(shí)間變長的缺點(diǎn)。
以另一解決策略來說，阿部等人提案將來自儲(chǔ)存區(qū)的流道進(jìn)行分支，通過將經(jīng)分支的流道交互連結(jié)，使液體較容易混合的液混合裝置(日本專利特開2001-120971；專利文獻(xiàn)6)。但是，這種方法是因?yàn)閷⑶胺搅鲃?dòng)的液體與后方流動(dòng)的液體進(jìn)行混合，因而便無法進(jìn)行定量的濃度控制成在流動(dòng)方向形成濃度梯度的狀態(tài)。
(1)本發(fā)明的目的在于提供一種可依微計(jì)量將微少量液體進(jìn)行迅速混合，且可定量的濃度控制的液體混合裝置及液體混合方法。
(2)本發(fā)明的再另一目的在于提供一種為將依微計(jì)量進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作簡單化、分析與反應(yīng)時(shí)間縮短化，以及可高產(chǎn)能化，尚且能達(dá)晶片小型化、高精度化(例如高分解能化)，因而采用本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的一連串液體混合技術(shù)的分析用微芯片(例如微芯片電泳裝置)及微反應(yīng)器。
如前所述，在傳統(tǒng)的DGGE方面，將有實(shí)驗(yàn)操作繁雜、分析時(shí)間較久、無法達(dá)高產(chǎn)能的分析、需要大型裝置以及相較于以微計(jì)量的分析而有分解能力較差劣等問題。
(3)本發(fā)明的再另一目的在于提供一種在微芯片上進(jìn)行DGGE的微芯片電泳裝置及電泳法。
在微芯片上進(jìn)行DGGE方面，需要將含有不同濃度變性劑的多個(gè)緩沖液依微計(jì)量進(jìn)行混合。例如需要一邊將含變性劑的緩沖液與不含變性劑的緩沖液，使它們的混合比進(jìn)行連續(xù)變化，一邊導(dǎo)入1條微流道內(nèi)，俾利用此混合比的變化形成變性劑濃度梯度。在提供有效的DGGE用微芯片方面，形成正確且重現(xiàn)性高的變性劑濃度梯度乃屬重要的一環(huán)。
但是，如上述，在微流道內(nèi)將有液體彼此間較難混合的問題。因?yàn)樵谖⒘鞯纼?nèi)合流的濃度互異的2個(gè)緩沖液也不易混合而有形成層狀流動(dòng)的傾向，因而為能在流道的寬度方向獲得均勻的濃度梯度將頗耗時(shí)間，結(jié)果將阻礙分析時(shí)間的縮短化。如圖2所示，若使用長流道而花費(fèi)時(shí)間進(jìn)行混合，將較難迅速的獲得既定的濃度梯度。此外，在圖3所示的混合方法(日本專利特開2001-120971號(hào)中所記載)中，因?yàn)樵诙鄠€(gè)處所將前方所流動(dòng)的液體與后方所流動(dòng)的液體進(jìn)行混合，因而頗難形成DGGE所需要的正確的濃度梯度。如上述，在傳統(tǒng)的混合方法中，不僅無法滿足正確的形成微計(jì)量所要求的濃度梯度，且頗難精密且自由的控制濃度梯度的形成。
(4)本發(fā)明的再另一目的在于提供一種可將含有不同濃度的變性劑的多個(gè)緩沖液，在微流道內(nèi)迅速的，尤其可在流道的寬度方向均勻的混合，并能形成對(duì)DGGE有用的變性劑濃度梯度的微芯片電泳裝置及電泳法。
(5)本發(fā)明的再另一目的在于提供一種借助于將本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)液體混合的一連串技術(shù)，使用于微計(jì)量緩沖液彼此間的混合，而提供對(duì)DGGE特別有用的微芯片電泳裝置及電泳法。
達(dá)成上述目的(1)與(2)的本發(fā)明，是一種液體混合裝置，其是含有用來導(dǎo)入液體的至少2條液體導(dǎo)入用微流道、以及連接至少2條液體導(dǎo)入用微流道的混合用微流道而成，且從各液體導(dǎo)入用微流道所導(dǎo)入的各液體，在混合用微流道內(nèi)進(jìn)行合流，并涉及具有用來促進(jìn)在上述混合用微流道內(nèi)所合流的液體間的混合的混合促進(jìn)部件的液體混合裝置。
本發(fā)明較好實(shí)施形態(tài)包括有混合促進(jìn)部件是增加液體間的界面之面積的部件的第1實(shí)施形態(tài)(實(shí)施形態(tài)1-1、實(shí)施形態(tài)1-2、實(shí)施形態(tài)1-3及實(shí)施形態(tài)1-4)，以及混合促進(jìn)部件是將液體間的界面不穩(wěn)定化的部件的第2實(shí)施形態(tài)(實(shí)施形態(tài)2-1、實(shí)施形態(tài)2-2及實(shí)施形態(tài)2-3)。
實(shí)施形態(tài)1-1本發(fā)明的實(shí)施形態(tài)1-1是混合促進(jìn)部件具有將各液體流量(流速)控制成使在混合用微流道內(nèi)合流的液體間的接觸面增加的機(jī)構(gòu)。
實(shí)施形態(tài)1-1裝置的混合促進(jìn)部件是可將導(dǎo)入液體導(dǎo)入用微流道中的液體流量，獨(dú)立于其他液體導(dǎo)入用微流道而進(jìn)行控制的1個(gè)以上的液體導(dǎo)入手段。
實(shí)施形態(tài)1-1的一例中，混合促進(jìn)部件最好是上述液體導(dǎo)入手段可控制流量的泵、液體導(dǎo)入用微流道中所設(shè)置的閥以及這些閥的組合。
實(shí)施形態(tài)1-1的另一例中，上述液體導(dǎo)入手段是由液體導(dǎo)入用微流道的各導(dǎo)入部中所設(shè)置的第1電極；以及上述混合用微流道的排出部中設(shè)置的第2電極所構(gòu)成，且通過對(duì)第1與第2電極間施加電壓，而在各液體導(dǎo)入用微流道中產(chǎn)生電滲透流。
實(shí)施形態(tài)1-1中所使用液體混合方法的一例，是在通過2個(gè)以上的液體導(dǎo)入用微流道，導(dǎo)入2個(gè)以上的液體，并將各液體導(dǎo)入用微流道在共通地點(diǎn)進(jìn)行合流的混合用微流道中，導(dǎo)入液體并進(jìn)行混合的步驟，并包含利用將從液體導(dǎo)入用微流道所導(dǎo)入的液體流量，形成流量不同于來自其他液體導(dǎo)入用微流道的流量，而增加在混合用微流道內(nèi)合流的液體間所形成的接觸面的步驟。
實(shí)施形態(tài)1-1所使用的液體混合方法的另一例，是包含利用泵控制導(dǎo)入液體導(dǎo)入用微流道中的各液體之流量；利用液體導(dǎo)入用微流道中所設(shè)置的閥控制各液體的流量；以及利用這些閥的組合，而控制各液體的流量。
實(shí)施形態(tài)1-1所使用的液體混合方法的另一例，是通過對(duì)液體導(dǎo)入用微流道的各導(dǎo)入部所設(shè)置的第1電極、與混合用微流道的排出部所設(shè)置的第2電極之間施加電壓所產(chǎn)生的電滲透流，而將液體導(dǎo)入混合用微流道內(nèi)的步驟，并包含借助于根據(jù)每條液體導(dǎo)入用微流道改變所賦予的電位，而獨(dú)立控制從各液體導(dǎo)入用微流道中所導(dǎo)入的流量的步驟。
實(shí)施形態(tài)1-2本發(fā)明的實(shí)施形態(tài)1-2是混合促進(jìn)部件具有在多個(gè)液體導(dǎo)入用微流道的至少其中一個(gè)設(shè)置的高速動(dòng)作閥。
實(shí)施形態(tài)1-2之一例中，高速動(dòng)作閥是采用壓電元件的閥體驅(qū)動(dòng)手段。實(shí)施形態(tài)1-2的另一例是利用流道的局部加熱所產(chǎn)生的液體的體積膨脹，而可以高速控制對(duì)混合用微流道噴出微小流量的液體的手段。實(shí)施形態(tài)1-2的另一例中，高速動(dòng)作閥是驅(qū)動(dòng)在液體導(dǎo)入用微流道內(nèi)可開閉細(xì)微空隙的閥體的手段。
實(shí)施形態(tài)1-2所使用的液體混合方法的一例中，是從混合用微流道所連接的2個(gè)以上的液體導(dǎo)入用微流道分別導(dǎo)入液體，并在混合用微流道內(nèi)使2個(gè)以上的液體合流的步驟，并包含借助于以高速開閉驅(qū)動(dòng)在多個(gè)液體導(dǎo)入用微流道中的至少1個(gè)所設(shè)置的高速動(dòng)作閥，而對(duì)所導(dǎo)入的液體的流量賦予變動(dòng)的步驟。
實(shí)施形態(tài)1-2所使用的液體混合方法的另一例中，是包含對(duì)借助于以高速的開閉驅(qū)動(dòng)高速動(dòng)作閥而所導(dǎo)入液體的流量，依短時(shí)間間隔賦予變動(dòng)，使占據(jù)混合用微流道內(nèi)的液體比率(體積比)，在流道寬度方向進(jìn)行連續(xù)式或間歇式變化，而增加液體間的接觸面的步驟。
實(shí)施形態(tài)1-2所使用的液體混合方法的另一例是包含將高速動(dòng)作閥的開閉周期設(shè)為一定，且開閉周期的1周期中，可改變閥開啟的時(shí)間比率(Duty比)的步驟。此液體混合方法是包含在多個(gè)液體導(dǎo)入用微流道中的至少2個(gè)以上分別設(shè)置高速動(dòng)作閥，并同步開閉控制多個(gè)高速動(dòng)作閥的步驟。此液體混合方法的另一例中，是包含使多個(gè)高速動(dòng)作閥同步開閉控制，以使混合用微流道中所流動(dòng)的液體總流量成為一定狀態(tài)的步驟。
實(shí)施形態(tài)1-1與1-2的液體混合裝置可適用于微芯片，最好可適用于更具有能將分析對(duì)象物導(dǎo)入混合用微流道的試樣導(dǎo)入部的微芯片電泳裝置。
本發(fā)明的另一面中，微芯片電泳裝置所使用的流量控制機(jī)構(gòu)不僅促進(jìn)混合，而且對(duì)形成將分析對(duì)象物分離用的變性劑濃度梯度具有作用。通過使用上述控制機(jī)構(gòu)(例如可使用實(shí)施形態(tài)1-1、1-2及它們的組合)，控制所導(dǎo)入的多個(gè)液體(例如含有不同濃度變性劑的液體)的流量，便可在流動(dòng)方向形成混合用微流道內(nèi)合流的特定液體、或合流的液體內(nèi)的試劑的濃度分布(例如變性劑濃度分布)。
實(shí)施形態(tài)1-3本發(fā)明的實(shí)施形態(tài)1-3是混合促進(jìn)部件是在混合用微流道的至少一部分具有通過使其流道高度小于其流道寬度所形成的混合室。
實(shí)施形態(tài)1-3的一例乃導(dǎo)入混合對(duì)象的液體的多條微流道，朝上下方向積層并合流且連接于混合室。
實(shí)施形態(tài)1-3的另一例中，在混合室的上游，具有使多條導(dǎo)入用微流道合流的預(yù)混合用(pre-mixing)微流道。
實(shí)施形態(tài)1-3所使用的液體混合方法之一例中，是透過多條微流道導(dǎo)入混合對(duì)象液體，并使所導(dǎo)入的液體合流且導(dǎo)入混合室的步驟，并包含將這些合流液體導(dǎo)入流道高度小于其流道寬度的混合室的步驟。
實(shí)施形態(tài)1-3所使用的液體混合方法的另一例中，是包含將導(dǎo)入微流道的液體，依上下方向積層的方式進(jìn)行合流的步驟。
實(shí)施形態(tài)1-3所使用的液體混合方法的另一例中，是包含將導(dǎo)入微流道的液體合流后，導(dǎo)入1條預(yù)混合用微流道之后，再導(dǎo)入混合室的步驟。
實(shí)施形態(tài)1-4本發(fā)明的實(shí)施形態(tài)1-4乃混合促進(jìn)部件，是從各液體導(dǎo)入用微流道所分支的多條分支流道集合并連接的合流部，且具有多條分支流道彼此間以在3維空間上配置成相互不同的形態(tài)，連接于混合用微流道的合流部。
實(shí)施形態(tài)1-4之一例是將多張基板貼合通過的層構(gòu)造，且具有多張基板在分支流道的大致合流方向、或大致分支方向上重疊的層構(gòu)造。最好合流部的流道是曲線形狀。
實(shí)施形態(tài)1-4的裝置的制法一例，是包含使用微影(photolithography)技術(shù)制作合流部的流道的步驟。此制法的另一例是可將合流部的流道截面形狀加工成曲線形狀。
實(shí)施形態(tài)1-4的另一例是一種液體混合裝置，其是具有用來導(dǎo)入液體的多個(gè)液體導(dǎo)入口的一組液體導(dǎo)入用微流道，及連接這些流道的混合用微流道，并涉及上述多個(gè)液體導(dǎo)入口是以幾何配置而設(shè)的液體混合裝置。此幾何配置的例子是直線狀、圓弧狀、或橢圓狀。
具有多個(gè)液體導(dǎo)入口的實(shí)施形態(tài)1-4之一例中，是各液體導(dǎo)入用微流道的流道寬度，較混合用微流道狹窄的液體導(dǎo)入用微流道聚集形成混合用微流道。此實(shí)施形態(tài)的另一例是利用電滲透流驅(qū)動(dòng)至少一部分液體的裝置，且為將分支狀驅(qū)動(dòng)電極以裝卸自如的方式設(shè)置成對(duì)應(yīng)于多個(gè)液體導(dǎo)入口的幾何配置的裝置。此實(shí)施形態(tài)的再另一例中，是利用泵壓力驅(qū)動(dòng)至少一部分液體的裝置，且為將分支狀液壓導(dǎo)入管以裝卸自如的方式設(shè)置成對(duì)應(yīng)于多個(gè)液體導(dǎo)入口的幾何配置的裝置。
具有多個(gè)液體導(dǎo)入口的實(shí)施形態(tài)1-4的另一例中，是設(shè)有在相對(duì)于多個(gè)液體導(dǎo)入口大致與其同一平面上配置的驅(qū)動(dòng)電極。此實(shí)施形態(tài)的再另一例中，是在液體導(dǎo)入用微流道組分別具有獨(dú)立控制泵壓力及/或電滲透流的控制手段。此實(shí)施形態(tài)的再另一例中此控制手段是導(dǎo)入有同一液體的液體導(dǎo)入用微流道組中，通過控制執(zhí)行送液的流道數(shù)量，而可改變同一液體對(duì)混合用微流道的總流入量。此實(shí)施形態(tài)的再另一例中，上述控制手段是設(shè)為可控制導(dǎo)入有同一液體的各液體導(dǎo)入用微流道的控制閥。具有上述控制手段的實(shí)施形態(tài)1-4的再另一例中，是設(shè)有相對(duì)于導(dǎo)入有同一液體的液體導(dǎo)入用微流道組，在其上游較流道組的流道數(shù)量更少數(shù)量的壓力泵或電滲透流驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)。
在液體導(dǎo)入口設(shè)置驅(qū)動(dòng)電極的實(shí)施形態(tài)1-4的一例中，上述控制手段是可獨(dú)立開/關(guān)(ON/OFF)控制各液體導(dǎo)入用微流道的電極與電源之間。此實(shí)施形態(tài)的另一例中，其電滲透流驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)是包含將上述電源與電機(jī)及之間進(jìn)行開/關(guān)的開關(guān)或繼電器。
實(shí)施形態(tài)2-1本發(fā)明的實(shí)施形態(tài)2-1乃混合促進(jìn)部件，是用來對(duì)液體導(dǎo)入用微流道及/或混合用微流道內(nèi)的液體進(jìn)行加熱的加熱器。
實(shí)施形態(tài)2-1的一例中，混合促進(jìn)部件是用來從下側(cè)對(duì)混合用微流道內(nèi)的液體進(jìn)行加熱的加熱器。
實(shí)施形態(tài)2-1的再另一例中，乃包含用來對(duì)多個(gè)液體導(dǎo)入用微流道的至少1個(gè)進(jìn)行加熱的至少一個(gè)加熱器，而多個(gè)液體導(dǎo)入用微流道是根據(jù)利用加熱器進(jìn)行的加熱，以溫度依序升高的順序，在垂直方向從下方起進(jìn)行積層的方式連接于混合用微流道。
實(shí)施形態(tài)2-1所使用的液體混合方法的一例中，乃透過多個(gè)液體導(dǎo)入用微流道導(dǎo)入多個(gè)混合對(duì)象液體，并使多個(gè)液體合流再導(dǎo)入混合用微流道的步驟，并包含利用加熱器，對(duì)液體導(dǎo)入用微流道及/或混合用微流道內(nèi)的液體進(jìn)行加熱的步驟。此液體混合方法的另一例中，乃包含使多個(gè)液體在上下方向積層并合流，再導(dǎo)入混合用微流道的步驟。此液體混合方法的再另一例中，乃包含利用加熱器，對(duì)混合用微流道內(nèi)的液體進(jìn)行加熱的步驟。此液體混合方法的再另一例中，乃包含利用加熱器，從下側(cè)對(duì)混合用微流道內(nèi)的液體進(jìn)行加熱的步驟。
實(shí)施形態(tài)2-1所使用的液體混合方法的再另一例中，乃包含利用加熱器對(duì)多個(gè)液體導(dǎo)入用微流道的至少1條流道內(nèi)的液體進(jìn)行加熱，并將多個(gè)液體導(dǎo)入用微流道內(nèi)的液體，以依溫度高低順序，從下朝上依序積層并合流的方式，導(dǎo)入混合用微流道的步驟。
實(shí)施形態(tài)2-2本發(fā)明的實(shí)施形態(tài)2-2乃混合促進(jìn)部件具有用來將利用在混合用微流道合流的液體間所形成接觸面攪亂的機(jī)械式變動(dòng)部件。
實(shí)施形態(tài)2-2的一例中，機(jī)械式變動(dòng)部件是在混合用微流道內(nèi)的合流部附近所設(shè)置的可動(dòng)升力面(lifting surface)、轉(zhuǎn)動(dòng)體或擺動(dòng)體(swinger)。
實(shí)施形態(tài)2-2的另一例中，機(jī)械式變動(dòng)部件被設(shè)置在混合用微流道之壁面上的振動(dòng)子。實(shí)施形態(tài)2-2的再另一例中，機(jī)械式變動(dòng)部件被設(shè)置在混合用微流道之壁面外的振動(dòng)子。其中，所謂“可動(dòng)升力面”是指利用動(dòng)作而在上下面產(chǎn)生壓力差，并朝后形成方形成漩渦度的面，最好為剖面呈翼型形狀的襟翼(flap)，也可為單純的平板面。
實(shí)施形態(tài)2-2的另一例中，乃轉(zhuǎn)動(dòng)體或擺動(dòng)體是利用磁力驅(qū)動(dòng)。
實(shí)施形態(tài)2-2所使用的液體混合方法的一例，是通過2個(gè)以上的液體導(dǎo)入用微流道，將2種以上的液體導(dǎo)入上述液體導(dǎo)入用微流道在共通地點(diǎn)合流的混合用微流道內(nèi)并混合的步驟，并包含在液體導(dǎo)入用微流道的合流部附近(混合用微流道的上游部)，將合流的液體間的接觸面利用機(jī)械式變動(dòng)部件進(jìn)行攪亂的步驟。此液體混合方法的再另一例中，機(jī)械式變動(dòng)部件是在混合用微流道外壁所設(shè)置的振動(dòng)子、或在混合用微流道內(nèi)所設(shè)置的可動(dòng)升力面、轉(zhuǎn)動(dòng)體或擺動(dòng)體。
實(shí)施形態(tài)2-2所使用的液體混合方法的另一例，乃包含將合流的液體以在混合用微流道內(nèi)保持各液間的接觸面的方式導(dǎo)入的步驟，以及在液體導(dǎo)入完成后，在流動(dòng)靜止之后，便利用振動(dòng)子對(duì)各液間的接觸面進(jìn)行不穩(wěn)定化的步驟。此液體混合方法之一例中，乃包含利用在混合用微流道之壁面上所設(shè)置的振動(dòng)子，將各液間的接觸面進(jìn)行不穩(wěn)定化的步驟。此液體混合方法的另一例中，乃包含利用混合用微流道之壁面外所設(shè)置的振動(dòng)子，將振動(dòng)傳遞給混合用微流道內(nèi)的液體，而將各液間的接觸面進(jìn)行不穩(wěn)定化的步驟。
實(shí)施形態(tài)2-3本發(fā)明的實(shí)施形態(tài)2-3乃混合促進(jìn)部件具有在混合用微流道內(nèi)排列有許多微小構(gòu)造物。實(shí)施形態(tài)2-3的一例中，微小構(gòu)造物是充分小于混合用微流道的流道寬度的突起或溝。
具有混合促進(jìn)部件的實(shí)施形態(tài)的組合在本發(fā)明的液體混合裝置及方法中，可單獨(dú)使用實(shí)施形態(tài)1-1至2-3所示的混合促進(jìn)部件，也可將這些手段進(jìn)行任意組合使用。
較好組合之一例是利用流量控制用來增加液體間的接觸面的第1實(shí)施形態(tài)，與利用流量控制用來破壞已增加的液體間的接觸面的第2實(shí)施形態(tài)的組合。特別好的組合是包含實(shí)施形態(tài)1-1的流量獨(dú)立控制、與實(shí)施形態(tài)2-1的加熱器的組合。借助于實(shí)施形態(tài)1-1進(jìn)行的流量控制，增加由混合用微流道所形成液體間的接觸面的同時(shí)，所增加的接觸面因?qū)嵤┬螒B(tài)2-1的由加熱器所產(chǎn)生的熱對(duì)流形成不穩(wěn)定化時(shí)，便可有效的促進(jìn)混合。
同樣的，利用可增加液體間的面積的第1實(shí)施形態(tài)(實(shí)施形態(tài)1-1至1-4)的至少1個(gè)，與可將液體間的接觸面不穩(wěn)定化的第2實(shí)施形態(tài)(實(shí)施形態(tài)2-1至2-3)的至少1個(gè)的組合，便可有效的促進(jìn)混合。
實(shí)施形態(tài)2-1的加熱器是可輕易的與其他混合促進(jìn)部件進(jìn)行組合。例如，若在實(shí)施形態(tài)1-3的混合室下側(cè)或?qū)嵤┬螒B(tài)1-4的分支流道合流部下側(cè)，使用加熱器的話，由于可增加所加熱的液體接觸面故屬較好狀況。實(shí)施形態(tài)2-3的微小細(xì)構(gòu)造體也可使用熱導(dǎo)率較高的材料，并利用加熱器對(duì)其進(jìn)行加熱。
即使是相同型態(tài)的混合促進(jìn)部件，只要這些手段可適用于相同的微芯片上，即可一起適用于1個(gè)微芯片上。例如，也可同時(shí)使用利用實(shí)施形態(tài)1-1或1-2的流量控制增加合流液體的接觸面，以及根據(jù)實(shí)施形態(tài)1-3或?qū)嵤┬螒B(tài)1-4的流道形狀增加合流液體的接觸面。同樣的，只要可在同一流道上適用串聯(lián)的話，便可在1條流道上設(shè)置多個(gè)混合促進(jìn)部件。另外，當(dāng)使用溫度敏感性(temperature-sensitive)試劑或反應(yīng)體時(shí)，除加熱器以外的手段，例如也可使用實(shí)施形態(tài)2-2的利用振動(dòng)子的方法。
液體混合裝置及方法對(duì)微芯片電泳裝置的應(yīng)用上述實(shí)施形態(tài)1-1至2-3的液體混合裝置及方法，可應(yīng)用在微芯片電泳裝置。
使用液體混合裝置及方法的微芯片電泳裝置的一個(gè)例子中，具備有用來分別導(dǎo)入含有不同濃度變性劑的至少1條緩沖液的液體導(dǎo)入微流道；用來利用從各液體導(dǎo)入的微流道所導(dǎo)入緩沖液的混合而形成濃度梯度區(qū)域的混合用微流道；用來將含有分析對(duì)象物的試樣導(dǎo)入混合用微流道的試樣導(dǎo)入部；以及用來在混合用微流道內(nèi)進(jìn)行液體合流的實(shí)施形態(tài)1-1至2-3所示的至少1個(gè)的混合促進(jìn)部件。此實(shí)施形態(tài)中，利用單獨(dú)或任何較好組合使用實(shí)施形態(tài)1-1至2-3的液體混合裝置及方法，便可促進(jìn)含不同濃度變性劑的緩沖液彼此間的混合。
上述各實(shí)施形態(tài)的液體混合手段或流量控制手段，是可使用在下述實(shí)施形態(tài)A或?qū)嵤┬螒B(tài)B。依照本說明書中的揭示，它們組合可適用在任何實(shí)施形態(tài)。本說明書是講解它們首選的組合及首選組合的實(shí)施實(shí)施形態(tài)。
達(dá)成上述目的(3)、(4)及(5)的本發(fā)明，是涉及利用分析對(duì)象物的變性劑濃度梯度的分析對(duì)象物的分離裝置及方法。本發(fā)明的較好實(shí)施形態(tài)乃包含用來形成分析對(duì)象物的變性劑的濃度梯度區(qū)域的微流道而成，乃涉及經(jīng)導(dǎo)入濃度梯度區(qū)域的分析對(duì)象物進(jìn)行電泳的裝置。本發(fā)明的分離裝置及方法中，如下述，有變性劑濃度梯度形態(tài)不同的“實(shí)施形態(tài)A”及“實(shí)施形態(tài)B”。在這些實(shí)施形態(tài)中，典型的分析對(duì)象物乃為雙鏈核酸。雙鏈核酸則有雙鏈DNA與雙鏈RNA等。
實(shí)施形態(tài)A實(shí)施形態(tài)A是利用將含有不同濃度變性劑的緩沖液進(jìn)行混合，而形成變性劑濃度連續(xù)變化的變性劑濃度梯度。
實(shí)施形態(tài)A的一例是包含用來導(dǎo)入含不同濃度變性劑的緩沖液的至少2條液體導(dǎo)入用微流道，以及上述至少2條液體導(dǎo)入用微流道所連接的混合用微流道而成的微芯片電泳裝置，且為借助于從各液體導(dǎo)入用微流道以變動(dòng)比率所導(dǎo)入的各緩沖液，在混合用微流道內(nèi)進(jìn)行合流變性劑的濃度梯度區(qū)域的裝置。
在實(shí)施形態(tài)A的另一例中，“含有不同濃度變性劑的2個(gè)緩沖液”，是含變性劑的緩沖液與不含變性劑的緩沖液(以下也簡稱“緩沖液”)。
在實(shí)施形態(tài)A的微芯片電泳裝置一例中，最好具有用來促進(jìn)在混合用微流道內(nèi)合流的緩沖液間的混合的至少1個(gè)混合促進(jìn)部件。在實(shí)施形態(tài)A所使用的混合促進(jìn)部件中是包括有上述實(shí)施形態(tài)1-1至2-3的液體混合裝置及它們的組合。實(shí)施形態(tài)A所使用的混合促進(jìn)部件的一例，是并不需要另外設(shè)置特殊的裝置，就成本面很具優(yōu)勢的流量獨(dú)立控制，例如實(shí)施形態(tài)1-1的電滲透流的控制、或利用實(shí)施形態(tài)1-1的泵所進(jìn)行的獨(dú)立控制手段。
實(shí)施形態(tài)A的裝置的另一例，是具有泳動(dòng)用緩沖液中形成核酸變性劑濃度梯度的濃度梯度區(qū)域流道(混合用微流道)；設(shè)置在濃度梯度區(qū)域流道上游側(cè)，且具有用來將緩沖液供應(yīng)給濃度梯度區(qū)域流道的多個(gè)儲(chǔ)存區(qū)與流道(液體導(dǎo)入用微流道)的濃度梯度形成部；以及設(shè)置在濃度梯度區(qū)域流道下游側(cè)，且用來將含有雙鏈核酸的核酸試樣，導(dǎo)入濃度梯度區(qū)域流道的試樣導(dǎo)入部。此實(shí)施形態(tài)乃在各儲(chǔ)存區(qū)內(nèi)填充著含不同濃度核酸變性劑的緩沖液。例如，通過分別對(duì)儲(chǔ)存區(qū)內(nèi)的緩沖液賦予電位，便可控制它們所產(chǎn)生的各電滲透流，且借助于電滲透流的控制，便可將來自任意儲(chǔ)存區(qū)的緩沖液，依適當(dāng)流量供應(yīng)給濃度梯度區(qū)域流道內(nèi)。緩沖液的供應(yīng)并不僅限于利用電滲透流所進(jìn)行的驅(qū)動(dòng)。通過在上述儲(chǔ)存區(qū)與流道中，設(shè)置如實(shí)施形態(tài)1-1與1-2中所說明的泵及/或閥，便可從各儲(chǔ)存區(qū)控制緩沖液的供應(yīng)。
使用上述液體驅(qū)動(dòng)用的控制手段，便可從濃度梯度形成部的儲(chǔ)存區(qū)與流道，將含有不同濃度核酸變性劑的緩沖液，依變動(dòng)比率在濃度梯度區(qū)域流道內(nèi)進(jìn)行合流。借助于使導(dǎo)入濃度梯度區(qū)域流道內(nèi)的不同濃度緩沖液的流入比率連續(xù)的變化，便可在濃度梯度區(qū)域流道內(nèi)形成核酸變性劑濃度梯度?？蓪⒑怂嵩嚇訉?dǎo)入此濃度梯度區(qū)域中并進(jìn)行電泳。
在實(shí)施形態(tài)A的裝置的一例中，具有濃度梯度區(qū)域流道(9)，并在其上游側(cè)設(shè)置濃度梯度形成部(2)，且在其下游側(cè)設(shè)置具有試樣導(dǎo)入部(3)的電泳部(4)。此外，此實(shí)施形態(tài)中，濃度梯度形成部(2)是包含填充著含變性劑的緩沖液的第1儲(chǔ)存區(qū)(5)、與通過其中的第1流道(7)；以及填充著不含核酸變性劑的緩沖液的第2儲(chǔ)存區(qū)(6)、與通過其中的第2流道(8)。此實(shí)施形態(tài)乃通過第1流道(7)與第2流道(8)的合流，而形成濃度梯度區(qū)域流道(9)。另外，此實(shí)施形態(tài)乃更包含連接于第1儲(chǔ)存區(qū)(5)的第1電極(10)、與其連接的第1電源(11)；以及第2儲(chǔ)存區(qū)(6)所連接的第2電極(12)、與其連接的第2電源(13)。
上述實(shí)施形態(tài)中，借助于控制第1與第2電源(11、13)的各電位，而控制含變性劑的緩沖液與不含變性劑的緩沖液中各自產(chǎn)生的電滲透流，可將2種液體依變動(dòng)比率進(jìn)行混合。通過這些緩沖液利用變動(dòng)比率進(jìn)行混合，便可在濃度梯度區(qū)域流道(9)內(nèi)一邊形成變性劑的濃度梯度區(qū)域，一邊導(dǎo)入電泳部(4)(各元件符號(hào)請(qǐng)參照第59圖至圖64)。
在實(shí)施形態(tài)A的裝置的另一例中，乃在濃度梯度形成部中更包含可驅(qū)動(dòng)第1儲(chǔ)存區(qū)或第1流道內(nèi)的液體的第1泵(14)，以及可驅(qū)動(dòng)第2儲(chǔ)存區(qū)或第2流道內(nèi)的液體的第2泵(15)(各元件符號(hào)請(qǐng)參照第59圖至圖64)。此實(shí)施形態(tài)中，借助于控制第1電源與第2電源所賦予的電位，以及控制第1泵與第2泵的各輸出，便可控制含變性劑的緩沖液與緩沖液的各流量。
實(shí)施形態(tài)A的裝置的另一例中，乃在電泳部所設(shè)置的試樣導(dǎo)入部包含填充著核酸試樣的第3儲(chǔ)存區(qū)、與通過其中的第4流道，以及核酸試樣廢液用第4儲(chǔ)存區(qū)、與通過其中的第5流道。此實(shí)施形態(tài)乃第4流道與第5流道是與濃度梯度區(qū)域流道交叉并連通，更包含連接于第3儲(chǔ)存區(qū)的第3電極、與其連接的第3電源，以及連接于第4儲(chǔ)存區(qū)的第4電源、與其連接的第4電源。此實(shí)施形態(tài)中，借助于控制第3與第4電源的各電位，以及產(chǎn)生電滲透流及/或電泳，便可將核酸試樣導(dǎo)入濃度梯度區(qū)域流道。核酸試樣的供應(yīng)并不僅限于利用電滲透流進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。借助于在上述儲(chǔ)存區(qū)與流道，設(shè)置如實(shí)施形態(tài)1-1與1-2中所說明的泵及/或閥，便可控制來自儲(chǔ)存區(qū)的核酸試樣的供應(yīng)。
實(shí)施形態(tài)A的裝置的另一例中，乃電泳部(4)是包含在濃度梯度區(qū)域流道上的下游側(cè)(較試樣導(dǎo)入部更靠下游側(cè))所設(shè)置的廢液用第5儲(chǔ)存區(qū)(24)，以及第5儲(chǔ)存區(qū)(24)所連接的第5電極(25)、與其連接的第5電源(26)(各元件符號(hào)請(qǐng)參照第59圖至圖64)。此實(shí)施形態(tài)可將從試樣導(dǎo)入部(3)所導(dǎo)入的核酸試樣，在濃度梯度區(qū)域流道(9)內(nèi)進(jìn)行電泳。
實(shí)施形態(tài)A所使用的分析對(duì)象物的分離方法的一例，是通過在微芯片內(nèi)的流道，改變含變性劑的緩沖液與緩沖液的比率并混合，而形成變性劑的濃度梯度，將含雙鏈核酸的核酸試樣導(dǎo)入流道內(nèi)，并使所導(dǎo)入的核酸試樣利用電泳進(jìn)行移動(dòng)而分離的方法。
實(shí)施形態(tài)A所使用的分離方法的另一例中，乃在微芯片上所實(shí)施的方法，上述微芯片是具有用來形成核酸變性劑濃度梯度的濃度梯度區(qū)域流道，并在濃度梯度區(qū)域流道上游側(cè)，設(shè)置用來分別供應(yīng)含有不同濃度核酸變性劑的緩沖液的多個(gè)儲(chǔ)存區(qū)與流道，在其下游側(cè)設(shè)有用來導(dǎo)入含雙鏈核酸的核酸試樣的試樣導(dǎo)入部，并包含分別對(duì)各儲(chǔ)存區(qū)內(nèi)的緩沖液賦予電位，同時(shí)控制它們所產(chǎn)生的各電滲透流，將這些緩沖劑依變動(dòng)比率進(jìn)行混合并導(dǎo)入濃度梯度區(qū)域流道內(nèi)，而在濃度梯度區(qū)域流道內(nèi)形成核酸變性劑濃度梯度的步驟；以及將核酸試樣導(dǎo)入濃度梯度區(qū)域流道內(nèi)并進(jìn)行電泳的步驟。
實(shí)施形態(tài)B本案的申請(qǐng)人就有關(guān)上述實(shí)施形態(tài)A的裝置及方法已以日本專利特愿2003-392302號(hào)提出申請(qǐng)。但是，本申請(qǐng)不僅采取傳統(tǒng)的DGGE濃度梯度形成方法，而且提供可容易大量生產(chǎn)且可重現(xiàn)性高的分析的分離技術(shù)。
實(shí)施形態(tài)B是涉及不需要將含不同濃度變性劑的緩沖液彼此間進(jìn)行混合的分離裝置及方法。實(shí)施形態(tài)B涉及利用變性劑濃度梯度非連續(xù)的變性劑濃度梯度的分析對(duì)象物的分離方法、供其使用的緩沖液區(qū)域排列的形成方法及使用這些方法的微芯片電泳裝置。
實(shí)施形態(tài)B是包含將分析對(duì)象物的含不同濃度變性劑的緩沖液區(qū)域，沿泳動(dòng)方向交互配置，并將分析對(duì)象物導(dǎo)入緩沖液區(qū)域排列且進(jìn)行電泳的步驟。
在實(shí)施形態(tài)B的一例中，緩沖液區(qū)域的排列中，不含變性劑或含較低濃度的緩沖液區(qū)域的各個(gè)長度(泳動(dòng)方向?qū)挾?，是以朝下游側(cè)逐漸縮小的方式排列。在實(shí)施形態(tài)B的另一例中，緩沖液區(qū)域的排列中，含較高濃度變性劑的緩沖液區(qū)域長度(泳動(dòng)方向?qū)挾?，是以朝下游側(cè)逐漸擴(kuò)大的方式排列。
實(shí)施形態(tài)B的另一例中，含不同濃度變性劑的緩沖液區(qū)域排列是形成于微流道內(nèi)。此時(shí)，在微流道內(nèi)借助于交叉導(dǎo)入含既定濃度變性劑的第1緩沖液、與含與其不同濃度變性劑的第2緩沖液，在微流道內(nèi)交互排列含不同濃度變性劑的緩沖液區(qū)域。此實(shí)施形態(tài)中，采用上述實(shí)施形態(tài)1-1與1-2中所使用的流量控制的手段，便可將含不同濃度變性劑的緩沖液區(qū)域交叉導(dǎo)入微流道內(nèi)。
在實(shí)施形態(tài)B的另一例中，將緩沖液區(qū)域交互排列的步驟是包含在將第1緩沖液導(dǎo)入第1微流道內(nèi)之后，再將第2緩沖液導(dǎo)入與第1微流道交叉的第2微流道中，由此第1微流道內(nèi)的第1緩沖液，便利用第2微流道內(nèi)的第2緩沖液而在它們的交叉部處進(jìn)行分段的步驟；以及依照上述步驟，交叉送入第1緩沖液與第2緩沖液的步驟。借助于這些步驟，便在第1微流道內(nèi)形成第1緩沖液與第2緩沖液的交互排列。此實(shí)施形態(tài)中，也可包含通過調(diào)整第1緩沖液的饋送量，而使第1緩沖液的泳動(dòng)方向長度逐漸變化的步驟。
使用實(shí)施形態(tài)B的方法的裝置的一例是微芯片電泳裝置，具備有用來執(zhí)行電泳的第1微流道；將第1緩沖液導(dǎo)入第1微流道內(nèi)的手段；將所含變性劑濃度不同于第1緩沖液的第2緩沖液，導(dǎo)入第1微流道內(nèi)的手段；以及將含雙鏈核酸的試樣導(dǎo)入第1微流道的手段。
實(shí)施形態(tài)B的另一例，是在電泳用的基板上，用來形成含不同濃度雙鏈核酸變性劑的緩沖液區(qū)域排列的方法，并涉及將應(yīng)形成緩沖液區(qū)域排列的基板保持于平臺(tái)部件，并設(shè)置用來對(duì)基板噴射含不同濃度雙鏈核酸變性劑的緩沖液的噴射部件，利用位置控制上述平臺(tái)部件及/或上述噴射部件，同時(shí)逐次驅(qū)動(dòng)噴射部件，而在上述基板排列含不同濃度變性劑的緩沖液區(qū)域的方法。
在實(shí)施形態(tài)B所進(jìn)行緩沖液區(qū)域排列形成用的方法的另一例中，乃保持電泳用微芯片基板作為基板，并在所保持的微芯片基板的微流道內(nèi)，配置含不同濃度變性劑的緩沖液區(qū)域的排列。此外，在另一例中，乃保持電泳用平板凝膠取代上述基板，并在所保持的平板凝膠，配置含不同濃度變性劑的緩沖液區(qū)域的排列。
實(shí)施形態(tài)B所進(jìn)行緩沖液區(qū)域排列形成用的裝置的一例，乃在電泳用基板上或平板凝膠，用來形成含不同濃度雙鏈核酸變性劑的緩沖液區(qū)域的排列的裝置，并具備有用來保持應(yīng)形成緩沖液區(qū)域排列的基板或平板凝膠的平臺(tái)部件；用來對(duì)基板或平板凝膠，噴射含不同濃度雙鏈核酸變性劑的緩沖液的噴射部件；以及用來位置控制上述平臺(tái)部件及/或上述噴射部件，同時(shí)逐次驅(qū)動(dòng)噴射部件的控制手段。
實(shí)施形態(tài)B所進(jìn)行緩沖液區(qū)域排列形成用的裝置及方法的另一例中，乃上述噴射部件可利用具有混合促進(jìn)部件的實(shí)施形態(tài)1-1至實(shí)施形態(tài)2-3的液體混合裝置及方法。此實(shí)施形態(tài)是利用適當(dāng)?shù)囊后w混合手段，促進(jìn)供應(yīng)給上述噴射部件的含不同濃度變性劑的緩沖液彼此間的混合。
本發(fā)明是提供一種可依微計(jì)量將微少量液體迅速且均勻混合的液體混合裝置或方法。利用本發(fā)明所提供的液體混合裝置或方法，可適用于現(xiàn)存或今后可能開發(fā)的所有μTAS，例如微化學(xué)分析裝置、或微化學(xué)反應(yīng)裝置(微反應(yīng)器)，結(jié)果便可達(dá)依微計(jì)量所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作的簡單化、分析時(shí)間與反應(yīng)時(shí)間的縮短化、以及高產(chǎn)能化，甚至晶片小型化、高精度化(例如高分解能力化)等各種優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明另一方面，乃提供一種利用分析對(duì)象物的變性劑濃度梯度，用來分離分析對(duì)象物的裝置及方法，以及變性劑濃度梯度的形成裝置及方法。尤其本發(fā)明是提供在微芯片上用來進(jìn)行DGGE的微芯片電泳裝置及電泳法。此發(fā)明也借助于將依微計(jì)量用來促進(jìn)液體混合的一連串技術(shù)，使用于微流道內(nèi)的緩沖液間的混合，而提供對(duì)DGGE有用的微芯片電泳裝置及電泳法。
根據(jù)本發(fā)明所提供的DGGE微芯片電泳裝置及其電泳法，便可正確的形成核酸變性劑的濃度梯度，且可自由的控制濃度梯度的形成。特別是可大量提供能經(jīng)常重現(xiàn)相同變性劑濃度梯度或排列的分析用晶片。結(jié)果，便可進(jìn)行各個(gè)數(shù)據(jù)間的嚴(yán)格比較與檢討，例如當(dāng)根據(jù)所分析的試樣中所含的核酸之比較(典型的rRND基因的堿基排列的比較)，解析微生物群落的構(gòu)造時(shí)，便具有采取數(shù)據(jù)的資料庫化變?yōu)槿菀椎雀鞣N優(yōu)點(diǎn)。


圖1是表示熟知的標(biāo)準(zhǔn)微計(jì)量混合用微流道的概略圖。
圖2圖是例示為能充分拮取擴(kuò)散距離，而將混合用微流道加長的微計(jì)量混合用微流道的概略圖。
圖3是例示具有用來促進(jìn)混合的液體分割細(xì)溝的微流道。(實(shí)施形態(tài)1-1)圖4是表示實(shí)施形態(tài)1-1的裝置的概略圖。
圖5是表示本實(shí)施形態(tài)的電壓控制的概念圖。
圖6是表示本實(shí)施形態(tài)的濃度梯度形成裝置的概略圖。
圖7是表示本實(shí)施形態(tài)的送壓控制的概念圖。(實(shí)施形態(tài)1-2)圖8是表示實(shí)施形態(tài)1-2的液體混合裝置的概略構(gòu)造圖。
圖9是表示圖8的液體混合裝置的具體構(gòu)造的斜視圖。
圖10是放大顯示圖8的液體混合裝置的高速動(dòng)作閥的斜視圖。
圖11是表示圖10的高速動(dòng)作閥(未動(dòng)作時(shí))的剖面圖。
圖12是表示圖10的高速動(dòng)作閥(動(dòng)作時(shí))的剖面圖。
圖13是用來說明高速動(dòng)作閥所使用的突起的制作方法的圖。
圖14是用來說明高速動(dòng)作閥所使用的突起的制作步驟的圖。
圖15是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置的另一例的構(gòu)造圖。
圖16是用來說明本實(shí)施形態(tài)的混合效果的圖。
圖17是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置再另一例的構(gòu)造圖。
圖18是有關(guān)圖16的液體混合裝置的控制的時(shí)序圖。
圖19是有關(guān)圖16的液體混合裝置的控制的另一時(shí)序圖。
圖20是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置再另一例的構(gòu)造圖。
圖21是有關(guān)圖20的液體混合裝置的控制的另一時(shí)序圖。
圖22是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置再另一例的構(gòu)造圖。
圖23是有關(guān)圖22的液體混合裝置的控制的另一時(shí)序圖。
圖24是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置再另一例的構(gòu)造圖。
圖25是有關(guān)圖24的液體混合裝置的控制的另一時(shí)序圖。
圖26是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置再另一例的概念圖。
圖27是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置再另一例的概念圖。
圖28是用來說明熟知的液體混合裝置的問題點(diǎn)的圖。
圖29是用來說明熟知的液體混合裝置的問題點(diǎn)的圖。(實(shí)施形態(tài)1-3)圖30是表示實(shí)施形態(tài)1-3的液體混合裝置的一例的圖。
圖31是說明接觸面面積(S)與平均每單位流道長的流道體積(V)的比(S/V)的圖。
圖32a是表示當(dāng)導(dǎo)入用微流道積層方向、與混合室高度方向?yàn)榇怪睍r(shí)，且導(dǎo)入用流道與混合室直接連接時(shí)的混合室中的液體狀態(tài)。
圖32b是表示當(dāng)導(dǎo)入用微流道積層方向、與混合室高度方向?yàn)榇怪睍r(shí)，且導(dǎo)入用微流道與混合室乃透過預(yù)混合用微流道而連接時(shí)的混合室中的液體狀態(tài)。
圖33是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置一例的圖。
圖34a是表示預(yù)混合用微流道與混合室平順連結(jié)時(shí)的液體的流動(dòng)。
圖34b是表示預(yù)混合用微流道與混合室并未平順連結(jié)時(shí)的液體的流動(dòng)。
圖35是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置的另一例。(實(shí)施形態(tài)1-4)圖36是表示實(shí)施形態(tài)1-4的液體混合裝置的概略構(gòu)造的左側(cè)視圖(a)、前視圖(b)、右側(cè)視圖(c)及剖面圖(d)。
圖37是表示液體混合裝置的層構(gòu)造與貼合步驟的圖。
圖38是表示另一層構(gòu)造的剖面圖。
圖39是表示相關(guān)液體混合裝置的合流部的另一構(gòu)造的剖面圖。
圖40是表示具有多個(gè)液體導(dǎo)入口的實(shí)施形態(tài)1-4的構(gòu)造例的圖。
圖41是表示圖40的裝置可使用的分支狀電極的構(gòu)造例的圖。
圖42是表示具有多個(gè)液體導(dǎo)入口的實(shí)施形態(tài)1-4的另一構(gòu)造的圖。
圖43是用來說明圖40或圖42的液體混合裝置的控制手段及方法的圖。(實(shí)施形態(tài)2-1)圖44是表示實(shí)施形態(tài)2-1的液體混合裝置的一例的圖。
圖45是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置的另一例的圖。
圖46是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置的另一例的圖。(實(shí)施形態(tài)2-2)圖47是表示實(shí)施形態(tài)2-2的液體混合裝置一例的概略圖。
圖48是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置另一例的概略圖。
圖49是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置再另一例的概略圖。
圖50是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置再另一例的概略圖。
圖51是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置中的液體導(dǎo)入形態(tài)的示意圖。
圖52是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置再另一例的概略圖。
圖53是表示本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置再另一例的概略圖。(實(shí)施形態(tài)2-3)圖54是表示本實(shí)施形態(tài)2-3的液體混合裝置的概略構(gòu)造圖。
圖55是表示圖54的裝置的柱狀微小構(gòu)造物組的例的圖。
圖56是表示具有溝狀微小構(gòu)造物組的本實(shí)施形態(tài)的概略構(gòu)造圖。
圖57是表示溝狀微小構(gòu)造物組的例的示意圖。
圖58是表示溝狀微小構(gòu)造物組的另一例的示意圖。(實(shí)施形態(tài)A)圖59a是表示實(shí)施形態(tài)A的微芯片電泳裝置基本構(gòu)造一例的示意概念圖。
圖59b是表示實(shí)施形態(tài)A的基本構(gòu)造的另一例的概念圖。
圖59c是表示實(shí)施形態(tài)A的基本構(gòu)造再另一例的概念圖。
圖59d圖是表示實(shí)施形態(tài)A的基本構(gòu)造再另一例的概念圖。
圖60是表示實(shí)施形態(tài)A的變性劑濃度梯度形成部的構(gòu)造例的示意圖。
圖61是表示變性劑濃度梯度形成部的另一例的示意圖。
圖62是表示實(shí)施形態(tài)A的試樣導(dǎo)入部的例的示意圖。
圖63是表示實(shí)施形態(tài)A的一例的示意圖。
圖64是表示實(shí)施形態(tài)A的另一例的示意圖。
圖65是表示設(shè)置高速閥的實(shí)施形態(tài)A的變性劑濃度梯度形成部的示意圖。
圖66是表示設(shè)置高速閥的另一變性劑濃度梯度形成部的示意圖。
圖67是表示設(shè)置高速閥的實(shí)施形態(tài)A的一例的示意圖。
圖68是表示設(shè)置高速閥的實(shí)施形態(tài)A的另一例的示意圖。(實(shí)施形態(tài)B)圖69是表示實(shí)施形態(tài)B的第1形態(tài)的變性劑間歇配置的概念圖。
圖70是表示實(shí)施形態(tài)B的第2形態(tài)的變性劑間歇配置的概念圖。
圖71是表示含有具變性劑間歇配置的平板凝膠的泳動(dòng)裝置的概略構(gòu)造的斜視圖。
圖72是表示微流道所形成的變性劑間歇配置的概念圖。
圖73是表示實(shí)施形態(tài)B的微芯片電泳裝置的一例的圖。
圖74是表示實(shí)施形態(tài)B的微芯片電泳裝置的另一例的圖。
圖75是表示實(shí)施形態(tài)B的微芯片電泳裝置的另一例的圖。
圖76是構(gòu)成圖75的裝置的各基板的構(gòu)造圖。
圖77是表示實(shí)施形態(tài)B的微芯片電泳裝置的另一例的圖。
圖78是表示實(shí)施形態(tài)B的形成緩沖液區(qū)域排列的裝置的概略構(gòu)造的斜視圖。
圖79是表示適用于在平板凝膠形成緩沖液區(qū)域排列的裝置的概略構(gòu)造的斜視圖。
圖80是表示實(shí)施形態(tài)B的緩沖液區(qū)域排列形成方法的一例的概念圖。
圖81是表示實(shí)施形態(tài)B的含變性劑的緩沖液區(qū)域長度的調(diào)整方法的概念圖。
圖82是用來說明實(shí)施形態(tài)B的原理的圖。
圖83是表示供形成緩沖液區(qū)域排列的設(shè)有高速動(dòng)作閥的裝置的示意圖。
圖84是表示供形成緩沖液區(qū)域排列的噴射部件一例的示意圖。
附圖標(biāo)記說明(實(shí)施形態(tài)1-1；圖1至圖7)5 第1儲(chǔ)存區(qū)6 第2儲(chǔ)存區(qū)7 第1液體導(dǎo)入用微流道8 第2液體導(dǎo)入用微流道9 混合用微流道 10 第3儲(chǔ)存區(qū)11 第1電極 12 第2電極13 第3電源 14 第1泵15 第2泵(實(shí)施形態(tài)1-2；圖8至圖29)130 液體導(dǎo)入用微流道131 混合用微流道132 高速動(dòng)作閥(實(shí)施形態(tài)1-3；第30至35圖)205 第1儲(chǔ)存區(qū) 206 第2儲(chǔ)存區(qū)207 第1液體導(dǎo)入用微流道208 第2液體導(dǎo)入用微流道230 混合室 233 混合用微流道234 預(yù)混合用微流道 235 連接部(實(shí)施形態(tài)1-4；圖36至圖43)330 液體導(dǎo)入用微流道330a 分支流道331 混合用微流道X 分支方向
Y 合流方向(實(shí)施形態(tài)2-1；圖44至圖46)405 第1儲(chǔ)存區(qū) 406 第2儲(chǔ)存區(qū)407 第1液體導(dǎo)入用微流道408 第2液體導(dǎo)入用微流道430 合流部431、432、451、452 導(dǎo)入用微流道433、453 混合用微流道 435 加熱器440、450 合流部 441、442 導(dǎo)入用微流道443 混合用微流道445、455 加熱器(實(shí)施形態(tài)2-2；圖47至圖50)505 第1儲(chǔ)存區(qū) 506 第2儲(chǔ)存區(qū)507 第1液體導(dǎo)入用微流道508 第2液體導(dǎo)入用微流道509、533 混合用微流道 510、537 振動(dòng)子511 可動(dòng)升力面 512 轉(zhuǎn)動(dòng)體513 擺動(dòng)體 535、536 混合對(duì)象的液體538 閥(實(shí)施形態(tài)2-3；圖54至圖57)707 第1液體導(dǎo)入用微流道708 第2液體導(dǎo)入用微流道709 液體混合用濃度梯度區(qū)域流道(混合用微流道)709a 濃度梯度區(qū)域流道下面709b 濃度梯度區(qū)域流道上面730 合流部 731 微小構(gòu)造物組(實(shí)施形態(tài)A；第59圖至圖68)801 微芯片 802 變性劑濃度梯度形成部803 試樣導(dǎo)入部 804 電泳部805 第1儲(chǔ)存區(qū) 806 第2儲(chǔ)存區(qū)
807 第1流道(液體導(dǎo)入用微流道)808 第2流道(液體導(dǎo)入用微流道)809 濃度梯度區(qū)域流道(混合用微流道)810 第1電極 811 第1電源812 第2電極 813 第2電源814 第1泵815 第2泵816 第3儲(chǔ)存區(qū)817 第4儲(chǔ)存區(qū)818 第4流道 819 第5流道820 第3電極 821 第3電源822 第4電極 823 第4電源824 第5儲(chǔ)存區(qū)825 第5電極826 第5電源(實(shí)施形態(tài)B；圖69至圖84)901 核酸分析用流道(微流道)902 核酸試樣導(dǎo)入流道 903 微芯片基板905 檢測部906 含變性劑的緩沖液導(dǎo)入流道910 基板 911 平臺(tái)部件912 噴射部件 914 平板凝膠具體實(shí)施方式
液體混合裝置及方法本發(fā)明的液體混合裝置是含有用來導(dǎo)入液體的至少2條液體導(dǎo)入用微流道、以及至少2條液體導(dǎo)入用微流道所連接的混合用微流道而構(gòu)成，且從各液體導(dǎo)入用微流道所導(dǎo)入的各液體在上述混合用微流道內(nèi)進(jìn)行合流的液體混合裝置，乃具有用來促進(jìn)在上述混合用微流道內(nèi)合流的液體間的混合的混合促進(jìn)部件。
在本發(fā)明的第1實(shí)施形態(tài)中，混合促進(jìn)部件是增加所混合的液體間的界面之面積的部件。第1實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置例，包括有下述所示實(shí)施形態(tài)1-1、1-2、1-3及1-4。
在本發(fā)明的第2實(shí)施形態(tài)中，混合促進(jìn)部件是將所混合的液體間的接觸面，利用熱、機(jī)械式及/或構(gòu)造部件進(jìn)行不穩(wěn)定化的部件。第2實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置例是包含有下述所示實(shí)施形態(tài)2-1、2-2及2-3。
以下，依序說明本發(fā)明各實(shí)施形態(tài)。
實(shí)施形態(tài)1-1(圖4至圖7)本實(shí)施形態(tài)的裝置的混合促進(jìn)部件是可將導(dǎo)入于液體導(dǎo)入用微流道中的液體流量，與其他液體導(dǎo)入用微流道相獨(dú)立地進(jìn)行控制的至少1個(gè)液體導(dǎo)入部件。
圖4顯示本實(shí)施形態(tài)的裝置。此裝置是包含有填充著第1試劑溶劑的第1儲(chǔ)存區(qū)5；填充著第2試劑溶液的第2儲(chǔ)存區(qū)6；通過第1儲(chǔ)存區(qū)5的第1流道(液體導(dǎo)入用微流道)7；通過第2儲(chǔ)存區(qū)6的第2流道(液體導(dǎo)入用微流道)8；連結(jié)第1流道7與第2流道8的第3流道(混合用微流道)9；以及第3儲(chǔ)存區(qū)10；而且，在第1儲(chǔ)存區(qū)5中還含有第1電極11，在第2儲(chǔ)存區(qū)6中還含有第2電極12，在第3儲(chǔ)存區(qū)10中還含有第3電極13。
若對(duì)第1電極11與第3電極13之間施加電壓V1時(shí)，利用所產(chǎn)生的電滲透流，第1試劑溶液便從第1儲(chǔ)存區(qū)5通過第1流道7而導(dǎo)入于第3流道9中。同樣的，若對(duì)第2電極12與第3電極13之間施加電壓V2時(shí)，第2試劑溶液便從第2儲(chǔ)存區(qū)6通過第2流道8而導(dǎo)入于第3流道9中。
一般而言，在微流道中，若2液合流時(shí)，會(huì)形成層流且2液所鄰接的接觸面會(huì)穩(wěn)定的維持。所以，已知當(dāng)擴(kuò)散系數(shù)較小的供試液時(shí)，利用擴(kuò)散所進(jìn)行的混合將無法充分的進(jìn)行，而在分離為2層的情況下，流通于混合用微流道內(nèi)。此時(shí)，如圖5(b)實(shí)線所示，若對(duì)電壓V1與電壓V2賦予適當(dāng)變動(dòng)成分時(shí)，使2液所形成的接觸面產(chǎn)生不穩(wěn)定，而2液所鄰接的接觸面將擴(kuò)大、或由于可使接觸面構(gòu)造崩解，因而便可將2液高速且均勻的混合。所以，通過對(duì)電壓V1與電壓V2賦予適當(dāng)變動(dòng)成分，便可將第1試劑溶液與第2試劑溶液，在第3流道9上依任意比率迅速的混合。此外，若使電壓V1與電壓V2如圖5(a)虛線、單點(diǎn)劃線般的連續(xù)變化，便可使第1試劑溶液與第2試劑溶液的流量比連續(xù)變化。在此若如圖5(b)虛線、單點(diǎn)劃線般，使變動(dòng)成分重疊于電壓信號(hào)時(shí)，第1與第2試劑溶液便將充分的混合，而可在第3流道9中快速的形成試劑溶液的濃度梯度區(qū)域。變動(dòng)成分可考慮正弦波、鋸齒波、矩形波等及它們的組合。此外，為求促進(jìn)擴(kuò)散、流量保持，也可考慮將各流道的變動(dòng)成分相位錯(cuò)開。
圖6顯示本實(shí)施形態(tài)的一例。包含有填充著第1試劑溶液的第1儲(chǔ)存區(qū)5；填充著第2試劑溶液的第2儲(chǔ)存區(qū)6；通過第1儲(chǔ)存區(qū)5的第1流道(液體導(dǎo)入用微流道)7；通過第2儲(chǔ)存區(qū)6的第2流道(液體導(dǎo)入用微流道)8；連結(jié)第1流道7與第2流道8的第3流道(混合用微流道)9；以及第3儲(chǔ)存區(qū)10；而且，第1儲(chǔ)存區(qū)5還含有第1電極11，第2儲(chǔ)存區(qū)6還含有第2電極12，第3儲(chǔ)存區(qū)10還含有第3電極13。此外，第1儲(chǔ)存區(qū)5與第2儲(chǔ)存區(qū)6乃分別屬于附加著第1泵14與第2泵15的構(gòu)造。
通過利用這些泵進(jìn)行液體輸送，便可輔助利用圖4的電滲透流所進(jìn)行的液體輸送，即使試劑溶液粘性較高時(shí)，仍可以較高速進(jìn)行液體輸送。此時(shí)，如圖7(b)實(shí)線所示，若對(duì)第1泵14與第2泵15的液體輸送壓賦予適當(dāng)變動(dòng)成分，便使2液所形成接觸面產(chǎn)生不穩(wěn)定，而2液所鄰接的接觸面將擴(kuò)大、或由于可使接觸面構(gòu)造崩解，因而可將2液高速且均勻的進(jìn)行混合。所以，借助于對(duì)第1泵14與第2泵15的液體輸送壓賦予適當(dāng)變動(dòng)成分，便可將第1試劑溶液與第2試劑溶液，在第3流道9上依任意比率迅速的進(jìn)行混合。此外，若使第1泵14與第2泵15的液體輸送壓，如圖7(b)虛線、單點(diǎn)劃線般的連續(xù)變化，便可使第1試劑溶液與第2試劑溶液的流量比連續(xù)的變化。在此，若如圖7(b)虛線、單點(diǎn)劃線，使變動(dòng)成分重疊于液體輸送壓，便可將第1試劑溶液與第2試劑溶液充分的混合，而可在第3流道9中形成試劑溶液濃度梯度區(qū)域。此外，在圖6中，同時(shí)控制泵14與泵15的液體輸送壓及電極11與電極12的賦予電位，便可實(shí)施更有效的促進(jìn)擴(kuò)散與濃度梯度控制。變動(dòng)成分也可考慮正弦波、鋸齒波、矩形波等及這些波的組合。另外，為求促進(jìn)擴(kuò)散、保持流量，也可考慮將各流道的變動(dòng)成分的相位錯(cuò)開。
實(shí)施形態(tài)1-2(圖8至圖22)本實(shí)施形態(tài)的裝置的混合促進(jìn)部件是在至少1條液體導(dǎo)入用微流道中所設(shè)置的高速動(dòng)作閥。
圖8是表示本實(shí)施形態(tài)的微芯片裝置的流道概略構(gòu)成，圖9是表示本實(shí)施形態(tài)的微芯片具體構(gòu)造。此微芯片的微流道是由2條液體導(dǎo)入用微流道130a、130b；及它們合流的1條混合用微流道31所構(gòu)成。依照本實(shí)施形態(tài)，在一條液體導(dǎo)入用微流道中安裝有高速動(dòng)作閥132。
圖9顯示微芯片整體構(gòu)造。另外，圖10是放大顯示高速動(dòng)作閥機(jī)構(gòu)的部分，圖11顯示此高速動(dòng)作閥的剖面。如圖9圖所示，從液體導(dǎo)入用微流道的各儲(chǔ)存區(qū)，利用注射泵(syringe pump)P對(duì)A液與B液進(jìn)行加壓，并分別導(dǎo)入于各液體導(dǎo)入用微流道130a、130b中，且在1條混合用微流道131合流。在導(dǎo)入A液的液體導(dǎo)入用微流道130a中途，設(shè)有利用壓電元件驅(qū)動(dòng)的高速動(dòng)作閥132。借助于此高速動(dòng)作閥的開閉，控制A液從液體導(dǎo)入用微流道130a導(dǎo)入混合用微流道131。借助于高速動(dòng)作閥132的控制，對(duì)A液的流入量賦予變動(dòng)，而可控制對(duì)混合用微流道131內(nèi)所供應(yīng)的液體的A液與B液的混合比等。
高速動(dòng)作閥是如圖11(液體導(dǎo)入用微流道130a的軸方向剖面)及圖12所示，包含部分液體導(dǎo)入用微流道130a。此部分乃屬于由PDMS(聚二甲基硅氧烷)制膜而成之厚度20μm、寬度300μm左右的閥體133。在相同流道內(nèi)靠近閥體處設(shè)置突起134，并相對(duì)于閥體133設(shè)置從外部抵接的φ250μm左右的壓頭135，形成此壓頭135利用壓電元件進(jìn)行驅(qū)動(dòng)的構(gòu)造。閥體133與突起134之間的空間形成10μm左右的細(xì)微間隙h。閥體133利用以響應(yīng)頻率10kHz以上進(jìn)行動(dòng)作的壓電元件，直接朝上下進(jìn)行高速驅(qū)動(dòng)，由此執(zhí)行此細(xì)微間隙h的開閉。
本實(shí)施形態(tài)所使用的高速動(dòng)作閥的較好機(jī)能是閥開閉動(dòng)作屬高速性，以及此開閉時(shí)的動(dòng)作體積(相當(dāng)于閥的閥體移動(dòng)而關(guān)閉流道時(shí)，擠壓流道內(nèi)的液體所產(chǎn)生的體積)較小。此事項(xiàng)最好如本實(shí)施形態(tài)，將流道內(nèi)的突起形成半圓柱狀等，而閥體以近乎線接觸的形式接觸于突起，且閥體進(jìn)行上下的沖程(h)也設(shè)為10μm左右的微小程度。
再者，就本實(shí)施形態(tài)中可使用的另一高速動(dòng)作閥來說，有如噴墨打印機(jī)所使用的閥。例如也可采用借助于以熱對(duì)液體導(dǎo)入用微流道進(jìn)行局部性加熱，使流動(dòng)于液體導(dǎo)入用流道內(nèi)的液體氣化而使體積膨脹，由此來高速控制從液體導(dǎo)入用流道，將一定微小流量噴出于混合用微流道中的閥。
參照?qǐng)D13與圖14，說明高速動(dòng)作閥所使用的半圓柱狀突起134的制作方法。在玻璃基板上涂布50μm厚膜劑，利用微影制程將流道形成圖案曝光成g線(波長436nm的紫外光)中，而進(jìn)行顯影。如圖13所示，液體導(dǎo)入用微流道的流道寬度乃例如100μm，依正交于形成半圓柱狀突起的部分的方式，進(jìn)行流道寬度100μm的直線圖案。如圖14(圖13的A-A剖面)所示，為使此橋接圖案變形為半圓柱狀突起形狀，所以便將經(jīng)抗蝕劑圖案化的玻璃基板投入恒溫爐中，并利用300℃進(jìn)行20分鐘的加熱處理。由此因?yàn)榭刮g劑在250℃以上便軟化，因而邊緣將受表面張力而變形趨于圓形，最后便形成半圓柱狀。其次，對(duì)此基板進(jìn)行干式蝕刻處理。若對(duì)玻璃基板進(jìn)行蝕刻處理時(shí)，因?yàn)榭刮g劑也將一起接受蝕刻處理，結(jié)果便將抗蝕劑形狀直接原狀的轉(zhuǎn)印在玻璃基板上。此種加工雖也可采用RIB(Reactive Ion Etching)，但是為進(jìn)行良好的形狀轉(zhuǎn)印性，最好采行中性粒子光束加工。如上述便可在液體導(dǎo)入用微流道內(nèi)形成適當(dāng)?shù)耐黄饦?gòu)造。
本實(shí)施形態(tài)所使用的高速動(dòng)作閥的所謂“高速的開閉動(dòng)作”，是指閥體具有響應(yīng)頻率約10Hz以上，最好10～20kHz周期的動(dòng)作。
其次，參照?qǐng)D15至圖21，說明本實(shí)施形態(tài)的液體混合方法。
在上述構(gòu)造的微芯片中，當(dāng)導(dǎo)入A液與B液之時(shí)，便使設(shè)置在A液的液體導(dǎo)入用微流道上的高速動(dòng)作閥，依一定周期高速地進(jìn)行開閉動(dòng)作。依此若對(duì)液體流量以短時(shí)間間隔賦予變動(dòng)時(shí)，在混合用微流道內(nèi)所形成的A液與B液之間的接觸面，便形成圖15的混合用微流道31中所描繪的“打褶(wave)”形狀。通過高速動(dòng)作閥被導(dǎo)入的液體A，在混合用微流道寬度方向中所占的比率可以短時(shí)間進(jìn)行連續(xù)式變化。所以，液體A在混合用微流道內(nèi)與所合流的其他液體B的接觸面積便將增加。如上述2液的接觸面將擴(kuò)大，而使2液的擴(kuò)散混合較容易進(jìn)行。
在未使用高速動(dòng)作閥的傳統(tǒng)方法方面，如圖28所示，2液接觸面在混合用微流道內(nèi)形成大致直線。例如在寬度200μm的流道流動(dòng)的行進(jìn)方向取單位長度時(shí)，以通過使用高速動(dòng)作閥所形成的50μm周期將寬度100μm的打褶形狀的接觸面(參照?qǐng)D15)，相較于平板的接觸面(參照?qǐng)D28)時(shí)，若將打褶形狀形成近似正弦波，則其表面積將擴(kuò)大成4倍。
借助于2個(gè)接觸面間形成打褶形態(tài)，混合時(shí)間到底縮短何種程度，用下述計(jì)算模型表示。在圖16的模型中，打褶周期為L時(shí)，若擴(kuò)散至一半的L/2，實(shí)際上因?yàn)閺拇蝰薜膬蓚?cè)進(jìn)行擴(kuò)散，因而可認(rèn)為混合已結(jié)束。液體擴(kuò)散的單純擴(kuò)散計(jì)算模型乃如以下公式所述(D0＝擴(kuò)散系數(shù)[m2/s](變性劑10-10、水10-9)、t＝時(shí)間[see])公式1σ[m]=2D0t]]>例如當(dāng)變性劑(擴(kuò)散系數(shù)D0＝10-11)時(shí)，若以5分鐘完成混合的方式設(shè)計(jì)周期L＝2σ，則此計(jì)算便如以下公式所示。
公式2σ=2×10-11×300[m]]]>=6000×10-12[m]]]>=77×10-6[m]]]>=77[μm]]]>如上述所示，擴(kuò)散距離σ將為77[μm]。此表示打褶間之間隔若為50μm，便可在5分鐘內(nèi)完成混合。此時(shí)間對(duì)執(zhí)行DGGE分析而言為非常的短時(shí)間。
圖17的裝置可較圖15的混合裝置更加提高混合效率。在此裝置中，分別于2個(gè)液體A、B用的2條液體導(dǎo)入用微流道中設(shè)有高速動(dòng)作閥(閥A與閥B)。此實(shí)施形態(tài)的較好高速動(dòng)作閥的運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)序圖的例顯示于圖18與圖19。
如圖18所示，在上述實(shí)施形態(tài)的裝置中，使閥A與閥B的開閉動(dòng)作同步，當(dāng)閥A為“開”時(shí)，閥B便呈“閉”，反之，當(dāng)閥A為“閉”的時(shí)，閥B便呈“開”。由此便可在混合用微流道內(nèi)將A液所形成的打褶形狀的寬度，擴(kuò)大到流道的整個(gè)寬度部分。此外，因?yàn)锳液與B液二者的流量和經(jīng)常呈一定狀態(tài)，因而液體便依一定流速在混合用微流道內(nèi)流通。所以，在混合用微流道內(nèi)制作濃度梯度方面將可獲得較好的控制特性。另外，關(guān)于使用實(shí)施形態(tài)1-2形成濃度梯度的方法在后敘述。
圖17的裝置是2液界表面積為圖14時(shí)的2倍，換句話說，未形成打褶時(shí)(圖28)的8倍。圖18乃全開/全閉控制閥的開閉。但是，閥開度不僅為全閉或全開的任何開閉控制，也可通過使用壓電元件，并調(diào)整賦予壓電元件的電位，便可變控制閥開度。例如也可運(yùn)用如圖19的運(yùn)作時(shí)序圖。不管何者，運(yùn)作時(shí)序圖均不限于上述方式，也可利用其他各種方式控制閥的開閉。
圖20的裝置可進(jìn)一步提高混合效率。此裝置是3條液體導(dǎo)入用微流道130a、130b、130c連接于混合用微流道131。A液從中心位置的液體導(dǎo)入用微流道130a導(dǎo)入混合用微流道131中，B液從位于兩旁的2條液體導(dǎo)入用微流道130b、130c導(dǎo)入。在這2條液體導(dǎo)入用微流道130b、130c中分別設(shè)置高速動(dòng)作閥(閥1與閥2)?？蓪⑺鼈兝鐖D21的動(dòng)作時(shí)序圖所示進(jìn)行開閉動(dòng)作，由此便可形成如圖20的混合用微流道131內(nèi)所描繪的打褶形狀的接觸面。此2液的接觸面(打褶總表面積)將為圖15時(shí)的2倍，換句話說，將獲得未形成打褶時(shí)(圖28)的16倍的接觸面表面積，由此便可實(shí)現(xiàn)非常高效率的液體混合。在此雖例示A液與B液的2液體混合，但是若將輸送B液用的2條液體導(dǎo)入用微流道130b、130c的其中任一設(shè)為輸送C液用時(shí)，便可利用混合用微流道131將A、B、C等3液進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕旌稀?br> 其次，參照?qǐng)D22至圖25，利用本實(shí)施形態(tài)說明控制液體導(dǎo)入的方法。
將A液與B液在混合用微流道內(nèi)混合成具濃度梯度狀態(tài)的方法中，A液與B液可使用含有不同濃度溶質(zhì)(例如核酸變性劑)的液體。為適合這種情況，在上述所說明的裝置中，可改變閥開閉動(dòng)作的運(yùn)轉(zhuǎn)方法。形成濃度梯度的混合方法的一例，乃將高速動(dòng)作閥的開閉周期設(shè)為一定，且在此1周期中，可變控制閥所開啟時(shí)間的比率(Duty比)。
例如若使閥A與閥B的動(dòng)作，如圖23的運(yùn)作時(shí)序圖進(jìn)行動(dòng)作，便可將具不同濃度的2液接觸面的打褶形狀，一旁逐漸變化其大小一邊形成(如圖22的混合用微流道內(nèi)所描繪所示)。然后，若放置5分鐘左右，通過此接觸面迅速的引起2液間的擴(kuò)散混合，而可在混合用微流道31內(nèi)形成具一定濃度梯度的混合液。
使用圖23說明形成濃度梯度的混合方法中較好的運(yùn)作時(shí)序的例。首先，基本上當(dāng)閥A為“開”之時(shí)，閥B便“閉”，反之，當(dāng)閥A為“閉”之時(shí)，閥B便“開”。依照此基本方式，將1周期的時(shí)間，例如設(shè)定為100ms(毫秒)，開始的1周期在90ms間將閥A設(shè)為“開”。接著的第2周期在80ms間將閥A設(shè)為“開”。接著的第3周期在70ms間將閥A設(shè)為“開”。如上述，若將1周期中的閥A的開啟時(shí)間逐漸縮短，在混合用微流道內(nèi)便可獲得濃度朝下游方向(圖式從左側(cè)朝右側(cè))，逐漸依一次線性變濃的濃度梯度。
利用上述方式雖可充分的進(jìn)行擴(kuò)散混合，但是若根據(jù)圖24與圖25所示裝置與方法，將可更加改善擴(kuò)散混合。此方式乃如圖25運(yùn)作時(shí)序所示，閥A為“開”的時(shí)間T1是固定，而使閥A為“閉”的時(shí)間T2進(jìn)行變化。T1最好設(shè)定為高速動(dòng)作閥可動(dòng)作的最短脈沖時(shí)間程度。例如若閥的響應(yīng)頻率為1kHz的話，便將T1設(shè)定成最少動(dòng)作時(shí)間1ms的數(shù)倍的5ms。然后，若形成如圖22的濃度梯度的話，僅要將T2設(shè)定為逐漸變長便可。如上述所示，因?yàn)锳液與B液的接觸面比圖22時(shí)增加，因此擴(kuò)散混合將更高速的進(jìn)行，并在短時(shí)間內(nèi)便完成混合。
在上述說明中，乃例示使2條液體導(dǎo)入用微流道合流，并輸送液體于1條混合用微流道中的例子。但是也可如圖26所示，將此混合構(gòu)成單位形成幾段組合，并進(jìn)行多數(shù)次的混合。此時(shí)，當(dāng)然各處所導(dǎo)入的液體種類也可改變。此外，也可以如圖27所示，將2條以上的多數(shù)液體導(dǎo)入用微流道(同圖中為4條液體導(dǎo)入用微流道)，一次便導(dǎo)入于1條混合用微流道中并進(jìn)行混合。
實(shí)施形態(tài)1-3(圖30至圖35)本實(shí)施形態(tài)的裝置的混合促進(jìn)部件是有關(guān)混合用微流道的形狀，乃借助于將混合用微流道的流道高度設(shè)為小于其流道寬度所形成的混合室。
圖30所示的本實(shí)施形態(tài)裝置包含用來導(dǎo)入混合對(duì)象液體的2條液體導(dǎo)入用微流道207、208；將2條液體導(dǎo)入用微流道朝上下方向積層并合流的1條預(yù)混合用微流道234；以及連結(jié)于預(yù)混合用微流道的混合室230。預(yù)混合用微流道234與混合室230構(gòu)成混合用微流道。
在本實(shí)施形態(tài)的裝置中，混合對(duì)象液體從液體導(dǎo)入用微流道207、208導(dǎo)入，且混合對(duì)象液體朝上下方向積層并合流，并導(dǎo)入于液體導(dǎo)入用微流道所連結(jié)的預(yù)混合用微流道234中，經(jīng)合流的液體將被導(dǎo)入于預(yù)混合用微流道所連結(jié)的混合室230中。在本實(shí)施形態(tài)中，借助于通過液體導(dǎo)入用微流道與預(yù)混合用微流道的狹窄流道而來的液體，導(dǎo)入于扁平型混合室230中，而增加液體間的接觸面，由此便促進(jìn)多個(gè)液體的混合。
在本實(shí)施形態(tài)的裝置中，可將儲(chǔ)存區(qū)205、206連接于液體導(dǎo)入用微流道207、208上游，此時(shí)，將2種液體供應(yīng)給儲(chǔ)存區(qū)205、206。液體的供應(yīng)可利用周知的任何方法實(shí)施，例如可利用機(jī)械式或電性驅(qū)動(dòng)力來實(shí)施。具體而言，可利用液體輸送泵或閥調(diào)節(jié)流量。例如，利用調(diào)節(jié)儲(chǔ)存區(qū)間的施加電壓或賦予電位而進(jìn)行電滲透流控制，及利用微量注射針等調(diào)節(jié)液體輸送的壓力而控制液體輸送泵，由此便可調(diào)節(jié)各液體的流量。
在本實(shí)施形態(tài)中，混合對(duì)象液體雖為2種，但并不僅限于此，所混合的液體也可為2種以上。此外，在本實(shí)施形態(tài)中，液體導(dǎo)入用微流道雖為2條，但并不僅限于此，液體導(dǎo)入用微流道可設(shè)為2條以上。
在本實(shí)施形態(tài)中，所謂“流道高度”是指相對(duì)于多個(gè)液體彼此間鄰接所形成的液接觸面，在垂直方向的流道尺寸，所謂“流道寬度”是指平行于液接觸面，且與流動(dòng)方向垂直的方向的流道尺寸。在本實(shí)施形態(tài)中，例如針對(duì)預(yù)混合用微流道234可將流道寬度設(shè)為500μm、將流道高度設(shè)為100μm，而針對(duì)混合室230可將流道寬度(形成最大的地方)設(shè)為10mm，將流道高度設(shè)為5μm。
更詳細(xì)說明本實(shí)施形態(tài)的液體混合程序。首先，在本實(shí)施形態(tài)中，液體導(dǎo)入用微流道與預(yù)混合用微流道內(nèi)的液體流動(dòng)實(shí)質(zhì)上為層流。之所以如此，乃因?yàn)橐后w導(dǎo)入用微流道與預(yù)混合用微流道的寬度較狹窄。另外，此傾向在流通于液體導(dǎo)入用微流道的液體的流量較小時(shí)，更為明顯。結(jié)果，在預(yù)混合用微流道中，僅在各液體間的接觸面會(huì)產(chǎn)生混合，但因?yàn)橐后w間的接觸面較小，因而較不容易發(fā)生各液間的混合。另一方面，經(jīng)合流的液體若從此預(yù)混合用微流道流入于混合室時(shí)，在混合室中因?yàn)橐后w間的接觸面將變大，因而利用在接觸面的擴(kuò)散混合，便將混合對(duì)象的液體充分迅速的混合。
液體導(dǎo)入用微流道也可與混合室直接連接，如圖30的實(shí)施形態(tài)所示，也可在混合室上游設(shè)置預(yù)混合用微流道。但是，最好如圖30實(shí)施形態(tài)所示，在混合室上游設(shè)置預(yù)混合用微流道。理由是當(dāng)未設(shè)置預(yù)混合用微流道，而是從2條液體導(dǎo)入用微流道直接連接于混合室時(shí)，因?yàn)榱鞯缹挾葘⒓眲〉臄U(kuò)大，因而流動(dòng)將變?yōu)槲蓙y的緣故。當(dāng)如本實(shí)施形態(tài)所示在混合室上游設(shè)置預(yù)混合室時(shí)，所流入液體的流動(dòng)并未凌亂。
在此，探討預(yù)混合用微流道與混合室中液體的混合容易度。當(dāng)考慮接觸面處的擴(kuò)散混合時(shí)，液體的混合容易度，乃依存于平均每單位流道長的流道體積(V)與接觸面(S)的比(S/V)。此比(S/V)乃根據(jù)流道高度(H)，可表示為1/H(參照?qǐng)D31，L流道長度、W流道寬度、H流道高度)，因而得知液體的混合容易度僅依存于流道高度(H)。
公式3S/V＝1/HS接觸界面面積[μm2]V流道體積[μm3]H流道高度[μm]例如若針對(duì)預(yù)混合用微流道的各液流道高度為50μm，而混合室的各液流道高度為2.5μm時(shí)進(jìn)行探討的話，流道體積(V)與接觸面(S)的比(S/V)，便形成預(yù)混合用微流道為1/50(μm-1)，混合室為1/2.5(μm-1)。所以，可謂混合室將容易形成預(yù)混合用微流道20倍程度的混合。
在此，在本實(shí)施形態(tài)的裝置中，使液體導(dǎo)入用微流道在流道的高度方向合流。因借助于在流道的高度方向合流，混合室中的液體間的接觸面會(huì)變充分?jǐn)U大，各液間的混合將迅速的進(jìn)行。反之，當(dāng)在流道寬度方向合流時(shí)(圖32)，液體間的接觸面相對(duì)于流道體積將變小，較難將液體迅速的混合。本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置是液體導(dǎo)入用微流道朝上下方向積層并合流，且連接于預(yù)混合用微流道與混合室。
其次，探討混合室內(nèi)的混合時(shí)間。一般而言，液體的擴(kuò)散可依單純擴(kuò)散方程式描述。
公式4σ[m]=2D0t]]>D0擴(kuò)散系數(shù)[m2/sec]t時(shí)間[sec]σ擴(kuò)散距離[m]此方程式是若使擴(kuò)散系數(shù)為D0(m2/s)的2種液體進(jìn)行接觸時(shí)，在時(shí)間t(s)中擴(kuò)散至σ(m)并相互混合的情況。
例如當(dāng)變性劑的擴(kuò)散系數(shù)D0為10-11時(shí)，5秒后的擴(kuò)散距離σ為10μm。所以，若流道高度在20μm以下，理論上可在5秒內(nèi)完成混合。實(shí)際上，在本實(shí)施形態(tài)的擴(kuò)散中，因?yàn)閺纳舷?液雙方進(jìn)行擴(kuò)散，因而若將混合室的流道高度設(shè)為L時(shí)，若擴(kuò)散至其一半的L/2，則可認(rèn)為混合幾乎便已完成。當(dāng)欲在5秒內(nèi)完成混合時(shí)，實(shí)際上可將流道高度設(shè)為10μm。另外，進(jìn)行微芯片DGGE時(shí)，因?yàn)?秒的混合時(shí)間非常的短，因而本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置可謂頗適于微芯片DGGE的液體混合裝置。
再者，經(jīng)由上述探討雖可理解若縮小流道高度便可縮短混合時(shí)間，但是若流道寬度如同流道高度般的縮小時(shí)，流動(dòng)的流量將變小，在產(chǎn)業(yè)應(yīng)用上無實(shí)用性。所以，為能高速的液體輸送且縮短混合時(shí)間，最好將流道寬度設(shè)為較長于流道高度。
圖33顯示另一實(shí)施形態(tài)。此實(shí)施形態(tài)的裝置是包含用來導(dǎo)入混合對(duì)象液體的2條液體導(dǎo)入用微流道207、208；2條流道朝上下方向積層并合流的1條預(yù)混合用微流道234；連結(jié)預(yù)混合用微流道與混合室的連接部235；以及連結(jié)于連接部的混合室230；在此，于本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置中，預(yù)混合用微流道與混合室，乃利用具備平順梯度的合流部235而加以連結(jié)。
如本實(shí)施形態(tài)所示，最好預(yù)混合用微流道與混合室為平順的相連結(jié)。理由是當(dāng)預(yù)混合用微流道與混合室平順連結(jié)時(shí)，在預(yù)混合用微流道與混合室的合流部中，并未發(fā)生沉淀區(qū)域，在流道中途并無液體卷起漩渦的情況，因而各液體間的接觸面將不致凌亂，可依液體流動(dòng)順序進(jìn)行混合并從混合室中取出的緣故(圖34a)。另一方面，當(dāng)連接部并未形成朝前端逐漸擴(kuò)大的形狀時(shí)，便將發(fā)生沉淀區(qū)域，并在此處產(chǎn)生漩渦。結(jié)果，即使從液體導(dǎo)入用微流道同時(shí)注入多個(gè)液體，也會(huì)在沉淀區(qū)域發(fā)生液體滯留，應(yīng)利用針孔混合的液體將時(shí)間性前后的到達(dá)混合室被混合，而導(dǎo)致頗難形成精密的濃度梯度(圖34b)。特別是在期望形成正確濃度梯度的微芯片DGGE方面，本實(shí)施形態(tài)的液體混合裝置便頗適合。
在圖33的實(shí)施形態(tài)中，例如可針對(duì)預(yù)混合用微流道234，將流道寬度設(shè)為500μm，將流道高度設(shè)為100μm，針對(duì)連接部235，將流道流動(dòng)方向的長度設(shè)為15mm，針對(duì)混合室230則將流道寬度設(shè)為10mm，將流道高度設(shè)為5μm。
圖35表示另一實(shí)施形態(tài)。此實(shí)施形態(tài)的裝置是包含用來導(dǎo)入混合對(duì)象液體的2條液體導(dǎo)入用微流道207、208；以及液體導(dǎo)入用微流道合流的1條混合用微流道(混合室230)。在本實(shí)施形態(tài)中，混合對(duì)象液體雖透過液體導(dǎo)入用微流道207、208合流，但是混合室230則設(shè)計(jì)成合流后的各液體間的接觸面變大的狀態(tài)。
在圖35的實(shí)施形態(tài)中，例如可將混合室的流道高度設(shè)為20μm，將流道寬度設(shè)為100μm。本實(shí)施形態(tài)的裝置并不需要將2片基板貼合的制作，可利用玻璃的干式蝕刻處理進(jìn)行加工處理。更詳言之，在圖案遮罩采用Ni濺鍍膜且利用進(jìn)行ICP蝕刻處理便可進(jìn)行加工處理。
實(shí)施形態(tài)1-4(圖36至圖43)本實(shí)施形態(tài)裝置的混合促進(jìn)部件是關(guān)于液體導(dǎo)入用微流道連接于混合用微流道的合流部形狀以及液體導(dǎo)入用微流道的配置等。詳細(xì)的說，這種混合促進(jìn)部件是液體導(dǎo)入用微流道具有多條分支流道，是從分支流道朝混合用微流道的合流部，且為以多條分支流道彼此于3維空間上配置成相互不同的形態(tài)，連接在混合用微流道的合流部。
首先，說明此實(shí)施形態(tài)的技術(shù)背景。
本實(shí)施形態(tài)是根據(jù)按每個(gè)混合液體將流道細(xì)分化，并使其以套筒式進(jìn)行合流，由此將多個(gè)液體排列成層狀并在流道內(nèi)進(jìn)行流動(dòng)，便將增加各液體的接觸面積，可輕易的促進(jìn)液體間的擴(kuò)散的發(fā)現(xiàn)。更進(jìn)一步探討的結(jié)果，便發(fā)現(xiàn)下述問題。
(1)至液體導(dǎo)入用微流道的液體導(dǎo)入口對(duì)各個(gè)液體為1個(gè)時(shí)，在實(shí)現(xiàn)本實(shí)施形態(tài)，便需要按每個(gè)液體使在流道分支，并使它們?cè)俣群狭鞯臉?gòu)造。此構(gòu)造并不容易形成于2維形狀晶片的單一層中。此構(gòu)造必須形成3維的立體交叉。若要利用微影處理與蝕刻處理進(jìn)行制作此構(gòu)造，便必須在一片晶片的表背面進(jìn)行蝕刻處理、或形成犧牲層，而導(dǎo)致制造步驟變?yōu)閺?fù)雜。
(2)再者，若在流道寬度100μm左右的微流道中，利用微影處理與蝕刻處理進(jìn)行制作時(shí)，合流部將角度展開，導(dǎo)致液體輸送時(shí)的壓力損失變大。
(3)由于各液體的導(dǎo)入方法，可不采取從1條液體導(dǎo)入用微流道分支的構(gòu)造，而配合分支流道數(shù)量設(shè)置多個(gè)導(dǎo)入口。根據(jù)此構(gòu)造，便可在2維形狀晶片的單一層上形成混合用微流道。但是，此時(shí)，晶片上游或準(zhǔn)備階段的液體導(dǎo)入機(jī)構(gòu)、導(dǎo)入方法將變?yōu)閺?fù)雜。
(4)如上述所示，在設(shè)有多個(gè)導(dǎo)入口的裝置中，在混合用微流道內(nèi)自由控制混合液體的混合濃度比的方法尚未確立。例如，在用來進(jìn)行DGGE的微芯片電泳裝置方面，為能形成正確且再現(xiàn)性好的核酸變性劑濃度梯度，需要對(duì)應(yīng)精密地控制濃度梯度。
本實(shí)施形態(tài)是關(guān)于用來解決上述問題的液體混合裝置。此外，本實(shí)施形態(tài)提供了一種在設(shè)有具多個(gè)導(dǎo)入口的液體導(dǎo)入用微流道的液體混合裝置中，可在微流道內(nèi)迅速地將試劑溶液進(jìn)行混合，且可良好控制流動(dòng)方向的濃度梯度等的裝置。
圖36所示是本實(shí)施形態(tài)裝置概略構(gòu)造的側(cè)視(a)、(c)、前視(b)及剖面(d)。此裝置為具有用來導(dǎo)入液體的2條液體導(dǎo)入用微流道330及它們所連接的混合用微流道331的微芯片。液體是從2條液體導(dǎo)入用微流道330(圖36左側(cè))流入，而在內(nèi)部合流并利用1條混合用微流道331進(jìn)行混合。各個(gè)液體導(dǎo)入用微流道330分別具有分支為梳齒狀的2條分支流道330a，上述第2條分支流道彼此從上下連接在混合用微流道331(將此連接方向稱為“合流方向Y”)。此合流部如圖36(d)的剖面DD及剖面EE所示，分支流道330a的分支方向X是相對(duì)于合流方向Y為大致直角的梳型形狀。這些分支流道330a彼此相互結(jié)合呈在3維上咬合的狀態(tài)，并合流于1條混合用微流道。透過此形態(tài)的合流部所合流的液體，也可在微流道內(nèi)進(jìn)行迅速且均勻的混合。
圖37是以斜視圖等顯示圖36裝置的概略構(gòu)造。此裝置是將已形成既定流道等的基板進(jìn)行貼合便可制得。此實(shí)施形態(tài)屬于中間基板為貼合2片基板的構(gòu)造。中間基板是通過將各液體導(dǎo)入用微流道330、它們的分支流道330a以及混合用微流道331，分別形成在一片基板上，而形成混合用微流道331(圖36(d)的剖面BB)。以此為中心，將已形成各液體導(dǎo)入用微流道的2片基板(圖36(d)的剖面AA及CC)從上下進(jìn)行貼合，然后再貼合上形成蓋的基板。如上述便形成在合流方向Y(即與分支方向X大致垂直的方向)重疊的層構(gòu)造。多分支流道330a是在1條液體導(dǎo)入用微流道上，設(shè)置在與其大致同一平面上。如上述合流的分支流道330a可謂屬于梳齒狀構(gòu)造。
圖38中，將如同圖36裝置的流道構(gòu)造，在分支方向X(即與合流方向Y大致垂直的方向)進(jìn)行貼合。此實(shí)施形態(tài)乃形成按每個(gè)分支流道設(shè)置基板的層構(gòu)造。
圖39是例示圖36的剖面FF、GG及圖38的合流部構(gòu)造適用曲線形狀的構(gòu)造。如上述合流部的流道也可構(gòu)成曲線構(gòu)造。如上述所示時(shí)，便可制得降低合流部中的壓損的液體混合裝置。
基板的材質(zhì)可從玻璃、石英、塑膠、硅樹脂等中適當(dāng)?shù)倪x擇。如上述的多數(shù)層重疊、表背多階段構(gòu)造乃利用微影/蝕刻加工便可制得。但是，本實(shí)施形態(tài)的裝置也可利用微影技術(shù)進(jìn)行制作，借助于對(duì)合流部的各流道剖面形狀加工成曲線(大略流線形)，可更良好的降低壓損。
其次，說明用來有效率進(jìn)行液體導(dǎo)入的實(shí)施形態(tài)。此實(shí)施形態(tài)是關(guān)于具有具多導(dǎo)入口的液體導(dǎo)入用微流道的裝置。
圖40的裝置是集合具有用來導(dǎo)入試劑溶液的多個(gè)液體導(dǎo)入口330a的液體導(dǎo)入用微流道330并連接于混合用微流道331。此集合型流道構(gòu)造中，液體導(dǎo)入用微流道330靠近集中而成的寬度，是與混合用微流道331的流道寬度相同。在此，一組多個(gè)液體導(dǎo)入口330a是對(duì)應(yīng)于將同一液體(同一濃度的緩沖液或同種類的試劑溶液等，在圖40中為第1試劑溶液或第2試劑溶液)，輸送給液體導(dǎo)入用微流道330的液體導(dǎo)入用微流道組。它們是在基板上設(shè)計(jì)成規(guī)則的幾何配置。幾何配置有如圖40(a)或(b)的直線狀或圓弧狀、橢圓狀的2維配置。此外，如這些裝置所示，各個(gè)液體導(dǎo)入口330a組的各幾何配置最好相互成相似形狀。
本實(shí)施形態(tài)的裝置有如在各液體導(dǎo)入口330a設(shè)置電極，并利用電滲透流驅(qū)動(dòng)液體。此實(shí)施形態(tài)也可制作如圖41所示的分支狀驅(qū)動(dòng)電極，并設(shè)置成對(duì)應(yīng)各液體導(dǎo)入口組的既定幾何配置狀態(tài)。圖41是表示對(duì)應(yīng)于直線幾何配置的分支電極構(gòu)造示意圖。借助于將如上述的分支電極設(shè)置成裝卸自如狀態(tài)，便可從一定的液體導(dǎo)入口組有效的驅(qū)動(dòng)試劑溶液。例如相對(duì)于導(dǎo)入同一試劑溶液的多個(gè)液體導(dǎo)入口330a使用一個(gè)分支電極，便可從多個(gè)液體導(dǎo)入口330a同時(shí)進(jìn)行液體輸送。
再者雖未圖示，若屬于利用泵壓力驅(qū)動(dòng)液體的裝置時(shí)，設(shè)置對(duì)應(yīng)此液體導(dǎo)入口組的幾何配置的分支狀液壓導(dǎo)入管，便可對(duì)所有的液體導(dǎo)入口同時(shí)且均等的施加壓力，同樣的可有效的執(zhí)行試劑溶液體的導(dǎo)入。此外，將本實(shí)施形態(tài)的混合裝置使用于微芯片時(shí)，便可將微芯片裝置薄型化。如圖42所示，可將多個(gè)液體導(dǎo)入口330a位置所對(duì)應(yīng)的分支狀驅(qū)動(dòng)電極，設(shè)置在與液體導(dǎo)入口大致同一平面上。
其次，說明本實(shí)施形態(tài)裝置的較好液體導(dǎo)入控制手段及方法。如上述在同一液體通過一組液體導(dǎo)入口330a而加以導(dǎo)入的實(shí)施形態(tài)中，可在這些液體導(dǎo)入用微流道組的上游設(shè)置泵或電滲透流驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)。此時(shí)，所使用的泵或電滲透流驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)的數(shù)量，即使較導(dǎo)入同種液體的液體導(dǎo)入用微流道的流道數(shù)量為少，也可適當(dāng)?shù)目刂埔后w導(dǎo)入。
圖43是例示用來驅(qū)動(dòng)電滲透流的控制手段。從各液體導(dǎo)入用微流道330利用電滲透流將同一試劑溶液朝混合用微流道331方向進(jìn)料。在此利用開關(guān)施加電源電位差A(yù)-C的流道，是將試劑溶液朝下游進(jìn)料，并與其他試劑溶液以層狀合流并混合。另一方面，同一試劑溶液的流道也利用開關(guān)賦予電源電位差B-C。在這些流道中，借助于設(shè)定適當(dāng)?shù)碾娢籅，便可使試劑溶液不致流向下游且不會(huì)逆流。
通過適當(dāng)切換該多個(gè)開關(guān)的開(ON)/關(guān)(OFF)，而改變同一試劑溶液朝下游流動(dòng)的流道的有效管路數(shù)量，結(jié)果，便可使同一試劑溶液朝混合用微流道331的總流入量長期且獨(dú)立的變化。僅對(duì)用來輸送同一試劑溶液的各組液體導(dǎo)入用微流道(即各個(gè)試劑溶液)所設(shè)置的開關(guān)組進(jìn)行開/關(guān)控制，便可使各試劑溶液的流入量以較少的電源數(shù)進(jìn)行多階段性的變化，而可控制在混合用微流道中的上述試劑溶液的濃度。特別是長期控制總流入量時(shí)，便可精確地控制經(jīng)混合后在流動(dòng)方向所形成的上述試劑溶液的濃度分布。
多個(gè)開關(guān)也可采用繼電器，而且也可取代電極或當(dāng)作輔助用的設(shè)置壓力泵，并對(duì)每個(gè)試劑溶液進(jìn)行壓力驅(qū)動(dòng)控制。當(dāng)設(shè)置壓力泵時(shí)，分別對(duì)各個(gè)液體導(dǎo)入用微流道設(shè)置控制閥，并以驅(qū)動(dòng)控制這些控制閥的方式，使每個(gè)試劑溶液的流量產(chǎn)生變化。
實(shí)施形態(tài)2-1(圖44至圖46)本實(shí)施形態(tài)裝置的混合促進(jìn)部件是包含在液體導(dǎo)入用微流道及/或混合用微流道中所設(shè)置的加熱器而成。
圖44是表示本實(shí)施形態(tài)的裝置。本實(shí)施形態(tài)的裝置是包含用來導(dǎo)入混合對(duì)象液體的液體導(dǎo)入用微流道431、432；將2條流道在合流部430合流的1條混合用的微流道433；以及用來將混合用微流道內(nèi)的液體加熱的加熱器435。
在本實(shí)施形態(tài)的裝置中，混合對(duì)象液體是從液體導(dǎo)入用微流道431、432導(dǎo)入，混合對(duì)象液體在合流部430合流，經(jīng)合流的液體將導(dǎo)入至連接于合流部430的混合用微流道433，并利用加熱器435(例如鉻鋼加熱器與珀耳帖元件(Peltier device)等)，將混合用微流道內(nèi)的溶液予以加熱，且將混合用微流道內(nèi)的液體加以混合。根據(jù)本實(shí)施形態(tài)，在混合用微流道內(nèi)合流的液體將由加熱器435所加熱，使混合用微流道內(nèi)的液體溫度上升，因?yàn)橐后w內(nèi)的溶質(zhì)布朗運(yùn)動(dòng)(Brownianmovement)將活化，因而便將促進(jìn)分子擴(kuò)散，可迅速的將多個(gè)液體混合。此外，利用加熱產(chǎn)生的熱對(duì)流，也會(huì)促進(jìn)所合流液體的混合。
液體的供應(yīng)也可利用傳統(tǒng)的任何方法實(shí)施，例如利用機(jī)械性或電性驅(qū)動(dòng)力實(shí)施。具體而言，通過調(diào)節(jié)液體輸送泵或閥，流量便可產(chǎn)生變化。例如通過調(diào)節(jié)儲(chǔ)存區(qū)間的施加電壓或賦予電位而控制電滲透流，或者利用微量注射針等調(diào)節(jié)液體輸送的壓力而控制液體輸送泵，也可調(diào)節(jié)各液體的流量。
在本實(shí)施形態(tài)的裝置中，混合對(duì)象的液體雖為2種，但并不僅限于此，所混合的液體也可為2種以上。此外，本實(shí)施形態(tài)的液體導(dǎo)入用微流道雖為2條，但并不僅限于此，也可為2條以上。
圖45是表示另一實(shí)施形態(tài)。此實(shí)施形態(tài)的裝置是包含液體導(dǎo)入用微流道441、442；使液體導(dǎo)入用微流道441、442在合流部40合流的1條混合用的微流道443；以及為加熱混合用微流道443而安裝在上述微流道443下方的加熱器445。根據(jù)本實(shí)施形態(tài)，混合對(duì)象液體在合流部440中朝垂直方向積層并合流，經(jīng)合流的液體將導(dǎo)入至連接在合流部440的混合用微流道443，并利用安裝在混合用微流道下方的加熱器445，從下面將混合用微流道443內(nèi)的溶液進(jìn)行加熱。如上述便將促進(jìn)混合用微流道內(nèi)的液體混合。在本實(shí)施形態(tài)中，經(jīng)合流的液體由加熱器445予以加熱，使混合用微流道下側(cè)的液體溫度上升，因?yàn)樵诹鞯?43內(nèi)將產(chǎn)生熱對(duì)流，因而利用垂直方向的對(duì)流將促進(jìn)擴(kuò)散效果，而促進(jìn)所合流液體的混合。此外，利用加熱所增加的分子擴(kuò)散，也可促進(jìn)所合流液體的混合。
圖46是表示另一實(shí)施形態(tài)。本實(shí)施形態(tài)的裝置是包含液體導(dǎo)入用微流道451、452；使液體導(dǎo)入用微流道451、452在合流部450合流的1條混合用的微流道453；以及用來加熱液體導(dǎo)入用微流道452的加熱器455。根據(jù)本實(shí)施形態(tài)，利用加熱器部455將液體導(dǎo)入用微流道452內(nèi)的溶液進(jìn)行加熱，未被加熱的流道451內(nèi)的液體、與經(jīng)加熱的流道452內(nèi)的液體在合流部450中，予以加熱且使溫度較高的流道452內(nèi)的液體為下面而朝垂直方向從下起依序積層并合流，所合流的液體將導(dǎo)入至合流部450所連接的混合用微流道453。如上述便將促進(jìn)混合用微流道內(nèi)的液體混合。在本實(shí)施形態(tài)中，雖然流道452內(nèi)的液體已被加熱器455加熱，但是在合流部450均被層積在未被加熱的流道451內(nèi)的液體下側(cè)并進(jìn)行合流，因而經(jīng)加熱的液體欲向上側(cè)移動(dòng)而在流道453內(nèi)產(chǎn)生熱對(duì)流，利用垂直方向的對(duì)流將促進(jìn)擴(kuò)散效果，從而促進(jìn)所合流液體的混合。此外，利用加熱而增加分子擴(kuò)散，也會(huì)促進(jìn)所合流液體的混合。
如本實(shí)施形態(tài)所示，利用加熱器將液體導(dǎo)入用微流道進(jìn)行加熱時(shí)，液體導(dǎo)入用微流道內(nèi)的液體將從高溫液體起依序朝垂直方向從下方積層并合流。本實(shí)施形態(tài)中可使用的加熱器，可從眾所周知的任何加熱裝置中選擇使用。例如可使用鉻鋼加熱器或珀耳帖元件。加熱器的設(shè)置位置是只要可對(duì)流道內(nèi)的液體進(jìn)行加熱便可，可設(shè)置在任何位置。例如可設(shè)置在流道壁面。此外，加熱器的設(shè)置個(gè)數(shù)并不僅限于1個(gè)，也可為多個(gè)。
實(shí)施形態(tài)2-2(圖47至圖53)本實(shí)施形態(tài)裝置的混合促進(jìn)部件是用來將在混合用微流道所合流的液體間的接觸面攪亂的機(jī)械式變動(dòng)部件。第1形式的機(jī)械式變動(dòng)部件被設(shè)置在混合用微流道內(nèi)的合流部附近的振動(dòng)子、可動(dòng)升力面、轉(zhuǎn)動(dòng)體或擺動(dòng)體。第2形式的機(jī)械式變動(dòng)部件并不限于在混合用微流道內(nèi)的合流部附近，而在較其更靠下游側(cè)的混合用微流道之壁面上或壁面外所設(shè)置的振動(dòng)子。
圖47至圖50是表示具有第1形式機(jī)械式變動(dòng)部件的一實(shí)施形態(tài)。圖47的裝置是在合流部設(shè)置振動(dòng)子510。此裝置是包含填充著第1液體的第1儲(chǔ)存區(qū)505；填充著第2液體的第2儲(chǔ)存區(qū)506；通過第1儲(chǔ)存區(qū)505的第1流道507(液體導(dǎo)入用微流道)；通過第2儲(chǔ)存區(qū)506的第2流道508(液體導(dǎo)入用微流道)；以及連結(jié)第1流道507與第2流道508的第3流道509(混合用微流道)，而更在第3流道509的壁面設(shè)有振動(dòng)子510。振動(dòng)子510是連接在未圖示的電源與驅(qū)動(dòng)控制手段。第1液體從第1儲(chǔ)存區(qū)505通過第1流道507，導(dǎo)入于第3流道509，而第2液體則從第2儲(chǔ)存區(qū)506通過第2流道507，導(dǎo)入于第3流道509。
一般而言，在微流道中，若2液合流，形成層流且2液相鄰接的接觸面將維持穩(wěn)定。所以，已知當(dāng)擴(kuò)散系數(shù)較小的供試液時(shí)，將無法利用擴(kuò)散充分的進(jìn)行混合，將呈分離為雙層的狀態(tài)進(jìn)行流動(dòng)。此時(shí)，若利用在流道壁面或壁面外側(cè)的極其附近所設(shè)置的振動(dòng)子510(或利用1個(gè)以上的多個(gè)振動(dòng)子組)，對(duì)混合部流動(dòng)處提供適當(dāng)變動(dòng)成分，因?yàn)榭墒?液所形成的接觸面產(chǎn)生不穩(wěn)定，而2液相鄰接的接觸面將擴(kuò)大，或利用上述揚(yáng)力面所產(chǎn)生的漩渦(漩渦度)使接觸面構(gòu)造崩解，或者利用漩渦變動(dòng)使負(fù)壓區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生氣穴(cavitation)，因而可將2液迅速且均勻的混合。
圖48所示另一實(shí)施形態(tài)的裝置中，是在合流部設(shè)置可動(dòng)升力面511。此裝置是包含填充著第1液體的第1儲(chǔ)存區(qū)505；填充著第2液體的第2儲(chǔ)存區(qū)506；通過第1儲(chǔ)存區(qū)505的第1流道507；通過第2儲(chǔ)存區(qū)506的第2流道508；以及連結(jié)第1流道507與第2流道508的第3流道509，而且在第3流道509的合流部設(shè)有可動(dòng)升力面511?？蓜?dòng)升力面511是連接在未圖示的電源與驅(qū)動(dòng)控制手段。第1液體從第1儲(chǔ)存區(qū)505通過第1流道507，導(dǎo)入于第3流道509中，而第2液體則從第2儲(chǔ)存區(qū)506通過第2流道508，并導(dǎo)入于第3流道509。此時(shí)，若利用合流部所設(shè)置的可動(dòng)升力面511，以引發(fā)接觸面不穩(wěn)定的頻率提供適當(dāng)變動(dòng)成分，便會(huì)使2液所形成的接觸面產(chǎn)生不穩(wěn)定，而2液相鄰接的接觸面將擴(kuò)大，或使接觸面構(gòu)造崩解，或者在液體內(nèi)產(chǎn)生氣穴，因而可將2液高速且均勻的混合。
圖49所示在另一實(shí)施形態(tài)的裝置中，是在合流部設(shè)置轉(zhuǎn)動(dòng)體512。此裝置是包含填充著第1液體的第1儲(chǔ)存區(qū)505；填充著第2液體的第2儲(chǔ)存區(qū)506；通過第1儲(chǔ)存區(qū)505的第1流道507；通過第2儲(chǔ)存區(qū)506的第2流道508；以及連接第1流道507與第2流道508的第3流道509，而且在第3流道509內(nèi)含有轉(zhuǎn)動(dòng)體512。轉(zhuǎn)動(dòng)體512是連接在未圖示的電源與驅(qū)動(dòng)控制手段。第1液體從第1儲(chǔ)存區(qū)505通過第1流道507并導(dǎo)入于第3流道509，而第2液體則從第2儲(chǔ)存區(qū)506通過第2流道508導(dǎo)入于第3流道509。此時(shí)若利用流道509內(nèi)所設(shè)置的轉(zhuǎn)動(dòng)體512(或多個(gè)轉(zhuǎn)動(dòng)體列)提供適當(dāng)變動(dòng)成分，因?yàn)槭?液所形成的接觸面產(chǎn)生不穩(wěn)定，從而2液相鄰接的接觸面將擴(kuò)大，或使接觸面構(gòu)造崩解，或者在液體內(nèi)產(chǎn)生氣穴，因而可將2液高速且均勻的混合。
圖50所示在另一實(shí)施形態(tài)的裝置中，是在合流部設(shè)置擺動(dòng)體513。此裝置是包含填充著第1液體的第1儲(chǔ)存區(qū)505；填充著第2液體的第2儲(chǔ)存區(qū)506；通過第1儲(chǔ)存區(qū)505的第1流道507；通過第2儲(chǔ)存區(qū)506的第2流道508；以及連結(jié)第1流道507與第2流道508的第3流道509，而且在第3流道509內(nèi)含有擺動(dòng)體513。擺動(dòng)體513是連接于未圖示的電源與驅(qū)動(dòng)控制手段。第1液體從第1儲(chǔ)存區(qū)505通過第1流道507并導(dǎo)入于第3流道509，而第2液體則從第2儲(chǔ)存區(qū)506通過第2流道508導(dǎo)入第3流道509。此時(shí)憑借在流道內(nèi)所設(shè)置的擺動(dòng)體513(或利用多個(gè)擺動(dòng)體列)提供適當(dāng)變動(dòng)成分，使2液所形成的接觸面產(chǎn)生不穩(wěn)定，從而2液相鄰接的接觸面將擴(kuò)大，或使接觸面構(gòu)造崩解，或者在液體內(nèi)產(chǎn)生氣穴，因而可將2液高速且均勻的混合。
根據(jù)上述各實(shí)施形態(tài)，可將第1液體與第2液體在第3流道509上，以任意比率迅速的混合。若使用不同濃度的第1液體與第2液體，通過使其混合比連續(xù)性的變化，便可在第3流道509中形成濃度梯度區(qū)域。
圖51至圖53是表示具有第2形式機(jī)械式變動(dòng)部件的裝置實(shí)施形態(tài)。此形式的裝置是包含多條液體導(dǎo)入用微流道；使多條液體導(dǎo)入用微流道合流的1條混合用的微流道；以及用來使混合用微流道中的各液體間的接觸面不穩(wěn)定化的振動(dòng)子。此實(shí)施形態(tài)的特征是在混合用微流道的下游側(cè)也設(shè)置振動(dòng)子(最好多個(gè)振動(dòng)子)，混合的促進(jìn)是在液體導(dǎo)入混合用微流道之后才實(shí)施。具體而言，將混合對(duì)象液體以保持各液間的接觸面的方式導(dǎo)入之后，便停止液體的導(dǎo)入，其次再利用上述振動(dòng)子將各液間的接觸面不穩(wěn)定化，而將各液體進(jìn)行混合。若形成濃度梯度，便在混合用微流道內(nèi)的流動(dòng)方向，形成2種液體體積比以進(jìn)行連續(xù)性變化的狀態(tài)而完成合流，接著便控制振動(dòng)子的輸出與驅(qū)動(dòng)時(shí)間并驅(qū)動(dòng)振動(dòng)子。
2種液體是靠改變來自各液體導(dǎo)入用微流道的流量比率而導(dǎo)入，可在混合用微流道內(nèi)形成各種形態(tài)的幾何圖案(例如可采用由上述實(shí)施形態(tài)1-1與1-2所進(jìn)行的流量控制)。圖51是表示混合用微流道中所形成的2種液體之形態(tài)?；旌蠈?duì)象液體635、636是從多條液體導(dǎo)入用微流道經(jīng)由合流部，導(dǎo)入混合用微流道633中，但是如先前技術(shù)中所說明，因?yàn)樵谖⒘鞯纼?nèi)較難進(jìn)行混合，因而這些液體有維持著保持接觸面狀態(tài)的傾向。若改變2液比率而導(dǎo)入，便可形成2液比率相對(duì)于流道長度方向呈連續(xù)變化的方式導(dǎo)入(圖51(a)與圖51(b))。此外，可將2液交叉，且以其比率相對(duì)于流道長度方向進(jìn)行變化的方式導(dǎo)入(圖51(c))。另外，可單純的將流道長度方向利用2液進(jìn)行二分化的方式導(dǎo)入(圖51(d))。在形成連續(xù)的濃度梯度方面，最好相對(duì)于流道長度方向，以液體體積比連續(xù)變化的形態(tài)，穩(wěn)定的保持著它們的接觸面。
圖52是表示依照?qǐng)D51形態(tài)，通過將導(dǎo)入混合用微流道633的2種液體，使用沿混合用微流道633壁面所設(shè)置的多個(gè)振動(dòng)子進(jìn)行混合，而形成濃度梯度的程序。振動(dòng)子是沿混合用微流道633壁面而設(shè)置多個(gè)。如上述所示，液體635、636是在保持著接觸面的狀態(tài)下導(dǎo)入于混合用微流道(圖51(c)、圖52(a))。其次，靠驅(qū)動(dòng)振動(dòng)子637，以將引發(fā)液體635、636間的接觸面不穩(wěn)定的頻率，提供適當(dāng)?shù)淖儎?dòng)成分，便可使各液體間的接觸面不穩(wěn)定化?？空駝?dòng)子的驅(qū)動(dòng)，便增加各液體間的接觸面，或者靠破壞各液體間的接觸面，或者在液體內(nèi)產(chǎn)生氣穴，便可將各液體迅速且均勻的進(jìn)行混合。以維持適當(dāng)體積比的方式所導(dǎo)入的2種液體，是靠振動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)，在流道長度方向相互混合，便可在流道流動(dòng)方向形成相同且連續(xù)的濃度梯度(圖52(b))。
圖53是表示將導(dǎo)入于圖51的混合用微流道中的2種液體進(jìn)行混合的實(shí)施形態(tài)。首先，如圖51(a)所示，將液體635、636在保持著接觸面的狀態(tài)下，導(dǎo)入混合用微流道中(圖51(a))。其次，利用混合用微流道端部所設(shè)置的振動(dòng)子637，以引發(fā)接觸面不穩(wěn)定的頻率提供適當(dāng)變動(dòng)成分，從而使各液體間的接觸面不穩(wěn)定化。這樣，將增加各液體間的接觸面，或者破壞各液體間的接觸面，或者在液體內(nèi)發(fā)生氣穴，便可將各液體迅速且均勻的進(jìn)行混合(圖53(b))。具體而言，經(jīng)混合后，以相對(duì)于流道內(nèi)的流動(dòng)方向，使2液混合比進(jìn)行連續(xù)式變化，便可在使體積比進(jìn)行變化且穩(wěn)定的保持著2液體間的接觸面的方式，導(dǎo)入液體635、636，靠控制輸出與驅(qū)動(dòng)時(shí)間并驅(qū)動(dòng)振動(dòng)子，便可形成如圖53(b)所示的液體濃度梯度。
導(dǎo)入混合對(duì)象液體的方法與裝置是可使用眾所周知所有的方法與裝置。例如可舉出控制泵的流量將2種液體分別以任意比率導(dǎo)入的方法，或者控制閥的開閉時(shí)間使混合對(duì)象液的比率進(jìn)行變化的方法，或者在電滲透流驅(qū)動(dòng)方式中控制著賦予電位而導(dǎo)入液體的方法，或者由他們所提出的方法(參照M.Yamada and M.Seki，Proc.IEEE the 16hInternational Symposium on Micro Electro Mechanical Systems(MEMS)，2003，PP.347-350，2003)。導(dǎo)入混合對(duì)象液體的方法與裝置最好在將各液體進(jìn)行混合之后，以各液體的混合比相對(duì)于流道長度方向形成連續(xù)式狀態(tài)，使體積比產(chǎn)生變化，并以穩(wěn)定的保持著各液體間的接觸面的方式導(dǎo)入。
本實(shí)施形態(tài)所使用的振動(dòng)子與其驅(qū)動(dòng)方法，可使用周知所有的手段與方法。例如，可舉出利用壓電元件、靜電致動(dòng)器、形狀記憶效果可動(dòng)元件、電磁致動(dòng)器及高分子電動(dòng)材料所進(jìn)行的方法等。本實(shí)施形態(tài)中所使用的液體為2種，但并不僅限于此，也可為2種以上。此外，本實(shí)施形態(tài)的液體導(dǎo)入用微流道雖為2條，但并不僅限于此，也可為2條以上。
振動(dòng)子的設(shè)置位置是僅要能使混合用微流道內(nèi)的液體接觸面產(chǎn)生振動(dòng)的話，可設(shè)在任何位置。例如可設(shè)置在混合用微流道的壁面(圖52)、或設(shè)置在混合用微流道的端部(圖53)。此外，也可設(shè)置在混合用微流道的兩側(cè)，也可在混合用微流道的壁面與端部二處并存。另外，僅要能對(duì)流道內(nèi)的液體傳遞振動(dòng)的話，可將振動(dòng)子設(shè)置在遠(yuǎn)離流道的位置處。而且，振動(dòng)子的設(shè)置個(gè)數(shù)并不僅限于1個(gè)，也可為多個(gè)。
實(shí)施形態(tài)2-3(圖54至圖58)本實(shí)施形態(tài)裝置的混合促進(jìn)部件是在混合用微流道內(nèi)的合流部附近排列有許多微小構(gòu)造物。
本實(shí)施形態(tài)裝置的基本構(gòu)造是包含導(dǎo)入液體的2條以上的液體導(dǎo)入用微流道、以及連接它們所形成的1條混合用微流道而成，且在混合用微流道內(nèi)多數(shù)排列著微小構(gòu)造物。從液體導(dǎo)入用微流道所導(dǎo)入并合流的液體，將利用接觸混合用微流道內(nèi)的微小構(gòu)造物組而促進(jìn)混合。若以微芯片電泳裝置為例，上述液體導(dǎo)入用微流道為用來導(dǎo)入緩沖液及/或含變性劑的緩沖液的微流道，而上述混合用微流道則為濃度梯度形成區(qū)域的流道。以下，說明微芯片電泳裝置的實(shí)施形態(tài)。
圖54的裝置是在濃度梯度區(qū)域流道709(混合用微流道)內(nèi)，設(shè)置微小構(gòu)造物組作為混合促進(jìn)部件。如此圖所示，變性劑濃度梯度形成部2是用來導(dǎo)入液體的第1流道707(液體導(dǎo)入用微流道)、與第2流道708(液體導(dǎo)入用微流道)，利用共通的合流部730予以連結(jié)，并連接于微流道709，在此合流部730的下游附近設(shè)置較此流道寬度微小的構(gòu)造物組731。此微小構(gòu)造物組731是細(xì)微大小的構(gòu)造物以幾何排列以大致等間距成列排列著，最好是各列的構(gòu)造物從液體流動(dòng)方向觀察，設(shè)計(jì)呈相互錯(cuò)開的排列狀態(tài)。從第1流道707與第2流道8所導(dǎo)入的液體，雖在合流部730接觸并形成層狀而進(jìn)行流動(dòng)，但由于通過微小構(gòu)造物組31時(shí)，會(huì)在它們的接觸面處因漩渦而產(chǎn)生擴(kuò)散作用，因而這2液將在良好混合之后，才朝流道709下游側(cè)(箭頭方向)流動(dòng)。
圖55表示微小構(gòu)造物組731具備有柱狀構(gòu)造物排列的實(shí)施形態(tài)。此柱狀構(gòu)造物組是平行于混合液體接觸面，且具有垂直于流動(dòng)方向的軸的構(gòu)造，也可為如第55(a)圖所示的圓柱狀，也可為如第55(b)圖所示的三角柱狀。微小構(gòu)造物組731的形狀并無特別的限制，只要當(dāng)合流的液體通過時(shí)，此流動(dòng)將脫離側(cè)壁，并利用此脫離漩渦的擴(kuò)散作用，可迅速進(jìn)行混合便可，可采用所有的形狀。此外，當(dāng)從上游流入核酸試樣時(shí)，此流動(dòng)因?yàn)閷⒓m纏于柱狀構(gòu)造物，因而可進(jìn)行核酸的分子量分離。
圖56表示微小構(gòu)造物組731是在合流部730下游附近，在微流道709壁面設(shè)置規(guī)則幾何形狀的細(xì)溝的實(shí)施形態(tài)。在合流部730合流的液體當(dāng)通過微小構(gòu)造物組731時(shí)，沿各溝產(chǎn)生流道寬度方向的流動(dòng)，而且也從溝緣后面形成脫離漩渦而產(chǎn)生擴(kuò)散作用，這樣便可迅速的混合。
由細(xì)溝所構(gòu)成的微小構(gòu)造物組731，也可為如圖57所示與流動(dòng)方向交叉的網(wǎng)孔狀，也可為如圖58所示設(shè)計(jì)多數(shù)個(gè)獨(dú)立的V字狀溝。如這些圖所示，微小構(gòu)造物組731是在微流道709的下面709a與其上面709b，設(shè)有上述溝排列。這種微小構(gòu)造物組731是采用周知微影技術(shù)等細(xì)微加工技術(shù)便可制得。
液體混合裝置的制造方法本發(fā)明的液體混合裝置是可利用上述技術(shù)領(lǐng)域中，周知的供微芯片制造用的慣用方法進(jìn)行制造。
本發(fā)明的液體混合裝置通常是由2片基板所構(gòu)成，但是也可由單片基板構(gòu)成。當(dāng)微芯片由2片基板構(gòu)成時(shí)，對(duì)單片基板采用微影技術(shù)等細(xì)微加工技術(shù)，便將形成寬度、深度均在10至100μm程度的流道，而對(duì)另一片基板則采用超音波加工等機(jī)械加工，開齒儲(chǔ)存區(qū)用孔。若將這2片基板，采用以熱進(jìn)行熔融接合等粘接技術(shù)進(jìn)行貼合時(shí)，便可獲得在既定位置具有流道與儲(chǔ)存區(qū)的微芯片。
微流道的尺寸(寬度與深度)是根據(jù)所要求的規(guī)格與可能的加工精度而決定。此外，若大于分析對(duì)象物(例如雙鏈核酸)，便容許至1mm。本發(fā)明中可適用的“微流道”尺寸大概為1nm至1000μm，就現(xiàn)況的加工精度而言為1nm至500nm較好，最好為10μm至100μm。
基板的加工是配合圖案寬度、深度，不僅可使用濕式蝕刻處理，也可使用干式蝕刻處理或噴砂加工，當(dāng)然，遮罩也不僅使用光罩，也可使用Ni或Cr等金屬遮罩。例如，微流道是利用微影技術(shù)對(duì)光阻遮罩進(jìn)行圖案化處理之后，可利用HF的10％稀釋液進(jìn)行濕式蝕刻處理形成。流道內(nèi)深度不同的部分則可改變遮罩，并可進(jìn)行多次圖案化處理步驟與蝕刻處理步驟形成。
基板的材料可從玻璃、石英、Pyrex(注冊(cè)商標(biāo))、塑膠、硅、樹脂、金屬之中，配合用途與制造方法進(jìn)行選擇。例如玻璃基板的貼合則可將經(jīng)稀釋為1％的HF溶液，滴在玻璃接合面之后，再將二者對(duì)位重疊并以70kPa的壓力放置60小時(shí)而實(shí)現(xiàn)。另外，接合是可利用熔融接合、利用真空裝置內(nèi)的光束照射而直接接合等方式。
若為塑膠時(shí)，在微芯片的制作方面，可利用噴射成形、模具轉(zhuǎn)印、奈米轉(zhuǎn)印(nanoimprinting)、奈米模板，屬于低成本，很適于大量生產(chǎn)且使用后拋棄。
液體混合裝置的用途本發(fā)明的液體混合裝置是可適用于需要將微少量液體進(jìn)行混合的所有裝置。例如，本發(fā)明可適用于化學(xué)分析或生化分析用，如分析用微芯片之類的微小化學(xué)分析裝置(μTAS)，可將這些裝置的微小量液體混合高速化。此外，化學(xué)合成用的微反應(yīng)器中，靠附加瞬間加熱或冷卻機(jī)構(gòu)而抑制中間反應(yīng)等，也可應(yīng)用于熟知燒杯內(nèi)反應(yīng)所無法達(dá)成的精密化學(xué)方面。
微反應(yīng)器用途之一例有如在將芳香族化合物與高反應(yīng)活性碳陽離子(carbocation)，進(jìn)行混合時(shí)的Friedel Crafts化反應(yīng)中，高產(chǎn)率僅獲得單取代體的裝置。在熟知燒杯內(nèi)的反應(yīng)方面，當(dāng)將三甲氧基苯與亞胺正離子進(jìn)行混合時(shí)，三甲氧基苯的取代率在80％以下，標(biāo)的單取代體的產(chǎn)率在40％以下，副生成物的二取代體產(chǎn)率在30％以上。但是，根據(jù)采用本發(fā)明的微反應(yīng)器，因?yàn)檫@些反應(yīng)體的高效率且可迅速混合，因而三甲氧基苯取代率在90％以上，單取代體產(chǎn)率在90％以上，二取代體的產(chǎn)率在5％以下，可選擇性制造僅有期待的反應(yīng)生成物。結(jié)果，也可減少獲得相同產(chǎn)量所需要的原料與反應(yīng)試劑量。
再者，可使用本發(fā)明的其他用途有如微芯片電泳裝置。在微芯片上進(jìn)行電泳方面，具下述各種優(yōu)點(diǎn)所使用試樣或試劑僅要少量便足夠；縮短反應(yīng)時(shí)間與分析時(shí)間；縮短反應(yīng)與制程處理時(shí)間，提升反應(yīng)效率與生成物產(chǎn)率；廢液少量；以及高產(chǎn)能分析。特別是靠將本發(fā)明的液體混合裝置與方法，使用在為形成變性劑濃度梯度的緩沖液混合方面，將可提供對(duì)DGGE有用的微芯片電泳裝置。
以下，說明使用DGGE將分析對(duì)象物分離的裝置與方法。
相關(guān)DGGE的實(shí)施形態(tài)A實(shí)施形態(tài)A方面，以變性劑濃度梯度朝泳動(dòng)方向連續(xù)變化的方式形成。
本實(shí)施形態(tài)的微芯片電泳裝置是包含有用來導(dǎo)入含不同濃度變性劑的緩沖液的至少2條液體導(dǎo)入用微流道，以及至少2條液體導(dǎo)入用微流道所連接的混合用微流道。借助于從各液體導(dǎo)入用微流道以變動(dòng)的比率所導(dǎo)入的各緩沖液，在上述混合用微流道內(nèi)進(jìn)行合流，便形成上述變性劑的濃度梯度區(qū)域。
再者，較好實(shí)施形態(tài)是具有用來促進(jìn)在混合用微流道內(nèi)所合流的緩沖液間的混合的混合促進(jìn)部件。此混合促進(jìn)部件可使用上述所說明的實(shí)施形態(tài)1-1至2-3的各實(shí)施形態(tài)及它們組合。
實(shí)施形態(tài)A的微芯片電泳裝置圖59a、圖59b、圖59c及圖59d圖是微芯片電泳裝置的基本構(gòu)造示意圖。首先，參照這些說明本實(shí)施形態(tài)的基本概念。
圖59a所示是在一片微芯片801上，含有變性劑濃度梯度形成部802與電泳部804。變性劑濃度梯度形成部802是與電泳部804的濃度梯度區(qū)域流道809相連結(jié)，從變性劑濃度梯度形成部802將含變性劑的泳動(dòng)用緩沖液，供應(yīng)給濃度梯度區(qū)域流道809。電泳部804是包含有濃度梯度區(qū)域流道809與連接于其下游側(cè)的試樣導(dǎo)入部803。一般的處理方式是在濃度梯度形成部802中，將含不同濃度變性劑的緩沖液間以變化的比率進(jìn)行混合，具有依此所獲得的變性劑濃度梯度的緩沖劑區(qū)域，從濃度梯度區(qū)域流道9上游側(cè)，逐次導(dǎo)入下游側(cè)的電泳部804。
試樣導(dǎo)入部803設(shè)置在電泳部804。精制DNA等核酸試樣(以下稱“DNA試樣”)，是從試樣導(dǎo)入部803導(dǎo)入電泳部804的濃度梯度區(qū)域流道809內(nèi)。若DNA試樣導(dǎo)入流道809內(nèi)的變性劑的濃度梯度區(qū)域，則在此DNA試樣中的雙股DNA便利用堿基排列的不同而被分離。
圖59b所示微芯片電泳裝置是在一片微芯片801上包含有變性劑濃度梯度形成部802、試樣導(dǎo)入部803及電泳部804。在電泳部804中，試樣導(dǎo)入部803是以橫切濃度梯度區(qū)域流道809的形態(tài)，與濃度梯度區(qū)域流道809相連結(jié)。在此形態(tài)下，借助于連結(jié)試樣導(dǎo)入部803，便可從電泳部804區(qū)域外(從濃度梯度區(qū)域流道809之外的其他試樣導(dǎo)入流道)，導(dǎo)入DNA試樣，使試樣的導(dǎo)入操作變得容易。
圖59c與圖59d圖所示微芯片電泳裝置，是在一片微芯片801上包含有變性劑濃度梯度形成部802、試樣導(dǎo)入部803及電泳部804，而變性劑濃度梯度形成部802包含有電泳部804，且形成變性劑濃度梯度形成部802兼用電泳部804的構(gòu)造。借助于變性劑濃度梯度形成部802兼用為電泳部804，除可達(dá)微芯片小型化之外，尚不需要使以變性劑濃度梯度802所形成的變性劑的濃度梯度區(qū)域，在電泳部804中進(jìn)行移動(dòng)。
其次，說明上述實(shí)施形態(tài)的各構(gòu)成部分。
以下為了使說明簡單化，就含不同濃度變性劑的緩沖液，說明中使用含變性劑的緩沖液、與不含變性劑的緩沖液(在本說明書中也有僅稱“緩沖液”的情況)的實(shí)施形態(tài)。
在本實(shí)施形態(tài)中，其中一緩沖液含有或不含變性劑并不重要，重要的是緩沖液間的變性劑的相對(duì)濃度差。例如若“不含變性劑的緩沖液”是含有相對(duì)低濃度變性劑，而“含有變性劑的緩沖液”則較“不含變性劑的緩沖液”含有效高濃度變性劑的話，仍可獲得相同的效果。此種實(shí)施形態(tài)也隸屬本發(fā)明的范圍內(nèi)。
圖60是表示圖59a至圖59d圖的裝置中的變性劑濃度梯度形成部802的具體構(gòu)造圖。在圖60的變性劑濃度梯度形成部802中，包含有以一定濃度填充著含變性劑的緩沖液的第1儲(chǔ)存區(qū)805；填充著不含變性劑的緩沖液的第2儲(chǔ)存區(qū)806；通過第1儲(chǔ)存區(qū)805的第1流道807(液體導(dǎo)入微流道)；通過第2儲(chǔ)存區(qū)806的第2流道808(液體導(dǎo)入微流道)；以及第1流道807與第2流道808合流所形成的濃度梯度區(qū)域流道809(混合用微流道)。第1儲(chǔ)存區(qū)805是包含有與第1電源811連接的第1電極810。第2儲(chǔ)存區(qū)806是包含有與第2電源813連接的第2電極812。
在變性劑濃度梯度形成部802中，若透過第1電源811與電極810、及第2電源813與電極812，對(duì)各儲(chǔ)存區(qū)內(nèi)施加電壓，這樣便會(huì)在流道內(nèi)產(chǎn)生電滲透流?？看穗姖B透流，含變性劑的緩沖液便從第1儲(chǔ)存區(qū)805通過第1流道807導(dǎo)入濃度梯度區(qū)域流道809中。同樣的，緩沖液將從第2儲(chǔ)存區(qū)806通過第2流道808，導(dǎo)入流道809中。
如上述，通過控制第1電源811與第2電源813的各電位，便可改變從流道807與流道808所流入各緩沖液的比率。依此在將含變性劑的緩沖液與緩沖液，在濃度梯度區(qū)域流道809上游點(diǎn)(來自流道807與流道808的各緩沖液的合流點(diǎn))，便可以任意比率進(jìn)行混合。為能在流道809內(nèi)形成連續(xù)的變性劑的濃度梯度區(qū)域，通過使第1電源811與第2電源813的各電位進(jìn)行連續(xù)變化，最好使相互合流的2個(gè)緩沖液的流量間比率以一定速度進(jìn)行變化，這樣便可使含變性劑的緩沖液與緩沖液的混合比進(jìn)行連續(xù)式變化。
圖61是表示變性劑濃度梯度形成部802的另一構(gòu)造圖。圖61所示變性劑濃度梯度形成部802，包含有填充著含變性劑的緩沖液的第1儲(chǔ)存區(qū)805；填充著緩沖液的第2儲(chǔ)存區(qū)806；通過第1儲(chǔ)存區(qū)805的第1流道807；通過第2儲(chǔ)存區(qū)806的第2流道808；以及第1流道807與第2流道808合0流所形成的濃度梯度區(qū)域流道809。第1儲(chǔ)存區(qū)805包含有與第1電源811連接的第1電極810，并在其上游側(cè)連接著第1泵814。此外，在第2儲(chǔ)存區(qū)806中包含有與第2電源813連接的第2電極812，在其上游側(cè)則連接著第2泵815。
圖61所示變性劑濃度梯度形成部802，是在圖60所示第1儲(chǔ)存區(qū)805與第2儲(chǔ)存區(qū)806，分別為附加第1泵814與第2泵815的構(gòu)造。此實(shí)施形態(tài)是透過第1泵814與第2泵815所進(jìn)行的液體輸送，便可輔助利用各電滲透流所進(jìn)行的液體輸送，具有即便含變性劑的緩沖液或緩沖液的粘性較高的情況下，仍可對(duì)濃度梯度區(qū)域流道809進(jìn)行適當(dāng)?shù)囊后w導(dǎo)入，以及確實(shí)的形成變性劑濃度梯度的優(yōu)點(diǎn)。
在圖61所示變性劑濃度梯度形成部802中，除第1電源811與第2電源813的各電位控制之外，尚借助于控制第1泵814與第2泵815的流量，便從第1儲(chǔ)存區(qū)805將含變性劑的緩沖液通過第1流道807導(dǎo)入流道809，同樣的，從第2儲(chǔ)存區(qū)806將緩沖液通過第2流道808導(dǎo)入流道809中。依此便可將含變性劑的緩沖液與緩沖液，在濃度梯度區(qū)域流道809的上游點(diǎn)(來自流道807與流道808的各緩沖液的合流點(diǎn))中，以任意比率進(jìn)行混合。為能在流道809內(nèi)形成連續(xù)的變性劑的濃度梯度區(qū)域，通過使第1電源811與第2電源813的各電位進(jìn)行連續(xù)式變化，最好使相互合流的2種緩沖液的流量間比率以一定速度進(jìn)行變化，由此便可使含變性劑的緩沖液與緩沖液的混合比進(jìn)行連續(xù)式變化。第1泵814與第2泵815也可如圖61所示，分別連接于第1儲(chǔ)存區(qū)與第2儲(chǔ)存區(qū)，也可設(shè)置在第1流道807與第2流道808上。
圖62是表示圖59b與圖59d圖的裝置中的試樣導(dǎo)入部803的具體構(gòu)造。圖62所示的試樣導(dǎo)入部803是包含有填充著DNA試樣的第3儲(chǔ)存區(qū)816；供所排放出的DNA試樣廢液用的第4儲(chǔ)存區(qū)817；通過第3儲(chǔ)存區(qū)816的第4流道818；以及通過第4儲(chǔ)存區(qū)817的第5流道819。第4流道818與第5流道819是與流道809交叉并相連接，因此第4流道818與第5流道819相連通。此外，在第3儲(chǔ)存區(qū)816上連接著第3電極820，且在第3電極820上連接著第3電源821。另外，在第4儲(chǔ)存區(qū)817上連接著第4電極822，且在第4電極822上連接著第4電源823。
在試樣導(dǎo)入部803中，通過控制第3電源821與第4電源823的各電位，進(jìn)行DNA試樣的供應(yīng)。DNA試樣是靠第3電源821與第4電源823的電位控制所產(chǎn)生的電滲透流與電泳力，而從第3儲(chǔ)存區(qū)816通過流道818、819，輸送給第4儲(chǔ)存區(qū)817。在此程序中，DNA試樣是導(dǎo)入于第4流道818與第5流道819在流道809上的交點(diǎn)，其次再對(duì)流道809兩端施加電壓。通過對(duì)流道809內(nèi)施加電壓，便僅將導(dǎo)入于流道818、819交點(diǎn)的DNA試樣斷片，導(dǎo)入于流道809內(nèi)。在流道809內(nèi)因?yàn)榫哂蠨NA變性劑的濃度梯度，因而導(dǎo)入于其中的DNA試樣便可在濃度梯度內(nèi)進(jìn)行電泳式分離。
圖63是表示圖59b裝置的一實(shí)施形態(tài)。在電泳部804中，在流道809下游側(cè)設(shè)置廢液用第5儲(chǔ)存區(qū)824。第5儲(chǔ)存區(qū)824是包含有與第5電源826連接的第5電極825。在流道809上游側(cè)，包含有如參照?qǐng)D60所說明的變性劑濃度梯度形成部802，以及如參照?qǐng)D62所說明的試樣導(dǎo)入部803。第1至第5電源也可適當(dāng)?shù)墓灿谩?br> 在圖63的實(shí)施形態(tài)中，借助于具有由變性劑濃度梯度形成部2所形成變性劑濃度梯度的緩沖劑流，導(dǎo)入于流道809內(nèi)，便在流道809內(nèi)產(chǎn)生變性劑的濃度梯度區(qū)域流動(dòng)(移動(dòng))。從試樣導(dǎo)入部803將DNA試樣導(dǎo)入在此變性劑的濃度梯度區(qū)域上。在此，從上游側(cè)導(dǎo)入流道809的變性劑的濃度梯度區(qū)域，是借助于在變性部濃度梯度形成部802與流道809內(nèi)所產(chǎn)生的電滲透流，朝下游方向移動(dòng)。另一方面，經(jīng)導(dǎo)入于流道809內(nèi)的DNA試樣，是借助于以在變性劑濃度梯度形成部802與流道809內(nèi)所產(chǎn)生的電滲透流而朝下游的移動(dòng)量，以及利用DNA試樣本身的負(fù)電荷所產(chǎn)生的電泳而朝上游的移動(dòng)量的總和，進(jìn)行移動(dòng)。DNA試樣的正電荷移動(dòng)量是較朝變性劑的濃度梯度區(qū)域下游方向的移動(dòng)量，僅減少因DNA試樣本身的負(fù)電荷所產(chǎn)生的朝上游的電泳部分。在此若經(jīng)過充分時(shí)間，DNA試樣便可到達(dá)位于上游的變性劑的濃度梯度區(qū)域。所以，利用既定時(shí)間的泳動(dòng)，DNA試樣中附有GC箝位(clamp)的雙股DNA斷片，將依存于堿基排列的不同與變性劑濃度梯度，并利用變性劑濃度梯度凝膠電泳(DGGE)，在流道809的移動(dòng)方向上分離。
本實(shí)施形態(tài)的DGGE原理是利用借助于尿素、甲酰胺等DNA變性劑，而中和核酸堿基的電荷，因而核苷酸(nucleotide)間的氫鍵將被切斷，雙股DNA將解離為單股DNA的現(xiàn)象。DNA試樣是包含有在其一端附加DNA變性劑濃度較高且較不易解離為單股DNA的人工DNA排列(GC箝位)，并經(jīng)PCR放大的雙股DNA。在已形成DNA變性劑濃度梯度的凝膠中，若對(duì)附有GC箝位的雙股DNA進(jìn)行電泳，便在某變性劑濃度中，未附有GC箝位側(cè)的雙股DNA將解離為單股DNA，此雙股DNA的移動(dòng)速度將降低。因?yàn)殡p股DNA解離為單股DNA的變性劑濃度，依存于其堿基排列，因而在相同濃度梯度區(qū)域上，若具有不同堿基排列的雙股DNA進(jìn)行泳動(dòng)，則在移動(dòng)距離上便將產(chǎn)生差異。依此，便可將雙股DNA利用堿基排列的不同而分離。
圖64是表示圖59b裝置的實(shí)施形態(tài)。圖64所示電泳部804是包含有廢液用第5儲(chǔ)存區(qū)824以及通過第5儲(chǔ)存區(qū)824的流道809。第5儲(chǔ)存區(qū)824是包含有與第5電源826連接的第5電極825。此實(shí)施形態(tài)是在其上游側(cè)包含有如參照?qǐng)D61所說明的變性劑濃度梯度形成部802，以及參照?qǐng)D62所說明的試樣導(dǎo)入部803。
在圖64的實(shí)施形態(tài)中，借助于具有由變性劑濃度梯度形成部802所形成的變性劑濃度梯度的緩沖劑流動(dòng)(移動(dòng))，導(dǎo)入于流道809內(nèi)，便將在流道809內(nèi)產(chǎn)生變性劑濃度梯度流。從試樣導(dǎo)入部803將DNA試樣導(dǎo)入在此變性劑的濃度梯度區(qū)域內(nèi)。在此，變性劑的濃度梯度區(qū)域是利用第1電源811與第2電源813的電位而施加于電滲透流，并靠第1泵814與第2泵815的驅(qū)動(dòng)，在流道809內(nèi)朝下游移動(dòng)。另一方面，經(jīng)導(dǎo)入于流道809中的DNA試樣，是利用以第1泵814、第2泵815、以及第1電源811與第2電源813的電位所產(chǎn)生的電滲透流而朝下游移動(dòng)，以及利用DNA試樣本身的負(fù)電荷所產(chǎn)生的電泳而朝上游移動(dòng)的總和，進(jìn)行移動(dòng)。DNA試樣的正電荷移動(dòng)量是與朝變性劑的濃度梯度區(qū)域下游方向的移動(dòng)量相比較，僅減少因DNA試樣本身負(fù)電荷所產(chǎn)生的朝上游的電泳部分。在此若經(jīng)過充分時(shí)間，DNA試樣便可到達(dá)位于上游的變性劑的濃度梯度區(qū)域。所以，利用既定時(shí)間泳動(dòng)，DNA試樣中的附有GC箝位的雙股DNA斷片，將依存于堿基排列的不同與變性劑濃度梯度，并利用變性劑濃度梯度凝膠電泳(DGGE)，在流道9移動(dòng)方向上分離。
在本實(shí)施形態(tài)微芯片電泳裝置的流道與儲(chǔ)存區(qū)中，填充著含有高分子基質(zhì)的緩沖液，這是因?yàn)榻柚诟叻肿踊|(zhì)的網(wǎng)孔構(gòu)造或高分子基質(zhì)與DNA間的相互作用，便可將DNA分離的緣故。可使用于本實(shí)施形態(tài)中的高分子基質(zhì)可從聚丙烯酰胺，羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、氧化纖維素、甲基纖維素等的纖維素衍生物；聚環(huán)氧乙烷，聚亞甲基甘醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮等的多元醇類；聚葡萄糖、聚三葡萄糖等之中適當(dāng)選擇。當(dāng)高分子基質(zhì)為羥乙基纖維素時(shí)，依存于雙股DNA長度，最好在0.01％至3.0％的濃度范圍內(nèi)。這種緩沖液的例子有如三醋酸緩沖液、三硼酸緩沖液等。
在本實(shí)施形態(tài)中便于使用的的DNA變性劑，是可從尿素、甲酰胺、甲醛、氫氧化鈉等的強(qiáng)堿等的中適當(dāng)選擇。最好為尿素與甲酰胺。當(dāng)將甲酰胺與尿素用作變性劑時(shí)，一般是將含7M尿素、40％甲酰胺的含變性劑的緩沖液，當(dāng)作含100％變性劑的緩沖液，而將不含變性劑的緩沖液設(shè)為0％緩沖液。一般當(dāng)在60℃中進(jìn)行泳動(dòng)時(shí)，變性劑濃度梯度是在0％至100％或20％至70％的范圍內(nèi)，但是當(dāng)采用16S rRNA基因的微生物組聚構(gòu)造解析時(shí)，最好為35％至55％。
本實(shí)施形態(tài)中可被分析的DNA試樣，可采用如從人類血液、細(xì)胞等之類的生物試樣，或食品、土壤、河水、海水等天然試樣，或活性污泥、甲烷發(fā)酵污泥等所萃取出的雙股DNA。所萃取的染色體組DNA的既定區(qū)域利用PCR反應(yīng)等，便可采用在其一端附加DNA變性劑濃度較高且較難解離為單股DNA的人工DNA排列(GC箝位)，并經(jīng)放大的雙股DNA。
本實(shí)施形態(tài)的DNA檢測手段是選擇自螢光檢測、發(fā)光檢測、吸光檢測、電化學(xué)檢測等。在螢光檢測方面有預(yù)先將PCR反應(yīng)的引物進(jìn)行螢光標(biāo)識(shí)的方法，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行螢光標(biāo)識(shí)的方法，預(yù)先將PCR產(chǎn)物利用DNA染色劑進(jìn)行染色的方法，以及使含高分子基質(zhì)的緩沖液含有DNA染色劑，并在電泳中進(jìn)行染色的方法等。螢光標(biāo)識(shí)物質(zhì)有螢光(fluorescence)、玫紅染劑(rhodamine)、Cy3、Cy5、BODIPYFL、TexasRed、Alexa Flour等。DNA染色劑有如SYBR Green、VistraGreen、溴化乙錠、YOYO-1、TOTO-1、thiazole orange等。檢測器是當(dāng)為螢光檢測、發(fā)光檢測、吸光檢測時(shí)，可使用光電倍增管(photomultiplier tube PMT)、UV檢測器、光電二極管檢測器等。
其次，針對(duì)采用本實(shí)施形態(tài)微芯片電泳裝置的分析，參照?qǐng)D63例示其操作順序的一個(gè)例子描述如下。
通過第1儲(chǔ)存區(qū)805、第2儲(chǔ)存區(qū)806、第3儲(chǔ)存區(qū)816、第4儲(chǔ)存區(qū)817、或第5儲(chǔ)存區(qū)824中的任一存儲(chǔ)區(qū)，并在第1流道807、第2流道808、第3流道809、第4流道818及第5流道819內(nèi)，填充著含高分子基質(zhì)的緩沖液。因毛細(xì)管現(xiàn)象而無法填充時(shí)，可利用注射器等施加壓力而進(jìn)行填充。
上述緩沖液填充之后，便在第1儲(chǔ)存區(qū)805中填充含變性劑的緩沖液，在第2儲(chǔ)存區(qū)806、第4儲(chǔ)存區(qū)817、第5儲(chǔ)存區(qū)824中填充緩沖液，在第3儲(chǔ)存區(qū)816中填充DNA試樣。在第4儲(chǔ)存區(qū)817與第5儲(chǔ)存區(qū)824中，依情況可填充不含變性劑的緩沖液。所使用的緩沖液與DNA試樣，最好全部含有高分子基質(zhì)。DNA試樣、第4儲(chǔ)存區(qū)817及第5儲(chǔ)存區(qū)824中所填充的緩沖液，可不含有高分子基質(zhì)。
其次，將第1電極810、第2電極812、第3電極820、第4電極822及第5電極825，分別插入于第1儲(chǔ)存區(qū)805、第2儲(chǔ)存區(qū)806、第3儲(chǔ)存區(qū)816、第4儲(chǔ)存區(qū)817及第5儲(chǔ)存區(qū)824中。其中，這些電極也可預(yù)先分別形成于第1儲(chǔ)存區(qū)805、第2儲(chǔ)存區(qū)806、第3儲(chǔ)存區(qū)816、第4儲(chǔ)存區(qū)817及第5儲(chǔ)存區(qū)824之內(nèi)部。
然后，將第5電極825接地，對(duì)第1電極810與第2電極811施加既定電位，并將既定濃度的變性劑的緩沖液導(dǎo)入流道809中。此時(shí)，最好對(duì)第3電極820與第4電極822施加既定電位，在第4流道818與第5流道819中不致流入緩沖液。
其次，如果當(dāng)由第4流道818與第5流道819所產(chǎn)生的電滲透流速度，大于雙股DNA的電泳速度時(shí)，便將第4電極822接地，并對(duì)第3電極820施加既定電壓，且將DNA試樣導(dǎo)入于流道809、第4流道818及第5流道819的交點(diǎn)。反之，當(dāng)由第4流道818與第5流道819所產(chǎn)生的電滲透流速度，小于雙股DNA的電泳速度時(shí)，便將第3電極820接地，并對(duì)第4電極822施加既定電壓。不管何種情況，均最好以第3流道809中未流入DNA試樣的方式，對(duì)第1電極810、第2電極812及第5電極825施加既定電位。
其次，將第5電極825接地，并使對(duì)第1電極810與第2電極812所施加的電壓進(jìn)行連續(xù)式變化，而將具有既定變性劑濃度梯度的區(qū)域?qū)肓鞯?09中。與此同時(shí)，在此流道809與第4流道818、819的交點(diǎn)處，DNA試樣將被導(dǎo)入具有上述變性劑的濃度梯度區(qū)域的流道809上。此時(shí)，最好以第4流道818與第5流道819中不致流入緩沖液的方式，對(duì)第3電極820與第4電極822施加既定電位。對(duì)第1電極810與第2電極812施加電位的變動(dòng)順序，是最先將第2電極812的電位設(shè)為大于第1電極810的電位，然后逐漸將第2電極812電位減小，接著再將第1電極810電位變大。結(jié)果，經(jīng)導(dǎo)入于流道809中的變性劑的濃度梯度區(qū)域，便形成在下游時(shí)變性劑濃度較薄，越往上游則越濃的狀態(tài)。
通過上述的操作，將DNA試樣中的雙股DNA，在變性劑的濃度梯度區(qū)域中進(jìn)行分離，在分離過程中或分離之后，便利用朝流道9所設(shè)置的DNA檢測器進(jìn)行檢測。DNA檢測可在流道9中的任何地方實(shí)施。在分析中，微芯片必須保持一定溫度，最好為40℃至70℃。
具有混合促進(jìn)部件的實(shí)施形態(tài)A的微芯片電泳裝置可將實(shí)施形態(tài)1-1至2-3各實(shí)施形態(tài)中所說明的混合促進(jìn)部件，使用于上述實(shí)施形態(tài)A的微芯片電泳裝置。當(dāng)在微芯片電泳裝置中使用混合促進(jìn)部件時(shí)，導(dǎo)入緩沖液用的微流道807、808便為液體導(dǎo)入用微流道，而濃度梯度形成區(qū)域的流道809則為混合用微流道，在流道9內(nèi)的緩沖液混合則使用混合促進(jìn)部件。此外，輸送緩沖液用的各儲(chǔ)存區(qū)是液體導(dǎo)入用微流道的液體導(dǎo)入口或?qū)氩俊?br> 再者，混合促進(jìn)部件也具有形成濃度梯度的作用。例如通過利用實(shí)施形態(tài)1-1與1-2施行流量的獨(dú)立控制手段(例如利用調(diào)整賦予電位或施加電壓而控制電滲透流、利用微量注射針調(diào)節(jié)壓力而進(jìn)行液體輸送泵的控制、或利用它們對(duì)液體驅(qū)動(dòng)進(jìn)行2次調(diào)節(jié)的閥控制)，便可將從微流道807、808所導(dǎo)入的緩沖液比率進(jìn)行任意變化，同時(shí)增加所合流緩沖液的接觸面。通過接觸面的增加，將促進(jìn)利用緩沖液間的分子擴(kuò)散而進(jìn)行的混合，所以便可在流道809內(nèi)朝流道寬度方向，迅速形成均勻的濃度梯度。此技術(shù)將可提供對(duì)DEEG有用的微芯片裝置，可達(dá)到DEEG分析時(shí)間的縮短化與高產(chǎn)能化的效果。
圖65至圖68是表示設(shè)有高速閥832的上述實(shí)施形態(tài)A的裝置。如這些圖所示，例如可在第1流道807上設(shè)置高速動(dòng)作閥832。在此變性劑濃度梯度形成部802中，若通過第1電源811與電極810、及第2電源813與電極812，對(duì)各儲(chǔ)存區(qū)內(nèi)施加電壓，利用依此所產(chǎn)生的電滲透流，便從第1儲(chǔ)存區(qū)805將含變性劑的緩沖液，通過第1流道807導(dǎo)入于濃度梯度區(qū)域流道809中，同樣的，從第2儲(chǔ)存區(qū)806將不含變性劑的緩沖液，通過第2流道7導(dǎo)入于流道809中。此時(shí)，通過控制高速動(dòng)作閥832的開閉動(dòng)作，便可使來自第1儲(chǔ)存區(qū)805的含變性劑的緩沖液，相對(duì)于來自第2儲(chǔ)存區(qū)806的一定流量緩沖液的混合比率，進(jìn)行任意的變化。通過使高速動(dòng)作閥832的開閉時(shí)間連續(xù)變化，便可形成連續(xù)的濃度梯度。
相關(guān)DGGE的實(shí)施形態(tài)B實(shí)施形態(tài)B的DGGE法是將含不同濃度變性劑的緩沖液區(qū)域(泳動(dòng)凝膠)，沿泳動(dòng)方向交互配置，并將分析對(duì)象物導(dǎo)入于濃度梯度區(qū)域進(jìn)行電泳。
實(shí)施形態(tài)B的微芯片電泳裝置，是在微流道內(nèi)將含不同濃度變性劑的緩沖液區(qū)域沿泳動(dòng)方向交互配置，并將分析對(duì)象物導(dǎo)入于上述濃度梯度區(qū)域中進(jìn)行電泳。
(1)本實(shí)施形態(tài)的原理以實(shí)施形態(tài)B所進(jìn)行的雙鏈核酸的分離方法，特征在于將含不同濃度變性劑的至少2個(gè)緩沖液區(qū)域，朝核酸的泳動(dòng)方向進(jìn)行交互配置。核酸是靠在此種變性劑濃度的不連續(xù)配置構(gòu)造中電泳式移動(dòng)而分離。參照傳統(tǒng)的DGGE法說明此原理。
DGGE原理是在已形成尿素、甲酰胺等核酸變性劑濃度梯度的凝膠中，這些核酸變性劑是通過將泳動(dòng)的雙鏈核酸的核酸堿基電荷進(jìn)行中和，而切斷核苷酸間的氫鍵，利用雙鏈核酸解離為單股核酸的現(xiàn)象。具體而言，將泳動(dòng)的核酸斷片，在其一端附加核酸變性劑濃度較高且不易解離為單股核酸的人工核酸排列(GC箝位)，進(jìn)行PCR放大而調(diào)制成雙鏈核酸，并對(duì)所調(diào)制的雙鏈核酸進(jìn)行電泳。此時(shí)，在某變性劑濃度中，未附有GC箝位側(cè)的雙鏈核酸將解離為單股核酸，移動(dòng)速度將變小。雙鏈核酸解離為單股核酸的變性劑濃度，因?yàn)橐来嬗陔p鏈核酸的堿基排列，所以便可將各種雙鏈核酸配合堿基排列的不同而進(jìn)行分離。即，DGGE巧妙的利用雙鏈核酸解離所需要的變性劑濃度的堿基排列依存性。具不同堿基排列的雙鏈核酸，乃以堿基排列而變?yōu)槿菀捉怆x的變性劑濃度不同。所以，這些雙鏈核酸是若在變性劑濃度具梯度的凝膠中進(jìn)行電泳的話，在變性劑濃度梯度上將逐漸在解離狀態(tài)產(chǎn)生差異，而實(shí)現(xiàn)它們的分離。
此變性劑濃度的堿基排列依存性，可認(rèn)為與變性劑中的尿素、甲酰胺等變性劑分子，作用于雙鏈核酸氫鍵部位的頻度不同的關(guān)聯(lián)性，此現(xiàn)象可說明如下。換句話說，將具某堿基排列的雙鏈核酸氫鍵部分切斷時(shí)，必須對(duì)此部分的雙鏈核酸的氫鍵部位，使變性劑分子以某臨限值以上的頻度產(chǎn)生作用。此外，在將雙鏈核酸某部分的氫鍵切斷的反應(yīng)中，需要有限的反應(yīng)時(shí)間。對(duì)此氫鍵部位，必須以至少較所需反應(yīng)時(shí)間更長的時(shí)間，使變性劑分子產(chǎn)生作用。此有限的反應(yīng)時(shí)間也可認(rèn)為依存于堿基排列。
根據(jù)上述想法，本發(fā)明人便除核酸與變性劑分子間的反應(yīng)頻度臨限值之外，也著眼于它們反應(yīng)時(shí)間的臨限值，針對(duì)雙鏈核酸的分離方法進(jìn)行探討。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在未使變性劑濃度連續(xù)變化的情況下，使反應(yīng)頻度變化，便可分離雙鏈核酸。本分離方法是利用切斷雙鏈核酸的氫鍵所需要的反應(yīng)頻度與反應(yīng)時(shí)間臨限值，隨堿基排列而不同的方法，且關(guān)于在電泳方向排列著含不同濃度變性劑的緩沖液區(qū)域的方法。具體而言，使含高濃度變性劑的緩沖液區(qū)域及/或不含變性劑或含較低濃度的緩沖液區(qū)域的“長度(泳動(dòng)方向距離)”在泳動(dòng)方向進(jìn)行變化，在此各緩沖液區(qū)域，乃配置呈在泳動(dòng)方向與變性劑分子間的反應(yīng)頻度或/及反應(yīng)時(shí)間(含高濃度變性劑的緩沖液區(qū)域的通過時(shí)間)，逐漸上升的狀態(tài)。若在如上述所配置的緩沖液區(qū)域上，使雙鏈核酸進(jìn)行泳動(dòng)，發(fā)現(xiàn)可將它們根據(jù)堿基排列的不同而分離。
實(shí)施形態(tài)B并不需要在各緩沖液區(qū)域內(nèi)形成變性劑濃度連續(xù)變化的梯度。形成含既定濃度變性劑的緩沖液區(qū)域的2維分布梯度，且形成越朝泳動(dòng)方向下游，變性劑分布越密的狀態(tài)。
如上述，本實(shí)施形態(tài)乃關(guān)于形成變性劑濃度不連續(xù)的配置構(gòu)造。
本實(shí)施形態(tài)所使用的用語“變性劑濃度不連續(xù)配置構(gòu)造”或“含不同變性劑的緩沖液區(qū)域的排列”，是指變性劑濃度不同的至少2個(gè)緩沖液區(qū)域交互排列的構(gòu)造。
本實(shí)施形態(tài)中所使用的用語“緩沖液區(qū)域”是指含一定濃度緩沖液的凝膠等電泳用基質(zhì)。
以下為求說明的簡單化，便針對(duì)含變性劑的緩沖液區(qū)域與不含變性劑的緩沖液區(qū)域交互配置(以下稱“變性劑間歇配置”)進(jìn)行說明。但是，各緩沖液區(qū)域是否含有或不含有變性劑并非重要，重要的是變性劑的相對(duì)濃度差。例如若“不含變性劑的區(qū)域”為含有相對(duì)低濃度變性劑，而“含變性劑的區(qū)域”則較“不含變性劑的區(qū)域”含有較高濃度變性劑的話，仍可獲得相同的效果。此種實(shí)施形態(tài)也隸屬本發(fā)明的范圍內(nèi)。
較好實(shí)施形態(tài)乃雙股的核酸是配合其移動(dòng)距離，盡量使與變性劑分子間的反應(yīng)頻度呈逐漸增加的狀態(tài)，或與變性劑分子間的反應(yīng)時(shí)間逐漸增長的狀態(tài)。在此較好實(shí)施形態(tài)中，使用在泳動(dòng)方向長度逐漸變化的含變性劑的緩沖液區(qū)域及/或不含變性劑的緩沖液區(qū)域的排列。
利用上述緩沖液區(qū)域面排列所進(jìn)行的分離原理，可說明如下。以圖69實(shí)施形態(tài)(后述第1實(shí)施形態(tài))為例進(jìn)行說明。如圖82所示，當(dāng)在泳動(dòng)方向縮短含變性劑的緩沖液區(qū)域間隔時(shí)，橫跨其排列圖案進(jìn)行泳動(dòng)的各核酸，在移動(dòng)距離較小處(上游區(qū)域)，在時(shí)間t內(nèi)，接觸含變性劑的緩沖液的時(shí)間比率A較小。然后，在移動(dòng)距離較大處(下游區(qū)域)，在相同時(shí)間t內(nèi)，接觸含變性劑的緩沖液的時(shí)間比率B將變大。換句話說，若在上游與下游的核酸移動(dòng)度并無有效差，且通過含變性劑的緩沖液各區(qū)域的時(shí)間Δt相同的話，在相同長度的時(shí)間t內(nèi)，核酸接觸含變性劑的緩沖液的時(shí)間比率，將依存于所通過的含變性劑的緩沖液區(qū)域數(shù)量，將成立A＜B的關(guān)系。依此，核酸便以其移動(dòng)距離(移動(dòng)時(shí)間)，在同一時(shí)間t內(nèi)，接觸含變性劑的緩沖液的時(shí)間比率(即反應(yīng)頻度)將逐漸增加。隨接觸時(shí)間比率的逐漸增加，雙鏈核酸便配合堿基排列的不同，在超過不同反應(yīng)臨限值的時(shí)候便解離，結(jié)果便分別具有固有移動(dòng)度(移動(dòng)距離)。所以，利用含變性劑區(qū)域的間歇配置，便可獲得如同利用連續(xù)形成變性劑濃度梯度時(shí)相同的分離效果。
圖69是表示變性劑間歇配置的第1實(shí)施形態(tài)。此實(shí)施形態(tài)是將核酸泳動(dòng)方向上含變性劑的緩沖液的各區(qū)域長度，設(shè)為大致一定，并將不含變性劑的緩沖液的各區(qū)域逐漸縮短的變性劑間歇配置。即，含變性劑的緩沖液間的間隔(不含變性劑的緩沖液區(qū)域的寬度)，將隨核酸泳動(dòng)方向變狹窄。在此實(shí)施形態(tài)中，若使核酸在變性劑間歇配置上進(jìn)行移動(dòng)，便將交叉通過含變性劑的緩沖液與不含變性劑緩沖液。在此，核酸通過各含變性劑的緩沖液區(qū)域所需時(shí)間，是設(shè)定為充分小于以堿基排列不同所引起解離的反應(yīng)時(shí)間差。然后，隨核酸將越往下游，因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間內(nèi)通過含變性劑的緩沖液的頻度將增加(即反應(yīng)頻度將增加)，便較容易解離為雙股。所以，具有雙股鍵結(jié)合較不穩(wěn)定堿基排列的核酸，將在變性劑間歇配置上含變性劑的緩沖液區(qū)域密度較小的地方(上游區(qū)域)進(jìn)行解離，但是具有雙股鍵結(jié)合較穩(wěn)定堿基排列的核酸，則將在含變性劑的緩沖液區(qū)域密度較大的地方(下游區(qū)域)進(jìn)行解離。此實(shí)施形態(tài)是利用含變性劑的緩沖液區(qū)域的排列密度變化(通過頻度的變化)。
圖70是表示變性劑間歇配置的第2實(shí)施形態(tài)。此實(shí)施形態(tài)是將核酸泳動(dòng)方向上不含變性劑的緩沖液的各區(qū)域長度，設(shè)為大致一定，并將含變性劑的緩沖液的各區(qū)域逐漸變長的變性劑間歇配置。在此實(shí)施形態(tài)中，也是核酸通過適當(dāng)數(shù)量含變性劑的緩沖液區(qū)域所需時(shí)間，小于以堿基排列不同所引起解離反應(yīng)時(shí)間之差。泳動(dòng)的核酸是利用通過各含變性劑的緩沖液區(qū)域的時(shí)間，是否已達(dá)堿基排列解離所需的反應(yīng)時(shí)間，而有不同的解離程度。此外，隨核酸將越往下游，因?yàn)橥ㄟ^含變性劑的緩沖液的時(shí)間將變長，因而雙股便較容易解雜。因而，若核酸的雙股屬于不穩(wěn)定，在變性劑間歇配置的上游區(qū)域?qū)⒔怆x，但是若屬于穩(wěn)定，則將在更下游區(qū)域中解離。此實(shí)施形態(tài)是利用依存于各個(gè)含變性劑的緩沖液區(qū)域的長度(泳動(dòng)方向?qū)挾?的持續(xù)作用(在一個(gè)排列中的反應(yīng)時(shí)間)變化。
另外，核酸通過含變性劑的緩沖液所需的時(shí)間，是依含變性劑的緩沖液的長度與核酸泳動(dòng)速度而決定。此外，核酸通過含變性劑的緩沖液的頻度，是依緩沖液長度與核酸的泳動(dòng)速度而決定。所以，通過適當(dāng)?shù)倪x擇含變性劑的緩沖液區(qū)域的長度、不含變性劑的緩沖液區(qū)域的長度、核酸泳動(dòng)速度、含變性劑的緩沖液的變性劑濃度、變性劑間歇配置的整體長度等，便可將各種雙鏈核酸根據(jù)堿基排列的不同，進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x。這些參數(shù)是根據(jù)所分析的核酸種類、所要求的精度等的不同而不同。它們也可依據(jù)事前所實(shí)施的預(yù)備實(shí)驗(yàn)而決定。例如，為了控制雙鏈核酸的分離，可調(diào)節(jié)含變性劑的緩沖液區(qū)域的長度或濃度。例如如果縮短含變性劑的緩沖液區(qū)域的長度，核酸通過含變性劑的緩沖液區(qū)域的時(shí)間便將縮短，從而可進(jìn)行精度佳的檢測。如果將含變性劑的緩沖液區(qū)域的變性劑濃度變稀薄，便可進(jìn)行精度高的檢測。依據(jù)此，為控制分離精度，便可將含變性劑的緩沖液區(qū)域的長度、不含變性劑的緩沖液區(qū)域的長度、核酸泳動(dòng)速度、含變性劑的緩沖液的變性劑濃度、變性劑間歇配置的整體長等，配合需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。
變性劑間歇配置的第1實(shí)施形態(tài)僅改變不含變性劑的緩沖液各區(qū)域的長度，而第2實(shí)施形態(tài)則僅改變含變性劑的緩沖液各區(qū)域的長度，但是并不僅限于這些，也可不含變性劑的緩沖液各區(qū)域與含變性劑的緩沖液各區(qū)域雙方的長度均改變并配置。
當(dāng)本實(shí)施形態(tài)在微芯片上實(shí)施時(shí)，就不需要濃度梯度形成區(qū)域上游點(diǎn)的緩沖液間的混合操作(如實(shí)施形態(tài)A，當(dāng)形成變性劑連續(xù)梯度時(shí)，將要求分析晶片上的混合)的點(diǎn)而言，乃屬較好狀況。此外，就不需要促進(jìn)此種分析晶片上混合的手段的點(diǎn)而言，乃屬較好狀況。
本實(shí)施形態(tài)中所使用的緩沖液，是含有配合需要的高分子基質(zhì)的緩沖液。這是因?yàn)槔酶叻肿踊|(zhì)的網(wǎng)孔構(gòu)造或高分子基質(zhì)與核酸間的相互作用，便可將核酸分離的緣故所致。
本實(shí)施形態(tài)可使用的高分子基質(zhì)，可從聚丙烯酰胺、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、氧化纖維素、甲基纖維素等纖維素衍生物；聚環(huán)氧乙烷、聚亞甲基甘醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮等多元醇類；聚葡萄糖、聚三葡萄糖等之中適當(dāng)選擇。當(dāng)高分子基質(zhì)為羥乙基纖維素時(shí)，便依存于雙股DNA的長度，最好在0.01％至3.0％的濃度范圍內(nèi)。使此高分子基質(zhì)含于三醋酸緩沖液、三硼酸緩沖液等之中，并當(dāng)作緩沖液使用。但是，也可在既成的平板凝膠中，通過注入緩沖液而形成緩沖液區(qū)域的排列。在已經(jīng)形成高分子基質(zhì)網(wǎng)孔構(gòu)造的凝膠方面，可使用不含有高分子基質(zhì)的緩沖液。
本實(shí)施形態(tài)中所使用的變性劑，可從尿素、甲酰胺、甲醛及氫氧化鈉等強(qiáng)堿等之中選擇。最好使用尿素與甲酰胺。當(dāng)將甲酰胺與尿素使用為變性劑時(shí)，一般乃將含有7M尿素、40％甲酰胺的含變性劑的緩沖液，當(dāng)作含100％變性劑的緩沖液使用，而將不含變性劑的緩沖液當(dāng)作0％緩沖液使用，但并不僅限于此。如上述，在實(shí)施形態(tài)B中，僅要可形成具有效濃度差的變性劑的緩沖液區(qū)域排列的話便可。
本實(shí)施形態(tài)的分析對(duì)象物代表而言，有如經(jīng)隔離的雙鏈核酸(也涵蓋僅稱“核酸”或“核酸分子”的情況)，在具有利用變性劑而解離的性質(zhì)的前提下，可使用任何形式的核酸分子。典型而言，可采用將從如人類血液、細(xì)胞等之類的生物試樣，如食品、土壤、河水、海水等天然試樣，或活性污泥、甲烷酸污泥等之中，所萃取出染色體組核酸的既定區(qū)域，利用PCR反應(yīng)等，而在一端附加核酸變性劑濃度較高，且不易解離為單股核酸的人工核酸排列(GC箝位)，并經(jīng)放大的雙鏈核酸。另外，本實(shí)施形態(tài)的分析對(duì)象物未必僅限于核酸。例如若通過選擇適當(dāng)?shù)木彌_液、變性劑及分離條件等，便可進(jìn)行電泳的話，此種生物高分子(例如蛋白質(zhì))，也可涵蓋在本實(shí)施形態(tài)的分析對(duì)象物中。
在本實(shí)施形態(tài)的變性劑間歇配置上進(jìn)行分離的核酸，將采用檢測手段進(jìn)行檢測。檢測手段是從螢光檢測、發(fā)光檢測、吸光檢測、電化學(xué)的檢測等之中選擇，而檢測器當(dāng)為螢光檢測、發(fā)光檢測，吸光檢測時(shí)則使用光電倍增管、UV檢測器、光電二極管檢測器等。螢光檢測有如預(yù)先將PCR反應(yīng)的引物進(jìn)行螢光標(biāo)識(shí)的方法、將PCR產(chǎn)物進(jìn)行螢光標(biāo)識(shí)的方法、預(yù)先將PCR產(chǎn)物利用DNA染色劑進(jìn)行染色的方法，以及使含高分子基質(zhì)緩沖液中含有DNA染色劑，并在電泳中進(jìn)行染色的方法等。螢光標(biāo)識(shí)物質(zhì)有如螢光、玫紅染劑、Cy3、Cy5、BODIPY FL、TexasRed、Alexa Fluor等。DNA染色劑有如SYBRGreen、Vistra Green、溴化乙錠、YOYO-1、TOTO-1、thiazole orange等。
(2)本實(shí)施形態(tài)的分離方法與裝置供執(zhí)行本實(shí)施形態(tài)核酸分離的支撐體，可舉例如平板凝膠或電泳用微芯片等分析基板。
本實(shí)施形態(tài)中可使用的平板凝膠有如含緩沖液的聚丙烯酰胺凝膠，但并不僅限于此。含緩沖液的聚丙烯酰胺凝膠有如由丙烯酰胺、N，N亞甲基-雙丙烯酰胺、蒸餾水所構(gòu)成的丙烯酰胺溶液；-或?qū)⑷姿峋彌_液、過硫酸銨溶液、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、蒸餾水進(jìn)行混合并聚合。任何形式的平板凝膠利用該技術(shù)領(lǐng)域所周知的常法便可制得。
在平板凝膠中，利用本實(shí)施形態(tài)較好的緩沖液區(qū)域形成方法，便可形成變性劑間歇配置。當(dāng)使用平板凝膠時(shí)，例如圖71所示，浸漬在充滿其他緩沖液的泳動(dòng)槽中，而形成為防止緩沖液或變性劑間歇配置蒸發(fā)的蓋體。雖省略詳細(xì)圖示，但是如同慣用的電泳法，在平板凝膠的泳動(dòng)方向上游側(cè)等間隔設(shè)置試樣孔，并在泳動(dòng)槽上連接著電極與電源。
支撐體并不僅限于平板凝膠，在可支撐變性劑間歇配置的前提下，涵蓋所有形式的分析基板?；宀馁|(zhì)可從玻璃、石英、塑膠、硅樹脂、紙等中選擇。此外，例如也可在已形成變性劑間歇配置的基板上，貼合著形成用來防止變性劑間歇配置蒸發(fā)用蓋體的基板而制成。另外，也可將未形成變性劑間歇配置的基板部分進(jìn)行彎曲，并將此部分利用為蓋體。
典型的分析基板有如微芯片。如圖72所示，可在屬于微芯片的濃度梯度形成區(qū)域的微流道內(nèi)，形成變性劑間歇配置。此微流道內(nèi)的變性劑間歇配置，是將含變性劑的緩沖液區(qū)域、與不含變性劑的緩沖液區(qū)域，在泳動(dòng)方向進(jìn)行交互排列，且不含各變性劑的緩沖液區(qū)域的寬度朝泳動(dòng)方向依序變短。
微芯片通常至少由2片基板所構(gòu)成。對(duì)一片基板采用微影技術(shù)等細(xì)微加工技術(shù)，形成寬度、深度均為10至100μm程度的流道，并對(duì)另一片基板，采用超音波加工等機(jī)械加工，開閉儲(chǔ)存區(qū)用孔。若將上述第2片基板，采用利用熱所進(jìn)行的熔融接合等粘接技術(shù)進(jìn)行貼合，便可獲得在既定位置具有流道與儲(chǔ)存區(qū)的微芯片?；宀馁|(zhì)可從玻璃、石英、塑膠、硅樹脂等之中適當(dāng)選擇。微芯片乃分析用流道屬于細(xì)微構(gòu)造，因而可實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)能解析、裝置整體小型化等。
其次，針對(duì)實(shí)施形態(tài)B的微芯片電泳裝置進(jìn)行說明。
圖73所示微芯片電泳裝置，是提供含有濃度梯度形成區(qū)域的微流道901(以下稱“核酸分析用流道901”)以及導(dǎo)入核酸試樣的微流道902的塑膠制微芯片903。在核酸分析用流道901內(nèi)形成變性劑間歇配置。此微芯片903是將已形成上述流道901、902的塑膠制基板903a、設(shè)有供試樣導(dǎo)入用的核酸導(dǎo)入口及排出口902a、902b，與第1及第2儲(chǔ)存區(qū)901a、902b的塑膠制基板3b，進(jìn)行貼合而制得。
采用圖73所示微芯片，根據(jù)堿基排列的不同將雙鏈核酸進(jìn)行分離的方法順序之一例，如下述。將緩沖液填充在核酸導(dǎo)入流道902中。在此，將試樣導(dǎo)入于核酸分析用流道內(nèi)901中的方法，有如將作為試樣的雙鏈核酸，利用電泳而導(dǎo)入于核酸分析用流道901的方法。在核酸導(dǎo)入口902a中導(dǎo)入含雙鏈核酸的緩沖液，并在核酸導(dǎo)入口902a與核酸排出口902b中，插入連接于直流電源的電極(未圖示)。核酸試樣含有一端附加有核酸變性劑濃度較高，且不易解離為單股核酸的人工核酸排列(GC箝位)，并經(jīng)放大的雙鏈核酸。因?yàn)殡p鏈核酸帶負(fù)電，因此便將核酸導(dǎo)入口側(cè)當(dāng)作陰極，將核酸排出口側(cè)當(dāng)作陽極。所使用的電極也可在核酸導(dǎo)入口與核酸排出口中，利用如蒸鍍、電鍍等方式預(yù)先形成。導(dǎo)入雙鏈核酸之時(shí)，最好抑制試樣擴(kuò)散于核酸分析用流道1側(cè)。所以，最好在第1儲(chǔ)存區(qū)901a與第2儲(chǔ)存區(qū)902a中插入電極，并施加大于核酸導(dǎo)入口902a的電位，且小于核酸排出口902b之電位的電位。
其次，在核酸分析用流道901兩端設(shè)置連接于直流電源的電極(未圖示)。因?yàn)殡p鏈核酸帶負(fù)電，因此便將第1儲(chǔ)存區(qū)側(cè)當(dāng)作陰極，將第2儲(chǔ)存區(qū)側(cè)當(dāng)作陽極。電極是可在第1儲(chǔ)存區(qū)及第2儲(chǔ)存區(qū)中，利用如蒸鍍、電鍍等方法預(yù)先形成。通過對(duì)插入于第1儲(chǔ)存區(qū)與第2儲(chǔ)存區(qū)中的電極，施加既定電位，以及通過對(duì)分析用基板兩端所設(shè)置的電極施加既定電壓，便可將依上述所導(dǎo)入的雙鏈核酸，在變性劑間歇設(shè)置內(nèi)進(jìn)行電泳。泳動(dòng)的雙鏈核酸將在變性劑間歇配置上，根據(jù)堿基排列的不同而分離。
依如上述操作而分離的核酸，將利用核酸分析用流道901內(nèi)或下游的檢測部905進(jìn)行檢測?？墒褂玫臋z測法乃如前面所說明的方法，可從螢光檢測、發(fā)光檢測、吸光檢測、電化學(xué)式檢測等之中選擇，最好為螢光檢測。螢光檢測有如預(yù)先將PCR反應(yīng)的引物進(jìn)行螢光標(biāo)識(shí)的方法、預(yù)先將PCR產(chǎn)物進(jìn)行螢光標(biāo)識(shí)的方法、將PCR產(chǎn)物利用DNA染色劑進(jìn)行染色的方法，以及使含高分子基質(zhì)的緩沖液中，含有DNA染色劑，并在電泳中進(jìn)行染色的方法等。螢光標(biāo)識(shí)物質(zhì)乃如上述，檢測器也如上述。在分析中，必須將分析用基板903a、903b保持在一定溫度，最好40℃至70℃。
所使用的微芯片也可為玻璃制。玻璃制微芯片雖電滲透流效果較大，但是，也可將流道表面利用周知技術(shù)進(jìn)行修飾而抑制電滲透流。由此，便可在與塑膠制微芯片相同構(gòu)造的玻璃制微芯片上，利用電泳進(jìn)行雙鏈核酸的分離。
圖74是表示玻璃制微芯片電泳裝置的一實(shí)施形態(tài)。即使存在電滲透流的情況下，利用如圖74所示構(gòu)造，仍可進(jìn)行雙鏈核酸的分析。此基本構(gòu)造乃如同圖5所示微芯片，但不同點(diǎn)在于核酸導(dǎo)入流道2設(shè)置在下游側(cè)。
首先，從核酸導(dǎo)入流道2將構(gòu)成試樣的雙鏈核酸，利用電滲透流導(dǎo)入于變性劑間歇配置的核酸分析用流道901中。將含雙鏈核酸的緩沖液導(dǎo)入核酸導(dǎo)入口902a中，并在核酸導(dǎo)入口902a與核酸排出口902b中，插入連接于直流電源的電極。通過對(duì)核酸導(dǎo)入口與核酸排出口之間施加既定電壓，便將含雙鏈核酸的緩沖液在核酸導(dǎo)入流道902中利用電滲透流進(jìn)行移動(dòng)，并導(dǎo)入于核酸分析用流道901內(nèi)。在此為了能利用電滲透流，便將核酸導(dǎo)入口側(cè)設(shè)為陽極，將核酸排出口側(cè)設(shè)為陰極。在此雙鏈核酸導(dǎo)入之時(shí)，也可抑制對(duì)核酸分析用流道901側(cè)的擴(kuò)散。所以，也即可將電極插入于第1儲(chǔ)存區(qū)901a與第2儲(chǔ)存區(qū)901b中，并施加小于核酸導(dǎo)入口902a的電位，且大于核酸排出口902b之電位的電位。各電極也可利用如蒸鍍、電鍍等方式預(yù)先形成。
其次，將所導(dǎo)入的雙鏈核酸利用電泳進(jìn)行分離。通過對(duì)插入于第1儲(chǔ)存區(qū)901a與第2儲(chǔ)存區(qū)902b中的電極，施加既定電壓，便將變性劑間歇配置的緩沖液區(qū)域，利用電滲透流在核酸分析用流道901a內(nèi)進(jìn)行輸送。經(jīng)導(dǎo)入于此緩沖液區(qū)域內(nèi)的雙鏈核酸，也將利用電泳而進(jìn)行移動(dòng)。一般利用電滲透流所進(jìn)行變性劑間歇配置的移動(dòng)方向，與利用電泳所進(jìn)行的核酸移動(dòng)方向，是呈相對(duì)向方向(相反向)。所以，當(dāng)使用圖74所示變性劑間歇配置時(shí)，便將第1儲(chǔ)存區(qū)901a當(dāng)作陽極，將第2儲(chǔ)存區(qū)901b當(dāng)作陰極，由此變性劑間歇配置便分別朝第2儲(chǔ)存區(qū)901b方向進(jìn)行移動(dòng)，而雙鏈核酸則朝第1儲(chǔ)存區(qū)901a方向進(jìn)行移動(dòng)。所以，雙鏈核酸是在變性劑間歇配置上進(jìn)行電泳，并根據(jù)堿基排列的不同而分離。
依如上述的操作而分離的雙鏈核酸，將利用變性劑間歇配置內(nèi)或在其下游的檢測部(未圖示)進(jìn)行檢測。
圖75是表示玻璃制微芯片電泳裝置的另一實(shí)施形態(tài)。此裝置是具備有形成有變性劑間歇配置的核酸分析用流道901(第1微流道)、在核酸分析用流道901其中一端并與其交叉的含變性劑之緩沖液導(dǎo)入部、以及在核酸分析用流道901另一端側(cè)并與其交叉的核酸導(dǎo)入部。第1儲(chǔ)存區(qū)901a是第1緩沖液用緩沖液導(dǎo)入口，而第2儲(chǔ)存區(qū)901b則為其排出口。
含變性劑之緩沖液導(dǎo)入部是具有橫跨核酸分析用流道901的含變性劑之緩沖液導(dǎo)入流道906(第2微流道)。含變性劑之緩沖液導(dǎo)入流道906是具有導(dǎo)入第2緩沖液用的含變性劑之緩沖液導(dǎo)入口906a與其排出口906b。從此含有變性劑之緩沖液導(dǎo)入流道906導(dǎo)入第2緩沖液。
核酸導(dǎo)入部是具有橫跨核酸分析用流道901的核酸試樣導(dǎo)入流道902。核酸試樣導(dǎo)入流道902是具有核酸導(dǎo)入口902a與其排出口902b。
圖75所示裝置是將已形成有核酸分析用流道901、含變性劑的緩沖液導(dǎo)入流道906及核酸導(dǎo)入流道902的在板903a(參照第76(a)圖)，以及已形成有各流道端部的緩沖液導(dǎo)入口與其排出口及含變性劑的緩沖液導(dǎo)入口與其排出口的基板903b(參照第76(b)圖)，例如通過采用依熱所進(jìn)行的熔融接合等粘接技術(shù)進(jìn)行貼合，而形成一片微芯片。供各儲(chǔ)存區(qū)用的孔是例如直徑2至10mm程度的圓形，是例如采用超音波加工等周知的加工技術(shù)而形成。
上述構(gòu)造的裝置是利用含變性劑之緩沖液導(dǎo)入部，便可在核酸分析用流道901內(nèi)，形成如圖77所示的所需變性劑間歇配置。此形成方法，在后述的“(3)實(shí)施形態(tài)B的緩沖液區(qū)域排列的形成方法與裝置”項(xiàng)中將有詳細(xì)說明。在此乃例示當(dāng)使用圖75所示微芯片電泳裝置時(shí)，在核酸分析用流道1中形成變性劑間歇配置之后所進(jìn)行的分離步驟。
當(dāng)在核酸分析用流道901中形成所需變性劑間歇配置之后，便從核酸導(dǎo)入口902a使雙鏈核酸朝核酸排出口902b方向進(jìn)行流動(dòng)，而將雙鏈核酸導(dǎo)入核酸分析用流道901內(nèi)。使雙鏈核酸流動(dòng)的方法，可從能控制流動(dòng)方向與流動(dòng)時(shí)間(流動(dòng)距離)的方法中任意選擇，但是若屬于玻璃制微芯片，最好用核酸導(dǎo)入口902a與核酸排出口902b之間施直流電壓，而產(chǎn)生電滲透流的方法。另外，當(dāng)雙鏈核酸導(dǎo)入步驟時(shí)，最好依不致對(duì)核酸分析用流道901流入多余試樣的方式，對(duì)緩沖液導(dǎo)入口901a、其排出口901b、含變性劑之緩沖液導(dǎo)入口906a及其排出口906b，例如通過施加直流電壓而賦予壓力。
其次，若將電極插入于緩沖液導(dǎo)入口901a與排出口901b中，并施加既定直流電壓，所導(dǎo)入的雙鏈核酸便將在核酸分析用流道901內(nèi)的變性劑間歇配置上進(jìn)行電泳，并根據(jù)堿基排列的不同而分離。各電極可在晶片上利用如蒸鍍、電鍍等方式預(yù)先形成。另外，當(dāng)玻璃制微芯片等時(shí)，將有也同時(shí)引起電滲透流的情況，變性預(yù)測間歇配置將利用電滲透流與雙鏈核酸相反方向(即朝陰極側(cè))進(jìn)行流動(dòng)。此時(shí)，必須如圖77所示，依緩沖液長度在核酸泳動(dòng)方向上逐漸變短的方式，在核酸分析用流道901內(nèi)預(yù)先形成變性劑間歇配置。
根據(jù)如上述的操作，在將核酸試樣中的雙鏈核酸進(jìn)行分離之后，利用核酸分析用流道901上既定地方例如其下游的檢測部(未圖示)，檢測出雙鏈核酸。在分析中，必須將微芯片保持在一定溫度，最好為40℃至70℃。此外，可使用的變性劑、緩沖液、可分析的試樣、檢測法等，均如同既述的裝置。
(3)實(shí)施形態(tài)B用的緩沖液區(qū)域排列的形成方法與裝置熟知DGGE必須在含變性劑的緩沖液中具有連續(xù)的濃度斜度。但是，在微芯片電泳裝置中所使用的微流道內(nèi)，則在含變性劑緩沖液與緩沖液間的混合需要充分的時(shí)間，或需要將含變性劑緩沖液與緩沖液效率高的進(jìn)行混合的機(jī)構(gòu)。
根據(jù)實(shí)施形態(tài)B的發(fā)明，因?yàn)楹怂釋⒃谖⒘鞯纼?nèi)所形成的變性劑間歇配置中進(jìn)行電泳，因此即便含變性劑的緩沖液與緩沖液并未完全混合，仍可實(shí)現(xiàn)核酸分離。特別是不需要將含變性劑之緩沖液與緩沖液進(jìn)行混合的攪拌手段。
以下，提供實(shí)施形態(tài)B的分離方法中可使用的所需緩沖液區(qū)域排列的形成方法與裝置。
圖78是表示形成緩沖液區(qū)域排列的裝置的一實(shí)施形態(tài)。此裝置是用來在電泳用分析基板910上形成含不同濃度雙鏈核酸的變性劑的緩沖液區(qū)域排列的裝置，具備有用來保持分析基板910的平臺(tái)部件911；對(duì)該基板910噴射含不同濃度雙鏈核酸的變性劑的緩沖液液滴913(例如不含變性劑的緩沖液、與含有變性劑的緩沖液的各液滴)的噴射部件912；以及對(duì)平臺(tái)部件911及/或噴射部件912進(jìn)行位置控制，且逐次驅(qū)動(dòng)噴射部件的控制手段(未圖示)。平臺(tái)部件911及/或噴射部件912是具有如圖中箭頭所示，可沿2維方向相互直線運(yùn)動(dòng)的移動(dòng)機(jī)械。
圖78的裝置是將上述具有核酸分析用流道1的微芯片等基板910，保持在平臺(tái)部件911上，并使用相對(duì)于此基板910，可噴射不含變性劑的緩沖液及/或含變性劑的緩沖液液滴913的噴射部件912，對(duì)平臺(tái)部件911及/或噴射部件912進(jìn)行位置控制，且逐次驅(qū)動(dòng)所需的噴射部件912。依此，便從噴射部件912使既定變性濃度的緩沖液液滴913，附著于核酸分析用流道901內(nèi)的任意位置，便可在其中形成變性劑間歇配置。另外上，當(dāng)以單次噴射所涂布的緩沖液的厚度較薄時(shí)，僅要對(duì)完全相同分布(相同的變性劑區(qū)域)重疊進(jìn)行涂布，直到適當(dāng)厚度為止便可。
更詳細(xì)地講，上述噴射部件912可利用具有液滴噴射頭的噴射機(jī)構(gòu)所構(gòu)成。例如透過未圖示的控制手段施加電氣信號(hào)，這樣便可依任意時(shí)序朝標(biāo)的噴射緩沖液。
最簡單的方式，是設(shè)置預(yù)先形成含緩沖液的凝膠的基板，并使用噴射與凝膠中緩沖液不同的變性劑濃度(至少高于凝膠中所含緩沖液的濃度)的緩沖液的1個(gè)液滴噴射頭912。這是屬于使用如核酸分析用流道內(nèi)已填充著含緩沖液凝膠的微芯片或含緩沖液的平板凝膠914的情況(圖79)。
另一方面，當(dāng)使用未具凝膠的核酸分析用流道、玻璃基板時(shí)，便如圖78所示，設(shè)置對(duì)應(yīng)著不同濃度緩沖液的多個(gè)液滴噴射頭912、912′，借助于選擇性的噴射所需液滴便可對(duì)應(yīng)。此時(shí)，通常使緩沖液中含有供形成凝膠用的高分子基質(zhì)。
如上述的液滴噴射機(jī)構(gòu)可利用例如噴墨打印機(jī)用噴射頭等。通過使用適當(dāng)?shù)囊旱螄娚漕^，便可輕易的涂布直徑至小較微芯片基板910上的核酸分析用流道1寬度為小的緩沖液液滴913。
上述液滴噴射機(jī)構(gòu)可將噴射相同濃度緩沖液的液滴噴射頭多個(gè)連結(jié)并使用。依照這樣的話，便可縮短變性劑間歇配置的形成時(shí)間。而且，也可將噴射不同濃度緩沖液的液滴噴射頭間進(jìn)行連結(jié)，也可例如作為將含變性劑的緩沖液用液滴噴射頭與緩沖液用液滴噴射頭形成一體的噴射頭模組。若使用這種噴射頭模組，裝置將形成小型，且可縮短變性劑間歇配置的形成時(shí)間。此外，如上述若使用更多個(gè)設(shè)置經(jīng)模組化的液滴噴射頭組，便可效率更高的形成變性劑間歇配置。
再者，如圖79所示，也可取代微芯片基板910，改為保持電泳用平板凝膠914，并對(duì)平板凝膠914上的任意位置噴射含變性劑的緩沖液液滴913。依此便可對(duì)平板凝膠914的任意地方，注入含變性劑之緩沖液液滴913，便可在此有效地依任意圖案形成變性劑間歇配置。
如上述，通過采用定位手段(911)與液滴噴射部件(912)等，便可輕易的形成具任意圖案的變性劑間歇配置，且可對(duì)應(yīng)所有形式的基板，特別是可效率高且重現(xiàn)性好，并大量形成相同圖案的變性劑間歇配置。
其次，參照?qǐng)D80與圖81，說明在微流道內(nèi)形成變性劑間配置的另一方法。
首先，利用緩沖液輸送步驟，使緩沖液(第1緩沖液；不含變性劑的緩沖液)從緩沖液導(dǎo)入口，朝排出口方向進(jìn)行流動(dòng)。此驅(qū)動(dòng)方法有可在緩沖液導(dǎo)入口與排出口之間施加直流電壓，而產(chǎn)生電滲透流的方法或在緩沖液導(dǎo)入口或/及排出口連接泵并進(jìn)行流動(dòng)的方法等，以及能控制流動(dòng)方向與流動(dòng)時(shí)間(流動(dòng)距離)的方法中任意選擇。在此，當(dāng)緩沖液輸送步驟時(shí)，設(shè)定成緩沖液不致從核酸分析用流道流入核酸導(dǎo)入流道、或含變性劑的緩沖液導(dǎo)入流道中的狀態(tài)。為此，最好對(duì)核酸導(dǎo)入口、核酸排出口、含變性劑的緩沖液導(dǎo)入口、含變性劑的緩沖液排出口，例如施加直流電壓、或附加壓力等。含變性劑的緩沖液導(dǎo)入流道內(nèi)的含變性劑緩沖液的驅(qū)動(dòng)方法與操作，均如同上述緩沖液的驅(qū)動(dòng)方法等。
緩沖液輸送步驟中，緩沖液區(qū)域?qū)⒈粚?dǎo)入核酸分析用流道901內(nèi)，此緩沖液區(qū)域?qū)⒈粚?dǎo)入直到通過與流道906的交點(diǎn)為止。然后，如圖80所示，利用含變性劑的緩沖液輸送的步驟，若從流道6輸送含變性劑之緩沖液(第2緩沖液)的話，來自流道906之含變性劑的緩沖液區(qū)域則從正橫向橫跨流道901的緩沖液區(qū)域。依此便形成將緩沖液區(qū)域分?jǐn)嗟?個(gè)含變性劑的緩沖液區(qū)域。其次，再度在緩沖液輸送步驟中，位于流道901內(nèi)的含變性劑的緩沖液區(qū)域部分，將從流道906中分離，并朝排出口方向與緩沖液區(qū)域一起進(jìn)行移動(dòng)。依此便可在緩沖液區(qū)域內(nèi)形成獨(dú)立的1個(gè)含變性劑的緩沖液區(qū)域901c。
如上述，利用交叉重復(fù)進(jìn)行緩沖液輸送步驟與含變性劑的緩沖液輸送步驟，便可在核酸分析用流道901內(nèi)形成變性劑間歇配置。在此通過調(diào)節(jié)緩沖液輸送步驟的時(shí)間，便可任意調(diào)整含變性劑的緩沖液區(qū)域與含變性劑的緩沖液區(qū)域間的間隔，例如圖69所示，可形成含變性劑的緩沖液區(qū)域間的間隔，越往下游越短的形態(tài)的變性劑間歇配置流道。
另外，核酸分析用流道的長度、含變性劑的緩沖液的長度、含變性劑的緩沖液的濃度、其間隔等，是因?yàn)殡S分離對(duì)象的雙鏈核酸種類等而異，因而可利用事前所實(shí)施的預(yù)備實(shí)驗(yàn)等而決定。
圖81是表示將含變性劑的緩沖液區(qū)域的泳動(dòng)方向的長度(寬度)縮小的方法一例。通過將含變性劑的緩沖液區(qū)域的泳動(dòng)方向長度縮小，便可提升雙鏈核酸的分離精度。利用圖80所示方法所形成的含變性劑的緩沖液區(qū)域的泳動(dòng)方向長度，是大致等于含變性劑的緩沖液流入口寬度。所以，在將這種含變性劑的緩沖液區(qū)域長度縮小方面，最好將含變性劑的緩沖液流入口變狹窄。但是，若將含變性劑的緩沖液流入口變狹窄的話，因?yàn)榱鲃?dòng)損失將明顯的增加，因此在使含變性劑的緩沖液進(jìn)行流動(dòng)上，便有需要非常大的動(dòng)力的情況。
為能避免上述問題，可如圖81所示，在含變性劑的緩沖液導(dǎo)入部中，設(shè)置鄰接含變性劑的緩沖液導(dǎo)入流道906的輔助緩沖液流道906′。依此，通過增加來自輔助緩沖液流道906′的導(dǎo)入口906c、906d的輔助緩沖液流入量，便可將含變性劑的緩沖液的流入寬度變細(xì)，可在泳動(dòng)方向形成使含變性劑的緩沖液區(qū)域長度逐漸縮短的狀態(tài)，同時(shí)可防止流動(dòng)損失的增加。輔助緩沖液的導(dǎo)入口既可以如圖81所示，以夾著含變性劑的緩沖液導(dǎo)入流道6的方式，設(shè)置多個(gè)輔助緩沖液流道與導(dǎo)入口，也可以僅設(shè)置其中任一個(gè)。
形成具有流量控制手段的實(shí)施形態(tài)B的緩沖液區(qū)域排列的裝置在實(shí)施形態(tài)B的裝置中，如實(shí)施形態(tài)1-1與1-2中所說明，控制來自液體導(dǎo)入用微流道的緩沖液流量的手段(例如依調(diào)節(jié)施加電壓或賦予電位而控制電滲透流、利用微量注射針等調(diào)節(jié)液體輸送壓力而控制液體輸送泵、或利用它們對(duì)輸送液體進(jìn)行2次調(diào)節(jié)的閥控制)，可用作形成上述變性劑間歇配置的手段。
實(shí)施形態(tài)B的裝置是在以具有不同濃度變性劑的緩沖液間，不易因分子擴(kuò)散而混合的條件的前提(如前面所說明的一樣，當(dāng)液體擴(kuò)散系數(shù)極端小時(shí)，將有不致引起混合的情況)下，可將實(shí)施形態(tài)1-1與1-2所示的流量控制手段，利用在如形成變性劑間歇配置的緩沖劑交叉供應(yīng)方面。
圖83是表示設(shè)置實(shí)施形態(tài)1-2中所說明高速動(dòng)作閥的實(shí)施形態(tài)。此實(shí)施形態(tài)是在2條緩沖液導(dǎo)入流道(導(dǎo)入不含變性劑的緩沖液的導(dǎo)入流道、與含變性劑的緩沖液用的導(dǎo)入流道)，分別設(shè)置高速動(dòng)作閥(閥1與閥2)。通過控制閥1與閥2的開閉時(shí)間，便可如圖83所示，在核酸分析用流道1內(nèi)形成變性劑間歇配置。
具有混合促進(jìn)部件的實(shí)施形態(tài)A的微芯片電泳裝置在形成圖78與圖79所示變性劑間歇配置的裝置中，可利用混合促進(jìn)部件。
圖84所示是噴射部件912的示意圖。箭頭a與箭頭b是指含不同濃度變性劑的緩沖液的輸入路徑。噴射部件912是內(nèi)置有可將含不同濃度變性劑的2個(gè)緩沖液，例如可將含變性劑的緩沖液(箭頭a)與不含變性劑的緩沖液(箭頭b)，依任意比率混合的混合裝置(未圖示)。
在噴射部件912內(nèi)的混合裝置中，可使用具有上述實(shí)施形態(tài)1-1至實(shí)施形態(tài)2-3的混合促進(jìn)部件的液體混合裝置。根據(jù)具有適當(dāng)混合促進(jìn)部件的混合裝置，因?yàn)榧^a與箭頭b所示2個(gè)緩沖液的混合將迅速的進(jìn)行，因此便可連續(xù)的調(diào)制得含所需濃度變性劑的緩沖液。
利用混合裝置進(jìn)行混合而調(diào)制得含變性劑的緩沖液，將從噴射部件912噴射所需濃度的液滴913。根據(jù)此實(shí)施形態(tài)，便可連續(xù)的供應(yīng)含不同濃度變性劑的緩沖液。所以，便無須更換供應(yīng)不同濃度緩沖液的夾頭。而且也無須使用夾頭式噴射部件。更不需要設(shè)置多種噴射部件。根據(jù)具有此形式噴射部件的實(shí)施形態(tài)，便可提供適于少樣多量生產(chǎn)的變性劑間歇配置形成裝置及方法。
例如當(dāng)噴射部件912內(nèi)的混合促進(jìn)部件，使用實(shí)施形態(tài)2-2的液體混合裝置時(shí)，因?yàn)榭蓪⒕彌_液彼此間的混合高速化，因而便可縮短從接收到混合濃度信息起至混合完成的時(shí)間。此外，當(dāng)噴射部件使用實(shí)施形態(tài)2-3的液體混合裝置時(shí)，便可將裝置小型化。
實(shí)施例1采用如上述各實(shí)施形態(tài)所記載的微芯片電泳裝置，進(jìn)行堿基排列不同的2種雙鏈核酸的分離。分析對(duì)象物是調(diào)制含有從2種Sphingomonas屬的微生物中，所獲得的16S rRNA基因的V3區(qū)域斷片的核酸試樣。
在實(shí)驗(yàn)中，首先將2種微生物分別利用液體培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)之后，再利用離心分離進(jìn)行回收。將菌體混合，利用氯化芐法從此混合菌體中萃取出核酸。針對(duì)此萃取核酸，采用來16S rRNA遺傳因子的V3區(qū)域?yàn)闃?biāo)的的普遍引物(universal primer)[前置；5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGG CGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAG GCAGCAG-3′(排列編號(hào)1)反置5′-ATTACCGCGG CTGCTGG-]3′(排列編號(hào)2)，進(jìn)行PCR，并將所生成的PCR產(chǎn)物當(dāng)作最終的核酸試樣。普遍引物是采用對(duì)5′末端進(jìn)行FITC標(biāo)識(shí)者。對(duì)前置引物賦予GC箝位區(qū)域。
在實(shí)驗(yàn)中，采用對(duì)Pyrex(注冊(cè)商標(biāo))玻璃(7cm×3.5cm)，利用微影技術(shù)形成寬度100μm、深度25μm的流道的微芯片。將此微芯片配置于倒立型螢光顯微鏡，并利用光電倍增管進(jìn)行檢測。變性劑采用尿素與甲酰胺。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測出2種微生物所對(duì)應(yīng)的2個(gè)尖峰。在30分鐘的短時(shí)間內(nèi)完成分析，確認(rèn)來高速分析。
實(shí)施例2采用實(shí)施例1的裝置，將堿基排列不同的2種以上雙鏈核酸進(jìn)行分離。存在有2種以上雙鏈核酸的試樣，乃采用將雌二醇當(dāng)作單一碳源并進(jìn)行集聚培養(yǎng)的活性污泥。實(shí)驗(yàn)方法乃如同實(shí)施例1。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測出多個(gè)微生物所對(duì)應(yīng)的多個(gè)尖峰，確認(rèn)到也可將2種以上不同堿基排列的雙鏈核酸進(jìn)行分離。
比較例1為與實(shí)施例1比較，便采用熟知的DGGE裝置，對(duì)相同試樣進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)是以Muyzer等的方法(Appl.Environ.Microbiol.，Mar1993，695-700，Vol 59，No.3)為基礎(chǔ)實(shí)施。DGGE裝置是采用DCodeUniversal Mutation Detection System(BIORAD)。
實(shí)驗(yàn)如同實(shí)施例1，將2種微生物分別利用液體培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)之后，再將利用離心分離所回收的菌體進(jìn)行混合，從混合菌體利用氯化芐法萃取核酸。對(duì)此萃取核酸，采用將16S rRNA遺傳因子的V3區(qū)域?yàn)闃?biāo)的的實(shí)施例1所述的普遍引物，進(jìn)行PCRR，并將所生成的PCR產(chǎn)物當(dāng)作最終核酸試樣。在此所使用的普遍引物是不同于實(shí)施例1，并未進(jìn)行螢光標(biāo)識(shí)，經(jīng)電泳后，利用Vistra Green對(duì)雙鏈核酸進(jìn)行螢光染色而檢測。在前置引物中存在GC箝位區(qū)域的事如同實(shí)施例1。變性劑濃度梯度凝膠的濃度梯度為35％至55％。
核酸試樣泳動(dòng)的結(jié)果，雖檢測出2種微生物所對(duì)應(yīng)的2個(gè)條帶，但是電泳時(shí)間為210分鐘，若包含變性劑濃度梯度凝膠的制作時(shí)間與凝膠染色時(shí)間等在內(nèi)，在分析方面便需要6小時(shí)程度。
比較例2
為與實(shí)施例2比較對(duì)照，便采用熟知的DGGE裝置，針對(duì)相同試樣進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)裝置、實(shí)驗(yàn)方法均如同實(shí)施例2。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖檢測出多個(gè)微生物所對(duì)應(yīng)的多個(gè)尖峰，但是如同比較例1，電泳時(shí)間為210分鐘，若包含變性劑濃度梯度凝膠的制作時(shí)間與凝膠染色時(shí)間等在內(nèi)，在分析方面便需要6小時(shí)程度。而且，需要變性劑濃度梯度凝膠的制作與凝膠染色等繁雜的手工作業(yè)操作。
在上述實(shí)施例中，使用實(shí)施形態(tài)A與實(shí)施形態(tài)B的裝置，利用在微芯片上的DGGE，依堿基排列的不同便可將雙鏈核酸進(jìn)行分離、分析。
再者，借助于DGGE用的微芯片裝置，采用實(shí)施形態(tài)1-1至實(shí)施形態(tài)2-3中所記載的混合促進(jìn)方法與裝置，便可迅速的形成濃度梯度，能夠以更短時(shí)間進(jìn)行分離、分析。
序列表<110>株式會(huì)社荏原制作所<120>微流體處理方法及裝置<130>YCT-995<140>日本<160>2<210>1<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR用引物；前置<400>1cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagcag57<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR用引物；反置<400>2attaccgcgg ctgctgg1權(quán)利要求
1.一種液體混合裝置，包含有用來導(dǎo)入液體的至少2條液體導(dǎo)入用微流道；以及上述至少2條液體導(dǎo)入用微流道所連接的混合用微流道，并且從各液體導(dǎo)入用微流道所導(dǎo)入的各液體在上述混合用微流道內(nèi)進(jìn)行合流，其特征在于，所述液體混合裝置包括混合促進(jìn)部件，用來促進(jìn)在上述混合用微流道內(nèi)進(jìn)行合流的液體間的混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體混合裝置，其特征在于上述混合促進(jìn)部件是增加所混合的液體間的界面之面積的部件。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體混合裝置，其特征在于上述混合促進(jìn)部件是使所混合的液體間的界面不穩(wěn)定化的部件。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液體混合裝置，其特征在于上述混合促進(jìn)部件包含有可對(duì)導(dǎo)入液體導(dǎo)入用微流道中的液體的流量、與其他液體導(dǎo)入用微流道相獨(dú)立地進(jìn)行控制的至少1個(gè)液體導(dǎo)入部件。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的液體混合裝置，其特征在于上述液體導(dǎo)入部件是可控制流量的泵。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的液體混合裝置，其特征在于上述液體導(dǎo)入部件是設(shè)置在液體導(dǎo)入用微流道中的閥。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的液體混合裝置，其特征在于上述液體導(dǎo)入部件是由設(shè)置在液體導(dǎo)入用微流道的各導(dǎo)入部中的第1電極；以及設(shè)置在上述混合用微流道的排出部中的第2電極所構(gòu)成，通過在第1與第2電極間施加電壓而在各液體導(dǎo)入用微流道中產(chǎn)生電滲透流。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液體混合裝置，其特征在于上述混合促進(jìn)部件包含有在至少1條液體導(dǎo)入用微流道中設(shè)置的高速動(dòng)作閥。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的液體混合裝置，其特征在于上述高速動(dòng)作閥是采用了壓電元件的閥體驅(qū)動(dòng)部件。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的液體混合裝置，其特征在于上述高速動(dòng)作閥是可以利用因液體導(dǎo)入用流道的局部加熱所導(dǎo)致的液體體積膨脹，來高速地控制微小流量液體向上述混合用微流道的噴出的部件。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液體混合裝置，其特征在于上述混合促進(jìn)部件包含有通過使混合用微流道的流道高度小于其流道寬度而形成的混合室。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的液體混合裝置，其特征在于上述混合室是通過將液體導(dǎo)入用微流道以沿上下方向?qū)臃e的方式進(jìn)行連接而形成。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的液體混合裝置，其特征在于，還包括在上述混合室的上游通過上述多條液體導(dǎo)入用微流道進(jìn)行合流而形成的至少1條預(yù)混合用微流道。
14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液體混合裝置，其特征在于上述混合促進(jìn)部件包含有連接各液體導(dǎo)入用微流道的多個(gè)分支流道的合流部，該合流部以該多個(gè)分支流道彼此在3維空間上相互不同地配置的形態(tài)連接于上述混合用微流道。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的液體混合裝置，其特征在于上述分支流道的3維配置是通過使具有分支流道的多個(gè)基板在分支流道的合流方向或分支方向上重合而形成。
16.根據(jù)權(quán)利要求3所述的液體混合裝置，其特征在于上述混合促進(jìn)部件包含有在液體導(dǎo)入用微流道及/或混合用微流道中所設(shè)置的加熱器。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的液體混合裝置，其特征在于上述加熱器被設(shè)置在混合用微流道的下側(cè)。
18.根據(jù)權(quán)利要求3所述的液體混合裝置，其特征在于上述混合促進(jìn)部件包含有用于將在混合用微流道中進(jìn)行合流的液體間的界面攪亂的機(jī)械式變動(dòng)部件。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的液體混合裝置，其特征在于上述機(jī)械式變動(dòng)部件是在混合用微流道內(nèi)的合流部附近所設(shè)置的可動(dòng)升力面、轉(zhuǎn)動(dòng)體或擺動(dòng)體。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的液體混合裝置，其特征在于上述機(jī)械式變動(dòng)部件是設(shè)置在混合用微流道之壁面上的振動(dòng)部件。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的液體混合裝置，其特征在于上述機(jī)械式變動(dòng)部件是設(shè)置在混合用微流道之壁面外的振動(dòng)部件。
22.根據(jù)權(quán)利要求3所述的液體混合裝置，其特征在于上述混合促進(jìn)部件包含有在混合用微流道內(nèi)的合流部附近排列有許多微小構(gòu)造物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的液體混合裝置，其特征在于上述微小構(gòu)造物是充分小于上述混合用微流道的流道寬度的突起或溝。
24.一種用于將分析對(duì)象物進(jìn)行分離的微芯片電泳裝置，其特征在于包含形成有分析對(duì)象物的變性劑的濃度梯度區(qū)域的微流道，并使被導(dǎo)入上述濃度梯度區(qū)域中的分析對(duì)象物進(jìn)行電泳。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微芯片電泳裝置，其特征在于上述分析對(duì)象物是雙鏈核酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微芯片電泳裝置，其特征在于包含有用來導(dǎo)入含有不同濃度的變性劑的緩沖液的至少2條液體導(dǎo)入用微流道；以及上述至少2條液體導(dǎo)入用微流道所連接的混合用微流道，并且從各液體導(dǎo)入用微流道以變動(dòng)的比率所導(dǎo)入的各緩沖液在上述混合用微流道內(nèi)進(jìn)行合流由此而形成上述變性劑的濃度梯度區(qū)域。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的微芯片電泳裝置，其特征在于，包括混合促進(jìn)部件，用來促進(jìn)在上述混合用微流道內(nèi)進(jìn)行合流的緩沖液間的混合。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的微芯片電泳裝置，其特征在于包含權(quán)利要求第1項(xiàng)至第23項(xiàng)中任一項(xiàng)所記載的液體混合裝置。
29.一種用于將分析對(duì)象物進(jìn)行分離的方法，其特征在于通過將含有不同濃度的分析對(duì)象物的變性劑的緩沖液以變動(dòng)的比率從至少2條液體導(dǎo)入用微流道導(dǎo)入混合用微流道內(nèi)，而在上述混合用微流道內(nèi)形成變性劑的濃度梯度區(qū)域，并將分析對(duì)象物導(dǎo)入上述濃度梯度區(qū)域中來進(jìn)行電泳。
30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微芯片電泳裝置，其特征在于上述濃度梯度區(qū)域使通過將含有不同濃度的變性劑的緩沖液區(qū)域沿泳動(dòng)方向交互配置而形成。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的微芯片電泳裝置，其特征在于上述分析對(duì)象物是雙鏈核酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的微芯片電泳裝置，其特征在于不含或含較低濃度的上述變性劑的緩沖液區(qū)域以各自的長度朝向泳動(dòng)方向的下游側(cè)逐漸變小的方式來進(jìn)行排列。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的微芯片電泳裝置，其特征在于含較高濃度的上述變性劑的緩沖液區(qū)域以各自的長度朝向泳動(dòng)方向的下游側(cè)逐漸變大的方式來進(jìn)行排列。
34.一種用于將分析對(duì)象物進(jìn)行分離的方法，其特征在于通過在微流道內(nèi)將含不同濃度的分析對(duì)象物的變性劑的緩沖液區(qū)域沿泳動(dòng)方向交互配置而形成變性劑的濃度梯度區(qū)域，并將分析對(duì)象物導(dǎo)入上述濃度梯度區(qū)域中來進(jìn)行電泳。
35.一種用于將分析對(duì)象物進(jìn)行分離的方法，其特征在于將含不同濃度的變性劑的緩沖液區(qū)域沿泳動(dòng)方向交互配置，并將分析對(duì)象物導(dǎo)入于上述緩沖液區(qū)域的排列內(nèi)來進(jìn)行電泳。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于上述分析對(duì)象物是雙鏈核酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于將不含或含較低濃度的上述變性劑的緩沖液區(qū)域以各自的長度朝向泳動(dòng)方向的下游側(cè)逐漸變小的方式來進(jìn)行排列。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于將含較高濃度的上述變性劑的緩沖液區(qū)域以各自的長度朝向泳動(dòng)方向的下游側(cè)逐漸變大的方式來進(jìn)行排列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用液體的微芯片裝置。更詳細(xì)地說，本發(fā)明提供一種液體混合裝置，其包含有用來導(dǎo)入液體的至少2條液體導(dǎo)入用微流道；以及該至少2條液體導(dǎo)入用微流道所連接的混合用微流道而成，并且從各液體導(dǎo)入用微流道所導(dǎo)入的各液體在上述混合用微流道內(nèi)進(jìn)行合流，所述液體混合裝置具有用來促進(jìn)在上述混合用微流道內(nèi)進(jìn)行合流的液體間的混合的混合促進(jìn)部件。此外，本發(fā)明還提供一種變性劑濃度梯度凝膠電泳法用的電泳裝置以及微芯片電泳裝置。
文檔編號(hào)G01N1/38GK1898016SQ20048003822
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者森田智之, 宮晶子, 福田明, 能見基彥, 一木克則, 辻村學(xué), 清水駿助 申請(qǐng)人:株式會(huì)社荏原制作所