專(zhuān)利名稱(chēng)：一種診斷牛結(jié)核病的重組抗原蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組抗原蛋白，尤其涉及一種診斷牛結(jié)核病的重組抗原蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群引起的不同疾病的總稱(chēng)，該復(fù)合群包括人結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。牛結(jié)核病(bovine tuberculosis)是由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一種人畜共患的慢性消耗性傳染病，可通過(guò)病畜傳染給人類(lèi)或其他動(dòng)物。牛結(jié)核病在世界各國(guó)均有發(fā)生，在我國(guó)依然是最常見(jiàn)的多發(fā)性疾病，牛結(jié)核病有眾多的宿主譜，幾乎可以感染所有的溫血脊椎動(dòng)物。牛結(jié)核病的傳染流行不僅嚴(yán)重地影響到畜牧業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，更嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的身心健康。
由于奶牛和人的關(guān)系比較密切，并且奶牛結(jié)核病的患病率頗高，因此，奶牛是傳播結(jié)核病給人類(lèi)的最危險(xiǎn)的動(dòng)物，與病牛長(zhǎng)期接觸或不慎食用含結(jié)核菌牛奶的人都有可能感染結(jié)核病。國(guó)外的一項(xiàng)報(bào)告表明，在100個(gè)結(jié)核病患者中，有26例是由動(dòng)物感染的。其中，15歲以下的竟占了20例，他們都與不慎飲用含結(jié)核桿菌的牛奶或與動(dòng)物密切接觸有關(guān)。由此可以看出，牛結(jié)核病是其他動(dòng)物結(jié)核病最大的傳染源。有報(bào)道說(shuō)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌能感染人并導(dǎo)致肺炎和肺外感染。但牛結(jié)核病感染一般發(fā)生在不太發(fā)達(dá)的國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家的特殊人群(即那些食用未經(jīng)巴氏消毒的奶制品)。在圣地亞哥的1931個(gè)結(jié)核病例中，7％的分離菌株被確定為牛分枝桿菌。這些感染病例與食入了未消毒的粗制的奶產(chǎn)品有關(guān)系。這些患者中的53％是肺外感染，從兒童中分離的33％的菌株是牛分枝桿菌。人感染牛結(jié)核病的另一種來(lái)源是與感染動(dòng)物的接觸，如屠宰場(chǎng)工人、獸醫(yī)和動(dòng)物訓(xùn)練員。在發(fā)生該病的這些工人當(dāng)中，以飛沫形式傳播已被確認(rèn)為是最可能的感染途徑。
在那些還流行牛結(jié)核病的國(guó)家中，人類(lèi)始終受到該病的威脅，除非消滅牛結(jié)核病，否則人類(lèi)結(jié)核病的控制是不會(huì)成功的。因此，1993年世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布結(jié)核病正處于全球緊急狀態(tài)。所以，要從根本上控制牛結(jié)核病的發(fā)生與流行，必須加強(qiáng)對(duì)本病的診斷學(xué)和綜合防治措施的研究，從而為控制和消滅牛結(jié)核病提供技術(shù)支持。
牛結(jié)核病的診斷方法有細(xì)菌學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法等。診斷標(biāo)準(zhǔn)目前仍是依賴(lài)于患者的臨床癥狀及細(xì)菌培養(yǎng)和涂片鏡檢。但結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，約需5～8周，且培養(yǎng)成功率亦只有80％左右。而分子生物學(xué)方法雖然特異性和敏感性較高，但只適于實(shí)驗(yàn)室操作而不適于臨床推廣應(yīng)用。免疫學(xué)診斷方法包括結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)即變態(tài)反應(yīng)診斷方法、ELISA方法和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等。早期結(jié)核菌素是由甘油或綜合蘇通液中培養(yǎng)，取其除菌濾液濃縮而成，此即舊結(jié)核菌素(OT)。1932年人們?cè)谂f結(jié)素的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了純結(jié)核菌素即純化蛋白衍生物(PPD)，以此作為皮膚反應(yīng)試劑在一定程度上提高了此反應(yīng)的敏感性。
PPD雖稱(chēng)為純化蛋白衍生物，但其實(shí)際上是一種相當(dāng)復(fù)雜的混合物，包含有多種抗原成分。目前，許多學(xué)者正在致力于尋找一種或幾種結(jié)核分枝桿菌特異性抗原作為結(jié)核病有效的診斷試劑。目前已用于結(jié)核桿菌診斷的抗原主要有ESAT-6、MPT32、Ag85、MPB70、MPB83、MPT51、MTC28、MPT64、19KD抗原、MPT63、38KD抗原、KatG、GroES和35KD抗原。
研究人員由結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液中鑒定并分離出了一種分子量為6KD的蛋白，將其命名為ESAT-6。1997年P(guān)ollock和Andersen證實(shí)ESAT-6是牛分枝桿菌感染后的一種重要的T細(xì)胞靶抗原，也是刺激IFN～γ應(yīng)答的主要抗原。并證實(shí)此種低分子量抗原不存在于環(huán)境分枝桿菌中。進(jìn)一步的研究證明EAST-6僅存在于結(jié)核分枝桿菌群及少數(shù)幾種致病性分枝桿菌中。編碼此蛋白的基因在90％以上的非致病性分枝桿菌中缺失(除堪薩斯分枝桿菌、海水分枝桿菌和蘇加分枝桿菌外)，此外該基因在所有BCG中也均缺如。Mortenharboe等利用ESAT-6的單抗HYB76-8對(duì)11個(gè)不同樣品進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有結(jié)核分枝桿菌H37RV珠、牛分枝桿菌AN5和Ravenel株3個(gè)樣品在6KD處出現(xiàn)目的條帶，對(duì)其它8個(gè)不同來(lái)源的BCG菌株及其它一些環(huán)境分枝桿菌不同菌株進(jìn)行了Souther blotting和PCR分析，結(jié)果均證明ESAT-6抗原是區(qū)別結(jié)核桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的最佳候選抗原。這些研究結(jié)果極大的推動(dòng)了ESAT-6作為結(jié)核桿菌診斷試劑的研究進(jìn)展。
ESAT-6是免疫記憶效應(yīng)性T細(xì)胞的主要靶抗原之一，可在再次感染的早期，誘導(dǎo)其迅速增值和釋放高水平的IFN～γ，有效的激活巨噬細(xì)胞，控制結(jié)核病感染。近期的研究表明，結(jié)核病患牛對(duì)ESAT-6有高度的免疫應(yīng)答，而禽型結(jié)核桿菌致敏的動(dòng)物血液中只有本底濃度的IFN～γ。ESAT-6的應(yīng)用明顯的提高了IFN～γ試驗(yàn)的特異性，而敏感性卻有所降低。與PPD-IFN～γ相比，其敏感性約為84～88％，而其特異性則很高，可達(dá)到99％～100％。IFN～γ對(duì)PPD的應(yīng)答在結(jié)核病人及健康的BCG免疫接種者之間無(wú)明顯差異，而未接種過(guò)BCG的健康者其IFN～γ對(duì)PPD的應(yīng)答明顯低于前兩者(P＜0.01)。除ESAT-6外，研究者們?cè)诮Y(jié)核桿菌濾液中又發(fā)現(xiàn)了一種結(jié)核桿菌特異性抗原，其分子量為10KD，命名為CFP10，ESAT-6基因位于RD1區(qū)，CFP10基因亦屬于ESAT-6基因家族成員，CFP10基因與ESAT-6基因具有相同的操縱子。
PPD不能鑒別TB感染、鳥(niǎo)型分枝桿菌致敏及BCG免疫產(chǎn)生的DTH應(yīng)答，而ESAT-6和CFP10則可以，但與ESAT-6相比，有少數(shù)動(dòng)物在鳥(niǎo)型分枝桿菌致敏及BCG免疫時(shí)會(huì)對(duì)CFP10產(chǎn)生輕微的非特異性陽(yáng)性DTH反應(yīng)。Laurens.A.H.Van Pinxteren等的研究表明在用PPD刺激下IFN～γ的應(yīng)答率為95％，而ESAT-6和CFP10均為60％，ESAT-6-CFP10重組體為70％；在牛則為75％，ESAT-6和CFP10分別為70％和40％，ESAT-6-CFP10重組體則為75％，與PPD相近。IFN～γ對(duì)ESAT-6-CFP10重組蛋白的應(yīng)答在結(jié)核病患者與健康者之間差異顯著(P＜0.01)。在TB患者中，IFN～γ對(duì)PPD和重組ESAT-6C-FP10的應(yīng)答之間差異不顯著，但在健康者中，對(duì)兩者的應(yīng)答差異極為顯著(P＜0.0001)。
以抗原刺激下IFN～γ的分泌量大于300pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)，PPD的敏感性為91％，但特異性為0。ESAT-6-CFP10重組抗原的特異性和敏感性分別為73％和71％，若以IFN～γ的分泌量大于100pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)則敏感性和特異性分別為82％和7％，ESAT-6-CFP10則為73％和93％，由此PPD與重組抗原之間的敏感性差異并不顯著，而特異性間的差異則極為顯著(P＜0.0001)?？梢?jiàn)結(jié)核桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP10具有其它診斷試劑如PPD等無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。
除ESAT-6和CFP10外，結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液中提純的抗原還有MPB59、MPB64、MPB70、MPB80、MPB83、Ag85等，其中研究較為廣泛的是MPB70和Ag85。
MPB70是由結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液中分離出來(lái)的一種高度菌種特異性蛋白，其分子量為22KD。PPD中的其中一種成份即為MPB70，此外它也是牛分枝桿菌BCG株中的一種主要的抗原蛋白。牛分枝桿菌皮膚試驗(yàn)刺激感染動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，在一定條件下，可以使血清中抗MPB70抗體水平在短期內(nèi)迅速升高。在皮膚試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MPB70是一種嚴(yán)格的牛分枝桿菌BCG特異性抗原，在牛分枝桿菌BCG致敏的豚鼠體內(nèi)MPB70可誘導(dǎo)DTH反應(yīng)，而在H37RV和堪薩斯分枝桿菌致敏的豚鼠體內(nèi)則不能誘導(dǎo)此反應(yīng)。這說(shuō)明MPB70具有菌種特異性。Morten Harboe等對(duì)比感染了牛分枝桿菌、禽分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌和假結(jié)核棒狀桿菌的動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的針對(duì)MPB70的抗體ELISA試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MPB70抗體群對(duì)于感染牛分枝桿菌的動(dòng)物是高度特異的。P.R.Wood等的試驗(yàn)結(jié)果表明MPB70--ELISA試驗(yàn)的特異性為96.1％，但其敏感性較低，只有18.1％。而以MPB70進(jìn)行的IFN～γ的特異性和敏感性可分別達(dá)到99.1％和81.8％。
目前，人們對(duì)結(jié)核桿菌多種抗原的研究主要集中于對(duì)其抗原“雞尾酒”的分析。經(jīng)過(guò)大量研究證實(shí)雞尾酒皮膚試驗(yàn)比任何單一抗原都要強(qiáng)，而且隨著抗原數(shù)量的增多而增強(qiáng)。以豚鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行的分析表明，應(yīng)用“雞尾酒”式的多種抗原作為結(jié)核桿菌診斷試劑是可行的。對(duì)“雞尾酒”抗原應(yīng)答的T細(xì)胞數(shù)量顯著比其中一種抗原應(yīng)答的量多。結(jié)核桿菌“雞尾酒”式的特異性抗原在牛型分枝桿菌BCG免疫鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)DTH反應(yīng)，但在禽型分枝桿菌免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)卻不存在此反應(yīng)。
此外，在結(jié)核桿菌診斷的血清學(xué)方法中，“雞尾酒”式的多種抗原應(yīng)用也有助于此方法特異性和敏感性的提高。血清學(xué)試驗(yàn)不像細(xì)菌學(xué)方法需鑒定其中致病菌的存在，只需檢測(cè)機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌的免疫應(yīng)答即可。血清學(xué)方法簡(jiǎn)便、迅速、所需花費(fèi)較少，而且此方法可鑒別顯性感染和隱性感染。人們對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗體應(yīng)答的認(rèn)識(shí)均來(lái)自于血清學(xué)試驗(yàn)，在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)單一抗原無(wú)法產(chǎn)生令人滿(mǎn)意的血清學(xué)診斷結(jié)果。如免疫優(yōu)勢(shì)抗原38KD的血清學(xué)試驗(yàn)在痰涂片陽(yáng)性肺結(jié)核桿菌中的敏感性為80％，而在陰性病例中僅為15％。Maria Laura Gennaro以不同的單一抗原及多種抗原混合物作為包被抗原進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，結(jié)果表明以單一抗原進(jìn)行的ELISA試驗(yàn)只有少數(shù)幾種抗原如38KD、14KD、ESAT-6和MPT32具有相對(duì)較高的敏感性，而以多種抗原混合物進(jìn)行的ELISA試驗(yàn)均具有較高的敏感性，其中以6種抗原混合的結(jié)果最好。進(jìn)一步證明了以多種抗原雞尾酒作為診斷試劑的優(yōu)勢(shì)所在，這就迫使人們把研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到多種抗原上。
到目前為止，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦牛結(jié)核病的診斷方法只有結(jié)核菌素(PPD)變態(tài)反應(yīng)。該方法在牛結(jié)核病的診斷和防制過(guò)程中起到了重要的作用，美國(guó)和歐共體的許多國(guó)家利用該方法消滅和控制了牛結(jié)核病，以至于現(xiàn)在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)仍以該方法作為牛結(jié)核病法定的檢疫方法。但該診斷方法存在許多弊端，除物理的和化學(xué)的因素之外，更多的是非典型分枝桿菌的干擾，常造成非特異反應(yīng)的發(fā)生。隨著該方法的嚴(yán)格性、非特異反應(yīng)越來(lái)越重，以至于該方法的特異性大為降低。因此，尋求特異敏感的診斷抗原已成為牛結(jié)核病診斷技術(shù)研究的重要方面。
在結(jié)核桿菌血清學(xué)試驗(yàn)中，ELISA作為IT(傳統(tǒng)結(jié)核桿菌試驗(yàn))的補(bǔ)充試驗(yàn)對(duì)于鑒別IT陰性和假陰性反應(yīng)具有重要作用。在西方一些國(guó)家，ELISA診斷方法在結(jié)核桿菌流行病學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用大大縮減了對(duì)牛結(jié)核病控制與消滅計(jì)劃的開(kāi)支，但同時(shí)有報(bào)道稱(chēng)ELISA試驗(yàn)在結(jié)核桿菌診斷上的敏感性只有47.5％。以多種抗原“雞尾酒”進(jìn)行ELISA試驗(yàn)有望提高其反應(yīng)的敏感性。
以“雞尾酒”多種抗原進(jìn)行牛結(jié)核病診斷有望提高其反應(yīng)的敏感性和特異性。應(yīng)用多抗原進(jìn)行診斷試劑的研究，需要將多種抗原分別進(jìn)行表達(dá)和純化(或分別進(jìn)行提純)，不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且還存在配合比例不均的問(wèn)題，這有可能影響診斷方法的敏感性和特異性的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種敏感性和特異性高的牛結(jié)核病診斷抗原蛋白。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種診斷牛結(jié)核病的重組抗原蛋白，它是由牛分枝桿菌MPB70抗原蛋白、MPB83抗原蛋白和ESAT-6抗原蛋白依次連接而形成的融合蛋白，其中所述的MPB70抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的MPB83抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的ESAT-6抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
所述的重組抗原蛋白其特征是MPB70抗原蛋白和MPB83抗原蛋白之間以及MPB83抗原蛋白和ESAT-6抗原蛋白之間具有連接肽序列(-SPGS-)。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備所述的診斷牛結(jié)核病的重組抗原蛋白的方法。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種制備診斷牛結(jié)核病的重組抗原蛋白的方法，步驟如下1)利用序列表SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示的核苷酸序列為引物，擴(kuò)增出MPB70基因；利用序列表SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示的核苷酸序列為引物，擴(kuò)增出MPB83基因；利用序列表SEQ ID NO9和SEQ IDNO10所示的核苷酸序列為引物，擴(kuò)增出ESAT-6基因，2)以SEQ ID NO5和SEQ ID NO8核苷酸序列為引物，以MPB70基因和MPB83基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3)回收步驟2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，然后與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到受體菌中，獲得含有MPB70-MPB83串連基因的重組表達(dá)載體。
4)將含有MPB70-MPB83串連基因的重組質(zhì)粒雙酶切后與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的ESAT-6基因進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和表達(dá)，將所表達(dá)重組蛋白收集、純化即得。
上述制備方法中，其中步驟1)中擴(kuò)增MPB70基因、MPB83基因和ESAT-6基因所用的模板是牛分枝桿菌Vallee菌株基因組DNA；步驟3)中將回收的MPB70-MPB83基因分別用限制性?xún)?nèi)切酶KpnI和BamHI進(jìn)行酶切，然后與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的表達(dá)載體pET32a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DE3受體菌中；步驟4)中將含有MPB70-MPB83串連基因的重組質(zhì)粒用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的ESAT-6基因進(jìn)行連接。
上述制備方法將多種抗原置于同一個(gè)表達(dá)載體中進(jìn)行串連表達(dá)，這不僅解決了多抗原分別表達(dá)和純化費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等問(wèn)題，而且還解決了配比不均的問(wèn)題，有利于提高診斷方法的敏感性和特異性。同時(shí)，在每個(gè)抗原基因之間加入了連接肽，能夠使每個(gè)抗原蛋白獨(dú)立發(fā)揮各自的功能而不相互影響，所以由本發(fā)明方法所制備的牛結(jié)核病診斷重組抗原蛋白與現(xiàn)有牛結(jié)核病診斷抗原蛋白相比具有敏感性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，在牛結(jié)核病診斷方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明重組蛋白抗原可用于牛結(jié)核病ELISA和皮試變態(tài)反應(yīng)的診斷抗原。


圖1MPB70-MPB83串連基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果AMPB70-MPB83二基因串連的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BDL2000marker。
圖2MPB70-MPB83串連二基因重組質(zhì)粒的酶切鑒定ADL2000marker，BMPB70-MPB83串連二基因重組質(zhì)粒的酶切。
圖3MPB70-MPB83-ESAT-6三基因串連重組質(zhì)粒的酶切鑒定ADL2000marker，BMPB70-MPB83-ESAT-6三基因串連重組質(zhì)粒的酶切。
圖4三基因串連重組質(zhì)粒的表達(dá)A蛋白質(zhì)中分子量marker，B和C細(xì)菌裂解上清，D和E全菌裂解液，F(xiàn)pET32a載體對(duì)照。
以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明牛結(jié)核病診斷重組抗原蛋白的制備MPB70基因的PCR擴(kuò)增牛分枝桿菌Vallee菌株基因組DNA(中國(guó)生物藥品檢定所)1ul，引物MPB70-F和MPB70-R各1ul(MPB70-FAGGGTACCATGGAATACGCGGCAGCCAAT，SEQ ID NO5，MPB70-RGGAACCTGGAGACGCCGGAGGCATTAG，SEQ ID NO6)，引物濃度為20pMol，10×TagDNA聚合酶Buffer5ul、2.5mM dNTP3ul、pfu TagDNA聚合酶0.5ul，以水補(bǔ)足，反應(yīng)體系為50ul，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為483bp。PCR反應(yīng)的條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。在1.5％的瓊脂搪凝膠上進(jìn)行電泳，100V電壓20分鐘后觀察結(jié)果。然后用膠回收試劑盒進(jìn)行MPB70基因的回收。
MPB83基因的PCR擴(kuò)增牛分枝桿菌Vallee菌株基因組DNA 1ul，引物MPB83-F和MPB83-R各1ul(MPB83-FTCTCCAGGTTCCATCAACGTTCAGGCCAAAC，SEQ IDNO7，MPB83-RTGTGGATCCCGGAGACACCGTATCGATCAT，SEQ IDNO8)，引物濃度為20pMol，10×TagDNA聚合酶Buffer5ul、2.5mM dNTP3ul、pfu TagDNA聚合酶0.5ul，以水補(bǔ)足，反應(yīng)體系為50ul，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為669bp。PCR反應(yīng)的條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。在1.5％的瓊脂搪凝膠上進(jìn)行電泳，100V電壓20分鐘后觀察結(jié)果。然后應(yīng)用膠回收試劑盒進(jìn)行MPB83基因回收。
ESAT-6基因的PCR擴(kuò)增牛分枝桿菌Vallee菌株基因組DNA 1ul，引物ESAT-6-F和ESAT-6-R各1ul(ESAT-6-FACGGGATCCGAGCAGCAGTGGAATTTC，SEQ ID NO9，ESAT-6-RGCCGAATTCCTATGCGAACATCCCAGTG，SEQ ID NO10)，引物濃度為20pMol，10×TagDNA聚合酶Buffer5ul、2.5mM dNTP3ul、pfuTagDNA聚合酶0.5ul，以水補(bǔ)足，反應(yīng)體系為50ul，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為288bp。PCR反應(yīng)的條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，63℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。在1.5％的瓊脂搪凝膠上進(jìn)行電泳，100V電壓20分鐘后觀察結(jié)果。然后應(yīng)用膠回收試劑盒進(jìn)行ESAT-6基因回收。
MPB70基因和MPB83基因的串連回收的MPB70PCR產(chǎn)物和MPB83PCR產(chǎn)物各1ul，引物MPB70-FAGGGTACCATGGAATACGCGGCAGCCAAT，MPB83-RTGTGGATCCCGGAGACACCGTATCGATCAT，引物各1ul，10×TagDNA聚合酶Buffer 5ul、2.5mM dNTP 3ul、Ex TagDNA聚合酶0.5ul，以水補(bǔ)足，反應(yīng)體系為50ul，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為1152bp。PCR反應(yīng)的條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。在1.5％的瓊脂搪凝膠上進(jìn)行電泳，100V電壓20分鐘后觀察結(jié)果。然后應(yīng)用膠回收試劑盒進(jìn)行MPB70-MPB83基因回收。結(jié)果PCR擴(kuò)增出1152bp的DNA片斷(見(jiàn)圖1)，與實(shí)際設(shè)計(jì)的大小相符。
MPB70-MPB83串連二基因的分子克隆將回收的MPB70-MPB83基因分別用限制性?xún)?nèi)切酶KpnI和BamHI進(jìn)行酶切，然后與經(jīng)過(guò)同樣處理的表達(dá)載體pET32a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DE3受體菌中，經(jīng)過(guò)質(zhì)粒提取及重組質(zhì)粒的鑒定，獲得含有MPB70-MPB83串連基因的重組表達(dá)載體。結(jié)果經(jīng)過(guò)酶切鑒定(見(jiàn)圖2)和序列測(cè)定，表明已經(jīng)構(gòu)建成功含有二基因串聯(lián)的重組表達(dá)載體。
所述的MPB70基因、MPB83基因和ESAT-6基因的串連三基因的分子克隆將含有MPB70-MPB83串連基因的重組質(zhì)粒用BamHI和EcoRI進(jìn)行酶切后與經(jīng)過(guò)同樣處理的ESAT-6基因進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和表達(dá)。
結(jié)果經(jīng)過(guò)酶切鑒定(如圖3所示)和序列測(cè)定(SEQ ID NO4所示的核苷酸序列)，表明已經(jīng)構(gòu)建成功含有三基因串聯(lián)的重組表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行了表達(dá)(如圖4所示)，表達(dá)的重組蛋白與實(shí)際設(shè)計(jì)的大小相符。將IPTG誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)過(guò)離心、洗滌后進(jìn)行超聲波裂解，高速離心后收集上清液，應(yīng)用親和層析柱進(jìn)行純化，測(cè)定純化后的蛋白濃度，測(cè)定的蛋白濃度為0.2mg/ml。純化后的蛋白置于-70℃保存。
本發(fā)明重組抗原蛋白的診斷效果試驗(yàn)將本發(fā)明實(shí)施例所表達(dá)的重組蛋白純化后，所純化的重組蛋白可以作為ELISA的診斷抗原，用于臨床樣品的檢測(cè)，能夠達(dá)到“雞尾酒”式的多種抗原的診斷效果。
ELISA檢測(cè)程序1、將純化后的重組抗原用pH9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋后進(jìn)行包被ELISA板(Nunco公司)，50μl/孔，4℃過(guò)夜；2、次日甩掉液體，加3％明膠(Sigma)進(jìn)行封閉，100μl/孔37℃濕盒1h；3、取出后甩掉液體，用pH7.6的PBST洗滌3次，200μl/孔每次3min；4、加用PBST稀釋后的待檢血清，50μl/孔37℃濕盒1h，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；5、取出后甩掉液體，用pH7.6的PBST洗滌3次，200μl/孔每次3min；6、加用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗牛的二抗(Sigma公司)，50μl/孔，37℃濕盒1h；7、取出后甩掉液體，用pH7.6的PBST洗滌3次，200μl/孔每次3min；8、加底物50μl/孔，避光室溫放置10min顯色；9、加50μl/孔2M H2SO4終止反應(yīng)，495nm測(cè)定OD值。
10、結(jié)果判定OD＞0.5為陽(yáng)性，OD＜0.5為陰性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 本發(fā)明重組抗原蛋白的ELISA診斷效果試驗(yàn)

說(shuō)明供試樣品的數(shù)值結(jié)果大于等于0.5為陽(yáng)性結(jié)果表明采用本發(fā)明重組表達(dá)的蛋白質(zhì)作為抗原，可用間接ELISA試驗(yàn)方法檢測(cè)牛結(jié)核病，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率高，說(shuō)明本發(fā)明重組蛋白抗原具有很高的特異性和敏感性，可用于牛結(jié)核病的血清學(xué)診斷。此外，該重組抗原還可作為用于牛結(jié)核病皮試變態(tài)反應(yīng)的診斷抗原。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>一種診斷牛結(jié)核病的重組抗原蛋白及其制備方法<130>20050127<160>10<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>156<212>PRT<213>Mycobacterium bovis<400>1Gly Thr Glu Tyr Ala Ala Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ala Ser Val Gln1 5 10 15Gly Met Ser Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu20 25 30Leu Thr Thr Leu Thr Ala Leu Ser Ala Gly Gln Leu Asn Pro Gln Val35 40 45Asn Leu Val Asp Thr Leu Asn Ser Gly Gln Tyr Thr Val Phe Ala Arg50 55 60Thr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr Ile Asp Glu Leu65 70 75 80Lys Thr Asn Ser Ser Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr Tyr His Val Val85 90 95Ala Gly Gln Thr Ser Pro Ala Asn Val Val Gly Thr Arg Gln Thr Leu100 105 110Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Thr Gly Gln Gly Asn Ser Leu Lys Val115 120 125Gly Asn Ala Asp Val Val Cys Gly Gly Val Ser Thr Ala Asn Ala Thr130 135 140Val Tyr Met Ile Asp Ser Val Leu Met Pro Pro Ala
145150 155<210>2<211>213<212>PRT<213>Mycobacterium bovis<400>2Ile Asn Val Gln Ala Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ser Leu Ala Ala Ile1 5 10 15Ala Ile Ala Phe Leu Ala Gly Cys Ser Ser Thr Lys Pro Val Ser Gln20 25 30Asp Thr Ser Pro Lys Pro Ala Thr Ser Pro Ala Ala Pro Val Thr Thr35 40 45Ala Ala Met Ala Asp Pro Ala Ala Asp Leu Ile Gly Arg Gly Cys Ala50 55 60Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Pro Thr Gly Pro Gly Ser Val Ala Gly Met65 70 75 80Ala Gln Asp Pro Val Ala Thr Ala Ala Ser Asn Asn Pro Met Leu Ser85 90 95Thr Leu Thr Ser Ala Leu Ser Gly Lys Leu Asn Pro Asp Val Asn Leu100 105 110Val Asp Thr Leu Asn Gly Gly Glu Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn115 120 125Ala Ala Phe Asp Lys Leu Pro Ala Ala Thr Ile Asp Gln Leu Lys Thr130 135 140Asp Ala Lys Leu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Tyr His Val Ile Ala Gly145 150 155 160Gln Ala Ser Pro Ser Arg Ile Asp Gly Thr His Gln Thr Leu Gln Gly165 170 175Ala Asp Leu Thr Val Ile Gly Ala Arg Asp Asp Leu Met Val Asn Asn180 185 190
Ala Gly Leu Val Cys Gly Gly Val His Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr195 200 205Met Ile Asp Thr Val210<210>3<211>93<212>PRT<213>Mycobacterium bovis<400>3Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile1 5 10 15Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln20 25 30Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala35 40 45Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn50 55 60Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala65 70 75 80Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala85 90<210>4<211>1419<212>DNA<213>Mycobacterium bovis<400>4ggtaccgaat acgcggcagc caatcccact gggccggcct cggtgcaggg aatgtcgcag60gacccggtcg cggtggcggc ctcgaacaat ccggagttga caacgctgac ggctgcactg120tcgggccagc tcaatccgca agtaaacctg gtggacaccc tcaacagcgg tcagtacacg180gtgttcgcac ggaccaacgc ggcatttagc aagctgccgg catccacgat cgacgagctc240aagaccaatt cgtcactgct gaccagcatc ctgacctacc acgtagtggc cggccaaacc300
agcccggcca acgtcgtcgg cacccgtcag accctccagg gcgccagcgt gacggtgacc 360ggtcagggta acagcctcaa ggtcggtaac gccgacgtcg tctgtggtgg ggtgtctacc 420gccaacgcga cggtgtacat gattgacagc gtgctaatgc ctccggcgtc tccaggttcc 480atcaacgttc aggccaaacc ggccgcagca gcgagcctcg cagccatcgc gattgcgttc 540ttagcgggtt gttcgagcac caaacccgtg tcgcaagaca ccagcccgaa accggcgacc 600agcccggcgg cgcccgttac cacggcggca atggctgacc ccgcagcgga cctgattggt 660cgtgggtgcg cgcaatacgc ggcgcaaaat cccaccggtc ccggatcggt ggccggaatg 720gcgcaagacc cggtcgctac cgcggcttcc aacaacccga tgctcagtac cctgacctcg 780gctctgtcgg gcaagctgaa cccggatgtg aatctggtcg acaccctcaa cggcggcgag 840tacaccgttt tcgcccccac caacgccgca ttcgacaagc tgccggcggc cactatcgat 900caactcaaga ctgacgccaa gctgctcagc agcatcctga cctaccacgt gatagccggc 960caggcgagtc cgagcaggat cgacggcacc catcagaccc tgcaaggtgc cgacctgacg 1020gtgataggcg cccgcgacga cctcatggtc aacaacgccg gtttggtatg tggcggagtt 1080cacaccgcca acgcgacggt gtacatgatc gatacggtgt ctccgggatc cgagcagcag 1140tggaatttcg cgggtatcga ggccgcggca agcgcaatcc agggaaatgt cacgtccatt 1200cattccctcc ttgacgaggg gaagcagtcc ctgaccaagc tcgcagcggc ctggggcggt 1260agcggttcgg aggcgtacca gggtgtccag caaaaatggg acgccacggc taccgagctg 1320aacaacgcgc tgcagaacct ggcgcggacg atcagcgaag ccggtcaggc aatggcttcg 1380accgaaggca acgtcactgg gatgttcgca taggaattc 1419<210>5<211>29<212>DNA<213>Artificial<220>
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<223>
<400>10gccgaattcc tatgcgaaca tcccagtg
權(quán)利要求
1.一種診斷牛結(jié)核病的重組抗原蛋白，它是由牛分枝桿菌MPB70抗原蛋白、MPB83抗原蛋白和ESAT-6抗原蛋白依次連接而形成的融合蛋白，其中所述的MPB70抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的MPB83抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的ESAT-6抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的重組抗原蛋白，其特征是MPB70抗原蛋白和MPB83抗原蛋白之間以及MPB83抗原蛋白和ESAT-6抗原蛋白之間具有連接肽序列。
3.按照權(quán)利要求1所述的重組抗原蛋白，其特征是MPB70抗原蛋白位于該重組抗原蛋白的氨基端，ESAT-6抗原蛋白位于該重組抗原蛋白的羧基端。
4.編碼權(quán)利要求1～3中任意一項(xiàng)所述的重組抗原蛋白基因。
5.按照權(quán)利要求4所述的基因，其特征是選自如下的任一核苷酸序列1)具有序列表SEQ ID NO4所示的核苷酸序列；2)由在嚴(yán)緊的雜交條件下與SEQ ID NO4所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
6.按照權(quán)利要求5所述的基因，其特征是具有序列表SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
7.制備權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的重組抗原蛋白的方法，步驟如下1)利用序列表SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示的核苷酸序列為引物，擴(kuò)增出MPB70基因；利用序列表SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示的核苷酸序列為引物，擴(kuò)增出MPB83基因；利用序列表SEQ ID NO9和SEQ IDNO10所示的核苷酸序列為引物，擴(kuò)增出ESAT-6基因，2)以SEQ ID NO5和SEQ ID NO8核苷酸序列為引物，以MPB70基因和MPB83基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3)回收步驟2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，然后與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到受體菌中，獲得含有MPB70-MPB83串連基因的重組表達(dá)載體。4)將含有MPB70-MPB83串連基因的重組質(zhì)粒雙酶切后與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的ESAT-6基因進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和表達(dá)，將所表達(dá)重組蛋白收集、純化即得。
8.按照權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是步驟3)中將回收的MPB70-MPB83基因分別用限制性?xún)?nèi)切酶KpnI和BamHI進(jìn)行酶切，然后與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的表達(dá)載體pET32a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DE3受體菌中。
9.按照權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是步驟4)中將含有MPB70-MPB83串連基因的重組質(zhì)粒用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的ESAT-6基因進(jìn)行連接。
10.權(quán)利要求1～4所述的重組抗原蛋白在制備檢測(cè)、診斷牛結(jié)核病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的診斷牛結(jié)核病的重組抗原蛋白，該重組抗原蛋白是由牛分枝桿菌MPB70抗原蛋白、MPB83抗原蛋白和ESAT－6抗原蛋白依次連接而形成的融合蛋白，其中所述的MPB70抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的MPB83抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的ESAT－6抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的重組抗原蛋白對(duì)于牛結(jié)核病的診斷具有敏感性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，在牛結(jié)核病診斷方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1810838SQ20051000500
公開(kāi)日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2005年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者劉思國(guó), 郭設(shè)平, 王春來(lái), 張秀華, 郭洋, 邵美麗 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所