專利名稱：多陣列、多特異性的電化學(xué)發(fā)光檢驗(yàn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種用于基于電化學(xué)發(fā)光的檢驗(yàn)的、成圖案的(patterned)多陣列、多特異性的表面(PMAMS)，以及制造和使用PMAMS的方法。
2.背景技術(shù)2.1.診斷測(cè)定從經(jīng)濟(jì)上考慮，強(qiáng)烈地需要快速、靈敏的診斷技術(shù)。診斷技術(shù)在各種各樣的經(jīng)濟(jì)市場(chǎng)上都是重要的，這些經(jīng)濟(jì)市場(chǎng)包括健康保健、研究、農(nóng)業(yè)、獸醫(yī)和工業(yè)市場(chǎng)。在靈敏度、所需的時(shí)間、易于使用性、耐用性或成本方面的改進(jìn)可以開辟尚無可滿足市場(chǎng)需要的技術(shù)的全新的診斷市場(chǎng)。某些診斷技術(shù)可具有高靈敏度，但太貴而不能滿足市場(chǎng)需要。其它一些技術(shù)可能是成本效益高，但對(duì)于各種市場(chǎng)來說，不足夠耐用。在診斷行業(yè)中，能夠綜合這些特性的全新診斷技術(shù)是一個(gè)顯著的進(jìn)步和機(jī)會(huì)。
有大量不同的分析技術(shù)用于診斷用途。這些技術(shù)包括放射性標(biāo)記、酶聯(lián)免疫測(cè)定、化學(xué)比色測(cè)定、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。這些技術(shù)的每一種都獨(dú)特地綜合了靈敏度水平、易于使用性、耐用性、速度和成本這幾個(gè)因素，這幾個(gè)因素確定和限制了它們?cè)诓煌脑\斷市場(chǎng)的應(yīng)用。這些差別部分源自每種技術(shù)所固有的物理約束。例如，放射性標(biāo)記本來就不耐用，這是因?yàn)闃?biāo)記本身衰變，并且對(duì)于許多應(yīng)用來說，所產(chǎn)生的放射性廢物的處理還導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)、安全和環(huán)境方面的開支。
目前所用的許多靈敏的診斷技術(shù)都受到市場(chǎng)的制約，這主要是因?yàn)樾枰炀毜募夹g(shù)人員來進(jìn)行檢驗(yàn)。例如，目前所用的電化學(xué)發(fā)光方法不僅需要熟練的技術(shù)人員，而且還需要反復(fù)的清洗和準(zhǔn)備步驟。這既增加了成本，又進(jìn)一步需要處理廢物。既簡(jiǎn)化檢驗(yàn)步驟又降低每次檢驗(yàn)的成本的全新診斷法，對(duì)于開辟新市場(chǎng)及放改善現(xiàn)有市場(chǎng)的操作都是極為重要和有用的。
2.2.電化學(xué)發(fā)光測(cè)定電化學(xué)發(fā)光(“ECL”)是這樣一種現(xiàn)象，其中，電激發(fā)的物質(zhì)發(fā)射光子(例如，見Leland和Powell，1990年，電化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Electrochem.Soc.)137(10)3127-3131)。這樣的物質(zhì)叫作ECL標(biāo)記物，而這里也叫作TAG(標(biāo)記物)。通常所用的ECL標(biāo)記物包括金屬有機(jī)化合物，其中，金屬例如選自第VIII族的貴金屬，所述金屬有機(jī)化合物包括含有釕的和含有鋨的金屬有機(jī)化合物，例如，釕(2，2′-雙吡啶)3+部分(也叫作“Rubpy”)，例如，為Bard等人所公開(美國(guó)專利US5,238,808)。ECL標(biāo)記物所產(chǎn)生的光可在診斷方法中用作信息信號(hào)(reporter signal)(Bard等人的美國(guó)專利US 5,221,605)。例如，ECL標(biāo)記物可以與諸如抗體或核酸探針那樣的結(jié)合試劑共價(jià)結(jié)合。ECL標(biāo)記物/結(jié)合試劑復(fù)合物可用來測(cè)定各種物質(zhì)(Bard等人的美國(guó)專利US5,238,808)。對(duì)于基于ECL的檢測(cè)系統(tǒng)來說，極為重要的是需要電勢(shì)來激發(fā)ECL標(biāo)記物發(fā)射光子。電勢(shì)波形橫跨一個(gè)電極表面(典型的是一個(gè)金屬表面)和一個(gè)反電極施加到一種ECL測(cè)定溶液(例如，見美國(guó)專利US 5,068,088；US 5,093,268；US 5,061,445；US 5,238,808；US5,147,806；US 5,247,243；US 5,296，191；US 5,310,687；US 5,221,605)中。
本領(lǐng)域有各種周知的裝置可用來進(jìn)行和檢測(cè)ECL反應(yīng)。例如，Zhang等人(美國(guó)專利US 5,324,457公開了用來進(jìn)行ECL的用于電化學(xué)電池的示例電極。Levantis等人(美國(guó)專利US 5,093,268)公開了用于進(jìn)行ECL反應(yīng)的電化學(xué)電池。Kamin等人(美國(guó)專利US 5,147,806)公開了用于進(jìn)行和檢測(cè)ECL反應(yīng)的裝置，包括電壓控制裝置。Zoski等人(美國(guó)專利US 5,061,445)公開了用于進(jìn)行和檢測(cè)ECL反應(yīng)的裝置，該裝置包括用于引發(fā)ECL反應(yīng)的電勢(shì)波形圖、數(shù)字/模擬轉(zhuǎn)換器、控制裝置、檢測(cè)裝置，并公開了用于檢測(cè)ECL反應(yīng)在工作電極處所產(chǎn)生的電流的方法，以便給電子控制裝置提供反饋信息。
例如，美國(guó)專利US 5,093,268詳細(xì)評(píng)論了ECL技術(shù)。簡(jiǎn)而言之，ECL技術(shù)是一種檢測(cè)在樣品中以較小的濃度存在于該樣品中的所感興趣的被分析物的方法。
在上面作為參考的被授權(quán)的專利中稱作TAG的ECL部分可以與被分析物結(jié)合，也可以不與被分析物結(jié)合，但對(duì)每種情況，由于從工作電極所接收的電能所觸發(fā)的一系列化學(xué)反應(yīng)，該ECL部分被促進(jìn)到一種激發(fā)態(tài)。有益地提供了一種促進(jìn)TAG的ECL的分子，例如，草酸鹽，或更優(yōu)選的是三丙胺(見美國(guó)專利US 5,310,687)。
2.3.商用ECL測(cè)定迄今為止，所有的商用ECL反應(yīng)都是在厘米級(jí)的電極表面進(jìn)行。厘米級(jí)電極在源自較大電極的ECL信號(hào)的強(qiáng)度增強(qiáng)和對(duì)每種測(cè)定所需的總樣品量減少的希望之間達(dá)到統(tǒng)一。不過，即或厘米級(jí)的電極也不能獲得許多測(cè)定所要求的靈敏度。為解決這個(gè)問題，所有的商用ECL系統(tǒng)還利用帶涂層的磁珠來捕獲ECL被分析物或試劑以提高靈敏度。然后，使所述珠靠近工作電極以提高靈敏度。
不過，采用磁珠有許多限制。珠本身涂覆有隨時(shí)間推移而剝落和降解的蛋白質(zhì)，引起信號(hào)變化。由于在處理和格式化基于珠的測(cè)定時(shí)的復(fù)雜性，商用ECL診斷要求對(duì)于每個(gè)用給定的樣品進(jìn)行的測(cè)定有一套復(fù)雜、順序進(jìn)行的程序，這對(duì)于每個(gè)要進(jìn)行的檢驗(yàn)來說，增加了時(shí)間和成本。5微米大小的珠防止了絕大多數(shù)的珠結(jié)合的ECL TAG到達(dá)鄰近工作電極的薄膜，這導(dǎo)致低效率地激發(fā)ECL TAG。
Leventis等人(美國(guó)專利US 5,093,268)提出了一種同時(shí)測(cè)定一種以上的不同的被分析物的方法，這種方法是對(duì)每種被分析物采用不同的ECL標(biāo)記物，在一次單獨(dú)的測(cè)定中，每種ECL標(biāo)記物對(duì)于每種不同的被分析物以不同波長(zhǎng)發(fā)射光子。不過，這種技術(shù)還是有局限性，例如，不能利用充足數(shù)量的以不同波長(zhǎng)輻射的有效的ECL標(biāo)記物，還需要優(yōu)化每種ECL標(biāo)記物的化學(xué)條件。這些實(shí)際的限制已防止了這樣的多波長(zhǎng)、多被分析物的ECL檢測(cè)系統(tǒng)的商品化。
提高ECL靈敏度的另一種方法是改進(jìn)電板技術(shù)。Zhang等人(美國(guó)專利US 5,324,457)已將ECL物質(zhì)膜直接沉積在各種金屬和半導(dǎo)體表面上。Zhang和Bard利用電極表面的整體飽和的技術(shù)導(dǎo)致了(如作者所述的那樣)不適于高靈敏度測(cè)定的不均一的不規(guī)則沉積。
前述那些用于進(jìn)行ECL測(cè)定的方法還要求必須用眾多的方法中的任何一種來對(duì)包括電極在內(nèi)的測(cè)定元件進(jìn)行清洗，所述眾多的方法包括使用稀酸、稀堿、洗滌溶液等，例如，如美國(guó)專利US 5,147,806所公開的那樣。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的、成本效率高的測(cè)定，用于順序或同時(shí)進(jìn)行許多ECL反應(yīng)，而且，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了安裝在內(nèi)部的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物以改進(jìn)精度。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供包含一個(gè)或多個(gè)載體的盒，該載體適于進(jìn)行許多同時(shí)或順序進(jìn)行的ECL反應(yīng)，所述盒還是易于處理的。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的相關(guān)的目的是減少對(duì)于在生物樣品中的所感興趣的被分析物進(jìn)行單獨(dú)測(cè)定的時(shí)間和成本。
本發(fā)明還有一個(gè)進(jìn)一步的相關(guān)的目的是提供對(duì)于在單個(gè)生物樣品中的所感興趣的許多被分析物同時(shí)進(jìn)行許多測(cè)定的方法和裝置。
3.發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種用于進(jìn)行ECL反應(yīng)和測(cè)定的盒，該盒包括許多固定在載體上的離散的結(jié)合區(qū)域，這些離散的結(jié)合區(qū)域與一個(gè)或多個(gè)電極和一個(gè)或多個(gè)反電極的對(duì)在空間位置上對(duì)準(zhǔn)。所述盒優(yōu)選地包括一個(gè)第一載體，這個(gè)第一載體具有許多固定在表面上的離散的結(jié)合區(qū)域。所述盒可具有一個(gè)或多個(gè)電極和一個(gè)或多個(gè)反電極的對(duì)。可通過能有效地觸發(fā)電化學(xué)發(fā)光的電壓波形形式的電能源來單獨(dú)可尋址(addressable)電極和反電極的對(duì)。所述盒還可包括一個(gè)能夠鄰接第一載體放置的第二載體，以便于在它們兩者之間提供含有樣品的裝置和/或用作電極。把結(jié)合區(qū)域在載體表面上構(gòu)成圖案并進(jìn)行制備，以便結(jié)合所感興趣的被分析物或試劑。
本發(fā)明還涉及一種用于測(cè)量樣品的電化學(xué)發(fā)光的裝置，這種裝置提供有載體或盒處理裝置、適于施加能有效地觸發(fā)電化學(xué)發(fā)光的控制電壓波形的電壓控制裝置、用于檢測(cè)來自樣品的電化學(xué)發(fā)光的光子檢測(cè)器裝置以及樣品處理裝置。
本發(fā)明還涉及使用這些用于測(cè)量樣品的電化學(xué)發(fā)光的盒的方法使一個(gè)盒的許多結(jié)合區(qū)域與含有許多所感興趣的被分析物的樣品在ECL測(cè)定條件下接觸，然后在上述許多電極和反電極的對(duì)的每一個(gè)對(duì)處施加能有效地觸發(fā)電化學(xué)發(fā)光的電壓波形，并且檢測(cè)或測(cè)量所觸發(fā)的電化學(xué)發(fā)光。廣而言之，本發(fā)明提供ECL測(cè)定方法，其中，樣品并不與電極接觸。此外，作為使用電極和反電極的對(duì)的一種可供選擇的替換方法，本發(fā)明提供了在整個(gè)結(jié)合區(qū)域上方掃描電極和反電極。
本發(fā)明還提供了包括一些組件的試劑盒，這些組件包括適于同時(shí)測(cè)量許多電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的一些盒、上面固定有許多區(qū)域的載體表面以及用于實(shí)施化學(xué)反應(yīng)的ECL測(cè)定的測(cè)定介質(zhì)。
本發(fā)明還提供由石墨納米管(graphitic nanotube)制備的電極。
4.


圖1說明形成本發(fā)明盒的兩個(gè)載體，其中，在載體10上有許多結(jié)合區(qū)域14，而在載體12上有許多對(duì)應(yīng)的電極16，這樣兩個(gè)載體靠近時(shí)在每個(gè)結(jié)合區(qū)域附近放置一反電極對(duì)。
圖1A說明形成本發(fā)明盒的兩個(gè)載體，其中，在載體10上有許多結(jié)合區(qū)域14，而在載體12上有許多對(duì)應(yīng)的電極16，這樣兩個(gè)載體靠近時(shí)在每個(gè)結(jié)合區(qū)域附近放置一反電極對(duì)。
圖2說明形成本發(fā)明盒的兩個(gè)載體，其中，在載體26上的許多結(jié)合區(qū)域30鄰接單個(gè)電極32中的一個(gè)，從而使得載體26和28靠近時(shí)，在每個(gè)結(jié)合區(qū)域30附件都放置一個(gè)反電極38。
圖3說明形成本發(fā)明盒的兩個(gè)載體，其中，許多結(jié)合區(qū)域48都具有與其鄰接的、在載體44上的電極和反電極的對(duì)50。載體46可任選鄰接載體44放置，這樣載體46提供鄰接結(jié)合區(qū)域48和電極50的含有樣品的裝置。
圖4說明形成本發(fā)明盒的兩個(gè)載體，其中，在載體60上的許多結(jié)合區(qū)域64與被認(rèn)為含有被分析物的樣品接觸。載體62具有區(qū)域66，區(qū)域66含有用于檢測(cè)或測(cè)量所感興趣的被分析物或者用于進(jìn)行所需要的反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)，這樣載體60和載體62靠近時(shí)就使結(jié)合區(qū)域64和區(qū)域66彼此接觸。
圖5A顯示用于多陣列、多特異性結(jié)合表面的成圖案的結(jié)合區(qū)域的俯視圖。幾何形狀、三角形、正方形和圓形代表了對(duì)不同的被分析物特異性的結(jié)合區(qū)域。這些結(jié)合區(qū)域可以是疏水性的或是親水性的。周圍的表面可具有與這些結(jié)合區(qū)域相反的性質(zhì)(親水性的或疏水性的)，以使結(jié)合試劑或被分析物從這些結(jié)合區(qū)域散布開的程度最小。
圖5B顯示用于把結(jié)合試劑和/或被分析物送到那些離散的結(jié)合區(qū)域的微觀流體導(dǎo)管的俯視圖。每個(gè)點(diǎn)顯示了一個(gè)微觀流體導(dǎo)管(例如，毛細(xì)管)的剖面。
圖5C顯示一種微觀流體導(dǎo)管的側(cè)視圖，顯示對(duì)齊或?qū)?zhǔn)的微觀流體導(dǎo)管靠近時(shí)，給成圖案的結(jié)合區(qū)域的一個(gè)多陣列輸送結(jié)合試劑和/或被分析物的情況。每個(gè)微觀流體導(dǎo)管可以給一個(gè)離散的結(jié)合區(qū)域運(yùn)送一種不同的結(jié)合試劑。
圖6A顯示多陣列電極與具有成圖案的多陣列、多特異性結(jié)合區(qū)域的表面靠近對(duì)齊的情況。在所述電極陣列和結(jié)合表面陣列之間示出有一個(gè)可拆卸的電極保護(hù)屏障。整個(gè)裝置包括一個(gè)用于進(jìn)行多種ECL反應(yīng)的盒。
圖6B顯示對(duì)齊的或?qū)?zhǔn)的可尋址的工作陣列和反電極靠近的情況。電極的形狀可以與結(jié)合區(qū)域互補(bǔ)，或是其它形狀(例如，交錯(cuò)對(duì)插的)。
圖7顯示了對(duì)齊或?qū)?zhǔn)的可尋址的工作和反電極以及互補(bǔ)的結(jié)合表面靠近時(shí)一個(gè)陣列的側(cè)視圖，其中，導(dǎo)電聚合物從電極表面生長(zhǎng)出來橫跨電極陣列和結(jié)合區(qū)域之間的縫隙，以便圍繞樣品的ECL標(biāo)記物延伸電勢(shì)場(chǎng)，從而提高ECL反應(yīng)的效率。
圖8顯示了對(duì)齊或?qū)?zhǔn)的可尋址的工作和反電極以及互補(bǔ)的結(jié)合表面靠近時(shí)一個(gè)陣列的側(cè)視圖，兩個(gè)組件之間散布有一些導(dǎo)電粒子，以便延伸電勢(shì)場(chǎng)。通過圍繞樣品的ECL標(biāo)記物延伸電位場(chǎng)，ECL反應(yīng)的效率提高。上述那些導(dǎo)電粒子可以是磁性的，以便于控制。
圖9顯示了對(duì)齊或?qū)?zhǔn)的可尋址的工作和反電極以及互補(bǔ)的結(jié)合表面靠近時(shí)一個(gè)陣列的側(cè)視圖，其中，電極具有延伸進(jìn)電極表面和結(jié)合區(qū)域之間的縫隙的細(xì)的突出部分，這是為了圍繞樣品的ECL標(biāo)記物延伸電勢(shì)場(chǎng)，以便提高ECL反應(yīng)的效率。
圖10顯示了對(duì)齊或?qū)?zhǔn)的可尋址的工作和反電極以及互補(bǔ)的結(jié)合表面在靠近時(shí)一個(gè)陣列的側(cè)視圖，其中，表面并不平行，而是以互補(bǔ)的方式彼此相適合。
圖11顯示了一個(gè)載體的側(cè)視圖，其上有一個(gè)金屬層，以便以一個(gè)盒的形式提供一個(gè)單獨(dú)的電極和結(jié)合表面組合件。在金屬層上成圖案地設(shè)置自組裝的單層的陣列(“SAMs”)。
圖12顯示了一個(gè)載體的側(cè)視圖，其上有一個(gè)金屬層，以便以一個(gè)盒的形式提供一個(gè)單獨(dú)的電極和結(jié)合表面組合件。把一個(gè)SAMs陣列成圖案設(shè)在上述金屬層上，而且，導(dǎo)電微粒散布在成圖案的SAMs中間，以便圍繞樣品的ECL標(biāo)記物延伸電勢(shì)場(chǎng)，從而提高ECL反應(yīng)的效率。
圖13顯示了一個(gè)載體的側(cè)視圖，這個(gè)載體的上面有一個(gè)金屬層，以便以一個(gè)盒的形式提供一個(gè)單獨(dú)的電極和結(jié)合表面組合件。把自組裝的單層即SAM的陣列成圖案設(shè)在上述金屬層上，并且示出一種導(dǎo)電聚合物和/或纖維從ECL標(biāo)記物生長(zhǎng)出來，以便圍繞樣品的ECL標(biāo)記物延伸電勢(shì)場(chǎng)，從而提高ECL反應(yīng)的效率。
圖1是一個(gè)載體的圖，這個(gè)載體具有一個(gè)由計(jì)算機(jī)控制的電極對(duì)陣列。
圖15是具有電極對(duì)陣列的一個(gè)載體的圖。
圖16是一個(gè)具有電極對(duì)陣列的載體和用于控制激發(fā)每個(gè)電極對(duì)過程的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的圖。
圖17是具有電極對(duì)陣列的載體和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的圖，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)具有多個(gè)電壓源和用于控制激發(fā)每個(gè)電極對(duì)過程的多路轉(zhuǎn)換器。
圖18是具有電極對(duì)陣列的載體和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的一張圖，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)具有許多用于控制激發(fā)每個(gè)電極對(duì)過程的換向電壓源。
圖19(a)至19(e)是關(guān)于幾種可供選擇的電極-反電極對(duì)的組合的平面圖。
圖20顯示帶完整的夾層測(cè)定的載體。
圖21顯示了在載體上的兩個(gè)相對(duì)的PMAMS表面。
圖22A顯示了微觀流體導(dǎo)管(2201)陣列和原纖維墊(2200)。
圖22B顯示結(jié)合區(qū)域(2202)。
圖23A顯示通過真空過濾形成原纖維墊的裝置。
圖23B顯示在過濾物膜(2303)上的原纖維墊(2304)。
圖24顯示了利用滾筒來生產(chǎn)原纖維墊。
圖25顯示多層原纖維墊的示意圖，其中，上層有用于測(cè)定的結(jié)合區(qū)域。
圖26顯示用增強(qiáng)非特異結(jié)合的部分衍生的原纖維的示意圖，且有幾種生物的和非生物的物質(zhì)結(jié)合到表面。
圖27顯示用增強(qiáng)非特異結(jié)合的部分衍生的原纖維的示意圖，而且，有幾種物質(zhì)結(jié)合到所衍生的原纖維上，而還有某些物質(zhì)結(jié)合到配體上。
圖28顯示了共價(jià)接合到原纖維上的幾種物質(zhì)，而還有一些物質(zhì)結(jié)合到另外的實(shí)體上。
圖29顯示利用多層原纖維墊作為濾光器，取決于光源的位置在所述墊上或在所述墊內(nèi)，所述多層原纖維墊可以使光通過和/或可以吸收和/或散射光。
圖30A顯示由碳原纖維墊電極上的電化學(xué)測(cè)量所得到的周期性的伏安記錄。
圖30B顯示由金箔電極上的電化學(xué)測(cè)量所得到的周期性的伏安記錄。
圖31比較了原纖維墊的電化學(xué)性質(zhì)隨墊的厚度和掃描速率變化的情況。
圖32說明隨著蛋白質(zhì)溶液中原纖維濃度增加，在原纖維上的非特異結(jié)合一般來說增加。
圖33說明利用表面活性劑可減弱ECL-TAG1-所標(biāo)記的蛋白質(zhì)和碳原纖維之間的非特異結(jié)合。
圖34顯示用于測(cè)量原纖維墊電極上的電化學(xué)性質(zhì)和ECL的實(shí)驗(yàn)元件的俯視圖。
圖35顯示用原纖維墊作為電極以及在溶液中的1000pM的TAG1(實(shí)線)所得到的ECL信號(hào)和來自測(cè)定緩沖劑(無TAG1)的信號(hào)(虛線)。
圖36顯示了兩個(gè)表面PMAMS裝置的示意圖，其中，通過成圖案的介電層分開所支承的兩個(gè)電極陣列。
圖37顯示一個(gè)裝置，這個(gè)裝置在載體上有許多結(jié)合區(qū)域(3702)，而在另一個(gè)載體上有電極和反電極。
圖38示出了一個(gè)盒，其中，結(jié)合區(qū)域設(shè)在支承在反電極上的不同物體的表面上。
圖39示出了與工作和反電極接觸的凝膠。
圖40示出ECL強(qiáng)度和從與工作和反電極接觸的為ECL標(biāo)記的凝膠所得到的周期性伏安記錄。
圖41示出ECL強(qiáng)度和從與工作和反電極接觸的非ECL標(biāo)記的凝膠所得到的周期性伏安記錄。
圖42示出了用于ECL的一個(gè)兩表面盒的示意圖。
圖43說明原纖維墊可用作一個(gè)電極，用于被吸收到該墊上的抗體-TAG1的ECL。
圖44A示出固定在電極上的TAG1所標(biāo)記的蛋白質(zhì)的ECL強(qiáng)度。
圖44B示出涂層電極的周期性伏安記錄。
圖45A顯示源自固定的ECL TAG1標(biāo)記的蛋白質(zhì)的ECL信號(hào)的準(zhǔn)可逆的重復(fù)產(chǎn)生。
圖45B示出局部保留涂層的涂層電極的周期性伏安記錄。
圖46A示出源自固定的ECL TAG1所標(biāo)記的蛋白質(zhì)的ECL信號(hào)的不可逆產(chǎn)生。
圖46B示出基本上損失了涂層的涂層電極的周期性伏安記錄。
圖47顯示多陣列ECL裝置以及一個(gè)含有用于產(chǎn)生和分析ECL信號(hào)的控制器裝置的微處理器。
5.具體實(shí)施方式
因此，本發(fā)明從廣義上來說包括一些用于進(jìn)行多種電化學(xué)測(cè)定的盒。這些盒由一些載體構(gòu)成，這些載體上有許多能特異性地結(jié)合一種或多種所感興趣的被分析物的結(jié)合區(qū)域。這些結(jié)合區(qū)域制成在所述載體上的成圖案的多陣列多特異性表面(“PMAMS”)。PMAMS通過例如大大增加可進(jìn)行的測(cè)定的密度，并通過使得能快速且同時(shí)進(jìn)行多種不同的測(cè)定，為先前已知的ECL測(cè)定方法提供了顯著的改進(jìn)。所述盒可包括許多電極，這些電極能選擇性由結(jié)合到結(jié)合區(qū)域的ECL所標(biāo)記的試劑觸發(fā)光的ECL發(fā)射。圖47示出多陣列ECL裝置，這個(gè)裝置具有電極4700、4704、帶有結(jié)合區(qū)域4706的基質(zhì)4702、以及含有控制器裝置4720的一個(gè)微處理器，控制器裝置4720用于產(chǎn)生和分析經(jīng)由導(dǎo)線4710至4716所連通的ECL信號(hào)。
在圖1所示的本發(fā)明的實(shí)施方案申，盒包括兩個(gè)載體10、12，其中，在第一載體10的表面上有許多結(jié)合區(qū)域14，而在第二載體12的表面上有許多電極/反電極對(duì)16。所述結(jié)合區(qū)域和電極/反電極對(duì)對(duì)準(zhǔn)，從而使得當(dāng)?shù)谝缓偷诙d體10、12靠在一起時(shí)，所述許多電極/反電極對(duì)16的每一對(duì)鄰接上述許多結(jié)合區(qū)域14中的不同的一個(gè)放置。在結(jié)合區(qū)域14的下面的第一載體10優(yōu)選地是具有金膜表面和透明結(jié)合區(qū)域的PMAMS。第二載體12優(yōu)選地是其上具有透明的電極/反電極對(duì)16的透明扁平塑料片。結(jié)合區(qū)域14優(yōu)選通過在載體表面上微觀壓印一種有機(jī)的自組裝的單層(由各種單獨(dú)的單體構(gòu)成)圖案來制備，其中，所述單體具有生物素或連接部分。然后，使抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合到暴露的生物素上(例如，參見美國(guó)專利US 5,093,268)。之后，通過施加諸如生物素標(biāo)記的抗體那樣的離散量的合適的生物標(biāo)記的結(jié)合試劑到已壓印了單層的載體表面上的一些位置來施加結(jié)合試劑，這些結(jié)合試劑能選擇性地結(jié)合所感興趣的被分析物。圖1A說明了包含裝在一個(gè)外殼(11)中的盒(圖1)的系統(tǒng)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，希望把指定量或預(yù)定量的一種或者多種試劑可再現(xiàn)地固定在一個(gè)表面上。固定廣泛地用于任何方法，用這些方法把試劑附著到表面，這些方法包括但不限于共價(jià)化學(xué)結(jié)合、非特異性吸收、在一個(gè)表面上干燥試劑、靜電相互作用、疏水性和/或親水性相互作用、封閉或夾雜在液體或者凝膠中、生物特異性結(jié)合(例如，配體/受體相互作用或寡核苷酸的夾雜)、金屬/配體結(jié)合、螯合作用和/或纏結(jié)在聚合物中。
可以以幾種方式預(yù)先確定固定在表面上的試劑量。例如，可通過一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部存有試劑的容器元件和/或表面元件來規(guī)定在表面上的試劑量。還可通過固定在表面上的試劑的各單一分子的數(shù)目來指定試劑量。可根據(jù)在一給定區(qū)域中某一特定試劑的密度來指定試劑量。可以把試劑量規(guī)定為帶有某一特定試劑的表面占該表面的總面積的百分比、或相對(duì)于在該表面上的其它試劑的量的百分比。還可把試劑量定義為在某特定的表面上給出足夠的ECL強(qiáng)度所必須有的試劑的量，以便使測(cè)定達(dá)到所需的特異性。在一個(gè)特定的例子中，1cm2的金表面面積可涂覆有鏈烷硫醇的一個(gè)單層。
還可把試劑可重復(fù)地固定在有涂層的表面上。涂層可用來增強(qiáng)某些試劑的固定作用和/或減弱或者抑制其它試劑的固定作用。表面可全部涂層，或可給表面局部涂層(即成圖案涂層)。涂層的成份可以一致，或可含有不同組成的元素。在一個(gè)特定的例子中，可把涂層設(shè)成圖案狀的單層膜，該膜在某些區(qū)域通過共價(jià)化學(xué)鍵固定免疫球蛋白G，并防止它固定在其它區(qū)域。
涂層還可用來預(yù)先確定在后續(xù)步驟或過程中固定在表面上的一種或多種試劑的量。也可通過限制沉積的試劑量來控制某一特定試劑的量。
表面上有以定量、可重復(fù)的方式固定的試劑(或涂層)，這樣就能夠可重復(fù)且可定量地測(cè)量來自樣品的ECL信號(hào)，這樣，就使得能校正。
優(yōu)選地，電極/反電極對(duì)16是亞厘米(sub-centimeter)尺寸的，并且，可通過眾所周知的、用于制作液晶顯示器和電化色顯示屏的方法，與電極引線20(例如，用透明金屬膜)一起制作。通過電連接線19把電極引線20連接到定形信號(hào)發(fā)生器18。有益的是，在計(jì)算機(jī)控制下，電極/反電極對(duì)是可單個(gè)尋址的，從而可以選擇性地給那些離散的結(jié)合區(qū)域施加電位。配置光檢測(cè)器裝置22和數(shù)字計(jì)算機(jī)裝置24，以便在結(jié)合到結(jié)合區(qū)域的一種合適的標(biāo)記物已經(jīng)激發(fā)了ECL發(fā)光時(shí)記錄和分析結(jié)果。
圖1A顯示了包括如圖1所示裝在外殼(11)中的一個(gè)盒、一些電引線、定形信號(hào)發(fā)生器、光檢測(cè)裝置和數(shù)字計(jì)算機(jī)的一個(gè)裝置。所述盒通過開口(15)插入上述外殼。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)工作電極用來在多個(gè)結(jié)合區(qū)域同時(shí)產(chǎn)生ECL信號(hào)。在這個(gè)實(shí)施方案中，通過使用光成像設(shè)備來鑒別來自每個(gè)結(jié)合區(qū)域的ECL信號(hào)。
概括地說，利用本發(fā)明的盒所進(jìn)行的測(cè)定的好處是利用了許多離散的結(jié)合區(qū)域的。例如，使用這樣的盒使得能快速和/或同時(shí)檢測(cè)或者測(cè)量各種各樣的所感興趣的被分析物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的測(cè)定還是這樣一些測(cè)定，這些測(cè)定得益于利用ECL所標(biāo)記的試劑、被分析物或結(jié)合表面。本發(fā)明的ECL測(cè)定包括使許多結(jié)合區(qū)域與被猜測(cè)含有所感興趣的被分析物的樣品接觸，并觸發(fā)來自結(jié)合ECL標(biāo)記物的ECL發(fā)光，其中，ECL標(biāo)記物是在被分析物或該被分析物的競(jìng)爭(zhēng)物上、在與該被分析物結(jié)合的試劑上或者在許多結(jié)合區(qū)域上。
本發(fā)明還提供用于檢測(cè)或測(cè)定所感興趣的被分析物的ECL測(cè)定方法，包括(a)接觸許多離散的結(jié)合區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)，所述許多結(jié)合區(qū)域固定在一個(gè)或多個(gè)載體的表面上，其中所述接觸是指與包括有結(jié)合到電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的分子的樣品接觸，其中，所述樣品在所述接觸步驟期間并不與任何電極或反電極接觸；(b)使一個(gè)電極接近所述許多結(jié)合區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)；(c)在所述許多結(jié)合區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)處施加能有效地觸發(fā)ECL的電壓波形；并且檢測(cè)或測(cè)量ECL。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了ECL測(cè)定方法，這方法是(a)接觸許多離散的結(jié)合區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)，所述許多結(jié)合區(qū)域(i)固定在一個(gè)或多個(gè)載體的表面上，以及(ii)與許多電極和反電極對(duì)在空間位置上對(duì)準(zhǔn)并處于該電極和反電極對(duì)的附近，其中，所述接觸是指與包括有結(jié)合到電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的分子的樣品接觸；(b)使電極和反電極接近所述許多結(jié)合區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)；(c)在所述許多結(jié)合區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)處施加能有效地觸發(fā)電化學(xué)發(fā)光的電壓波形；以及(d)檢測(cè)或測(cè)量電化學(xué)發(fā)光。
在載體上的所述許多結(jié)合區(qū)域能與要被測(cè)定的樣品相互作用。PMAMS可以進(jìn)一步與含有完成測(cè)定所必需的試劑的溶液接觸。然后，使結(jié)合表面與一個(gè)互補(bǔ)的電極(優(yōu)選的是一個(gè)干凈的、未用過的電極)的表面接觸(例如，壓在一起)，然后，用所述電極施加電位，以便激發(fā)ECL。
在利用圖1的裝置進(jìn)行測(cè)定的一種優(yōu)選的方法中，把被猜測(cè)含有所感興趣的被分析物的樣品與適于檢測(cè)該被分析物的ECL標(biāo)記的試劑一起，施加到許多結(jié)合區(qū)域14。之后，把載體11和載體12弄到一起，從而使許多結(jié)合區(qū)域14中的每一個(gè)處于許多電極/反電極對(duì)16的不同對(duì)的電極和反電極之間，而樣品含在其間。應(yīng)該注意，不需要使電極和反電極對(duì)與結(jié)合區(qū)域機(jī)械接觸，這是為了當(dāng)合適的電位施加到電極和反電極對(duì)之間時(shí)激發(fā)ECL。通過電連接線19，從波形信號(hào)發(fā)生器18，把適于觸發(fā)ECL發(fā)光的電位波形施加到許多電極/反電極對(duì)16上。在許多結(jié)合區(qū)域14上的ECL標(biāo)記物所發(fā)射的任何信號(hào)用光檢測(cè)裝置22檢測(cè)，并用數(shù)字計(jì)算機(jī)裝置24記錄分析。
本發(fā)明提供檢測(cè)在一定體積的多組份液體樣品中多種所感興趣的被分析物的方法，多種所感興趣的被分析物可以以各種濃度存在于所述樣品中。
概括地說，從多組份的樣品中可檢測(cè)低于10-3摩爾濃度的多種被分析物。優(yōu)選地，可以從多組份的樣品中檢測(cè)低于10-12摩爾濃度的多種被分析物。
本發(fā)明提供了從多組份的樣品進(jìn)行檢測(cè)的方法，這種方法可以多相檢測(cè)方式進(jìn)行和均相檢測(cè)方式進(jìn)行，多相檢測(cè)也就是說是這樣的檢測(cè)，其中，許多未結(jié)合的標(biāo)記過的試劑在許多結(jié)合了的標(biāo)記過的試劑處于電化學(xué)能量試驗(yàn)條件下之前就與這許多結(jié)合了的標(biāo)記過的試劑分離，而均相檢測(cè)也就是說是這樣的檢測(cè)，其中，許多未結(jié)合的標(biāo)記了的試劑與結(jié)合了的標(biāo)記過的試劑一起處于電化學(xué)能量試驗(yàn)條件下。
在本發(fā)明的測(cè)定中，用來檢測(cè)某一具體被分析物的電磁輻射是可以與相對(duì)于其它被分析物的電磁輻射區(qū)分開的，這是通過鑒別它的作為一個(gè)圖案的一個(gè)或多個(gè)特征的位置和/或定位來做到的，所述圖案對(duì)應(yīng)于在PMAMS中的結(jié)合區(qū)域的圖案。
在本發(fā)明的均相檢測(cè)中，由結(jié)合了的標(biāo)記過的試劑所發(fā)射的電磁輻射與未結(jié)合的試劑相比，由結(jié)合了的標(biāo)記過的試劑所發(fā)射的電磁輻射量或者為增加形式或?yàn)闇p少形式，或者，通過檢測(cè)在空間上對(duì)應(yīng)于一個(gè)圖案的一個(gè)或多個(gè)特征的源所發(fā)射的電磁輻射，這個(gè)圖案對(duì)應(yīng)于在PMAMS中的結(jié)合區(qū)域的圖案。
在圖20所示的本發(fā)明的方法的一個(gè)特定實(shí)例中，在載體(5)上進(jìn)行夾層測(cè)定，夾層(5)在其表面上具有許多結(jié)合區(qū)域(BD)，這些區(qū)域?qū)τ诮Y(jié)合某一特定的被分析物(An)是特異性的。當(dāng)把被猜測(cè)含有被分析物的樣品施加到上述結(jié)合區(qū)域時(shí)，該被分析物就結(jié)合到所述結(jié)合區(qū)域上。然后，把適于選擇性地結(jié)合被分析物(An)并已用ECL部分(TAG)標(biāo)記形成Ab-TAG的抗體(Ab)施加給到在結(jié)合區(qū)域上的所述被分析物。在過量后，把未結(jié)合的Ab-TAG從結(jié)合區(qū)域清洗掉，通過電極(未示出)把適于觸發(fā)電化學(xué)發(fā)光的一個(gè)電位波形施加到所述TAG，以便從在所述結(jié)合區(qū)域上的任何TAG觸發(fā)ECL發(fā)光。ECL信號(hào)用光檢測(cè)裝置檢測(cè)，并由數(shù)字計(jì)算機(jī)裝置記錄(例如，圖1中22和24所示)。
下面提供本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施例、特征和一些變型。
5.1.結(jié)合表面的制備為了更好地理解本發(fā)明、提供了關(guān)于制備在載體上的結(jié)合區(qū)域的更詳細(xì)的說明。在一個(gè)表面上的、對(duì)于許多被分析物是特異的結(jié)合區(qū)域的一個(gè)圖案陣列在這里叫作一個(gè)成圖案的、多陣列、多特異性的表面或PMAMS。例如，通過形成自組裝的單層(“SAMs”)圖案制備在載體上的PMAMS(參見Ferguson等，1993年，Macromolecules，26(22)5870-5875；Prime等，1991年，Science，2521164-1167；Laibinis等，1989年，Science，245845-847；Kumar等，1984年，Langmuir，10(5)1498-1511；Bain等，1989年，Angew.Chem.，101522-528)。形成表面圖案的方法還包括利用物理刻蝕(例如，微切削加工)(Abbott等，1992年，Science，2571380-1382；Abbott，1994年，Chem.Mater.6(5)596-602)、微平板印刷術(shù)(Laibinis等人，1989年，Science，245845-847)、通過利用可光激活的化學(xué)現(xiàn)象把化學(xué)基團(tuán)附著到表面(Sundberg等，1995年，J.Am.Chem.Soc.117(49)12050-12057)、以及微觀壓印技術(shù)(Kumar等，1994年，Langmuir，10(5)1498-1511；Kumar等，1993年，Appl.Phys.Lett.，63(14)2002-2004)。其它形成表面圖案的方法包括空間控制散布流體或粒子的方法(例如，Micropen deposition(例如，用微流體導(dǎo)管，采用X-Y平移送到表面上))、微毛細(xì)管填充(Kim等，1995年，Nature，376581)、噴墨技術(shù)、或注射器撒布器。可以用這些技術(shù)的組合來得到復(fù)雜的表面圖案。在圖5A中，顯示了載體600具有形狀獨(dú)立的結(jié)合區(qū)域，僅為了說明的目的，這結(jié)合區(qū)域表示為幾何形狀602，以便表明在一個(gè)單獨(dú)的載體上可存在不同的結(jié)合特異性。結(jié)合區(qū)域之間的表面604可為疏水性的或親水性的，以便約束結(jié)合試劑的沉積，形成結(jié)合區(qū)域。結(jié)合區(qū)域和/或在結(jié)合區(qū)域之間的表面可為易于和抗拒非特異性結(jié)合的，和/或它們可以易于或抗拒結(jié)合試劑通過共價(jià)或者非共價(jià)相互作用的附著。對(duì)于通過疏水性相互作用的非特異性結(jié)合并不是所想要的用于把結(jié)合化學(xué)物質(zhì)附著到表面的方法的情況，可加入洗滌劑，以防止出現(xiàn)偶然的非特異性結(jié)合。
概括地說，結(jié)合區(qū)域的寬度或直徑或最寬尺寸是從0.1μm到1mm，這取決于該區(qū)域的幾何形狀。把表面選擇性地衍生為具有例如對(duì)于ECL測(cè)定溶液特異性結(jié)合的組份。此外，在結(jié)合區(qū)域處的非特異性相互作用減弱，而同時(shí)通過把諸如聚乙二醇那樣的部分結(jié)合到離散的結(jié)合區(qū)域的暴露表面上來保持一種特異性結(jié)合部分(Prime等，1993年，J.Chem.Soc.11510714-10721；Prime等，1991年，Science，2521164-1167；Pale-Grosdemange等，1991年，J.Am.Chem.Soc.11312-20)。
概括地說，PMAMS可含有從2到108個(gè)結(jié)合區(qū)域。優(yōu)選的結(jié)合區(qū)域數(shù)目是從50到500。而在其它一些實(shí)施例中，結(jié)合區(qū)域的數(shù)目是25至100。
載體可以是各種材料，包括但并不限于玻璃、塑料、聚合物、彈性材料、金屬、陶瓷、合金、復(fù)合材料箔、半導(dǎo)體、絕緣體、硅和/或?qū)訝畈牧系?。例如，F(xiàn)erguson等(1993年，Macromolecules，265870-5875)、Ferguson等(1991年，Science，253776-778)、Chaudhury等(1992年，Science，2551230-1232)所說明的那樣，可以制備衍生化的彈性載體。
上面制備有PMAMS的載體表面可含有各種材料，例如，網(wǎng)狀物、毛氈、纖維材料、凝膠、固體(例如，由金屬構(gòu)成)彈性體等。載體表面可具有各種結(jié)構(gòu)、化學(xué)和/或光學(xué)性質(zhì)。例如，上述表面可以是剛性的或柔性的，扁平的或變形的，透明的、半透明的、部分或全反射的、或者是不透明的，并且可以具有一些復(fù)合物性質(zhì)、具有不同性質(zhì)的一些區(qū)域，而且可以是一種以上的材料的復(fù)合物。上述表面可以具有成圖案的表面結(jié)合區(qū)域和/或在一個(gè)或更多個(gè)表面上可按本發(fā)明出現(xiàn)催化反應(yīng)的成圖案的區(qū)域，和/或在一個(gè)或多個(gè)表面上的可尋址的電極陣列?？砂焉鲜鲚d體的表面做成任何合適的形狀，這形狀包括平面、球狀、立方體形狀和圓柱形狀。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，載有PMAMS的載體是一探針。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載有PMAMS的載體含有碳，例如石墨、玻璃碳或碳黑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載有PMAMS的載體含有一種或多種碳纖維。這些纖維可以是非晶碳或石墨碳。它們還可以是碳納米管、buckeytube或者富勒氏籠形碳分子族(fullerene family)的部分。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載有PMAMS的載體含有一種或多種碳原纖維(土衛(wèi)七原纖維TM)(美國(guó)專利US 4,663,230)。單根的碳原纖維(如美國(guó)專利US 4,663,230；US 5,165,909和US 5,171,560中所公開的)的直徑可在約3.5nm到70nm的范圍內(nèi)，而長(zhǎng)度大于該直徑的102倍，并且具有有序碳原子的多個(gè)基本連續(xù)層的外層區(qū)域和一個(gè)明顯的內(nèi)芯區(qū)域。僅為說明起見，碳原纖維的典型直徑可在約7nm到25nm之間，而典型的長(zhǎng)度范圍可在1μm到10μm之間。
可把碳材料制成為聚集體。如在美國(guó)專利US 5,110,693及其參考文獻(xiàn)中所公開的那樣，兩種或更多種單獨(dú)的碳原纖維可構(gòu)成纏結(jié)的原纖維的微觀聚集體。這些聚集體的尺寸可從5nm到幾厘米。僅為說明起見，一種類型的微觀聚集體(“棉花糖或CC”)類似于紡錘或纏結(jié)纖維棒，其直徑可從5nm到20μm，長(zhǎng)度可從0.1μm到1000μm。亦為了說明的目的，另一種類型的原纖維的微觀聚集體(“鳥巢，或BN”)可近似為球形，其直徑可從0.1μm到1000μm。可構(gòu)成每種類型的(CC和/或BN)的更大的聚集體或每種類型的混合體。
可用于載體中的原纖維包括但并不限于單獨(dú)的原纖維，一種或多種原纖維的聚集體、一種或多種原纖維的懸浮液、原纖維的分散體、原纖維和其它材料(例如，油、石臘、蠟、聚合物、凝膠、塑料、粘合劑、環(huán)氧樹脂、聚四氟乙烯、金屬、有機(jī)液體、有機(jī)固體、無機(jī)固體、酸、堿、陶瓷、玻璃、橡膠、彈性體、生物分子和介質(zhì)等)的混合物、還有它們的組合物。
在某些情況下原纖維可以是磁性的，而在另外一些情況下是非磁性的。把原纖維可制成磁性或非磁性的程度由催化劑的量來控制，所述催化劑因原纖維生產(chǎn)過程處于原纖維中，美國(guó)專利US 4,663,230；US5,165,909和US 5,171,560中公開了這樣的過程。PMAMS可位于上述載體上，上述載體中、或上述載體附近。
可由不同類型的表面結(jié)合基因生成PMAMS。可用來在它們所要結(jié)合的表面上形成單層的自組裝單層包括但并不限于鏈烷硫醇類(它結(jié)合金和其它金屬)、烷基三氯硅烷、(例如，它結(jié)合硅酮/二氧化硅)、鏈烷羧酸(例如，它結(jié)合氧化鋁)以及它們的組合?？墒紫刃纬蓡螌?，然后連接用來附著結(jié)合試劑的化學(xué)物質(zhì)。自組裝后的衍生過程產(chǎn)生更完美的在載體表面上的單層的二維晶體包皮，具有較少的針孔或缺陷?？稍谧越M裝之前或之后用結(jié)合試劑對(duì)單層衍生化。在單層中的規(guī)則的缺陷可以是希望的，并且可通過在自組裝前的單層或載體表面衍生化而得到。如果在結(jié)合試劑上所衍生的基團(tuán)(例如，暴露的結(jié)合基團(tuán))所占空間大，它可在暴露端產(chǎn)生密合(close-packed)的表面，但在金屬表面處具有一些規(guī)則的縫隙。這有利于加料通過這些規(guī)則的縫隙流到ECL標(biāo)記的部分，這ECL標(biāo)記的部分結(jié)合到與樣品溶液結(jié)觸的部分。
本領(lǐng)域中已知不完整單層的制備。用于制備不完整單層的其它方法包括但不限于用結(jié)合試劑的稀溶液形成單層、在完成前終結(jié)形成單層的反應(yīng)、用輻射損壞更多的完整的單層(例如，離子粒子)、光或化學(xué)試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，重復(fù)的壓印而不給印記重新涂墨可以給出有缺陷的單層的范圍(Wilbur等，1995年，Langmuir，11825)。
可在基質(zhì)的表面上生成PMAMS?；|(zhì)可以是高度導(dǎo)電的，例如，金屬電極或?qū)щ娋酆衔锬?；或者，基質(zhì)可以是絕緣體；或者，基質(zhì)可以是半導(dǎo)電的和/或具有中等導(dǎo)電率。基質(zhì)材料可以是離子導(dǎo)體或多孔材料。這樣的多孔材料可用作載體材料和/或?qū)щ姴牧虾?或過濾材料和/或溝流材料(channelling material)(例如，使流體、離子物質(zhì)等通過)。
多孔材料可與另外的一些材料組合。例如，可用另外的多孔材料、導(dǎo)電材料、半導(dǎo)體材料、溝道結(jié)構(gòu)和/或溶液(例如，離子流體)來制作多孔材料的復(fù)合結(jié)構(gòu)。這樣的復(fù)合結(jié)構(gòu)可以是層狀結(jié)構(gòu)、夾層結(jié)構(gòu)和/或散布的復(fù)合物?？梢圆捎弥С性诮饘匐姌O上的多孔材料的固體基質(zhì)。也可把多孔材料夾在導(dǎo)電材料、半導(dǎo)體材料或半導(dǎo)體材料與導(dǎo)電材料的組合材料之間。一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域可含在多孔材料的連續(xù)板上和/或可位于在載體上的許多離散的物體上，每個(gè)物體具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域。多孔材料(例如凝膠)表面可以是扁平的，半球形的或者為任何規(guī)則或不規(guī)則的形狀，和/或可具有各種物理性質(zhì)(例如，彈性、剛性、低密度、高密度、密度梯度、干、濕等)和/或光學(xué)性質(zhì)(例如，透明、半透明、不透明、反射、折射等)和/或電學(xué)性質(zhì)(例如，導(dǎo)電、半導(dǎo)電、絕緣可變導(dǎo)電性、例如濕與干的比較等)。
可在基質(zhì)中形成溝流的圖案。多孔材料層的厚度可從5微米到2000微米。多孔材料層的厚度還可以大于2mm。
孔可以局部和/或完全延伸穿過材料，或者可以是孔的網(wǎng)絡(luò)的一部分。這些孔的尺寸范圍可寬至從50埃到10000μm。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述材料有一些尺寸范圍從200埃到500埃的孔和一些尺寸范圍從0.5μm到100μm的孔。
材料的孔隙可以連續(xù)貫穿整個(gè)材料，或者，可以隨材料中的不同位置變化而增加或減少。所述材料可以有以打亂和/或隨機(jī)方式分布的各種各樣的不同尺寸的孔。
多孔材料可以是多于一種的材料的復(fù)合材料。
例如，上述材料中，某些孔可大到足以通過像生物細(xì)胞那樣大的物體，某些孔可通過像蛋白質(zhì)或抗體那樣大的生物介質(zhì)，某些孔可只能通過小的(＜1000的分子量)有機(jī)分子，和/或上述所有那些種孔的組合。
上述材料的孔隙可以使得一種或多種分子、液體、固體、乳液、懸浮液、氣體、凝膠和/或分散體能擴(kuò)散進(jìn)該材料、處于該材料內(nèi)和/或穿過該材料。所述材料的孔隙使得生物介質(zhì)可以擴(kuò)散(主動(dòng)或被動(dòng)地)或用某些裝置強(qiáng)迫進(jìn)入該材料，處于該材料內(nèi)和/或穿過該材料。生物介質(zhì)的例子包括但不限于全血、部分血、血漿、血清、尿、蛋白質(zhì)溶液、抗體或其片段、細(xì)胞、亞細(xì)胞粒子、病毒、核酸、抗原、脂蛋白、脂糖類、脂類、糖蛋白、碳水化合物、肽、激素或藥劑。多孔材料可有一層或多層不同孔隙度的層，這使得生物介質(zhì)可穿過一個(gè)或多個(gè)層，但不穿過其它層。
多孔材料能夠承載由于離子物質(zhì)的流動(dòng)產(chǎn)生的電流。在進(jìn)一步的細(xì)致改進(jìn)中，多孔材料是多孔水溶脹的凝膠，例如，聚丙烯酰胺或瓊脂。已有各種其它凝膠組合物(例如，參見Soane，D.S.，于生物技術(shù)中的聚合物應(yīng)用；Soane，D.S.，Ed.；Simon & SchusterEnglewood Cliffs，NJ，1992，或在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)中的水凝膠，第I-III卷；Peppas，N.A.Ed.；CRC出版社Boca，Raton，F(xiàn)L，1987)。結(jié)合區(qū)域可通過共價(jià)和非共價(jià)鍵附著到基質(zhì)上。(已經(jīng)撰寫了關(guān)于這個(gè)主題的許多評(píng)論和書籍；一些例子是Tampion J.和Tampion M.D.，固定的細(xì)胞原理和應(yīng)用，劍橋大學(xué)出版社NY，1987；固相生物化學(xué)分析和合成方面，Scouten，W.H.Ed.，John Wiley and SonsNY，1983；酶學(xué)中的方法，固定的酶和細(xì)胞，Pt.BMosbach，K.Ed.，Elsevier Applied ScienceLondon，1988；酶學(xué)中的方法，固定的酶和細(xì)胞，Pt.C Mosbach，K.Ed.，Elsevier Applied Science；London，1987；酶學(xué)中的方法，固定的酶和細(xì)胞，Pt.C Mosbach，K.Ed.，Elsevier Applied ScienceLondon，1987；還可參見上述的“在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)中的水凝膠”)。例如，可通過用蛋白質(zhì)溶液處理來把蛋白質(zhì)附著到聚丙烯酰胺和N-丙烯酰琥珀酰亞胺的交聯(lián)共聚物上。還可以在聚合或形成凝膠之前把結(jié)合區(qū)域并入多孔基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可采用各種耦聯(lián)化學(xué)物質(zhì)把結(jié)合區(qū)域附著到未交聯(lián)的聚合物上。然后，可以使聚合物交聯(lián)(例如，利用包括酰胺鍵、二硫化物、對(duì)環(huán)氧化合物的親核進(jìn)攻蝕等在內(nèi)的化學(xué)方法)(例如，參見Pollack等，1980，J.Am.Chem.Soc.102(20)6324-36)。結(jié)合區(qū)域可附著在單體物質(zhì)上，然后再在聚合期間結(jié)合入聚合物鏈中(參見Adalsteinsson，O.，1979，J.Mol.Catal.6(3)199-225)。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過在聚合反應(yīng)/形成凝膠期間把結(jié)合區(qū)域捕集在孔中，或者通過結(jié)合區(qū)域滲透進(jìn)多孔基質(zhì)和/或膜中，而把結(jié)合區(qū)域結(jié)合進(jìn)凝膠。此外，結(jié)合區(qū)域可通過由疏水和/或離子相互作用所導(dǎo)致的非特異吸收被吸附在多孔基質(zhì)(例如，聚合物凝膠和膜)的表面上。可以有益地把生物素用作交聯(lián)或結(jié)合試劑?？股锼氐鞍?、鏈霉抗生物素蛋白或其它生物素結(jié)合試劑可被結(jié)合進(jìn)結(jié)合區(qū)域。
可在具有不同孔尺寸和溶劑含量的多孔材料(例如，凝膠)上生成PMAMS。例如，孔尺寸變化的聚丙烯酰胺凝膠可通過改變丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)程度來做到。
在孔尺寸小于被分析物的這樣的PMAMS上，結(jié)合反應(yīng)基本上在凝膠的表面上進(jìn)行。在這種情況下，可用穿過凝膠的過濾作用和/或電泳現(xiàn)象來濃縮在凝膠表面處的被分析物并調(diào)節(jié)結(jié)合反應(yīng)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性(例如，增加速率)。較快的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性在快速測(cè)定中是有益的(例如，短時(shí)間得到結(jié)果)，并且可在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生高靈敏度。
在孔尺寸大于被分析物的PMAMS上，結(jié)合反應(yīng)可在凝膠表面上及在其本體中進(jìn)行。在這種情況下，可用過濾作用和/或可用電泳現(xiàn)象來提高結(jié)合的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性并從表面上去除未結(jié)合的物質(zhì)。
在凝膠上形成的PMAMS可以濕儲(chǔ)存和/或可以在干燥狀態(tài)下儲(chǔ)存，并在測(cè)定期間重組?？稍趦?chǔ)存前把ECL測(cè)定所必需的試劑結(jié)合進(jìn)凝膠(通過滲透進(jìn)凝膠，或通過在形成凝膠期間加入)和/或可在測(cè)定期間加入上述試劑。
可通過以液體形式把在基質(zhì)中含有每個(gè)結(jié)合區(qū)域的液滴或微液滴施加到基片上來生成PMAMS的成圖案的結(jié)合區(qū)域。然后，用各種眾所周知的技術(shù)(聚合、交聯(lián)、冷卻至凝膠化相變溫度以下、加熱)來引起液體的固化和/或凝膠化。導(dǎo)致固化或形成凝膠的試劑可包含在上述液滴中，從而使得在散布后的某個(gè)時(shí)候所述液滴固化和/或形成凝膠。可用后續(xù)的處理(例如，暴露于光、輻射和/或氧化還原電位)來引起固化和/或形成凝膠。在其它一些實(shí)施方案中，這樣的液滴或微液滴也可以是漿液、預(yù)聚合混合物、顆粒團(tuán)和/或基本上是固體滴。此外，可利用氣相沉積。
還可以通過形成基質(zhì)的分層結(jié)構(gòu)，而每一層含有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域來形成圖案。例如，可把連接到抗體(用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法)的瓊脂糖倒進(jìn)一個(gè)容器，并通過冷卻來使之形成凝膠。然后，可把后面的含有其它抗體的層接著倒在第一層上并使之成為凝膠。這種分層結(jié)構(gòu)的剖面給出了具有許多不同的結(jié)合區(qū)域的連續(xù)表面?？梢辕B置這樣的剖面，并可切開另一個(gè)剖面，以產(chǎn)生具有甚至更大密度的結(jié)合區(qū)域的PMAMS表面。也可彼此相鄰地輔置下含有給定結(jié)合元素的基質(zhì)的線條和/或疊置這些線條。還可以沿剖面切開這樣的結(jié)構(gòu)，并用作PMAMS表面。
還可利用某些基質(zhì)能分離的能力來形成圖案。例如，可通過在一個(gè)產(chǎn)生有許多不同結(jié)合區(qū)域的表面的聚丙烯酰胺片中的電泳來分離核酸探針的混合物。
還可用微觀流體導(dǎo)管在載體上制備PMAMS結(jié)合區(qū)域。微觀流體導(dǎo)管的部分清單包括中空的毛細(xì)管、用基質(zhì)制作的和/或填充了基質(zhì)(例如，多孔或被溶劑溶脹了的介質(zhì))的毛細(xì)管、可載有薄膜或液滴的固體載體。毛細(xì)管可以是固體，而試劑沿毛細(xì)管的外表面流動(dòng)，可使試劑流體容器可暴露于與PMAMS表面接觸的多孔基質(zhì)尖端。例如，可以連續(xù)不斷或周期性地補(bǔ)充試劑容器，從而使所給定的多孔基質(zhì)的尖端可重復(fù)地沉積試劑(例如，鏈烷硫醇，以形成單層；和/或結(jié)合試劑等)多次。此外，改變上述尖端的孔隙度可控制試劑流到表面的過程。不同的或相同的結(jié)合試劑可存在于許多毛細(xì)管中，和/或多種不同的結(jié)合試劑可存在于一個(gè)給定的毛細(xì)管中。使毛細(xì)管與PMAMS(例如，成圖案的SAM)的表面接觸，從而使某些區(qū)域受到結(jié)合試劑的作用，產(chǎn)生離散的結(jié)合區(qū)域。不同的結(jié)合試劑中，每一種均存在于不同的微觀流體導(dǎo)管中，同時(shí)按需要從流體導(dǎo)管陣列送到金屬表面、SAM等上面。微觀流體導(dǎo)管還可在施加到載體表面前用于用所需的分子涂上微觀印記。例如，單獨(dú)的微觀流體導(dǎo)管可用來施加連接到促進(jìn)載體表面吸附(例如，在碳?xì)溥B接物上的自由硫醇，它促進(jìn)金吸附)的部分上的不同結(jié)合試劑，以形成PMAMS。這樣，例如，用微觀流體導(dǎo)管用加入了帶自由硫醇的連接物的不同特異性的抗體涂抹的微觀印記，可用來在金表面上的所需區(qū)域中施加這樣的抗體，以形成PMAMS的離散的結(jié)合區(qū)域。
成圖案的流體發(fā)送的另一種方法涉及采用縮微印刷裝置，它通過穿過一個(gè)小孔注射滴狀流體來發(fā)送流體微滴(例如，噴墨印刷機(jī))?？赏ㄟ^不同的機(jī)制導(dǎo)致在這些裝置中注射滴狀流體，所述機(jī)制包括加熱、帶上靜電和/或從壓電裝置施以壓力。可通過采用多個(gè)孔和/或一個(gè)孔并裝上合適的閥來形成多于一種液體的圖案。
在一種制備PMAMS的方法中，用微觀流體導(dǎo)管直接(優(yōu)選的是同時(shí))把含有所需結(jié)合試劑的液滴發(fā)送到在一個(gè)表面上的離散的區(qū)域上，以形成離散的結(jié)合區(qū)域。結(jié)合試劑可含有功能性的化學(xué)基團(tuán)，該功能性化學(xué)基團(tuán)與在其要所施加的表面上的一種化學(xué)基團(tuán)形成鍵。在另一種變型中，在液滴中的結(jié)合試劑非特異性地吸附或結(jié)合到表面上(例如，在所述表面上干燥)。
可以選擇地，沉積在表面上的液滴含有可形成基質(zhì)的試劑。這種基質(zhì)可以是固體、聚合物或凝膠?？梢酝ㄟ^蒸發(fā)溶劑來形成基質(zhì)。它可通過單體物質(zhì)聚合而成。它可以通過預(yù)制的聚合物的交聯(lián)而成。它可以通過調(diào)節(jié)溫度(例如，冷卻和/或加熱)而成。它可以通過其它一些方法而成。例如，可通過冷卻或通過添加導(dǎo)致凝膠化的試劑來冷卻聚合物質(zhì)。可通過在電極處(包括基片)產(chǎn)生反應(yīng)性物質(zhì)、通過光(或其它輻射)、通過添加誘導(dǎo)固化或凝膠化的試劑、通過冷卻或加熱，誘導(dǎo)形成固體基質(zhì)。此外，所述表面可含有能夠引發(fā)形成基質(zhì)(例如，凝膠化或聚合)的催化劑。
在一種優(yōu)選的技術(shù)中，可采用成圖案的親水性/疏水性區(qū)域，以防止所施加的流體或凝膠的散布。這樣的流體或凝膠可含有待連接到載體表面上的結(jié)合試劑，以形成PMAMS的結(jié)合區(qū)域。在這種情況下，采用這樣的親水性/疏水性邊界有助于把所產(chǎn)生的結(jié)合區(qū)域限制在離散的區(qū)域處。可以選擇地，流體含有可在表面上形成基質(zhì)的試劑，而結(jié)合試劑當(dāng)沉積在表面上時(shí)含在一個(gè)確定的區(qū)域內(nèi)。例如，可利用親水性/疏水性邊界助劑可把液滴限制在一個(gè)確定的區(qū)域。此外，親水性或疏水性區(qū)域可給出可結(jié)合(例如，共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合)進(jìn)基質(zhì)的基團(tuán)，使得該基質(zhì)能更穩(wěn)定地粘合到基片上(Itaya和Bard，1978，Anal.Chem.50(11)1487-1489)。在另一種技術(shù)中，所施加的流體或凝膠是含有所感興趣的被分析物的樣品，樣品施加到制備好的PMAMS上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，可用含有疏水性溶液的毛細(xì)管把一種溶液沉積在離散的區(qū)域上，產(chǎn)生由疏水性區(qū)域圍繞的親水性區(qū)域。可以選擇地，親水性區(qū)域圍繞的疏水性結(jié)合區(qū)域可與含有結(jié)合試劑或被分析物的疏水性流體一起使用。疏水性和親水性是相對(duì)于彼此和/或相對(duì)于所施加的樣品的相對(duì)性術(shù)語，也就是說，這使得能控制施加到結(jié)合區(qū)域的流體或凝膠樣品的散布或潤(rùn)濕。進(jìn)而，可用物理表面特性(例如，在表面上的井(well)或溝流)來完成來自微觀流體陣列的受控制的溶液沉積。微觀流體導(dǎo)管可包括在一個(gè)盒中，或更優(yōu)選地，用來在使用之前給載體施加一些特定的試劑。
可把一種以上的連接化學(xué)物質(zhì)施加到同一載體表面和/或可用多種印記產(chǎn)生帶親水性和疏水性結(jié)合區(qū)域的表面。例如，可如下制備這樣一個(gè)區(qū)域，在這個(gè)區(qū)域中，想要親水性結(jié)合區(qū)域在位置1處，并想要疏水性結(jié)合區(qū)域在位置2處。制作一個(gè)第一親水性印記，這親水性印記在位置1處有一個(gè)圓盤，而在位置2處有一個(gè)更大的環(huán)。制作第二疏水性印記，它的盤在位置2處，這盤適配于在由印記1所留下的環(huán)形單層內(nèi)。最后，由單層組份的疏水性溶液清洗表面。
具體地說，用微觀接觸印刷(也就是說壓印)來產(chǎn)生PMAMS。這樣施加的單層由例如用于金表面的表面結(jié)合基團(tuán)構(gòu)成，優(yōu)選具有鏈烷烴(例如，(CH2)n)間隔基的硫醇類基團(tuán)。有一個(gè)間隔基團(tuán)連接(優(yōu)選地共價(jià)結(jié)合)到連接基團(tuán)A?！癆”例如可以是抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或生物素或者任何具有可資利用的互補(bǔ)結(jié)合對(duì)“B”的其它合適的結(jié)合試劑。A:B連接可以是共價(jià)的或非共價(jià)的，而且，Bard等人公開了本領(lǐng)域中已知的可以使用的某些連接化學(xué)物質(zhì)(美國(guó)專利US5,221,605和US 5,310,687)?！癇”進(jìn)一步連接到結(jié)合試劑，例如，抗體、抗原、核酸、藥物或其它適于形成結(jié)合區(qū)域的物質(zhì)，該結(jié)合區(qū)域能結(jié)合在要被檢驗(yàn)的樣品中的一種或多種所感興趣的被分析物。B還可以連接到ECL TAG或標(biāo)記物?？山柚诿?xì)管或微觀流體導(dǎo)管陣列(圖5A至圖5C)給SAM發(fā)送連接基團(tuán)B，該毛細(xì)管或微觀流體導(dǎo)管陣列能在單層“A”連接鍵上放置許多具有不同結(jié)合表面特異性的“B”試劑。A和B還可以在附著到所述單層之前或先于附著到單層就被連接。如所說明的那樣，在圖5A中，為說明簡(jiǎn)單起見，形狀獨(dú)立的結(jié)合區(qū)域表示為幾何形狀602，以便表明在單個(gè)載體600上可存在有不同的結(jié)合特異性。圖5B提供了微觀流體導(dǎo)管(例如，毛細(xì)管)陣列606的俯視圖。圓點(diǎn)610是所述導(dǎo)管的剖面。圖5C提供了微觀流體導(dǎo)管陣列608的側(cè)視圖。從頂部和底部伸出的線條是單獨(dú)的微觀流體導(dǎo)管610。在下面的幾何圖形612代表一旦從每個(gè)單獨(dú)的毛細(xì)管發(fā)送結(jié)合試劑時(shí)所形成的特異性結(jié)合區(qū)域。
作為舉例，在上述第一次壓印后，裸表面(例如，金)區(qū)域可與第二種鏈烷硫醇反應(yīng)，該鏈烷硫醇并沒有連接化學(xué)物質(zhì)A，而且具有與上述第一單層相反的疏水性/親水性。特異性連接區(qū)域就以這種方式在表面上制備。
可對(duì)每個(gè)結(jié)合區(qū)域采用特異的或用于所感興趣的被分析物的結(jié)合試劑，或者，可采用特異地結(jié)合于多種所感興趣的被分析物的結(jié)合試劑。
而在另一種變型中，如上述圖5A所示，可用具有不同連接化學(xué)物質(zhì)和/或結(jié)合部分的一些材料(例如，結(jié)合試劑、ECL標(biāo)記物、SAMs)壓印載體表面多次。
成圖案的結(jié)合試劑可以是穩(wěn)定的和/或堅(jiān)固的化學(xué)基團(tuán)(例如，經(jīng)受得住它們所遇到的情況)，化學(xué)基團(tuán)然后再連接到比較不那么穩(wěn)定或耐用的結(jié)合基團(tuán)?？衫枚喾N連接鍵，以便使在制備PMAMS表面時(shí)的每一步的條件最佳和/或簡(jiǎn)化PMAMS表面的制備。例如，可以用普通方式制備第一PMAMS表面，然后，進(jìn)行改性，產(chǎn)生不同的PMAMS表面。在另一個(gè)實(shí)施例中，普通的PMAMS表面可以與一些結(jié)合試劑的溶液混合物反應(yīng)，這些結(jié)合試劑本身含有把它們引導(dǎo)到該P(yáng)MAMS表面上的一些特定區(qū)域(例如，結(jié)合區(qū)域)的一些結(jié)合區(qū)域。例如，每一個(gè)均給出一種不同的寡(核苷酸)序列的結(jié)合區(qū)域的圖案被連接到表面上。然后，用含有一些輔助結(jié)合試劑混合物的溶液處理表面，所述這些輔助結(jié)合試劑的每一種都連接到互補(bǔ)于在上述表面上的一個(gè)序列的寡(核苷酸)序列。以這種方式就可達(dá)到形成這些輔助結(jié)合部分的圖案的目的。優(yōu)選地，寡(核苷酸)序列是DNA的6至30鏈節(jié)。6至30鏈節(jié)的某些組可含有基本上類似的序列互補(bǔ)性，從而使對(duì)于雜交的近似結(jié)合恒量在某一給定的組內(nèi)是類似的，并且可識(shí)別地不同于較少互補(bǔ)性的序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，上述輔助結(jié)合部分是蛋白質(zhì)(例如，抗體)。
還可以把用來如下面5，13節(jié)中所述的那樣抑制施加到一個(gè)表面上的試劑或樣品的浸濕或散布的所述方法用于制備PMAMS(和/或施加樣品)?？梢杂盟┘拥碾娢?例如，從電極/反電極對(duì))進(jìn)一步控制試劑和/或樣品的沉積和/或散布(例如，參見Abbott等，1994年，Langmuir，10(5)1493-1497)。
PMAMS結(jié)合試劑可位于含有碳的材料上。它們還可以位于單獨(dú)的碳原纖維上，或者，PMAMS結(jié)合試劑可以位于一種或多種原纖維的聚集體上。在許多實(shí)施方案中，PMAMS結(jié)合試劑可以位于一種或多種原纖維懸浮液、原纖維分散體、原纖維與其它材料的混合物(如上述例子中所述)以及它們的混合物等之上。
PMAMS結(jié)合試劑可位于許多單根的原纖維和/或原纖維的聚集體上，該原纖維和/或原纖維的聚集體位于載體之上、之中或附近。在一個(gè)例子中，結(jié)合試劑位于分散的單根的原纖維或原纖維的聚集體上。這些原纖維或原纖維的聚集體可在載體上的一些不同的結(jié)合區(qū)域內(nèi)占據(jù)位置，并可構(gòu)成本申請(qǐng)所述的結(jié)合區(qū)域。
在另一個(gè)例子中，單獨(dú)的這樣一些結(jié)合區(qū)域或許多這樣的結(jié)合區(qū)域位于載體的隔開的不同區(qū)域中。借助非限定性的例子，單獨(dú)的這樣一些結(jié)合區(qū)域或結(jié)合區(qū)域的集合體可位于載體中的凹處、坑和/或孔洞里。而在另一個(gè)例子中，單獨(dú)的一直結(jié)合區(qū)域或許多結(jié)合區(qū)域可位于水滴、凝膠、彈性體、塑料、油等物質(zhì)里，這些物質(zhì)定位在載體的表面上。在另外又一個(gè)例子中，單獨(dú)的一些結(jié)合區(qū)域可通過一個(gè)涂層(可成圖案)而定位在載體上，這個(gè)涂層對(duì)于不同的結(jié)合試劑和/或結(jié)合試劑/原纖維的集合體具有不同的結(jié)合親合力。
借助于一種或多種微觀流體導(dǎo)管(例如，毛細(xì)管)使結(jié)合區(qū)域理想地位于許多單獨(dú)的原纖維上和/或把原纖維的聚集體制備在載體上。不同的或等同的一些結(jié)合試劑可存在于許多微觀流體導(dǎo)管中或許多微觀流體導(dǎo)管上，和/或多種不同的結(jié)合劑可存在于某一給定的微觀流體導(dǎo)管中或某一給定的微觀流體導(dǎo)管上?？梢允姑?xì)管與載體接觸(點(diǎn)樣)，和/或毛細(xì)管可發(fā)送試劑，這時(shí)微觀流體導(dǎo)管和/或表面被掃描或相對(duì)另一個(gè)平移(也就是說，書寫的類似鋼筆的方法)。微觀流體導(dǎo)管可把位于原纖維上的結(jié)合試劑發(fā)送到載體上，從而使該載體的某些區(qū)域暴露于原纖維—結(jié)合試劑復(fù)合物，以產(chǎn)生離散的結(jié)合區(qū)域。在一種優(yōu)選的情況中，不同的結(jié)合試劑每種存在于一個(gè)不同的微觀流體導(dǎo)管中，它們同時(shí)從導(dǎo)管陣列發(fā)送到載體上。在一個(gè)例子中，結(jié)合試劑和/或它們所定位的原纖維用與載體表面成鍵(例如，共價(jià)或非共價(jià)相互作用)的一種化學(xué)官能團(tuán)衍生化。在某些實(shí)施例中，結(jié)合試劑和原纖維非特異性地結(jié)合或吸附到表面上。而對(duì)于另一種情況，可把定位在原纖維上的結(jié)合試劑發(fā)送到在載體的表面中的凹處、坑和/或洞里。在另一個(gè)例子中，結(jié)合試劑發(fā)送到涂有一種材料的表面，這種材料對(duì)于某些結(jié)合試劑或結(jié)合試劑/原纖維集合體具有更強(qiáng)的或更弱的結(jié)合親合力，而這樣就產(chǎn)生了所述試劑的一些區(qū)域，這些區(qū)域占據(jù)的空間位置不同于其它那些結(jié)合試劑。
結(jié)合試劑定位在一種或多種磁性的單獨(dú)的原纖維或原纖維的聚集體上。在這樣一種情況下，磁性載體可把定位在磁性原纖維上的結(jié)合試劑吸引到該載體上。
載體可含有幾種不同的區(qū)域，這幾種不同的區(qū)域是磁性的且被一些非磁性的區(qū)域圍繞。定位在磁性原纖維上的結(jié)合試劑可定位在上述載體的磁性區(qū)域上。在一個(gè)例子中，載體可含有一種或更多種不同的區(qū)域，這不同的區(qū)域是磁性的且被一些非磁性的區(qū)域圍繞，而且，可以調(diào)節(jié)或改變上述磁性區(qū)域中的磁場(chǎng)強(qiáng)度。在這方面，采用這樣的可調(diào)節(jié)或可改變的磁場(chǎng)有助于把定位在原纖維上的結(jié)合試劑附著在載體表面或從該載體表面釋放，而這樣就可用來攪動(dòng)或混合所述那些區(qū)域。
結(jié)合區(qū)域的數(shù)目范圍大致為2至108個(gè)，而優(yōu)選的是25至500個(gè)區(qū)域。
結(jié)合區(qū)域可位于工作電極和/或反電極上。
此處所述的對(duì)于不同類型的PMAMS、載體以及電極及其結(jié)構(gòu)的不同實(shí)施方案也可以互相結(jié)合實(shí)施。
可以保存(例如，通過保護(hù)性表面涂層、干燥表面、處于真空或惰性氣氛下的耐用包裝、冷凍及有關(guān)方法)PMAMS載體以備將來所用。5.2、結(jié)合試劑本發(fā)明的結(jié)合區(qū)域制備成含有特異地與至少一種所感興趣的被分析物(配體)結(jié)合的結(jié)合試劑。在離散的結(jié)合區(qū)域中選擇結(jié)合試劑從而使結(jié)合區(qū)域具有所想要的結(jié)合特異性?？蓮谋绢I(lǐng)域中已知的能夠或被推定能夠特異地結(jié)合某種所感興趣的被分析物的任何分子中選取結(jié)合試劑?？蓮南率?.10節(jié)“可以進(jìn)行的ECL測(cè)定”中所述的那些被分析物中選取所感興趣的被分析物。這樣，結(jié)合試劑就包括但并不限于受體、用于受體的配體、抗體或其結(jié)合部分(例如，F(xiàn)ab，(Fab)′2)、蛋白質(zhì)或其片段、核酸、寡核苷酸、糖蛋白、多糖、抗原、抗原決定部位、細(xì)胞和細(xì)胞的組成部分、亞細(xì)胞粒子、碳水化合物部分、酶、酶底物、外源凝集素、蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)G、有機(jī)化合物、金屬有機(jī)化合物、病毒、鋸鹱、類病毒、類脂物、脂肪酸、脂多糖、肽、細(xì)胞代謝物、激素、藥劑、鎮(zhèn)靜劑、巴比妥鹽、生物堿、類固醇、維生素、氨基酸、糖、非生物聚合物、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、諸如聚合樹脂那樣的有機(jī)連接化合物、脂蛋白、胞質(zhì)分裂素、淋巴細(xì)胞活素、激素、合成聚合物、有機(jī)和無機(jī)分子等。核酸及寡核苷酸可以指包括但并不限于下述這些物質(zhì)的DNA、RNA和/或寡核苷酸的類似物含改性的堿基或改性的糖的寡核苷酸、含有不是磷酸二酯鍵的骨架化學(xué)物質(zhì)的寡核苷酸(例如，參見Nielsen，P.E.，1995年，AnnuRev.Biophys.Biomcl.Street.24167-183)和/或已經(jīng)被合成或被改性給出可用來形成與其它分子的鍵(共價(jià)或非共價(jià))的化學(xué)基團(tuán)(這里，我們定義核酸或寡(核苷酸)含有兩個(gè)或多個(gè)核酸堿基和/或核酸堿基的衍生物)的寡核苷酸。
本發(fā)明的PMAMS可具有許多的離散的結(jié)合區(qū)域，這些離散的結(jié)合區(qū)域至少包括一個(gè)含有一些結(jié)合試劑的結(jié)合區(qū)域，這些結(jié)合試劑彼此相同，且與含在其它結(jié)合區(qū)域中的那些結(jié)合試劑特異性不同，以便用不同的結(jié)合區(qū)域?yàn)樗信d趣的不同的被分析物提供結(jié)合。作為例子，這樣的一種PMAMS包括一個(gè)含有對(duì)于甲狀腺刺激激素(TSH)的抗體的結(jié)合區(qū)域、一個(gè)含有雜交肝炎C病毒(HCV)的寡核苷酸的結(jié)合區(qū)域、一個(gè)含有雜交HIV的寡核苷酸的結(jié)合區(qū)域、一個(gè)含有對(duì)于HIV蛋白質(zhì)或糖蛋白的抗體的結(jié)合區(qū)域、一個(gè)含有對(duì)于前列腺特異抗原(PSA)的抗體的結(jié)合區(qū)域、以及一個(gè)含有對(duì)于肝炎B病毒(HBV)的抗體的結(jié)合區(qū)域，或包括前述那些結(jié)合區(qū)域的子區(qū)域。
PMAMS可具有許多離散的結(jié)合區(qū)域，這些離散的結(jié)合區(qū)域至少包括一個(gè)結(jié)合區(qū)域，這個(gè)結(jié)合區(qū)域在其內(nèi)含有一些結(jié)合試劑，這些結(jié)合試劑結(jié)合特異性不同，從而使一個(gè)單獨(dú)的結(jié)合區(qū)域能結(jié)合多種所感興趣的被分析物。作為例子，這樣的一種PMAMS包括一個(gè)結(jié)合區(qū)域，這個(gè)結(jié)合區(qū)域含有對(duì)于T細(xì)胞抗原受體的抗體以及對(duì)于諸如CD4那樣的T細(xì)胞表面抗原的抗體。
PMAMS可具有許多離散的結(jié)合區(qū)域，這些離散的結(jié)合區(qū)域包括(i)至少一個(gè)結(jié)合區(qū)域，這個(gè)結(jié)合區(qū)域含有一些結(jié)合試劑，這些結(jié)合試劑彼此相同而與含在其它結(jié)合區(qū)域中的那些結(jié)合試劑中的至少一種的特異性不同；以及(ii)至少一個(gè)結(jié)合區(qū)域，這個(gè)結(jié)合區(qū)域在其內(nèi)含有一些結(jié)合試劑，這些結(jié)合試劑的結(jié)合特異性不同。作為例子，把PMAMS制作成具有(a)至少一個(gè)結(jié)合區(qū)域，這個(gè)結(jié)合區(qū)域含有單一特性的結(jié)合試劑(例如，對(duì)于T細(xì)胞抗原受體的抗體，例如，α、βT細(xì)胞抗原受體或者γ、δT細(xì)胞抗原受體)，這樣，使得這至少一個(gè)結(jié)合區(qū)域結(jié)合所有表達(dá)這種T細(xì)胞抗原受體的細(xì)胞；以及(b)至少一個(gè)結(jié)合區(qū)域，這個(gè)結(jié)合區(qū)域含有兩種不同的結(jié)合試劑，例如，對(duì)于T細(xì)胞抗原受體的抗體和對(duì)于CD4的抗體，這樣，使得這種至少一個(gè)結(jié)合區(qū)域結(jié)合表達(dá)那種T細(xì)胞抗原受體的CD4+T淋巴細(xì)胞(也就是說，T淋巴細(xì)胞的亞種群)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，至少一個(gè)結(jié)合區(qū)域含有一些結(jié)合試劑，這些結(jié)合試劑是不同的分子，但具有相同的結(jié)合特異性(例如，諸如表皮生長(zhǎng)因子和對(duì)于表皮生長(zhǎng)因子受體的抗體那樣的一些結(jié)合試劑)。
可選擇許多種結(jié)合試劑，從而使得盡管這些結(jié)合試劑不同且具有不同的結(jié)合特異性，但它們識(shí)別相同的被分析物(在一個(gè)可供選擇的實(shí)施例中，識(shí)別不同的被分析物)。例如，對(duì)于被分析物是一種具有眾多結(jié)合部分的被分析物的情況(例如，一種具有不同細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞)，與不同的結(jié)合部分結(jié)合的不同的結(jié)合試劑會(huì)識(shí)別相同的被分析物。作為另一個(gè)例子，對(duì)于在一個(gè)單個(gè)細(xì)胞上的不同的細(xì)胞表面抗原的抗體會(huì)識(shí)別相同的細(xì)胞。而作為又一個(gè)例子，對(duì)于一個(gè)單獨(dú)抗原的不同的抗原決定部位的抗體可用作識(shí)別該抗原的結(jié)合試劑。
在另外又一個(gè)實(shí)施例中，只有特異性地結(jié)合一種單獨(dú)的所感興趣的被分析物的結(jié)合試劑存在于一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域中?？梢赃x擇地，特異性地結(jié)合多于一種所感興趣的被分析物的結(jié)合試劑存在于一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域中(例如，交叉反應(yīng)抗體)。在一種特殊的方案中，可采用結(jié)合一類例如具有類似特性的被分析物的結(jié)合試劑。
還可把結(jié)合區(qū)域裝入含有一些結(jié)合試劑的PMAMS，這些結(jié)合試劑對(duì)于所需的標(biāo)準(zhǔn)被分析物是特異性的并被用作一種內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(例如，一個(gè)可與含有確定量的被分析物的樣品接觸的結(jié)合區(qū)域，而結(jié)合試劑與該被分析物結(jié)合)。還可把含有對(duì)于相同的被分析物特異性的結(jié)合試劑的多種結(jié)合區(qū)域裝入PMAMS，以便使得能取分析結(jié)果的統(tǒng)計(jì)平均。上述那些結(jié)合試劑不僅對(duì)相同的被分析物特異性，而且可以是等同的，從識(shí)別所述被分析物上的相同結(jié)合部分。于是，可制備與相同的結(jié)合部分特異性結(jié)合的許多結(jié)合區(qū)域(例如，在2個(gè)到108個(gè)的范圍內(nèi))，從而可對(duì)ECL量測(cè)記錄取統(tǒng)計(jì)平均，以便控制變化并提高精度。在PMAMS上的許多結(jié)合區(qū)域可以對(duì)在一單獨(dú)載體上的一種對(duì)照用被分析物或一種所感興趣的被分析物或者這兩種被分析物特異性。
作為另一個(gè)例子，可制備具有已知的ECL標(biāo)記物初始濃度數(shù)的一個(gè)或多個(gè)離散的結(jié)合區(qū)域。裝在內(nèi)部的ECL層用作對(duì)照物，以便監(jiān)控例如標(biāo)記降解和溫度效應(yīng)。
可采用這樣一種結(jié)合試劑，這種結(jié)合試劑是一種對(duì)于底物(所述底物是所感興趣的被分析物)特異性的酶，其中在所述底物上的酶反應(yīng)產(chǎn)物是一種信息試劑(reporter agent)(一種可檢測(cè)的試劑)，例如，是一種觸發(fā)ECL反應(yīng)的產(chǎn)物、一種熒光分子、一種一旦與合適的酶接觸就變色的物質(zhì)(例如，用于辣根過氧化酶的生色底物)等等。在這樣一種實(shí)施方案的一個(gè)例子中，用作結(jié)合試劑的酶是可用來檢測(cè)或測(cè)量樣品中的葡萄糖的葡萄糖脫氫酶(GDH)。ECL標(biāo)記物位于含有GDH的結(jié)合區(qū)域內(nèi)或位于該區(qū)域附近。通過酶在葡萄糖上的反應(yīng)產(chǎn)生NADH，NADH能與ECL標(biāo)記物反應(yīng)，促進(jìn)ECL(Martin等，1993年，Anal.Chim.Acta281475)。
可用含有增強(qiáng)背景結(jié)合作用的(也就是說，與存在于所感興趣的被分析物上以及在樣品中的其它被分析物上的結(jié)合成份結(jié)合的)的結(jié)合試劑的結(jié)合區(qū)域提高在檢測(cè)和測(cè)量電化學(xué)發(fā)光期間的信噪比。作為例子，這里所感興趣的被分析物是特異細(xì)胞亞種群(例如，CD4+細(xì)胞)而樣品是含有病人細(xì)胞的流體樣品(例如，血)，于是對(duì)于唾液酸的抗體可用作結(jié)合試劑，以增強(qiáng)對(duì)樣品中的幾乎所有細(xì)胞的背景結(jié)合(由于唾液酸是幾乎所有細(xì)胞表面糖蛋白的一個(gè)組成部分)，然后，對(duì)于特異于細(xì)胞亞種群的細(xì)胞表面抗原的抗體(例如，對(duì)于CD4的抗體)可用作結(jié)合試劑(在與含有對(duì)于唾液酸的抗體的結(jié)合區(qū)域相同或不同的結(jié)合區(qū)域中)。
5.3、電壓波形施加在多個(gè)ECL單元的電極和反電極對(duì)上的電壓波形(電位/時(shí)間變化)必須足以觸發(fā)ECL反應(yīng)。電壓波形通常是均勻電壓變化形式，從第一電壓開始，穩(wěn)定移動(dòng)到第二電壓，移動(dòng)回第一電壓再到第三電壓，然后再回到所述第一電壓。例如，波形可從-0.5伏到0.5伏范圍內(nèi)第一電壓開始，直升到1伏到2.5伏范圍的第二電壓，移動(dòng)回到第一電壓再到0.0伏到-1伏范圍的第三電壓。作為另一個(gè)例子，在較簡(jiǎn)單的波中，可把電壓修改為從0.0到+3.5到0.0。電壓波形可帶有線性斜坡、階梯函數(shù)和/或其它函數(shù)。當(dāng)電壓保持固定在一個(gè)電位時(shí)、電壓波形可具有時(shí)間周期?？上鄬?duì)于一個(gè)或多個(gè)參考電極控制所施加的電位，或者，沒有參考電極可資利用。此外，可用負(fù)電位。這樣，用來誘導(dǎo)來自本發(fā)明的盒的ECL發(fā)光的電壓，對(duì)于最佳ECL信號(hào)強(qiáng)度以及對(duì)于ECL標(biāo)記物和測(cè)定介質(zhì)的特異性，是易于選取的。
在某些應(yīng)用中，當(dāng)測(cè)量發(fā)自結(jié)合區(qū)域的光時(shí)，優(yōu)選改變電壓。這對(duì)于確定導(dǎo)致結(jié)合區(qū)域發(fā)光的電場(chǎng)的閾值特別重要。在這種情況下，在所述結(jié)合區(qū)域處施加的電位從被認(rèn)為是低于發(fā)光所需閾值的一個(gè)值開始，并第一次測(cè)量所發(fā)射的光。如果沒有測(cè)量到光，或者，光處于預(yù)定閾值以下，就在計(jì)算機(jī)的控制下，例如，通過計(jì)算機(jī)控制的電壓源，提高施加在電極對(duì)上的電位，并再一次測(cè)量。可重復(fù)這個(gè)過程，直至接收到預(yù)定的適量的光。以這種方式，所施加的電壓就可用作測(cè)定信號(hào)。
可從施加到電極對(duì)上的交流電壓產(chǎn)生ECL信號(hào)。
例如，如美國(guó)專利US 5,324,457和US 5,068,088所公開的那樣，熟悉電壓和電流設(shè)定的普通技術(shù)人員能易于選取用于觸發(fā)ECL發(fā)光的最佳電壓和電壓掃描。
如果工作電極是半導(dǎo)體或含有響應(yīng)于光而產(chǎn)生電流的另一種組成成分，則通過光照射該工作電極表面，可產(chǎn)生用于產(chǎn)生ECL的所需的電位。
5.4.可尋址的電極和使用該電極的方法可用眾多方法來對(duì)許多電極/反電極對(duì)尋址。圖14至18中示出了幾種示意性的這樣的技術(shù)。這些圖中作為例子所示出的是四個(gè)電極/反電極對(duì)101、102、103、104、以及一個(gè)波形信號(hào)發(fā)生器，波形信號(hào)發(fā)生器一般是一個(gè)數(shù)字計(jì)算機(jī)，而且，優(yōu)選地與用于處理由檢測(cè)裝置所檢測(cè)的ECL的計(jì)算機(jī)是同一計(jì)算機(jī)。
在圖14中，每個(gè)電極/反電極對(duì)101至104單獨(dú)由一對(duì)連接到波形信號(hào)發(fā)生器的線路尋址。作為例子，線路105、106訪問(access)電極/反電極對(duì)101?？捎貌ㄐ涡盘?hào)發(fā)生器在任何給定的時(shí)間給連接到各個(gè)電極/反電極對(duì)的任何一對(duì)或多對(duì)線路施加合適的波形。
為減少反電極對(duì)尋址所需的連接件的數(shù)目，可以提供圖14直接連接方案的替代方案。例如，圖15中示出了行和列的訪問方案，用于電激發(fā)一些或所有的電極。在這種方案中，在許多電極/反電極對(duì)的每一列中的電極201、202中的一個(gè)連接到在載體200上的共用電導(dǎo)體205，而在所述多個(gè)電極/反電極對(duì)的每一行中的每個(gè)反電極連接到載體200上的導(dǎo)體207、208。導(dǎo)體205、206在載體200的邊緣處分別連接到連接件C1、C2，而導(dǎo)體207、208分別連接到連接件R1、R2。然后，用單獨(dú)的線路把這些連接件的每一個(gè)連接到波形信號(hào)發(fā)生器。結(jié)果，在圖15的結(jié)構(gòu)中，所需的連接件的數(shù)目和來自波形信號(hào)發(fā)生器的信號(hào)線的數(shù)目已經(jīng)從8減少到4。
要使得能快速和順序地激發(fā)每個(gè)電極對(duì)，采用計(jì)算機(jī)控制的開關(guān)裝置是有益的。圖16的結(jié)構(gòu)顯示了連接到一個(gè)第一多路轉(zhuǎn)換器310的許多電極。許多反電極連接到第二多路轉(zhuǎn)換器320。第一多路轉(zhuǎn)換器還連接到電壓源330的第一個(gè)極，電壓源330典型地提供下述隨時(shí)間變化的電位。第二多路轉(zhuǎn)換器還連接到電壓源的第二個(gè)極。利用電連接到每個(gè)多路轉(zhuǎn)換器并連接到寄存器340的尋址線A0-A3，計(jì)算機(jī)處理器350可引導(dǎo)所述多路轉(zhuǎn)換器選擇性地把任何或所有第一電極連接到電壓源的第一個(gè)極，并把任何或所有的第二電極連接到電壓源的第二個(gè)極。
如圖17所示，許多電壓源通過一些單獨(dú)的多路轉(zhuǎn)換器組連接到每個(gè)電極。如果要求在一特定的電極對(duì)處有一個(gè)第一電位或電位范圍，就通過計(jì)算機(jī)處理器350對(duì)與提供那個(gè)電位的電壓源430結(jié)合在一起的多路轉(zhuǎn)換器410、420，典型地是通過寄存器340來尋址，由此使那個(gè)特定的電壓源與所述的電極對(duì)連接。如果對(duì)另一個(gè)電極對(duì)要求不同的電位或電位范圍，就通過計(jì)算機(jī)處理器來對(duì)與不同的電壓源460結(jié)合在一起的多路轉(zhuǎn)換器440、450尋址，由此，通過所結(jié)合的多路轉(zhuǎn)換器440、450使那個(gè)電壓源與所述電極對(duì)連接。
如圖14或圖15所示，如果這個(gè)實(shí)施例中的電極陣列中至少有一部分電極對(duì)是可以獨(dú)立激勵(lì)的，例如，一個(gè)電極對(duì)可由一個(gè)電壓源激勵(lì)，而另一個(gè)電極對(duì)同時(shí)由另一個(gè)電壓源激勵(lì)。可以選擇地，可用一個(gè)與兩組并聯(lián)在一起的多路轉(zhuǎn)換器都連接的單個(gè)電壓源來替代圖17的兩個(gè)電壓源，這使得能用同一電壓源來激勵(lì)兩個(gè)電極對(duì)。
如圖18所示，可配置許多電壓源520、530，而不是如圖17所示的那樣對(duì)每個(gè)電壓源配置一組兩個(gè)多路轉(zhuǎn)換器。這些電壓源可通過計(jì)算機(jī)控制的電開關(guān)510或一些開關(guān)連接到一組單個(gè)的多路轉(zhuǎn)換器310、320。如圖18所示、所述計(jì)算機(jī)會(huì)指示開關(guān)510把某一特定的電壓源與多路轉(zhuǎn)換器連接，并且還會(huì)指示該多路轉(zhuǎn)換器(通過它們的訪問線路A0-A3發(fā)信號(hào))把所選擇的電壓源與所希望的特定的電極對(duì)連接。
可以選擇地，在任何一個(gè)實(shí)施例中施加給每個(gè)電極對(duì)的電位可以變化。當(dāng)使用具有許多不同結(jié)合區(qū)域的盒時(shí)這一點(diǎn)特別有益。這樣的盒可要求在不同的結(jié)合區(qū)域處施加不同范圍的電位?？紤]過幾個(gè)不同的實(shí)施方案，這幾個(gè)不同的實(shí)施例能改變施加給每個(gè)電極的電位。
可有益地使用計(jì)算機(jī)控制的電壓源。計(jì)算機(jī)控制的電壓源是一個(gè)可被計(jì)算機(jī)訪問的電壓源，以選擇提供特定的電位。可以選擇地，可給所述計(jì)算編程，以便在一段預(yù)定的時(shí)間范圍順序施加某一特定范圍的電位。在這樣一個(gè)系統(tǒng)中，與計(jì)算機(jī)和電壓源電連接的訪問線使得計(jì)算機(jī)能給電壓源編好程序，以便產(chǎn)生特定的電位，施加給待施以電壓的那個(gè)電極對(duì)。
還可采用用于訪問許多電極對(duì)的另外一些方法。例如，可鄰近許多電極和反電極對(duì)的每一個(gè)放置許多參考電極，以便感知施加到其上的電壓。以這種方法可以維持對(duì)電壓波形的附加控制。
圖36顯示了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案；電極陣列(3600，3601)支承在由在絕緣體3604(例如，一張穿有孔3605的塑料片)中的一些縫隙的圖案分開的兩個(gè)表面(3602，3603)的每一個(gè)上。每個(gè)電極通過許多縫隙。如果電位施加在每一表面上的一個(gè)電極上，電流就只能通過與這兩個(gè)電極接觸的縫隙，這樣，就限制了任何可能發(fā)生的電化學(xué)或ECL的位置。在該圖所示的優(yōu)選實(shí)施方案中，電極(3600，3601)是在載體上的線路陣列。使在上述兩個(gè)表面上的兩組電極互相垂直取向。在上述絕緣片中的縫隙只位于每個(gè)表面的電極的相交部分。
這個(gè)實(shí)施方案優(yōu)于那些被單獨(dú)訪問的電極對(duì)的優(yōu)點(diǎn)是只需更少的電引線。
在一個(gè)可供選擇的實(shí)施方案中，省略了絕緣體3604，而把上述那些表面緊靠著放置，從而使得只有一個(gè)狹縫隙存在于上述兩個(gè)表面之間。在這個(gè)實(shí)施方案中，施加在每一表面的電極之間的電位會(huì)優(yōu)選地使電流通過電極的相交部分處(也就是說，在該處，兩個(gè)電極之間的距離最小)，這樣就限制了任何可能發(fā)生的電化學(xué)或ECL的位置。
5.5.光檢測(cè)用合適的光檢測(cè)器或鄰接本發(fā)明的裝置放置的檢測(cè)器檢測(cè)由被觸發(fā)的ECL發(fā)光所產(chǎn)生的光。光檢測(cè)器例如可以是薄膜、光電倍增管、光電二極管、雪崩光電二極管、電荷耦合器件(“CCD”)、或其它光檢測(cè)器或者攝像機(jī)。光檢測(cè)器可以是單個(gè)的檢測(cè)器，以檢測(cè)順序發(fā)光，或者可以是許多檢測(cè)器，以檢測(cè)并在空間上分辨在所發(fā)射的光的一個(gè)單獨(dú)波長(zhǎng)或多個(gè)波長(zhǎng)處同時(shí)發(fā)射的光。所發(fā)射和被檢測(cè)的光可以是可見光，或者可作為諸如紅外或紫外輻射那樣的不可見輻射而被發(fā)射。上述檢測(cè)器可以是靜止的，或者是可以移動(dòng)的?？山柚谕哥R、反射鏡以及光導(dǎo)纖維光導(dǎo)管或光導(dǎo)管(單個(gè)的、多個(gè)的、固定的或可移動(dòng)的)使所發(fā)射的光或其它輻射導(dǎo)向上述檢測(cè)器，所述透鏡、反射鏡以及光導(dǎo)纖維光導(dǎo)管或光導(dǎo)管定位在盒的結(jié)合表面上，或鄰近該盒的結(jié)合表面，或者，上述檢測(cè)器可直接接收光。此外，載體、PMAMS以及電極表面本身可用來引導(dǎo)光或透過光。
PMAMS可在光檢測(cè)器陣列的表面上形成。從而使每個(gè)檢測(cè)器只接收來自一個(gè)結(jié)合區(qū)域的光。所述光檢測(cè)陣列可以是CCD片，而結(jié)合區(qū)域可以(用標(biāo)準(zhǔn)的連接化學(xué)物質(zhì))附著到半導(dǎo)體器件表面。
沉積在結(jié)合區(qū)域上的液滴或沉積在一個(gè)附近的第二表面上的液滴可用作微透鏡，以引導(dǎo)或控制所發(fā)射的光?？梢赃x擇地，光檢測(cè)器可以在盒的前面直接定向，而且，可采用諸如拋物面反射器或透鏡那樣的各種聚光裝置，而不是采用光導(dǎo)管，來把發(fā)自許多結(jié)合區(qū)域的任何一個(gè)的光引導(dǎo)到所述檢測(cè)器?？赏瑫r(shí)或順序測(cè)量發(fā)自至少兩個(gè)離散的結(jié)合區(qū)域的光。
可用在光測(cè)量裝置和被測(cè)量的結(jié)合區(qū)域之間的“遮光器”(chopper)裝置來控制由于熱漂移、裝置的老化或光檢測(cè)器中所固有的電噪聲所產(chǎn)生的誤差。所述遮光器可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的那些普通機(jī)械遮光器中的任何一種，例如，具有能使光通過的狹縫或開口的旋轉(zhuǎn)圓盤。可以選擇地，可用LCD光闌、LCD光闌陣列、固體光閥或者諸如此類的東西來遮斷光?？梢赃x擇地，可采用諸如光學(xué)計(jì)算領(lǐng)域中已知的那樣的LCD遮光器的一個(gè)平面陣列或固體光閥。這些裝置優(yōu)選地位于盒的平面和光導(dǎo)管或聚光裝置之間，光導(dǎo)管或聚光裝置把光從結(jié)合區(qū)域引向光檢測(cè)器。在一個(gè)實(shí)施方案中，遮光器位于每個(gè)結(jié)合區(qū)域上方。當(dāng)使用LCD遮光器和光閥時(shí)，可在不同頻率處調(diào)制遮光器，以便為不同的發(fā)光結(jié)合區(qū)域同時(shí)提供不同的遮光速率。利用這種技術(shù)，可用一個(gè)單獨(dú)的光檢測(cè)器重疊和同時(shí)測(cè)量許多不同的光信號(hào)。然后可用與光檢測(cè)器電連接的電子帶通濾波器把單個(gè)的電信號(hào)分成幾個(gè)電分量，每個(gè)電分量對(duì)應(yīng)于許多單獨(dú)的光分量中的一個(gè)。通過如上述那樣遮斷光，或者通過采用本領(lǐng)域中眾所周知的其它機(jī)制，產(chǎn)生使得DC噪聲成分能被電濾波掉的AC光波形。
同樣可通過把先前確定的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)試劑比較來校準(zhǔn)ECL信號(hào)，以便針對(duì)試劑耗盡作信號(hào)調(diào)制。
5.6.ECL信號(hào)分析由一個(gè)給定的結(jié)合區(qū)域所產(chǎn)生的信號(hào)可具有一個(gè)范圍的值，而這些值與定量測(cè)量值相關(guān)，提供“模擬”信號(hào)。在另一種技術(shù)中，從每個(gè)區(qū)域得到“數(shù)字”信號(hào)，表明被分析物存在與否。
統(tǒng)計(jì)分析用于上述兩種技術(shù)，而且對(duì)于轉(zhuǎn)化許多數(shù)字信號(hào)特別有用以提供定量的結(jié)果。不過，某些被分析物要求表明閾值濃度有/沒有的數(shù)字信號(hào)。可單獨(dú)或組合利用‘模擬’和/或‘?dāng)?shù)字’格式。其它一些統(tǒng)計(jì)方法可用于PMAMS。例如，可在一個(gè)表面上產(chǎn)生PMAMS的濃度梯度(Chaudhury等，1992年，科學(xué)，2561539-1541)。這種技術(shù)用來通過對(duì)于整個(gè)濃度梯度上的結(jié)合情況的統(tǒng)計(jì)分析來確定濃度?？捎枚喾N不同的特異性結(jié)合試劑產(chǎn)生具有濃度梯度的PMAMS的多個(gè)線性陣列。濃度梯度可由給出所述那些不同濃度結(jié)合試劑的一些離散的結(jié)合區(qū)域構(gòu)成。
在盒的結(jié)合表面上有對(duì)照測(cè)定系統(tǒng)也是重要的，以確保每次分析的一致性，從而控制信號(hào)變化(例如，由于降解、盒及其它組件的波動(dòng)、老化、熱漂移、電子線路中的噪聲，以及光檢測(cè)裝置中的噪聲等產(chǎn)生的變化)。例如，可利用對(duì)相同的被分析物的多個(gè)多余的結(jié)合區(qū)域(含有對(duì)于所述相同的被分析物特異性的同樣的一些結(jié)合試劑或一些不同的結(jié)合試劑)。在另一個(gè)例子中，利用濃度已知的被分析物，或者，PMAMS的對(duì)照區(qū)域共價(jià)地連接到已知量的ECL標(biāo)記物，或者使用溶液中的已知量的ECL標(biāo)記物。
按照本發(fā)明所進(jìn)行的測(cè)定會(huì)快速且有效地收集大量的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)例如可以以數(shù)據(jù)庫的形式被儲(chǔ)存，由臨床或研究資料的匯集構(gòu)成。所收集的數(shù)據(jù)還可用于快速法醫(yī)或個(gè)人鑒定。例如，采用許多受到人類DNA樣品影響的核酸探針就可用于DNA指紋，可易于用來鑒定臨床或研究樣品。
5.7.多電極陣列的制備電極的寬度或直徑可大致為0.001mm至10mm。一個(gè)優(yōu)選范圍的電極對(duì)的尺寸(寬度或直徑或最寬尺寸，這取決于該電極對(duì)的幾何形狀)是0.01mm到1mm。
優(yōu)選地，用合適的導(dǎo)電材料制作電極，例如透明金屬膜或半導(dǎo)體(例如，分別為金或氧化銦錫)，這在本領(lǐng)域中是眾所周知的，例如，用于制作液晶顯示器等。在組裝好狀態(tài)的盒中，在第一和第二載體之間留下足夠的空間，以便容納例如薄膜或潤(rùn)濕表面形式的分析樣品。
可用含有碳、碳纖維、碳的納米管(nanotube)和/或上述這些材料的聚集體的材料制作電極。
可用碳原纖維制作電極?？杉庸ひ环N或多種單獨(dú)的原纖維和/或一種或多種原纖維的聚集體來形成更大的聚集體(美國(guó)專利US5,124,075)。
這個(gè)更大的聚集體是一個(gè)墊或網(wǎng)狀物(以后叫作”原纖維墊“)，其中，原纖維可纏結(jié)在一起或交織在一起。原纖維墊一般具有50M2/g到400M2/g的表面積。
作為例子，可把原纖維墊用作分析和/或制備電化學(xué)中的工作電極、反電極或參考電極。在一個(gè)例子中，原纖維墊用作用于電化學(xué)發(fā)光(ECL)的電極。
可用原纖維墊承載PMAMS的結(jié)合區(qū)域。本發(fā)明的PMAMS有許多離散的結(jié)合區(qū)域，其中兩個(gè)或更多個(gè)離散的結(jié)合區(qū)域可以彼此等同，或可以不同。原纖維墊承載一種或多種結(jié)合區(qū)域。
可用一個(gè)或多個(gè)微觀流體導(dǎo)管在原纖維墊上制備許多結(jié)合區(qū)域。不同的或等同的一些結(jié)合試劑可存在于許多微觀流體導(dǎo)管中，和/或多種不同的結(jié)合試劑可存在于一個(gè)微觀流體導(dǎo)管中。
在圖22A和圖22B中，用優(yōu)選為一個(gè)陣列形式的許多微觀流體導(dǎo)管優(yōu)選地同時(shí)發(fā)送含有所需要的那些結(jié)合試劑的液滴到原纖維墊2200的一些區(qū)域上，以形成一些離散的結(jié)合區(qū)域2202。所述那些結(jié)合試劑與存在于上述原纖維墊的部分成鍵。所述那些結(jié)合試劑可非特異性地吸收到上述墊上，或在表面上干燥。
把所需要的結(jié)合試劑發(fā)送到原纖維墊上，而同時(shí)對(duì)該墊施加抽吸過濾。在這種情況下，抽吸過濾沒抽到，或抽到一些或所有的結(jié)合試劑進(jìn)入或穿過上述墊，而這樣做時(shí)，減少了在形成圖案過程期間結(jié)合試劑在上述墊的表面上側(cè)向散布的量。
把碳原纖維的懸浮液壓在基片上，制備原纖維墊，該懸浮液的液體能穿過所述基片(例如，一種過濾物)。可用來形成原纖維墊的過濾物的例子包括濾紙、由聚合物(例如，尼龍)膜形成的過濾物、金屬微孔篩、陶瓷濾器、玻璃濾器、彈性體過濾器、玻璃纖維過濾物和/或兩種或多種這樣的過濾材料的組合。過濾領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到這些材料只是適于過濾固體懸浮液的許多可能的材料的一些例子。
圖23A和圖23B顯示一種實(shí)施方案，其中，可通過抽吸過濾制作原纖維墊。用過濾物2300過濾碳原纖維2301的分散液和/或懸浮液，過濾物2300可選擇地配備有過濾膜2303和/或過濾物載體2302。利用抽吸過濾懸浮液，而抽吸作用例如是通過一個(gè)濾瓶2306由真空源2305施加給上述過濾器的。原纖維墊2304聚集在過濾膜2303和/或過濾物載體2302上?？蓮纳鲜鲞^濾物上去除帶或不帶過濾膜2302的原纖維墊2304。
在另一個(gè)實(shí)施例中，用壓力強(qiáng)迫原纖維的懸浮液穿過過濾器。在一個(gè)例子中，通過用活塞把一個(gè)受約束的空氣層和/或液體層壓在上述懸浮液上面，從而把壓力施加在受約束的原纖維的懸浮液上。在一個(gè)特定的例子中，原纖維過濾器限制在注射器上，所述活塞是注射器柱塞，而上述過濾器是一次性注射器過濾器(本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知許多這樣的過濾器)。
通過毛細(xì)管作用迫使原纖維的懸浮液穿過過濾器，或者，通過把所述懸浮液芯吸進(jìn)或穿過過濾器來過濾所述原纖維的懸浮液。
在另一個(gè)例子中，使單根的原纖維或原纖維的聚集體共價(jià)交聯(lián)成墊，用光照射用光敏部分所衍生的原纖維，光敏部分當(dāng)受到光作用時(shí)就聚合。
可用過濾物把原纖維俘獲在它的孔中，從而構(gòu)成一個(gè)復(fù)合物的墊，其中，過濾物起到一個(gè)載體的作用。在圖24中，可通過使由源2402所發(fā)送的原纖維2401的稀漿通過兩個(gè)大滾筒2403之間來制備原纖維墊2400。在這個(gè)過程中，類似于在制備紙片或聚合物片的過程中所見到的那樣，滾筒壓迫懸浮液的液體，并且生產(chǎn)大的、連續(xù)的原纖維墊，可從這個(gè)大的、連續(xù)的原纖維墊上切下較小的墊。
原纖維墊可以是獨(dú)立的或可被支承。
可改變過濾速率，以獲得所需要的墊性能。例如，可改變的那些性能包括結(jié)構(gòu)的均勻性或不均勻性、原纖維或原纖維聚集體的纏結(jié)程度、厚度、墊的孔隙度和/或它們的組合。
碳原纖維的懸浮液受到約束，并去除懸浮原纖維的液體。在一個(gè)例子中，使其中懸浮原纖維的液體蒸發(fā)。在另一個(gè)例子中，通過加熱去除液體。在另外又一個(gè)例子中，懸浮液受到離心作用，并去除所得到的液體(例如，上清液)。在另一個(gè)例子中，通過抽氣去除液體。
可把懸浮液置于一個(gè)或多個(gè)上述過濾物上，并通過蒸發(fā)使懸浮液干燥?？赏ㄟ^加熱或在一個(gè)爐子中烘烤來弄干懸浮液，或者，通過冷凍和萃取液體來去除液體。在另外又一個(gè)例子中，通過用泵抽氣來去除液體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的許多其它方法都可用來從懸浮液中去除液體。
可通過使一種或多種碳原纖維分散在合適的液體、準(zhǔn)固體或凝膠中形成適于通過過濾形成原纖維墊的原纖維懸浮液。合適的液體的例子包括但并限于水、乙醇、甲醇、己烷、二氯甲烷、緩沖過的溶液、表面活性劑、有機(jī)溶劑、含有生物介質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)、抗體或其片段、細(xì)胞、亞細(xì)胞粒子、病毒、核酸、抗原、脂蛋白、脂糖、類脂物、糖蛋白、碳水化合物、肽、激素或藥劑、小分子的溶液、聚合物前體、酸或堿的溶液、油和/或它們的組合)的溶液。
可通過借助聲處理把碳原纖維分散在含水溶液中來制備原纖維的懸浮液。在另一個(gè)實(shí)施例中，可加入表面活性劑或洗滌劑。
原纖維墊的厚度可大體為0.01μm到10,000μm。
在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，原纖維墊的厚度在1μm到100μm之間。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施例中，原纖維墊的寬度或直徑范圍為10mm到200mm。
可重復(fù)沖洗并重新過濾原纖維墊，以去除懸浮液殘留的殘余材料。
加熱經(jīng)過濾或蒸發(fā)所制備的原纖維墊(例如，在爐子中)，以去除未被過濾去除的懸浮液殘留液體。
可用連續(xù)的過濾步驟形成由一個(gè)或多個(gè)不同的層所構(gòu)成的原纖維的墊，該一個(gè)或多個(gè)不同的層或者接觸一個(gè)或多個(gè)其它的層，或者緊密鄰近一個(gè)或多個(gè)其它的層?？赏ㄟ^幾種性質(zhì)來區(qū)分這些層，這些性質(zhì)包括但并不限于孔隙度的差別、密度、厚度、單根原纖維和/或原纖維的微觀聚集體的尺寸分布、類型、原纖維聚集體的數(shù)量和/或尺寸、原纖維的化學(xué)衍生性(參看下文)和/或有其它物質(zhì)附著在原纖維上。
圖25，通過連續(xù)的過濾步驟制備多層原纖維墊2500。一個(gè)0.5μm到100μm厚的平原纖維層2501構(gòu)成第一層；一個(gè)0.5μm到10μm厚的原纖維層2502構(gòu)成第二層，原纖維層2502帶有諸如阻止吸收蛋白質(zhì)和其它分子的聚(乙二醇)那樣的部分；一個(gè)0.5μm到5μm厚的帶有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域(參看上文)的層2503構(gòu)成第三層。所述結(jié)合區(qū)域含有一種或多種可結(jié)合被分析物2505的抗體2504。抗體/被分析物的復(fù)合物可結(jié)合一種被標(biāo)記的抗體2506。標(biāo)記物可以是ECL標(biāo)記物。在另外一些實(shí)施例中，上述標(biāo)記物可以是在本申請(qǐng)的其它地方所述的許多標(biāo)記物的一種或多種。這樣的一種多層墊可以是獨(dú)立的，或者可支承在上述許多可能的載體的一種上面。
可形成有多層組合的多層墊，其中，某些或所有的層可以是不同的。
可以給用來構(gòu)成原纖維墊的過濾物、原纖維和/或原纖維墊涂層。在一些特定的實(shí)施例中，涂層是金屬。可以把這些涂層弄成圖案，從而使某些部分被涂層，而另外一些部分不涂層。在一個(gè)例子中，用電沉積來施加涂層。在另一個(gè)例子中，用化學(xué)鍍層來施加涂層。
給過濾物涂覆金屬，并用與所述金屬成鍵的化學(xué)官能團(tuán)對(duì)原纖維衍生化。所述過濾物是金屬網(wǎng)或金屬片。
原纖維墊可以是扁平的或可以變形、規(guī)則的或不規(guī)則的、圓的、卵形的、矩形的、或許多形狀中的一種形狀、剛性的或柔軟的、透明的、半透明的、局部或整個(gè)不透明，并且可具有復(fù)合性能或者一些不同的的單獨(dú)或復(fù)合性能的區(qū)域。
上述墊可以是一個(gè)圓盤或取自一張板的一小塊。
優(yōu)選地同時(shí)制作許多原纖維墊，且優(yōu)選地制作成陣列形式。在一個(gè)例子中，微觀流體導(dǎo)管的陣列在上述載體上構(gòu)成許多原纖維墊。在另一個(gè)過濾物陣列中，或一個(gè)成圖案的過濾物(例如，具有不同孔隙度的一些區(qū)域)用來制備原纖維墊的陣列。
用具有一些孔洞陣列的掩模(例如，篩網(wǎng))來覆蓋過濾物或載體的某些部分，并通過過濾和/或蒸發(fā)同時(shí)制作許多離散的纖維墊。
原纖維墊的密度從0.1到3.0g/cm2。該墊可具有可變的密度。例如，可不時(shí)地給所述墊施加機(jī)械力或壓力，以便增加或減少密度。
原纖維墊可有一些孔。這些孔可局部和/或完全穿過該墊延伸，或者可以是一個(gè)網(wǎng)絡(luò)或一些孔的一部分。這些孔的尺寸范圍大致從50埃到1000μm。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，原纖維墊具有一些尺寸范圍從200埃到500埃的孔。所述墊的孔隙度在諸多因素中主要取決于該墊的密度。
上述墊的孔隙度始終貫穿整個(gè)墊，或者，可隨在墊中位置的變化而增加或減少。原纖維墊可具有雜亂和/或隨機(jī)方式分布的、不同尺寸的各種各樣的孔。
原纖維墊可含有不同孔隙度的一些不同區(qū)域。例如，原纖維墊可具有一層或多層，每層有不同的孔隙度。原纖維墊可有一些貫穿該墊的不同孔隙度的柱。
可通過包含不同數(shù)量的碳原纖維聚集體來改變上述墊的孔隙度，這些聚集體具有不同的尺寸、形狀、成分或組合。在一個(gè)具體的例子中，從單獨(dú)的原纖維，CC原纖維(如上述)和BN原纖維(下述)或一些不同的組合制備墊。例如，原纖維墊中，某些孔可大到足以通過象生物細(xì)胞那樣大的物體、某些孔可通過象蛋白質(zhì)或抗體那樣大的生物介質(zhì)、某些孔可只通過小(分子量＜1000)的有機(jī)分子和/或有這些孔的組合。
上述墊的孔隙度使得一種或多種分子，液體、固體、乳濁液、懸浮液、氣體、凝膠和/或分散液能擴(kuò)散進(jìn)該墊、位于該墊內(nèi)和/或穿過該墊。原纖維墊的孔隙度使得生物介質(zhì)能擴(kuò)散(主動(dòng)或被動(dòng))或用某些裝置強(qiáng)迫進(jìn)入該墊、位于該墊內(nèi)和/或穿過該墊。生物介質(zhì)的例子包括但不限于全血、分成各部分的血、血漿、血清、尿、蛋白質(zhì)溶液、抗體或其片段、細(xì)胞、亞細(xì)胞粒子、病毒、核酸、抗原、脂蛋白、脂糖類、類脂物、糖蛋白、碳水化合物、肽、激素或藥劑。原纖維墊可具有一個(gè)或多個(gè)不同孔隙度的層，從而使材料可穿過一層或多層，但不穿過其它那些層。
原纖維墊用另一種材料承載或支承在另一種材料上。作為例子，支承材料可以是金屬、塑料、聚合物、彈性體、凝膠、紙、陶瓷、玻璃、液體、蠟、油、石臘、有機(jī)固體、碳或者上述兩種或多種物質(zhì)的混合物。所述材料可以是固體的或液體的。如果它是固體的，它可含有一個(gè)或許多孔洞或孔。在一個(gè)特定的例子中，上述載體可以是金屬篩網(wǎng)、尼龍過濾膜或?yàn)V紙。所述載體可以是導(dǎo)體、半導(dǎo)體和/或絕緣體。
在美國(guó)專利US 5,304,326和US 5,098,771所公開的一個(gè)實(shí)施例中，原纖維可分散在另一種材料中。例如，原纖維可分散在油、蠟、石臘、塑料(例如，ABS、聚苯乙烯、聚乙烯、丙烯腈等)、陶瓷、聚四氟乙烯、聚合物、彈性體、凝膠和/或它們的組合中。原纖維在其它材料中的分散液是導(dǎo)電性的?？梢阅Ｋ?、壓制、成型、鑄造、紡制、編織和/或噴射原纖維在其它材料中的分散體，以形成所需形狀和/或形式的物體。原纖維墊可帶有另外的材料，例如，細(xì)纖維、碎片或金屬球，以便提高所述墊的電導(dǎo)率。在另一個(gè)例子中，原纖維墊可帶有尺寸、形狀及密度可變的其它碳纖維、玻璃纖維和/或金屬纖維，以產(chǎn)生僅用原纖維所不能獲得的孔隙度。在另一方面，上述墊可帶有磁珠(例如，DYNAL珠)。在后一個(gè)例子中，所述珠可用來改變上述墊的孔隙度，或者，所述珠本身可用作載體，用來固定結(jié)合區(qū)域。
其它一些碳纖維(例如，碳的納米結(jié)構(gòu)、碳納米管、buckminister富勒氏籠形碳分子、bucky管、富勒氏籠形碳分子或它們的組合)可用來替代碳原纖維。
碳原纖維制備時(shí)可同時(shí)有共價(jià)連接到它們的表面上的化學(xué)官能團(tuán)。如在國(guó)際專利WO 90/14221中所述的那樣，這些化學(xué)官能團(tuán)包括但并不限于COOH、OH、NH2、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)-酯、聚-(乙二醇)、硫羥、烷基((CH2)n)基團(tuán)和/或它們的組合。這些和其它化學(xué)官能團(tuán)可用來把其它材料附著到原纖維的表面上。
某些化學(xué)官能團(tuán)(例如，COOH、NH2、SH、NHS-酯)可用來把其他小分子偶連到原纖維上。這樣的化學(xué)官能團(tuán)和小分子的組合有許多種可能。
在許多實(shí)施例中，NHS-酯基團(tuán)用來連接帶有親核化學(xué)官能團(tuán)(例如，胺)的其它分子或材料。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，親核化學(xué)官能團(tuán)存在于生物分子上和/或生物分子中，該生物分子是天然的和/或是化學(xué)衍生的。合適的生物分子的例子包括但并不限于氨基酸、蛋白質(zhì)及其功能性片段、抗體、抗體的結(jié)合片段、酶、核酸以及它們的組合。這是許多這樣的可能的技術(shù)之一，而且一般可用于這里所給出的那些例子和許多其它類似的材料和/或生物分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，可用于ECL的試劑可通過NHS—基團(tuán)附著到原纖維上。
可用于ECL測(cè)定的抗體可通過共價(jià)鍵(例如，與NHS—酯基團(tuán)反應(yīng))、可通過與合適的連接物(參見上文)反應(yīng)、通過非特異性結(jié)合和/或可通過這些方法的結(jié)合，而附著到一種或多種原纖維或者一種原纖維墊上。核酸和/或細(xì)胞通過共價(jià)連接到附著在原纖維上的NHS—酯上可附著到該原纖維或纖維墊上。
可能希望控制材料與原纖維和/或原纖維墊非特異性結(jié)合的程度。只是作為非限定性的例子，可能希望減少或防止下述這些物質(zhì)的非特異性吸收，這些物質(zhì)是蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段、細(xì)胞、亞細(xì)胞粒子、病毒、血清和/或其中的一種或多種成分、ECL標(biāo)記物(例如，RuII(bpy)3和RuIII(bpy)3衍生物)、草酸鹽、三烷基胺、抗原、被分析物和/或這些物質(zhì)的組合。在另一個(gè)例子中，可能希望增強(qiáng)生物分子的結(jié)合。
一種或多種減少或防止非特異性結(jié)合的化學(xué)組成部分可存在于下述物質(zhì)之中，之上或附近，這些物質(zhì)是一種或多種原纖維、一種或多種原纖維聚集體和/或原纖維墊。通過使PEG組成成分共價(jià)連接到一種或多種原纖維和/或原纖維墊上，控制非特異性結(jié)合。帶電荷的殘余物(例如，磷酸鹽、銨離子)可共價(jià)地附著到一種或多種原纖維或原纖維墊上。
用于載體、電極和/或結(jié)合區(qū)域的材料可以用表面活性劑處理，以減少非特異性結(jié)合。例如，可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的表面活性劑和/或洗滌劑(例如，吐溫系列，Triton，span，Brij)處理原纖維或原纖維墊。用表面活性劑和/或洗滌劑的溶液清洗、浸濕、保溫、聲處理和/或與這些方法的組合一起處理原纖維或原纖維墊?？刹捎肞EGs的溶液和/或行為方式類似于PEG的分子(例如，寡糖或多糖、其它親水性低聚物或聚合物)(“聚乙二醇化學(xué)生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用”，Harris，J.M.編輯，1992，Plenum出版社)表面活性劑和/或洗滌劑，和/或一起使用。
可通過競(jìng)爭(zhēng)性非特異吸收阻斷諸如上面所列出的那些物質(zhì)那樣的某些物質(zhì)的所不希望的非特異吸收。這種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物質(zhì)可以是牛血清白蛋白(BSA)免疫球蛋白G(IgG)。
可通過TAG的化學(xué)改性減少ECL-TAG的非特異性結(jié)合。例如，可以改性TAG，以提高它的親水性(例如，通過給在Ru(bpy3)中的二吡啶基配體加入親水的極性氫鍵和/或帶電荷的官能團(tuán))，而這樣就減少了TAG與其它表面的非特異性結(jié)合。
可能希望使生物分子或其它介質(zhì)固定到原纖維或原纖維墊上?？梢愿街贵w、抗體片段、蛋白質(zhì)、酶、酶底物、抑制劑、輔因子、抗原、不全抗原、脂蛋白、脂糖、細(xì)胞、亞細(xì)胞組分、細(xì)胞受體、病毒、核酸、抗原、類脂物、糖蛋白、碳水化合物、肽、氨基酸、激素、蛋白質(zhì)結(jié)合的配體、藥劑和/或它們的組合。
還可能希望附著非生物物質(zhì)于原纖維上，例如，但并不限于聚合物、彈性體、凝膠、涂層、ECL標(biāo)記物、氧化還原活性物質(zhì)(例如，三丙胺、草酸鹽)、無機(jī)材料、螯合劑、連接物等。
一種或多種或者許多物質(zhì)可變?yōu)榉翘禺愋越Y(jié)合(例如吸收)到原纖維或原纖維墊的表面。
可通過非特異性吸收使生物分子或其它介質(zhì)附著到原纖維或原纖維墊上。對(duì)于任何給定的原纖維、原纖維墊和/或生物分子，非特異性吸收的程度由所述每種物質(zhì)的某些性質(zhì)確定。存在于原纖維上的某些化學(xué)官能團(tuán)或生物組成成分可減弱或增強(qiáng)非特異性結(jié)合。在蛋白質(zhì)的表面上存在有疏水性和/或親水性斑點(diǎn)(patch)可增強(qiáng)或減弱蛋白質(zhì)與原纖維或原纖維墊的非特異性結(jié)合。用親水性和/或疏水性斑點(diǎn)來控制在所控制區(qū)域中的非特異性結(jié)合。
可用烷基鏈(CH2)和/或羧酸基團(tuán)對(duì)原纖維衍生化，以增強(qiáng)生物分子或介質(zhì)或者其它材料的非特異性結(jié)合。
圖26示意性地說明對(duì)于單獨(dú)的原纖維情況時(shí)的實(shí)施例。用烷基鏈2601衍生化原纖維2600。生物分子2602、2603和2604與該烷基鏈非特異性地結(jié)合。聚合物/彈性體2605也被結(jié)合。
未衍生化的原纖維、原纖維聚集體和/或原纖維墊用來通過非特異性結(jié)合固定生物分子、生物介質(zhì)和其它材料。
ECL TAG含有帶電荷的殘余物。使ECL TAG選擇性地吸引到載體和/或電極上。例如，具有凈負(fù)電荷的衍生化的ECL TAG對(duì)于處于更大還原電位的電極具有較低的親合性，然而，對(duì)于電極電位變得更加氧化性時(shí)的電極具有較高的親合性。調(diào)節(jié)ECL tag和/或結(jié)合試劑對(duì)于電極的親合性(例如，在結(jié)合和/或清洗步驟期間減少親合性，而在ECL量測(cè)記錄期間增加ECL TAG和/或結(jié)合試劑的親合性，以提高由ECLTAG所感受的有效電位)。
在圖28中，可借助共價(jià)鍵使分子(生物的和非生物的)附著于原纖維上。載有NHS—酯化學(xué)官能團(tuán)的原纖維2800可形成與生物分子或生物介質(zhì)2802、2803的共價(jià)鍵2801。這些生物介質(zhì)可使用氨基，以便通過與NHS—酯基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵。固定聚合物2800。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到NHS—酯基團(tuán)作為對(duì)于分子的偶聯(lián)劑的通用性，并且能選擇合適的生物分子和合適的反應(yīng)條件，以實(shí)現(xiàn)固定。
一對(duì)組成成分和/或分子“M1”和“S1”中，其中的一種或多種附著于原纖維上，且顯示相互親合性或結(jié)合能力。M1/S1可以是抗體/抗原、抗體/不全抗原、酶/底物、酶/輔因子、酶/抑制劑、外源凝集素/碳水化合物、受體/激素、受體/效應(yīng)物、核酸/核酸、蛋白質(zhì)/核酸、病毒/配體、細(xì)胞/細(xì)胞受體等?！敖Y(jié)合對(duì)”M1/S1有許多種組合，且能選擇一些適于獲得所需要的結(jié)合的組合。M1或S1或者M(jìn)1和S1兩者都可以附著到一種或多種原纖維上。
圖27和圖28說明可能用于這個(gè)實(shí)施例的多種可能的結(jié)構(gòu)中的某些結(jié)構(gòu)。在圖27中，用烷基鏈2701所衍生的原纖維2700非特異性地結(jié)合了分子2702，分子2702對(duì)于另一種分子2703具有相互親合性或結(jié)合能力。分子2703還附著于另一種分子2704。阻斷分子2705可非特異性地吸收到原纖維上。阻斷聚合物2706和/或具有配體(2708)的聚合物2707被非特異生地吸收，其中配體(2708)對(duì)于分子2709具有親合性。
在圖28中，原纖維2800通過2801共價(jià)連接生物分子2802和2803以及接頭分子(linker group)2804。接頭分子2804對(duì)于另一種生物分子2805具有相互親合性或結(jié)合能力。生物分子2803對(duì)另一接頭分子2806具有相互親合性或結(jié)合能力，其中接頭分子2806與2807共價(jià)連接。具有對(duì)于結(jié)合對(duì)2809特異性的配體2812的聚合物2808與原纖維共價(jià)連接。阻斷分子(例如，BSA)2811和阻斷聚合物2810共價(jià)連接。
可以用生物素和/或生物素酰化(biotinylated)的接頭物衍生原纖維，而抗生物素蛋白和/或鏈霉抗生物素蛋白可以與這接頭物結(jié)合?？股锼氐鞍缀?或鏈霉抗生物素蛋白可以與原纖維結(jié)合，而生物素?；目贵w和/或蛋白質(zhì)可以結(jié)合。通過非特異性結(jié)合、共價(jià)鍵、另外的或相同的偶聯(lián)對(duì)或者它們的組合，可使抗生物素蛋白和/或鏈霉抗生物素蛋白固定在原纖維上。采用(鏈霉)抗生物素蛋白以及生物素作為“結(jié)合對(duì)”是把生物分子或生物介質(zhì)附著于其它材料上的廣泛采用的方法，而且對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是眾所周知的(Spinke等，1993年，Langmuir，91821)。
一個(gè)結(jié)合對(duì)可以是一種單克隆抗體和一種與該抗體結(jié)合的抗原。
可以構(gòu)成多重結(jié)合對(duì)(例如，M1/S1/M2)。M1是單克隆抗體，S1是對(duì)于M1的抗原，而M2是與S1結(jié)合的抗體。這種復(fù)合物可構(gòu)成一種抗體/抗原/抗體“夾層”復(fù)合物(這樣的抗體可以被單克隆，或可以不被單克隆)。M2可以是一種用ECL活性的標(biāo)記物標(biāo)記的抗體(參看上文)、一種螢光標(biāo)記物、一種放射性標(biāo)記物、一種酶標(biāo)記物和/或它們的組合。
M1可以是能與金屬、金屬離子或金屬有機(jī)化合物絡(luò)合的一種組成成份(一種“螯合劑”)，而S1是與M1形成一種絡(luò)合物的一種金屬、金屬離子或金屬有機(jī)化合物(一種“螯合劑”)，而M2是一種生物分子上的組成成份，這種生物分子與M1/S1絡(luò)合物結(jié)合(Gershon和Khilko，1995年，免疫方法雜志，7371)。
用本領(lǐng)域中眾所周知的方法進(jìn)行金屬電極圖案和把電流分布于在表面上的這樣的電極的導(dǎo)電元件的制作(例如，參見美國(guó)專利US 5,189,549)。在透明表面上制備金屬膜，以產(chǎn)生液晶顯示器，并且很適于制備本發(fā)明的電極。參見Haneko，1987年，液晶電視顯示器，液晶顯示器的原理和應(yīng)用，KTK科學(xué)出版社，東京，D.Reidel Publishing。例如，還可按照DiMilla等人的方法(J.Am.Chem.Soc.116(5)2225-2226)制備透明電極表面。使0.5nm的鈦和5nm的金沉積在透明基片(玻璃或塑料)上?？刹捎猛ㄟ^上述DiMilla的方法所制備薄金層來制備用上述Kumar的方法所制備的透明電極結(jié)構(gòu)。最好改進(jìn)這種方法，以增加導(dǎo)電層的厚度，改進(jìn)運(yùn)載電流的能力，而同時(shí)最好保持透明性，而這一點(diǎn)對(duì)普通技術(shù)人員來說是顯而易見的?？捎眠@樣的技術(shù)制備與PMA MS的離散的結(jié)合區(qū)域?qū)?zhǔn)或鄰接的電極表面。
此外，膜和/或單層可由這樣一些組成成分構(gòu)成，其中這些組成成份便于從電極表面給ECL標(biāo)記物傳遞電位，而不是如Zhang和Bard所教導(dǎo)的那樣，采用一些絕緣組成成份(例如，烷基鏈)。例如，可采用廣泛的共軛系統(tǒng)中的Pi軌道重疊用于電子傳遞。由聚吡咯或其它共軛的環(huán)或雙鍵結(jié)構(gòu)提供這樣的Pi軌道電子傳遞。
可用寡核苷酸來調(diào)節(jié)電子傳遞。例如，可采用在雙鏈DNA中重疊Pi鍵，以提高電子傳遞速率。結(jié)合至電極表面的低聚核苷酸可用作結(jié)合區(qū)域的結(jié)合試劑。一旦結(jié)合了互補(bǔ)的寡核苷酸序列，就形成具有組織好的重疊的Pi鍵的雙鏈。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，一種最初或原始固定了的(例如，共價(jià)地與一個(gè)載體結(jié)合)寡核苷酸是ECL標(biāo)記的。在另一個(gè)實(shí)施例中，一種輔助的互補(bǔ)的寡核苷酸或?qū)ι鲜鲈嫉墓押塑账岬木植炕パa(bǔ)序列的寡核苷酸是ECL標(biāo)記的。與上述輔助的寡核苷酸互補(bǔ)或局部互補(bǔ)的叔寡核苷酸被標(biāo)記(例如，一種夾層測(cè)定)。還可利用分枝了的寡核苷酸鏈?？衫酶鞣N各樣的寡核苷酸和/或寡核苷酸的仿制品(例如，具有改性的堿基和/或具有例如含有氮和/或硫的改性的骨架的寡核苷酸)?？蛇M(jìn)行有關(guān)差異的研究?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)電子傳遞來監(jiān)控在寡核苷酸和/或寡核苷酸的復(fù)合物中的Pi重疊的可變化的穩(wěn)定性?？梢詫?duì)照來自更無序的單鏈寡核苷酸的信號(hào)和/或所期望的信號(hào)，關(guān)聯(lián)由Pi鍵穩(wěn)定的ECL標(biāo)記的雙螺旋寡核苷酸對(duì)所產(chǎn)生的信號(hào)(例如，ECL光產(chǎn)生的和/或阻抗測(cè)量)。對(duì)于在完全互補(bǔ)的ECL標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸和局部互補(bǔ)的ECL標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸之間的ECL信號(hào)的變化可以相關(guān)。此外，可利用多種寡核苷酸的寡核苷酸復(fù)合物。例如，可采用三重螺旋。
可用ECL檢測(cè)以及電子裝置測(cè)量電子傳遞速率的調(diào)節(jié)。ECL標(biāo)記物可以共價(jià)地連接到寡核苷酸的一些鏈上和/或被非特異性地結(jié)合(例如，被插入)。可以不用接頭物(例如，5′硫醇化的DNA在金上的吸收)，或者用短的(＜10個(gè)原子)接頭物，使DNA與電極結(jié)合，以保證對(duì)于從DNA到電極的電子傳送的低電阻?？墒褂媚苡行У貜碾姌O到DNA鏈(例如，一個(gè)聚乙炔鏈)傳送電子的連接鏈。
可使用一種混合的單層和/或膜，其中，該單層或膜的至少一種構(gòu)成部分根據(jù)具體情況便于傳遞電位?？梢赃x擇地，使便于電位傳遞的一種分子或粒子吸附到上述單層或膜上。如前述例子那樣，可使用Pi共軛的單層和/或吸附支和/或鄰近于電極表面的導(dǎo)電微觀粒子。在單層或膜中產(chǎn)生成圖案的規(guī)則縫隙。通過利用受控制的一些縫隙圖案，而這些縫隙圖案在一種有序的實(shí)質(zhì)上是垂直的SAM中，其中SAM由長(zhǎng)鏈鏈烷硫醇構(gòu)成(也就是說，是絕緣的)，ECL標(biāo)記物已順序地附著在該長(zhǎng)鏈鏈烷硫醇上，這樣就能控制加在上述ECL標(biāo)記物上的有效電位。例如，圖11顯示了一個(gè)盒1200，盒1200由具有一個(gè)金屬層1204、一個(gè)SAM圖案1206以及在SAM圖案之間的縫隙1208的單獨(dú)的載體構(gòu)成。
ECL標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以非共價(jià)地連接到單層表面。ECL標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以吸附到以甲基為終端的鏈烷硫醇所衍生的金表面的表面上。金表面起到工作電極或反電極的作用。如圖11至圖13所示，許多結(jié)合區(qū)域可結(jié)合在一個(gè)單獨(dú)的載體上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，結(jié)合區(qū)域包含標(biāo)記過的和/或未標(biāo)記過的蛋白質(zhì)和/或核酸和/或細(xì)胞和/或化學(xué)物質(zhì)。
可以選擇地，可以改變單層的那些組成部分的長(zhǎng)度(例如，在鏈烷硫醇單層中的烷基鏈的長(zhǎng)度)，以控制所述單層的暴露的表面處的有效電位。
概括地說，鏈烷硫醇可以具有長(zhǎng)度在1個(gè)碳和100個(gè)碳之間的碳鏈。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，鏈烷硫醇的碳長(zhǎng)度含有2到24個(gè)碳。鏈烷硫醇的碳鏈長(zhǎng)度是在2到18個(gè)碳之間。碳鏈長(zhǎng)度是在7到11個(gè)碳之間。這樣的鏈烷硫醇可具有暴露于測(cè)定介質(zhì)的各種的首基，包括甲基、羥基、胺、羧酸、低聚(乙二醇)、磷酸基、磷?；?、生物素、次氮基三乙酸、谷胱甘肽、環(huán)氧化物、二硝基苯基和/或NHS酯。其它一些首基包括通常用于提純和固定重組融合蛋白標(biāo)記物的配體(例如，Sassenfeld，1990年，TIBTECH，888-93)。結(jié)合區(qū)域可以衍生到不同程度，以獲得結(jié)合試劑的各種密度。例如，可采用不同密度的可活化的化學(xué)物質(zhì)，和/或可使衍生進(jìn)行到不同程度。可利用混合的化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生所需的結(jié)合密度?？衫没旌系膯螌涌刂瓶苫罨幕鶊F(tuán)和/或結(jié)合試劑的密度?？刂平Y(jié)合基團(tuán)的密度，以使ECL的信噪比最佳?？刂平Y(jié)合區(qū)域內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)的總數(shù)，以使ECL光信號(hào)的強(qiáng)度相對(duì)于來自其它結(jié)合區(qū)域的其他ECL光信號(hào)最佳，不管這樣的ECL光信號(hào)是被順序檢測(cè)或是被同時(shí)檢測(cè)，和/或用光檢測(cè)裝置檢測(cè)。
可施加電壓波形，以便一次或多次激發(fā)在PMA MS內(nèi)與結(jié)合區(qū)域結(jié)合在一起ECL標(biāo)記物?？梢远啻谓o相同鏈烷硫醇衍生的具有所結(jié)合的ECL標(biāo)記物的表面施加足以激發(fā)ECL發(fā)光的電位，以多次產(chǎn)生ECL光信號(hào)。充分施加電位以可逆地產(chǎn)生ECL。施加電位，以便準(zhǔn)可逆地產(chǎn)生ECL。在電壓波形的一個(gè)準(zhǔn)可逆序列中，可以化學(xué)和/或物理地改變里面帶有(例如，結(jié)合)ECL標(biāo)記物的結(jié)合區(qū)域。所施加的電壓波形序列可以不可逆地導(dǎo)致ECL發(fā)光。
進(jìn)一步，可施加足以釋放單層的組份的電位。希望釋放這樣的一些單層組份，其中，在電極表面上的體積小(例如，位于電極表面的另一個(gè)載體或板)。這樣，由于單層被破壞，甚至某些未有效激發(fā)的ECL標(biāo)記物也可以被電極表面激發(fā)，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光的信號(hào)，而ECL標(biāo)記物被限制在一個(gè)小體積內(nèi)，限制從電極擴(kuò)散?？衫酶鞣N單層組成控制對(duì)于某一給定電位的單層的破壞程度。其中各組份間有強(qiáng)的親合力的單層更能阻止單層的破壞。較長(zhǎng)鏈的鏈烷硫醇比較短鏈的鏈烷硫醇更有效地阻止破壞。通過改變鏈的長(zhǎng)度，可獲得所需的穩(wěn)定性。
修飾PMAMS內(nèi)的結(jié)合區(qū)域可用于調(diào)節(jié)ECL信號(hào)。施加一系列電壓波形以產(chǎn)生許多ECL信號(hào)。可利用所述許多ECL信號(hào)獲得額外的和/或更好的結(jié)果。可以使ECL信號(hào)的調(diào)節(jié)速率的統(tǒng)計(jì)分析與一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域的整體質(zhì)量關(guān)聯(lián)。此外，例如可通過過濾一個(gè)序列中的某些ECL信號(hào)來利用所述許多ECL信號(hào)提高信噪比。進(jìn)而可利用多個(gè)電位波形脈沖，以減少由于非特異性結(jié)合造成的所不想要的信號(hào)調(diào)節(jié)?？墒┘与娢灰员惴乐鼓承щ娢镔|(zhì)的非特異性結(jié)合。另外，可施加電位以促進(jìn)所感興趣的被分析物或化學(xué)物質(zhì)在結(jié)合區(qū)域附近定位。所施加的電壓波形提供了大的過電位(Over-Potential)(例如，比所需更高的電位，以產(chǎn)生ECL)?？捎眠^電位調(diào)節(jié)在一個(gè)電壓波形序列中或在一個(gè)單獨(dú)的電壓波脈沖中的ECL信號(hào)。此外，可用過電位調(diào)節(jié)ECL反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性和/或化學(xué)和/或物理地調(diào)節(jié)結(jié)合電位。進(jìn)一步，可用一個(gè)或多個(gè)電壓波形和/或其它本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的電子探針來評(píng)估和/或關(guān)聯(lián)和/或外推關(guān)于電極的質(zhì)量和/或電子性質(zhì)的數(shù)據(jù)。
優(yōu)選地，可通過延伸工作電極表面積提高ECL反應(yīng)的效率，這是通過提供另外的與該電極接觸的導(dǎo)電裝置做到的?？衫脧膶?dǎo)電材料或?qū)щ娏Ｗ拥碾姌O(例如，導(dǎo)線或金屬須)的突出部分或延伸部分提高電極表面積，從而使電場(chǎng)更接近ECL標(biāo)記物。可以選擇地，電極結(jié)構(gòu)中的凹槽或井可用于同樣目的。
具體地說，導(dǎo)電粒子可填充在電極表面上的縫隙和/或覆蓋載體或單層，提高圍繞ECL標(biāo)記物的電場(chǎng)的絕對(duì)值，如圖12所示。這些導(dǎo)電粒子延伸電極表面積，并因此而提高ECL反應(yīng)的效率。圖12顯示盒1300，具有在金屬層1304上載有成圖案的SAM 1306的載體1302，并指明導(dǎo)電微觀粒子填充在縫隙(例如，圖11中的1208)中并延伸到金屬表面上方，在兩個(gè)SAM圖案之間。對(duì)于磁性導(dǎo)電粒子，可用磁鐵或磁場(chǎng)把該粒子吸到表面。還可以如上所述的那樣，用導(dǎo)電粒子延伸在電極表面和具有兩個(gè)靠近的載體的PMAMS的結(jié)合區(qū)域之間的電位。在圖8中，盒900由具有多陣列電極的一個(gè)第一載體902和具有PMAMS的一個(gè)第二載體904構(gòu)成。導(dǎo)電微觀粒子906定位在兩個(gè)相對(duì)的表面之間，以朝向在結(jié)合區(qū)域(未示出)上的ECL標(biāo)記物延伸電位。
可以選擇地，從在電極表面上暴露的縫隙生長(zhǎng)導(dǎo)電聚合物，如圖13所示的那樣，以便于圍繞樣品的ECL標(biāo)記物延伸電位。圖13顯示了具有一個(gè)載體1402的盒1400，載體1402載有在成圖案的SAM表面1406上的一個(gè)金屬層1404。遍布SAM表面上生長(zhǎng)導(dǎo)電聚合物1408，以便擴(kuò)展由多陣列電極(未示出)提供給在該SAM表面上的結(jié)合區(qū)域(未示出)的電場(chǎng)。還可以如上所述的那樣，如圖7所示，用導(dǎo)電聚合物擴(kuò)展在電極表面和兩個(gè)靠近的載體的PMAMS的結(jié)合區(qū)域之間的電位。在圖7中，盒800由靠近的載體802和804構(gòu)成。在兩個(gè)相對(duì)的表面之間生長(zhǎng)導(dǎo)電聚合物806，以便于朝向在結(jié)合區(qū)域(未示出)上的ECL標(biāo)記物擴(kuò)展電位。
圖9顯示了一個(gè)盒1000，盒1000由具有多電極陣列的一個(gè)第一載體1002及具有PMAMS結(jié)合表面的一個(gè)第二載體1004構(gòu)成，其中，工作電極的導(dǎo)電突出部分(1006)(例如，細(xì)導(dǎo)線或其它突出物)圍繞在PMAMS結(jié)合區(qū)域中的ECL標(biāo)記物擴(kuò)展電場(chǎng)。
可以把電極對(duì)做成各種結(jié)構(gòu)。在本說明書的附圖中所畫出的最簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)是由施加在不導(dǎo)電的平面表面上的金屬和/或金屬氧化物膜和/或半導(dǎo)體膜制作而成。這些電極對(duì)的電極優(yōu)選地確定了在它們之間的一個(gè)寬度比較恒定的區(qū)域，由此提供了比較恒定的電場(chǎng)。
提供了電極的其它一些結(jié)構(gòu)。圖19(a)至圖19(e)中示出了幾種這樣的結(jié)構(gòu)的平面圖。圖19(a)示出了一個(gè)交錯(cuò)對(duì)插的、類似于梳子的電極對(duì)。在這種結(jié)構(gòu)中，每個(gè)電極具有從做成為梳子形狀的導(dǎo)體延伸出來的許多指。電極和反電極對(duì)可鄰接結(jié)合區(qū)域定位，或者，結(jié)合區(qū)域可定位在電極和反電極之間。圖19(b)示出了一對(duì)同心電極，一個(gè)是圓形的，而一個(gè)是半圓形的。圖19(c)顯示了兩個(gè)半圓形的電極，這兩個(gè)半圓形的電極的直邊彼此相向。圖19(d)顯示了一對(duì)矩形電極。圖19(e)顯示了一對(duì)交錯(cuò)對(duì)插的電極，電板具有一些互補(bǔ)的相對(duì)的、彎曲的表面，以便連它們之間形成彎曲的縫隙。
為了對(duì)齊的目的，還可以使電極/反電極對(duì)形成為與在PMAMS結(jié)合表面上的形狀互補(bǔ)的特定的形狀。圖6B中示出了示例的形狀。顯示了載有電極對(duì)714-720的載體712。電極對(duì)例如可以是圓形的714、交錯(cuò)對(duì)插的716、三角交錯(cuò)對(duì)插的718或多個(gè)電極交錯(cuò)對(duì)插的720。
在上述圖14至圖19所示的那些實(shí)施例中，電極對(duì)位于一個(gè)單獨(dú)的載體上。可以選擇地，如圖2所示，電極對(duì)位于第一和第二相對(duì)的載體上。
5.8、盒盒含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的載體。盒可以包括許多結(jié)合區(qū)域以及一個(gè)或多個(gè)工作電極。
圖2示出了一個(gè)盒，其中，在載體26上的許多結(jié)合區(qū)域30的每一個(gè)都與許多電極32中的不同的一個(gè)鄰接。反電極38在一個(gè)第二載體28上形成。如前所述，通過把一個(gè)樣品放在結(jié)合區(qū)域30上，然后使載體26和28移到一起，從而使反電極38的每一個(gè)鄰接每一個(gè)結(jié)合區(qū)域30，這樣進(jìn)行ECL測(cè)定，并且，可如上所述，通過波形信號(hào)發(fā)生器裝置39、經(jīng)由引線34來觸發(fā)ECL反應(yīng)，而且，通過光檢測(cè)裝置40、導(dǎo)線41及數(shù)字計(jì)算機(jī)裝置42檢測(cè)和記錄ECL信號(hào)。
圖3顯示了一個(gè)盒，其中，許多結(jié)合區(qū)域48的每一個(gè)均具有在載體44上與其鄰接的、許多電極/反電極對(duì)50中的不同的一對(duì)?？梢匀芜x把載體46鄰接載體44放置，從而使載體46構(gòu)成鄰接許多結(jié)合區(qū)域48及許多電極50的含有樣品的裝置。這樣，通過波形信號(hào)發(fā)生器裝置54，經(jīng)由電連接裝置52，可以觸發(fā)ECL反應(yīng)，而且，用光檢測(cè)裝置56檢測(cè)ECL信號(hào)，并用數(shù)字計(jì)算機(jī)裝置58記錄和分析ECL信號(hào)。
如圖21所示，提供了含有一對(duì)或多對(duì)載體的盒，定位每對(duì)載體，從而使含有結(jié)合區(qū)域的一個(gè)第一載體1501的表面面向第二載體含有結(jié)合區(qū)域的表面，其中，每個(gè)表面含有電極1504和結(jié)合區(qū)域1506；這使得在第一載體上的每個(gè)結(jié)合區(qū)域面向并對(duì)準(zhǔn)第二載體上的一個(gè)電極，而在第二載體上的每個(gè)結(jié)合區(qū)域面向且對(duì)準(zhǔn)第一載體上的一個(gè)電極。
圖4顯示了一個(gè)盒，其中，ECL電極是任選的。載體64上的結(jié)合區(qū)域64與被猜想含有某種被分析物的樣品接觸。載體62上的區(qū)域66含有反應(yīng)介質(zhì)，用于檢測(cè)或測(cè)量所感興趣的被分析物，或用于進(jìn)行所需要的反應(yīng)。使載體60和載體62靠到一起，從而使結(jié)合區(qū)域64和區(qū)域66接觸，并且，通過一個(gè)指示器系統(tǒng)，例如，通過比色化學(xué)發(fā)光或可用光電檢測(cè)器裝置68檢測(cè)并可用數(shù)字計(jì)算機(jī)裝置70記錄和分析的螢光信號(hào)，確定被分析物或反應(yīng)產(chǎn)物的存在。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的盒或裝置包括一個(gè)用于把樣品發(fā)送到許多離散的結(jié)合區(qū)域上的裝置(例如，參見美國(guó)專利US 5,147,806的圖1的部件1；美國(guó)專利US 5,068,088的圖1的部件1；把這兩篇美國(guó)專利的全部?jī)?nèi)容作為參考)。所述用于發(fā)送樣品的裝置可以是靜止的或可移動(dòng)的，并且可以是任何本領(lǐng)域中已知的發(fā)送樣品的裝置，該裝置包括但并不限于一個(gè)或多個(gè)入口、孔洞、孔、通道、管道、微觀流體導(dǎo)管(例如，毛細(xì)管)、管、套管等?？捎酶鞣N各樣的公知的方法使流體穿過上述系統(tǒng)移動(dòng)，例如用泵、吸移管、注射器、引力流動(dòng)、毛細(xì)管作用、芯吸、電泳、壓力、真空等。用于流體移動(dòng)的裝置可位于盒上或位于一個(gè)單獨(dú)的單元上。可把樣品一起放在所有的結(jié)合區(qū)域上?？梢赃x擇地，可用毛細(xì)管流體輸送裝置把樣品放在一些特定的結(jié)合區(qū)域上?？梢赃x擇地，可通過用于把流體樣品直接發(fā)送到在載體上的PMAMS上、或者發(fā)送進(jìn)盒或盒的保持器的儲(chǔ)存器中便于以后直接給結(jié)合表面發(fā)送用的自吸移管，把樣品放在載體上。
可用多種材料制備載體，這些材料包括但并不限于玻璃、塑料、陶瓷、聚合物材料、彈性材料、金屬、碳或含有碳材料、合金、復(fù)合物箔、硅和/或分層材料。載體可有各種結(jié)構(gòu)、化學(xué)和/或光學(xué)性質(zhì)。它們可以是剛性的或柔軟的、扁平的或變形的、透明的、半透明的、局部或全部全反射或不透明的，并且可具有復(fù)合性質(zhì)、具有不同性質(zhì)的區(qū)域，而且可以是多于一種材料的復(fù)合物。
用于進(jìn)行測(cè)定的試劑可存儲(chǔ)在盒和/或單獨(dú)的容器中。可以以干和/或濕的狀態(tài)存儲(chǔ)試劑。在一個(gè)實(shí)施例中，通過加入檢驗(yàn)樣品使在盒中的干試劑再水合。在一個(gè)不同的實(shí)施例中，試劑存儲(chǔ)在“泡形罩包裝”里的溶液中，由于來自可移動(dòng)的滾子或活塞的壓力，使該“泡形罩包裝”爆裂敞開。盒可以含有廢物室或海綿，用于在完成測(cè)定后存儲(chǔ)液體廢物。在一個(gè)實(shí)施例中，盒包括一個(gè)用于制備要被檢驗(yàn)的生物樣品的裝置?？珊羞^濾器，用于去除血中的細(xì)胞。在另一個(gè)例子中，盒可包括諸如用于計(jì)量樣品的精確的毛細(xì)管那樣的裝置。
一般通過機(jī)械裝置，例如，通過用導(dǎo)柱、定位銷、合葉(在每個(gè)載體之間)或?qū)н?，使在載體上的許多結(jié)合區(qū)域和許多電極/反電極放置得彼此鄰近對(duì)準(zhǔn)。可用光學(xué)制導(dǎo)裝置定位載體和采用在該載體上確定的光學(xué)制導(dǎo)標(biāo)記的電子裝置。也可利用其它采用電或磁對(duì)準(zhǔn)裝置的系統(tǒng)。
把盒的載體的結(jié)構(gòu)做成直到需要觸發(fā)ECL反應(yīng)時(shí)才使電極對(duì)與樣品接觸。例如，可用各種機(jī)械裝置，例如，用可去除的電極保護(hù)裝置，使電極保持與結(jié)合區(qū)域表面分開，直到需要電極與樣品接觸為止。
本發(fā)明的盒或裝置包括參考電極，例如，Ag/AgCl或飽和甘汞電極(SCE)。
可用夾具、粘合劑、鉚釘、銷針或任何其它合適的機(jī)械連接裝置使載體保持在一起。還可通過液體樣品的表面張力，或通過可拆卸地放置在兩個(gè)載體的相對(duì)側(cè)上的壓緊裝置，使上述那些載體保持在一起。
盒還可包括兩個(gè)以上的載體，例如，具有結(jié)合區(qū)域和電極的交替層，或者有多個(gè)載體，在單個(gè)載體上包括結(jié)合表面和電極表面。這將形成ECL分析元件的三維陣列。任選除了在兩個(gè)結(jié)合區(qū)域之間的某些區(qū)域外，上述盒的所有的前述組件都是透明的。例如，可以疊置多個(gè)透明的結(jié)合表面、電極表面和載體。
第一和第二載體可以是扁平的，并使它們相對(duì)，以便在它們兩者之間確定保持樣品的容積。可以選擇地，假若兩個(gè)載體以及它們的任何其它組件形狀相符合，可把第一和第二載體層的結(jié)構(gòu)做成其它一些合適的形狀，包括球形、立方形、圓柱形。例如，圖10顯示了由兩個(gè)相鄰的非平面載體1102和1104構(gòu)成的一個(gè)盒1100。每個(gè)載體有一個(gè)與其它載體形態(tài)互補(bǔ)的表面。每個(gè)載體可具有一個(gè)PMAMS表面或多電極陣列或同時(shí)具有這兩者。載體之一或兩個(gè)載體可以是彈性的，以便符合另一個(gè)載體的形狀。還可以以預(yù)切割形態(tài)制備載體或盒，或者從一個(gè)滾筒發(fā)放器發(fā)放合適長(zhǎng)度的載體或盒。盒還可包括樣品容納裝置，例如，樣品保持容積、以及樣品分散槽、通道、凹處等等。
圖37顯示了一個(gè)盒，其中，在基質(zhì)(3703)中和/或上的結(jié)合區(qū)域(3702)存在于表面(3701)上。放置有承載工作電極(3704)和反電極(3705)的第二表面，從而使結(jié)合區(qū)域緊密靠近工作電極。在導(dǎo)致從與結(jié)合區(qū)域結(jié)合的ECL標(biāo)記物產(chǎn)生光的條件下，可通過一個(gè)或兩個(gè)表面檢測(cè)光。采用光檢測(cè)器陣列(3706，例如，CCD陣列、增強(qiáng)的CCD陣列或雪崩光電二極管陣列)同時(shí)測(cè)量來自上述那些結(jié)合區(qū)域的許多光信號(hào)。光檢測(cè)器陣列使從結(jié)合區(qū)域產(chǎn)生的光成像。透鏡、反射器和/或光波導(dǎo)管可用來加強(qiáng)成像。在另外一些例子中，使從光檢測(cè)器區(qū)段或區(qū)域檢測(cè)到的光(例如，光檢測(cè)像素)與結(jié)合區(qū)域關(guān)聯(lián)?？捎脠D像分析輔助所檢測(cè)到的光與結(jié)合區(qū)域的關(guān)聯(lián)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，表面是彈性的或柔順的，因此，能使得與電極表面緊密接觸。使結(jié)合區(qū)域與一些聚合物連接，其中這些聚合物能夠從反電極攜帶離子流到工作電極。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，物體是可水溶脹的一些聚合物，它們能夠從反電極攜帶離子流到工作電極。
圖38顯示了一個(gè)盒，其中，結(jié)合區(qū)域(3805，3806，3807)置于不同的物體(3808，3809，3810)的表面上，物體(3808，3809，3810)承載在反電極(3800)上。工作電極(3801)靠近那些物體的表面放置。在導(dǎo)致與結(jié)合區(qū)域結(jié)合的標(biāo)記物標(biāo)記的基團(tuán)的ECL的情況下，可通過一個(gè)電極或兩個(gè)電極(如果所述的每一個(gè)電極或兩個(gè)電極是透明的或半透明的)和/或從側(cè)面檢測(cè)光。用光檢測(cè)器(3802)陣列同時(shí)測(cè)量來自每個(gè)結(jié)合區(qū)域的許多光信號(hào)。上述那些物體可以是彈性的和/或柔順的，因而能與工作電極形成緊密的接觸。所述那些物體可以是能夠從反電極攜帶離子流到工作電極的聚合物。所述那些物體可以是能夠從反電極攜帶離子流到工作電極的可水溶脹聚合物。
使含有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域的透明載體與原纖維墊電極接觸?？墒乖噭┰谳d體/結(jié)合區(qū)域和原纖維墊之間流動(dòng)，或穿過所述墊到達(dá)結(jié)合區(qū)域。光可從結(jié)合區(qū)域通過，穿過透明載體到達(dá)檢測(cè)器。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，給電極涂覆半透光或透光的碳原纖維層，以增加該電極的有效表面積。
可有益地把本發(fā)明的PMAMS載體和/或盒包裝成試劑盒。試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)按照本發(fā)明制備的PMAMS載體，用于進(jìn)行包括測(cè)定、對(duì)照等在內(nèi)的ECL反應(yīng)。試劑可任選包含在試劑盒中，包括對(duì)照試劑、ECL測(cè)定和校準(zhǔn)試劑等等。可包括試劑混合物，它含有多種對(duì)于多種不同的被分析物特異性的結(jié)合試劑。
5.9、進(jìn)行ECL的裝置反應(yīng)在一個(gè)實(shí)施例中，載體上的PMAMS和含有該載體的盒設(shè)計(jì)成能插入一個(gè)裝置，這個(gè)裝置含有用于把一個(gè)或多個(gè)檢驗(yàn)樣品施加到PMAMS結(jié)合區(qū)域上并引發(fā)多種ECL反應(yīng)的裝置。這樣的裝置可從通常的裝置按本發(fā)明做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)而成，以進(jìn)行許多基于載體或盒的ECL測(cè)定。本發(fā)明提供適于用上述各章節(jié)中所述的PMAMS的每一個(gè)特定的實(shí)施例進(jìn)行ECL測(cè)定的各種裝置。Zoski等人公開了一種用于進(jìn)行ECL反應(yīng)的裝置(美國(guó)專利US 5,061,445)。所需的改進(jìn)包括提供載體和/或盒的操作、多個(gè)樣品的發(fā)送、用電壓波形源訪問多個(gè)電極以及多個(gè)ECL信號(hào)的獲得和處理。
圖6A示出了本發(fā)明的說明性裝置的一些部件。這樣的裝置700包括上和下載體702、704以及一個(gè)電極防護(hù)板710。上載體載有許多電極/反電極對(duì)(未示出)。下載體載有結(jié)合區(qū)域706。上述裝置能夠從盒中去除電極防護(hù)板并把電極/反電極定位成接觸結(jié)合區(qū)域上結(jié)合的被分析物。試劑或流體流動(dòng)空間708鄰接載有結(jié)合區(qū)域的載體。上述裝置還能同時(shí)或順序地給許多電極/反電極對(duì)的每一個(gè)發(fā)送等同的或單獨(dú)的確定的電壓波，以引發(fā)盒中的ECL反應(yīng)，然后，用光子檢測(cè)器，例如，光檢測(cè)器裝置測(cè)量所發(fā)射的ECL輻射。上述裝置還可包括溫度控制裝置，用于保持載體和/或盒的溫度、或其上的環(huán)境溫度，并按照需要調(diào)節(jié)溫度，以便使ECL反應(yīng)條件最佳。溫度控制裝置優(yōu)選地是加熱和冷卻裝置，例如，電阻加熱元件、冷風(fēng)扇、冷凍裝置以及任何其它合適的加熱或冷卻源。溫度控制裝置還包括溫度傳感器，例如，恒溫器或熱電偶裝置，并包括響應(yīng)所檢測(cè)到的溫度變化、啟動(dòng)或關(guān)掉加熱或冷卻裝置的裝置。
上述裝置還提供用于保持、移動(dòng)和操縱一個(gè)或多個(gè)載體或盒的裝置，以進(jìn)行ECL反應(yīng)。上述裝置還包括靜止的或可移動(dòng)的樣品發(fā)送裝置，就像對(duì)于上述那些盒所述的那樣，用于把樣品放在PMAMS結(jié)合區(qū)域上。
上述裝置還包括一個(gè)電極接觸裝置，它能夠使盒的可單獨(dú)訪問的電極連接裝置陣列與一個(gè)電子波形信號(hào)發(fā)生器裝置(例如，穩(wěn)壓器)電連接(例如，參見美國(guó)專利US 5,068,088的圖5)。波形信號(hào)發(fā)生器裝置順序或同時(shí)發(fā)送信號(hào)，以便獨(dú)立地觸發(fā)在盒中的多種ECL反應(yīng)。
在ECL測(cè)定期間，在工作電極和反電極之間的離子流可穿過能傳導(dǎo)離子的液體(例如，含有離子鹽的水)、穿過這種液體的薄膜和/或穿過能傳導(dǎo)離子的固體基質(zhì)流動(dòng)。
這樣，用于測(cè)量樣品中電化學(xué)發(fā)光的裝置可包括許多用于保持至少一種樣品的小室，其中，一個(gè)小室可由一個(gè)或多個(gè)電極和一個(gè)或多個(gè)反電極以及一個(gè)包含許多離散的結(jié)合區(qū)域的第一載體構(gòu)成。電極和反電極可配置在第一載體的表面上，或配置在第二載體的表面上，其中，第二載體緊密靠近在第一載體上的結(jié)合區(qū)域。電極和反電極可成對(duì)出現(xiàn)。上述小室還可包括許多傳感電極，以感應(yīng)鄰近工作電極的電壓。盒還可包括含有參考電極的小室。
上述裝置還包括光檢測(cè)裝置，該光檢測(cè)裝置例如可通過一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器裝置檢測(cè)在盒中所進(jìn)行的ECL反應(yīng)。只是作為例子，這樣的檢測(cè)器裝置包括光纖通道陣列，這個(gè)光纖通道陣列與電極陣列對(duì)齊并且鄰接該電極陣列定位，連接到光檢測(cè)器裝置陣列、或連接到能掃描所發(fā)射的ECL信號(hào)陣列的一個(gè)單獨(dú)的光檢測(cè)器裝置。
上述裝置可任選地包括數(shù)字計(jì)算機(jī)或微處理器，以控制所述裝置的各種組件的工作。
上述裝置還包括信號(hào)處理裝置。僅作為例子，在一個(gè)實(shí)施例中，信號(hào)處理裝置包括用于傳送、記錄、分析和/或顯示每個(gè)ECL測(cè)定的結(jié)果的數(shù)字計(jì)算機(jī)。
可以選擇地，上述裝置包括電極平移裝置，以便例如使一個(gè)或多個(gè)電極/反電極對(duì)在結(jié)合表面上掃描，從而順序觸發(fā)ECL。
可在PMAMS的并聯(lián)陣列中使用選擇尺寸的過濾物。
5.10、可以進(jìn)行的ECL測(cè)定可從本領(lǐng)域中已知的那些ECL標(biāo)記物(參見上面2.2節(jié)以及美國(guó)專利US.5,310,687)中選擇本發(fā)明所用的ECL標(biāo)記物。ECL標(biāo)記物例如可包括含金屬的有機(jī)化合物，其中，所述金屬選自釕、鋨、錸、銥、銠、鉑、鈀、鉬、锝和鎢。用于制備ECL TAG試劑的合適的連接化學(xué)物質(zhì)是眾所周知的，例如，已由Bard等人公開(美國(guó)專利US 5,310,687和US 5,221,605)。使ECL標(biāo)記物與結(jié)合試劑結(jié)合的方法可以是共價(jià)和/或非共價(jià)的。ECL標(biāo)記物可非共價(jià)地與結(jié)合試劑結(jié)合(例如，通過疏水效應(yīng)或離子相互作用)。在非共價(jià)連接的另一個(gè)例子中，ECL標(biāo)記物(共價(jià)或非共價(jià)地)與一種復(fù)合物結(jié)合，這種復(fù)合物又非共價(jià)地與一種結(jié)合試劑連接。一個(gè)更具體的例子是Ru(bpy)3通過接頭物共價(jià)地連到Ni(II)-三次氮基三乙酸復(fù)合物上。這種分子將附著到一些結(jié)合試劑上，這些結(jié)合試劑包括含有許多組氨酸的肽序列?？梢灶愃品绞绞褂玫钠渌恍┦荏w配體對(duì)在本領(lǐng)域中是已知的(Sassenfeld，1990年，TIBTECH 888-93)。此外，可使用含有多種金屬有機(jī)化合物(例如，含有Ru)的ECL標(biāo)記物，該金屬有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)為帶分枝的網(wǎng)絡(luò)(例如，通過一種碳?xì)浠衔锝宇^物的網(wǎng)絡(luò))。這樣的含有許多種能夠ECL的金屬有機(jī)化合物部分的帶分枝的網(wǎng)絡(luò)可以在一處或多處連接在一種要被ECL標(biāo)記的分子上。在另一個(gè)實(shí)施例中，含有許多種金屬有機(jī)化合物的ECL標(biāo)記物是一種線形高聚物，金屬有機(jī)基團(tuán)沿著聚合物鏈(例如，線形的、帶分枝的或環(huán)狀聚合物)的許多位置處連接。
本領(lǐng)域眾所周知的其他各種ECL測(cè)定中可使用多種結(jié)合區(qū)域。在定量測(cè)定中，使用已知量的ECL標(biāo)記的試劑，并使所測(cè)量的ECL的量與已知的標(biāo)準(zhǔn)關(guān)聯(lián)，以便計(jì)算所存在的被分析物量?？捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的方法進(jìn)行向前、反向、競(jìng)爭(zhēng)性和夾層測(cè)定。例如，在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，如下進(jìn)行定量確定多組份液體樣品中所感興趣的被分析物的量的方法。使結(jié)合表面同時(shí)接觸(a)已知量的ECL標(biāo)記的配體，此配體在與存在于結(jié)合區(qū)域上的某種結(jié)合試劑結(jié)合時(shí)能與所感興趣的被分析物競(jìng)爭(zhēng)，以及(b)被猜想含有所感興趣的被分析物的樣品；所述接觸在適當(dāng)?shù)臈l件下實(shí)現(xiàn)，從而使上述所感興趣的被分析物和配體競(jìng)爭(zhēng)性地與上述結(jié)合試劑結(jié)合。在樣品中存在被分析物時(shí)，會(huì)減少與結(jié)合區(qū)域結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)ECL標(biāo)記的配體的量，這樣，就減少(相對(duì)于樣品中沒有被分析物時(shí))所得到的ECL量。引發(fā)在所得到的結(jié)合區(qū)域中的ECL，并定量確定所發(fā)射的光量，由此，定量確定存在于樣品中的所感興趣的被分析物的量?？梢赃x擇地，可使樣品在接觸具有ECL標(biāo)記的配體的結(jié)合表面之前接觸結(jié)合表面；然后，該ECL標(biāo)記的配體與來自在PMAMS表面上的樣品的先前所結(jié)合的被分析物競(jìng)爭(zhēng)，并替換某些所述先前所結(jié)合的被分析物。在一個(gè)可供選擇的實(shí)施例中，可處理樣品使之含有ECL標(biāo)記的物質(zhì)/分子，并可使標(biāo)準(zhǔn)量的未標(biāo)記的所感興趣的被分析物在與帶有樣品的結(jié)合表面接觸之前或同時(shí)，接觸結(jié)合表面，以便進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定。
在夾層測(cè)定中，ECL標(biāo)記的配體是一個(gè)結(jié)合配對(duì)，這個(gè)結(jié)合配對(duì)與在所感興趣的被分析物上的一種第二結(jié)合部分特異性地結(jié)合。這樣，當(dāng)在樣品中有特異性地與在PMAMS的結(jié)合區(qū)域中的結(jié)合試劑結(jié)合的被分析物時(shí)，就這樣形成了一種“夾層”，這種夾層由在結(jié)合區(qū)域上的、與來自上述樣品的被分析物結(jié)合的、與ECL標(biāo)記的結(jié)合配對(duì)結(jié)合的結(jié)合試劑構(gòu)成。在另一種競(jìng)爭(zhēng)性夾層測(cè)定中，使被分析物本身的復(fù)制品在暴露給樣品之前附著到多陣列結(jié)合表面的結(jié)合區(qū)域上。然后，使樣品與結(jié)合表面接觸。一種ECL標(biāo)記的結(jié)合配對(duì)(它可與被分析物特異性地結(jié)合)在測(cè)定溶液中沒有自由被分析物(來自樣品)的情況下會(huì)結(jié)合被分析物，但在該測(cè)定溶液中有自由被分析物(來自樣品)的情況下被競(jìng)爭(zhēng)性地抑制。
在一個(gè)可供選擇的實(shí)施例中，進(jìn)行順序標(biāo)記。例如，在夾層測(cè)定的一個(gè)特定實(shí)施例中，使與結(jié)合區(qū)域結(jié)合的被分析物順序與多種ECL標(biāo)記的、被分析物的結(jié)合配對(duì)接觸。在兩次與每個(gè)不同的結(jié)合配對(duì)接觸之間進(jìn)行ECL測(cè)量和任選的清洗步驟。以這種方式，可以進(jìn)行被分析物的多種不同的結(jié)合部分的ECL測(cè)量(例如，CD8+、a、b T細(xì)胞抗原受體陽性T細(xì)胞)。此外，可以使每一種都以不同的波長(zhǎng)發(fā)光的多種ECL標(biāo)記物的每一種都連接到一種對(duì)于在被分析物上的一種不同的組成成份特異的不同的結(jié)合試劑。進(jìn)而，例如可使用許多不同的報(bào)道方法(例如，ECL標(biāo)記物、螢光標(biāo)記物和酶連接的標(biāo)記物)，每一種標(biāo)記物都附著到對(duì)被分析物的不同結(jié)合部分特異的不同結(jié)合試劑上，例如，以區(qū)分CD4+、a、b T細(xì)胞抗原受體-陽性細(xì)胞與CD8+、a、b T細(xì)胞抗原受體-陽性細(xì)胞。
在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，結(jié)合區(qū)域含有被標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或核酸和/或細(xì)胞和/或化學(xué)物質(zhì)。在制作期間、在測(cè)定開始之前、在測(cè)定期間和/或在測(cè)定結(jié)束時(shí)，可給結(jié)合區(qū)域加入這樣的一些被標(biāo)記的組份(例如，ECL標(biāo)記物)。例如，可在任意時(shí)間加入多種被標(biāo)記的組分，并可順序取得測(cè)量記錄。這樣的測(cè)量記錄可提供累積的信息。在另一個(gè)實(shí)施例中，PMAMS的結(jié)合區(qū)域可重復(fù)使用許多次。在完成了給定的測(cè)定后，在恢復(fù)PMAMS表面的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域的活性的條件下清洗所述表面。作為例子，可通過改變反應(yīng)溶液的離子強(qiáng)度使某些結(jié)合反應(yīng)反向?？梢赃x擇地，可加熱分解結(jié)合復(fù)合物。某些結(jié)合區(qū)域本身就可以自我更新。含有催化(例如，酶促)官能性的結(jié)合區(qū)域可使用一次以上。結(jié)合區(qū)域可連續(xù)使用，而這樣就可用于生物傳感器方面的用途。
此外，可使測(cè)定格式化，從而附著到多陣列多特異性的成圖案的表面上的結(jié)合試劑被ECL標(biāo)記。一旦與樣品中的某些所感興趣的被分析物結(jié)合，ECL信號(hào)就會(huì)定量調(diào)節(jié)。例如，附著到表面上的ECL標(biāo)記的結(jié)合試劑可以對(duì)細(xì)胞表面上的被分析物特異性，例如，諸如α和βT細(xì)胞抗原受體抗原或CD4或CD8抗原那樣的抗原。一旦暴露于細(xì)胞的混合物，與上述表面結(jié)合的細(xì)胞在所述電極表面靠近多陣列多特異性的表面時(shí)，就會(huì)在空間上妨礙電極表面激發(fā)ECL標(biāo)記的結(jié)合試劑的能力，從而調(diào)弱ECL信號(hào)。
可進(jìn)行均相的測(cè)定和多相的測(cè)定。在多相測(cè)定中，在結(jié)合的或未結(jié)合的標(biāo)記的試劑暴露于電位之前，未結(jié)合的標(biāo)記的試劑與結(jié)合的標(biāo)記的試劑分開(例如，通過清洗步驟)。在均相測(cè)定中，未結(jié)合的標(biāo)記的試劑和結(jié)合的標(biāo)記的試劑一起暴露于電位作用。在均相測(cè)定中，結(jié)合的標(biāo)記的試劑發(fā)射的信號(hào)的強(qiáng)度或光譜特性大于或小于未結(jié)合的標(biāo)記的試劑發(fā)射的信號(hào)的強(qiáng)度?？赏ㄟ^測(cè)量強(qiáng)度差別確定各個(gè)結(jié)合的和未結(jié)合的組份的存在與否。
一旦完成結(jié)合試劑與被分析物其競(jìng)爭(zhēng)物以及對(duì)于該被分析物的任何競(jìng)爭(zhēng)配對(duì)接觸的所需步驟，即確保ECL標(biāo)記物處于導(dǎo)致ECL的環(huán)境。本領(lǐng)域中已知合適的ECL測(cè)定介質(zhì)。這樣的測(cè)定介質(zhì)有益地包括促進(jìn)ECL標(biāo)記物的ECL的分子，包括但并不限于草酸鹽、NADH，而最優(yōu)選三丙胺?？勺杂傻卦谌芤褐刑峁┻@樣的“促進(jìn)劑”分子，或可通過預(yù)先的連接到下列位置或可通過在下列位置處產(chǎn)生(例如，作為化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物)而提供PMAMS、所述表面上的單層、結(jié)合區(qū)域、電極表面、結(jié)合試劑和/或ECL標(biāo)記物等。如果與接觸步驟所得到的結(jié)合區(qū)域結(jié)合的ECL標(biāo)記物周圍的介質(zhì)導(dǎo)致ECL，就無需改變所述介質(zhì)?？梢赃x擇地，可調(diào)整或替換介質(zhì)，以便提供導(dǎo)致ECL的介質(zhì)。電極和反電極已經(jīng)鄰近結(jié)合區(qū)域，或者，已被使得在該結(jié)合區(qū)域附近，或者被使得與該結(jié)合區(qū)域接觸，施加電壓波形，并檢測(cè)或測(cè)量ECL。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在沒有電極和反電極的情況下，進(jìn)行使結(jié)合試劑與被分析物或該被分析物的競(jìng)爭(zhēng)物以及對(duì)于該被分析物的任何競(jìng)爭(zhēng)配對(duì)接觸的上述步驟，也就是說，從而使樣品并不接觸電極或反電極。接著這些步驟，使電極和反電極充分靠近與結(jié)合區(qū)域結(jié)合的ECL標(biāo)記物，以引發(fā)ECL反應(yīng)。
可用具有PMAMS的載體對(duì)核酸鏈排序。例如，用已知的核苷酸序列的不同的寡核苷酸探針作為不同結(jié)合區(qū)域中的結(jié)合試劑制備具有許多結(jié)合區(qū)域的PMAMS。也就是說，不同的結(jié)合區(qū)域會(huì)包含不同的已知核苷酸序列的結(jié)合試劑。然后，使要排序的核苷酸鏈或核苷酸鏈或片段與PMAMS結(jié)合區(qū)域結(jié)合(雜交)。要被排序的核酸被ECL標(biāo)記。在PMAMS上進(jìn)行結(jié)合測(cè)定，并且用來自PMAMS上的離散的結(jié)合區(qū)域的ECL信號(hào)分布給寡核苷酸鏈排序。
上述方法基于短的核苷酸與在另一核酸分子中它們的互補(bǔ)序列或基本上互補(bǔ)的序列雜交的能力(例如，參見Strezoska等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881089-1093；Bains，1992年，Bio/Technology10757-58，此處以這篇文獻(xiàn)作參考)?？蛇x擇一些條件，從而使所需序列互補(bǔ)性程度對(duì)于成功的雜交是必需的。未知序列的DNA分子與預(yù)定序列的探針的雜交檢測(cè)DNA分子中的互補(bǔ)序列的存在。優(yōu)選實(shí)施該方法，從而使得用與結(jié)合區(qū)域和在溶液中的樣品DNA結(jié)合的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。
PMAMS還可用來分離、篩選和/或選擇所需功能的(例如，結(jié)合或催化)新的分子或復(fù)合物。PMAMS可用來分離化合物和/或?qū)蚧衔?，用于治療目的?？衫帽景l(fā)明的方法制備含有許多肽、核酸、病毒載體或用各種各樣的組合化學(xué)物質(zhì)合成的聚合物的PMAMS。可用各種各樣的諸如PMAMS處理過的載體快速篩選例如與ECL標(biāo)記的細(xì)胞受體結(jié)合情況。在一種方法中，使用具有高分散性的不相關(guān)的肽序列的第一PMAMS，以分離前導(dǎo)結(jié)合肽序列。然后，使用具有相關(guān)序列的肽的PMAMS，該相關(guān)序列是與顯示了與在第一PMAMS上的所感興趣的分子(例如，一種細(xì)胞受體)結(jié)合的序列相關(guān)。重復(fù)此過程，直到找到具有所需結(jié)合特性的肽。
所感興趣的被分析物例如可以是存在于樣品中的全細(xì)胞、亞細(xì)胞粒子、病毒、朊病毒、類病毒、核酸、蛋白質(zhì)、抗原、脂蛋白、脂多糖、類脂物、糖蛋白、碳水化合物部分、纖維素衍生物、抗體或其片段、肽、激素、藥劑、細(xì)胞或細(xì)胞的組成部分、有機(jī)化合物、非生物聚合物、合成有機(jī)分子、金屬有機(jī)化合物或無機(jī)分子。
例如，樣品可從固體、乳濁液、懸浮液、液體或氣體中衍生出。進(jìn)而，樣品例如可從體液或組織、水、食物、血、血清、血漿、尿、糞便、組織、唾液、油、有機(jī)溶劑或空氣中衍生出。樣品可包括還原劑或氧化劑。
采用本發(fā)明，通過使對(duì)下述物質(zhì)特異性的結(jié)合試劑結(jié)合進(jìn)本發(fā)明的結(jié)合表面的結(jié)合區(qū)域，可以進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)量所述這些物質(zhì)的測(cè)定，所述物質(zhì)是白蛋白、堿性磷酸鹽、alt/SGPT、氨、液化酶、AST/SGOT、全蛋紅素、血液使用了的氮、鈣、二氧化碳、氯化物、全膽固醇、肌酸酐、GGT、葡萄糖、HDL膽固醇、鐵、LDH、鎂、磷、鉀、全蛋白質(zhì)、鈉、甘油三脂、尿酸、濫用的藥物、激素、心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑、腫瘤標(biāo)記物、傳染病抗原、誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)的抗原、免疫蛋白質(zhì)、細(xì)胞活素貧血/代謝標(biāo)記物、氨甲酰苯、地高辛、慶大霉素、鋰、苯巴比妥、苯妥英、普魯卡因酰胺、奎尼丁、茶堿、妥布霉素、丙戊酸、鹽酸萬古霉素、苯異丙胺、抗抑郁藥、巴比土酸鹽、苯并二氮類、大麻素、可卡因、LSD、美散痛、安眠酮、鴉片制劑、pheneylindine、phroppxy-phene、乙醇、水楊酸鹽、撲熱息痛、雌二醇、孕酮、睪酮、hcG/bhCG、刺激淋巴小結(jié)的激素、黃體化激素、催乳素、諸如刺激甲狀腺激素那樣的甲狀腺激素、T4、TUP、全T3、自由T4、自由T3、皮質(zhì)醇、肌酸酐激酶-MB、全肌酸酐激酶、PT、APTT/PTT、LD ISOs、肌酸酐激酶ISOs、肌紅蛋白、肌的輕鏈、肌鈣蛋白1、肌鈣蛋白T、衣原體、淋病病毒、皰疹病毒、萊姆病病毒、Epstein Barr病毒、IgE、風(fēng)疹G病毒、風(fēng)疹M病毒、CMV-G、CMV-M、毒素-G、毒素-M、HBsAg(B型肝炎病毒表面抗原)、HIV1、HIV2、抗HBc、抗HBs、HCV、抗HAV IgM、抗HBC IgM、抗HAV、HBeAg、抗HBeAg、TB、前列腺特異性抗原、CEA、AFP、PAP、CA125、CA15-3、CA19-9、b2微球蛋白、血紅蛋白、紅血細(xì)胞、HBcAb、HTLV、ALT、STS梅毒、ABO血型抗原和其它血型抗原、巨細(xì)胞病毒、鐵蛋白、B-12、葉酸鹽、烯糖化的血紅蛋白、苯異丙胺、抗抑郁藥、以及其它一些對(duì)精神有影響的藥物。
可順序或同時(shí)在一些不同的結(jié)合區(qū)域測(cè)量ECL。
使對(duì)作為細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的所感興趣的被分析物特異的PMAMS首先暴露于含有細(xì)胞的樣品，其中，想要計(jì)數(shù)樣品中的細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，使已知的樣品體積和/或稀釋的樣品暴露于PMAMS，PMAMS具有許多對(duì)于至少一種細(xì)胞表面抗原特異性的結(jié)合區(qū)域。然后，通過附著與ECL標(biāo)記物連接的輔助結(jié)合基團(tuán)來對(duì)結(jié)合細(xì)胞定量。這是一種能與很寬范圍的細(xì)胞類型相互作用的基團(tuán)，例如，一種連接到能插入細(xì)胞膜的疏水性基團(tuán)或連接到對(duì)著細(xì)胞表面糖指向的外源凝集素的ECL標(biāo)記物。ECL標(biāo)記物連接到對(duì)著細(xì)胞表面抗體指向的一種輔助抗體。在一個(gè)更具體的實(shí)施例中，可通過使用多種ECL標(biāo)記物標(biāo)記的輔助抗體區(qū)分與相同區(qū)域結(jié)合的幾種細(xì)胞類型。優(yōu)選確保對(duì)在細(xì)胞表面上的給定被分析物特異性的離散的結(jié)合區(qū)域的數(shù)目超過存在于樣品中將結(jié)合的細(xì)胞平均數(shù)目。然后，可用統(tǒng)計(jì)技術(shù)確定單位樣品體積中的細(xì)胞數(shù)目。還可用這種技術(shù)例如計(jì)數(shù)諸如病毒那樣的其它粒子，其中，結(jié)合試劑識(shí)別病毒上的抗原。上述區(qū)域與細(xì)胞的尺寸相比可以較小，從而使只有一個(gè)細(xì)胞能結(jié)合每個(gè)區(qū)域，這樣，就對(duì)每個(gè)區(qū)域?qū)е聰?shù)字信號(hào)，然后，用統(tǒng)計(jì)方法，可對(duì)所述那些區(qū)域的總和分析上述數(shù)字信號(hào)。上述區(qū)域與細(xì)胞的尺寸相比可以較大，從而使多種細(xì)胞能與一個(gè)區(qū)域結(jié)合。在這種情況下，可校正來自每個(gè)區(qū)域的信號(hào)，以便給出單位體積樣品中的細(xì)胞數(shù)目?？刹捎美霉鈾z測(cè)器陣列(例如，CCD攝像機(jī)或雪崩光電二極管陣列)進(jìn)行圖像分析，計(jì)數(shù)細(xì)胞并確定細(xì)胞的形態(tài)。
本發(fā)明優(yōu)選地還提供用于進(jìn)行ECL反應(yīng)的方法，例如，以在5分鐘到15分鐘的范圍內(nèi)1000個(gè)ECL反應(yīng)的速率進(jìn)行測(cè)定的方法。
5.11、與其它分析方法和/或ECL一起使用的PMAMS
上述用于基于ECL檢測(cè)的技術(shù)可與其它測(cè)定技術(shù)一起例如用作可能發(fā)生催化劑和其它化學(xué)反應(yīng)的區(qū)域。本發(fā)明的離散的結(jié)合區(qū)域可用于其它測(cè)定技術(shù)中，例如，臨床化學(xué)物質(zhì)測(cè)定，比如電解質(zhì)測(cè)定、臨床酶測(cè)定、血液蛋白質(zhì)測(cè)定、葡萄糖、尿素和肌酸酐的測(cè)定等等?？梢耘cECL測(cè)定結(jié)合和/或單獨(dú)與本發(fā)明的PMAMS一起使用的其它測(cè)定技術(shù)包括基于化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記物、基于螢光的測(cè)定、酶連接的測(cè)定系統(tǒng)、電化學(xué)測(cè)定(例如，參見Hickman，1991年，科學(xué)，252688-691)和/或共振檢測(cè)(例如，表面細(xì)胞質(zhì)基因組和聲學(xué)技術(shù))測(cè)定系統(tǒng)。
可利用具有液滴的PMAMS載體，其中，在液滴陣列中有許多不同的化學(xué)物質(zhì)。每個(gè)液滴可含有不同的結(jié)合試劑和/或不同的化學(xué)測(cè)定物(也就是說，對(duì)同一測(cè)定反應(yīng)介質(zhì))。例如，液滴可以是親水性的、位于由疏水性表面區(qū)域圍繞的親水性表面結(jié)合區(qū)域上。用覆蓋表面的疏水性溶液保護(hù)液滴。使要被測(cè)定的親水性溶液沉積在具有由疏水性區(qū)域圍繞的親水性結(jié)合區(qū)域的第二PMAMS上。使兩個(gè)表面對(duì)準(zhǔn)靠近，以便使在相對(duì)表面上的親水性區(qū)域接觸，并進(jìn)行光譜分析，以便檢測(cè)化學(xué)測(cè)定的反應(yīng)產(chǎn)物。
可把原纖維墊弄成圖案，從而使得有許多由親水性和/或疏水性區(qū)域圍繞的離散的疏水性和/或親水性區(qū)域。含有結(jié)合試劑的含水溶液的液滴可位于親水性區(qū)域上，并由周圍的疏水性區(qū)域限定。這些液滴例如可含有原纖維、原纖維的聚集體、結(jié)合試劑、ECL試劑、用于測(cè)定的試劑、表面活性劑、PEGs、洗滌劑、上述作為例子所提到的許多生物分子和/或它們的組合。
可控制地去除覆蓋第一PMAMS的疏水性溶液(例如，蒸發(fā)、芯吸)，以便只使在頂部的一部分液滴暴露于環(huán)境。然后，使要被測(cè)定光化學(xué)反應(yīng)的親水性溶液暴露于PMAMS表面-進(jìn)行親水性微液滴和要被測(cè)定的溶液的混合和分析(例如，光譜分析)。
還可把PMAMS結(jié)合區(qū)域用作預(yù)過濾物或過濾物。例如，細(xì)胞特異的PMAMS在某些情況下可單獨(dú)用作對(duì)某些細(xì)胞類型的過濾物，以及與一個(gè)篩選大小的過濾器一起使用。然后，使所得到的被分析物溶液暴露于對(duì)亞細(xì)胞顆粒物質(zhì)(例如，病毒)特異性的PMAMS。使用顆粒亞細(xì)胞PMAMS和/或篩選大小的過濾器，以產(chǎn)生小分子(例如，蛋白質(zhì)、小的化學(xué)實(shí)體)被分析物溶液。通過使用串聯(lián)的PMAMS測(cè)定系統(tǒng)，可順序提純被分析物溶液以為了減少非特異性被分析物的相互作用。
可以改變用于載體、電極和/或結(jié)合區(qū)域的材料的不透光性，以便獲得所需的性能。這樣的材料可以是半透明的、透明的或基本上不透明的，這取決于該材料的厚度、組成和/或光學(xué)密度。
原纖維墊的不透光性隨著該墊的厚度而增加。極薄的墊是半透光的。較厚的墊基本上是不透明的。在某些例子中，厚度范圍為0.01μm到0.5μm的墊基本上是半透明的。在另外一些例子中，厚度大于20μm的墊基本上是不透明的。厚度在0.5μm到20μm之間的墊具有中等的不透明性，這種中等不透明性隨著原纖維墊的厚度增加而增加。特定厚度的墊的不透光性取決于組成、密度、衍生情況、層的數(shù)目、分散在該墊中的那些材料的類型和量、和/或它們的組合情況。它還取決于所用光的波長(zhǎng)。
如果材料在給定的厚度基本上是半透明的，而對(duì)于另一厚度基本上是不透明的，則由上述材料的某一深度處所發(fā)出的光可穿出該材料，而由另一深度(例如，更深)所發(fā)出的光可基本上被所述材料吸收或散射。在一個(gè)例子中，材料的可變的不透明性使得該材料可用作濾光器。
從原纖維墊中的某一深度發(fā)出的光可基本上穿出該墊，并可用放在該原纖維墊的表面上或附近的檢測(cè)器觀察。從另一深度發(fā)出的光基本上可被所述墊吸收和/或散射，并且不能為在上述原纖維墊的表面上或附近的檢測(cè)器所觀察到。原纖維墊(和/或光學(xué)上類似的材料)的這種性質(zhì)可用來區(qū)分在ECL測(cè)定中結(jié)合的和未結(jié)合的試劑。
某些試劑可擴(kuò)散(主動(dòng)或被動(dòng))，被拉(例如，通過抽吸過濾和/或毛細(xì)管作用)、被芯吸、或通過壓力被推到多孔材料中足夠的深度，從而使這些試劑發(fā)射的光基本上或全部被墊吸收或散射。在一個(gè)例子中，原纖維墊起到物理過濾器或?yàn)V光器的作用，某些試劑穿過該原纖維墊，某些試劑被夾帶，和/或某些試劑在所述墊表面處或附近與一個(gè)極薄的層結(jié)合。防止與一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域結(jié)合的試劑和/或結(jié)合到一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域(這些區(qū)域位于原纖維墊的表面上或在PMAMS上的所述墊的表面附近的一個(gè)極薄的層中)的物質(zhì)擴(kuò)散或被拉入或穿過所述墊。使試劑和/或其它溶液流動(dòng)或懸浮在原纖維墊的表面上和/或遍布于該原纖維墊的表面，從而使試劑只與在所述墊的表面上的一個(gè)極薄的層結(jié)合。可在一個(gè)或多個(gè)方向上清洗試劑一次或多次穿過所述墊。試劑可與原纖維墊、一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域、結(jié)合到一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域的其它或相同的試劑結(jié)合，被夾帶在所述墊中，穿過該墊，或者，將這些情況組合起來。
用于載體和/或電極的多孔材料可多于一層，其中，上層具有結(jié)合區(qū)域，而在墊中的其它層沒有結(jié)合區(qū)域。在一個(gè)例子中，原纖維墊(圖29中示意性地示出)、上層2900的厚度足以防止光通過，此光來源于這層下面的所述墊的層2901、2902?？捎梦挥趬|的表面上或附近處的檢測(cè)器2906檢測(cè)來源于與這上層結(jié)合的源2904、2905的光。來源于下層2901、2902中的源2907、2908、2909的光可被所有的層中的任何一個(gè)或所有的層吸收或散射，而且不能用檢測(cè)器2906、2910檢測(cè)到。
可用預(yù)過濾步驟在制作墊之前選擇原纖維和/或原纖維的聚集體的特定的尺寸、類型、衍生物。用來過濾原纖維懸浮液的過濾媒介物是一定或多種孔隙度的原纖維墊。
多孔材料(例如，原纖維墊)可作為用于結(jié)合區(qū)域的載體、可用于ECL或其它電化學(xué)用途的電極、可用來控制試劑發(fā)送的過濾器和/或可以各種程度傳送、吸收和/或散射光的濾光器。
5.12、電化色ECL顯示器板本發(fā)明還提供了生產(chǎn)用于平板顯示器的隔離開的電化學(xué)像素的方法。已建議將平板印刷術(shù)用于基于電化色和電化學(xué)發(fā)光的平板顯示器，以產(chǎn)生像素，這些像素當(dāng)受到電子訪問時(shí)對(duì)鄰近的像素具有有限的影響(也就是說，有限的串?dāng)_)(參見美國(guó)專利5,189,549)。用于減少這樣的串?dāng)_的平板印刷術(shù)的局限性在于當(dāng)電解材料曝光時(shí)必須能改變它的電導(dǎo)率。本發(fā)明的特征是減少各像素之間的串?dāng)_而無需采用能夠光誘發(fā)電導(dǎo)率調(diào)制的材料，由此，使得能采用很廣泛圍的不同溶液、凝膠或膜。
在夾層結(jié)構(gòu)中，作為像素的活性區(qū)域的兩個(gè)電極表面是在兩個(gè)彼此面向的表面上。電極表面例如涂覆有互補(bǔ)的電化色材料。要減少串?dāng)_，把導(dǎo)電電解膜放在電極表面之間，而在不同的電極對(duì)之間(也就是說，在像素元之間)是不導(dǎo)電區(qū)域。如果有涂層的電極表面是親水性的，那么，就使圍繞電極的表面區(qū)域是疏水性的(例如，借助于壓印或穿過掩模沉積)，并把親水性導(dǎo)電小液滴放在第一表面的電極上(例如，借助于射流陣列)，然后，用機(jī)器對(duì)準(zhǔn)第二表面，并使該第二表面與第一表面接觸，從而使電極對(duì)準(zhǔn)。這樣，可使電解小液滴限制在處于一個(gè)像素內(nèi)的區(qū)域，而在像素之間無導(dǎo)電材料。像素的電極對(duì)在同一表面上并排緊密靠近。如果有涂層的電極對(duì)是親水性的，就使圍繞兩個(gè)電極的區(qū)域是親水性的，而使一個(gè)疏水性環(huán)圍繞親水性電極區(qū)域(例如，借助于壓印或穿過掩模沉積)。用疏水性溶液使上面兩個(gè)實(shí)施例中所述的小液滴穩(wěn)定?？商岣咚鋈芤旱恼扯?，以提高小液滴陣列的穩(wěn)定性?？墒褂H水性和疏水性反過來。在另外一些實(shí)施例中，小液滴可含有能聚合的溶液，以提高在電極對(duì)之間或在電極對(duì)上面的膜的穩(wěn)定性和/或電導(dǎo)率(例如，導(dǎo)電聚合物)。此外，可利用結(jié)構(gòu)特性來限制在像素之間的串?dāng)_。例如，可采用具有能并排環(huán)繞表面上的電極像素對(duì)的環(huán)形壓印突出物特征的彈性印記(例如，聚(二甲基硅氧烷))，以便隔離像素之間的電解液、凝膠或膜。可以選擇地，可把并排的電極像素對(duì)按照類似于井的電絕緣結(jié)構(gòu)放在表面上，電解液、凝膠或膜放在在電極上面的井中，并覆蓋或涂覆整個(gè)表面，以便隔離并包含每個(gè)像素的那些電解成份。
5.13、用于其它化學(xué)反應(yīng)的PMAMS本發(fā)明的PMAMS還可用來進(jìn)行并不與ECL結(jié)合的那些化學(xué)反應(yīng)。例如，可采用上面5.11節(jié)中所述的所有的技術(shù)和非ECL測(cè)定。
提供了一種盒，用于檢測(cè)或測(cè)量樣品中的所感興趣的被分析物，這種盒包括(a)一個(gè)表面上具有許多離散的結(jié)合區(qū)域的第一載體，以便至少形成一個(gè)結(jié)合表面，至少某些離散的結(jié)合區(qū)域與其它結(jié)合區(qū)域具有不同的結(jié)合特異性，所述許多離散的結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)是親水性的并由疏水性區(qū)域圍繞，以及(b)具有許多親水性區(qū)域的一個(gè)第二載體，該親水性區(qū)域包括適于在其上進(jìn)行化學(xué)測(cè)定的一些反應(yīng)介質(zhì)，以便形成一個(gè)測(cè)定表面，其中，所述許多離散的結(jié)合區(qū)域和許多反應(yīng)介質(zhì)能夠達(dá)到接觸，從而使存在于每個(gè)結(jié)合區(qū)域上的要被分析的樣品與反應(yīng)介質(zhì)接觸，以檢測(cè)或測(cè)量所感興趣的被分析物?？梢赃x擇地，結(jié)合區(qū)域可以是疏水性的，而第二載體具有許多含有反應(yīng)介質(zhì)的疏水性區(qū)域。
本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)或測(cè)量樣品中所感興趣的被分析物的方法，這種方法包括(a)把含有要被檢測(cè)或測(cè)量的被分析物的樣品液滴放在載體表面上的許多離散的結(jié)合區(qū)域上，其中，該許多離散的結(jié)合區(qū)域至少包括一個(gè)結(jié)合區(qū)域，這個(gè)結(jié)合區(qū)域含有一些彼此相同的結(jié)合試劑，這些結(jié)合試劑的特異性與容納在其它結(jié)合區(qū)域中的那些結(jié)合試劑不同，上述那些離散的結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)的特征為疏水性的或親水性的，但條件是圍繞每個(gè)結(jié)合區(qū)域的載體表面的區(qū)域是(i)疏水性的，如果該結(jié)合區(qū)域是親水性的話，以及(ii)親水性的，如果該結(jié)合區(qū)域是疏水性的話，以便于上述樣品中的一種或多種所感興趣的被分析物能與所述那些結(jié)合區(qū)域結(jié)合，以及(b)使在第一載體上的液滴與具有許多離散的親水性區(qū)域的第二載體表面接觸，該許多離散的親水性區(qū)域包括適于在其上進(jìn)行化學(xué)測(cè)定的反應(yīng)介質(zhì)，以及(c)確定與上述結(jié)合區(qū)域結(jié)合的所感興趣的被分析物的存在。
還提供一種用于檢測(cè)或測(cè)量樣品中所感興趣的被分析物的方法，這種方法包括(a)把含有要被檢測(cè)或測(cè)量的被分析物的樣品的液滴放在載體表面上的許多離散的結(jié)合區(qū)域上，其中，所述許多離散的結(jié)合區(qū)域至少包括一個(gè)結(jié)合區(qū)域，這個(gè)結(jié)合區(qū)域含有一些試劑，這些試劑彼此等同并且與容納在其它那些結(jié)合區(qū)域中的結(jié)合試劑的特異性不同，所述離散的結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)的特征為疏水性的或親水性的，但條件是圍繞上述那些結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)的載體表面的區(qū)域是(i)疏水性的，如果結(jié)合區(qū)域是親水性的話，以及(ii)親水性的，如果結(jié)合區(qū)域是疏水性的話，以便使得上述樣品中的一種或多種所感興趣的被分析物能與上述那些結(jié)合區(qū)域結(jié)合，以及(b)把反應(yīng)介質(zhì)的液滴放在樣品的液滴上；以及(c)確定與上述結(jié)合區(qū)域結(jié)合的所感興趣的被分析物的存在。
在本發(fā)明的這方面的一個(gè)特定的例子中，一些結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)均已結(jié)合有用在化學(xué)反應(yīng)中的順序的中間物作為底物的一種不同的酶，這些結(jié)合區(qū)域位于PMAMS表面上，從而使作為一種后來的酶的反應(yīng)物的一種給定的酶促反應(yīng)的產(chǎn)物流動(dòng)到在反應(yīng)通路中的下一種酶。本發(fā)明還用上述方法使酶整體固定在自組裝的單層上，例如，用于工業(yè)用途。
例如，在一側(cè)或兩側(cè)上具有這樣固定的酶的一些片可疊置，以便獲得表面積對(duì)溶液體積的高比值?？梢赃x擇地，這樣固定的酶可以附著到多孔材料上。此外，這樣固定的酶可以在探針上、在攪拌劑上、在管或毛細(xì)管的壁上、或者，在諸如溫育室那樣的容器的壁上。
在本發(fā)明的一種可供選擇的情況中，可以在PMAMS的類似物進(jìn)行諸如上述那樣的非ECL測(cè)定，所述PMAMS的類似物與上述PMAMS的不同之處在于該P(yáng)MAMS類似物含有一些用于進(jìn)行非ECL反應(yīng)的離散的區(qū)域，所述這些離散的區(qū)域并非必須已帶有結(jié)合試劑，因此并非必須是結(jié)合區(qū)域。這樣的PMAMS類似物具有用于進(jìn)行反應(yīng)的離散的區(qū)域，并被制備成能抑制施加到上述那些離散的區(qū)域的流體的散布和/或擴(kuò)散。在一個(gè)實(shí)施例中，上述那些區(qū)域相對(duì)于載體表面上的那些周圍的區(qū)域是疏水性的或者是親水性的，以幫助把反應(yīng)介質(zhì)和/或樣品局限于上述那些離散的區(qū)域中?？衫貌捎镁姆椒?、使反應(yīng)介質(zhì)或樣品沉積在氈墊或多孔材料上的方法、在凝膠、膜等物上沉積和干燥反應(yīng)介質(zhì)或樣品的方法來抑制散布或擴(kuò)散。這樣的離散的區(qū)域的每一個(gè)的直徑或?qū)挾刃∮?mm，優(yōu)選在50nm到1mm的范圍內(nèi)，最優(yōu)選的是在1微米到1毫米的范圍內(nèi)。在施加樣品前，可把同樣的或不同的反應(yīng)介質(zhì)沉積在上述離散的結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)上，或施加樣品可先于沉積反應(yīng)介質(zhì)。
在利用PMAMS的類似物進(jìn)行非ECL測(cè)定的一種優(yōu)選的情況中，把反應(yīng)介質(zhì)的液滴放在許多離散的區(qū)域上，優(yōu)選地同時(shí)從微觀流體導(dǎo)管陣列發(fā)送，然后，任選提高穩(wěn)定性和/或保護(hù)上述液滴，把更粘的溶液(例如，油)放在反應(yīng)介質(zhì)的頂部上，或者，可以選擇地，放在兩個(gè)離散的區(qū)域之間；然后，把含有要被檢測(cè)或測(cè)量的被分析物的樣品施加給每個(gè)區(qū)域，或者是離散地施加給每個(gè)離散的區(qū)域，或者是成塊地使含有所述那些區(qū)域的PMAMS類似物的整個(gè)表面暴露于流體樣品。使在上述那些結(jié)合區(qū)域中暴露于所得到的反應(yīng)進(jìn)行，并通過采用從本領(lǐng)域中已知的那些指示器和檢測(cè)系統(tǒng)中選出的一種指示器和檢測(cè)系統(tǒng)來觀測(cè)結(jié)果。
還在下述這些例子中進(jìn)一步說明本發(fā)明，絕非打算使所述這些例子限制本發(fā)明的范圍。
6、例子6.1、用微觀壓印制備MAB PMAMS表面按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且影響了的光刻膠底板制備成方形陣列圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184(可從DowCorning得到的聚(二甲基硅氧烷))和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1混合物倒到底板上并加以固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。通過暴露于親水性的、在乙醇溶液(1至10mM)中的、以O(shè)H為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH，給所得到的彈性印記“涂墨”，用機(jī)器使該所得到的彈性印記與一個(gè)對(duì)齊的金表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，并去除該所得到的彈性印記。然后，用疏水性的以CH3為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)10CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗基片幾秒鐘(例如，2秒到10秒)(Kumar等人，上述和Prime等人，科學(xué)，2521164-7)。然后，用氮?dú)饬鳒睾偷馗稍锼玫降谋砻?。之后，用機(jī)器使含有親水性溶液的毛細(xì)管陣列與上述對(duì)齊的表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，所述對(duì)齊的表面使毛細(xì)管與SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH區(qū)域?qū)?zhǔn)。毛細(xì)管陣列中的每個(gè)毛細(xì)管含有單克隆抗體(MABs)，對(duì)所感興趣的被分析物特異性，能通過酰胺鍵與親水性區(qū)域上的活性O(shè)H基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。
6.2、用微觀壓印制備MAB和核酸PMAMS表面按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影了的光刻膠底板制備成方形陣列圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑10∶1的混合物倒到底板上并加以固化。從硅底板上小心地去除聚合了的SYLGARD 184。通過暴露于親水性的、在乙醇溶液(1至10mM)中的、以O(shè)H為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH，給所得到的彈性印記“涂墨”，用機(jī)器使該所得到的彈性印記與一個(gè)對(duì)齊的金表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，并去除該所得到的彈性印記。然后，用疏水性的以CH3為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)10CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗基片幾秒鐘(例如，2秒到10秒)(Kumar等人，上述和Prime等人，科學(xué)，2521164-7)。然后，用氮?dú)饬髀馗稍锼玫降谋砻?。之后，用機(jī)器使含有親水性溶液的毛細(xì)管陣列與上述對(duì)齊的表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，所述對(duì)齊的表面使毛細(xì)管與SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH區(qū)域?qū)?zhǔn)。毛細(xì)管陣列中的每個(gè)毛細(xì)管含有抗體或改性的核酸，對(duì)所感興趣的被分析物特異性，能通過酰胺鍵與在親水性區(qū)域上的活性O(shè)H基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。
6.3、通過刻蝕制備PMAMS表面使清潔的金表面暴露于在乙醇溶液(1-10mM)中的親水性的、以O(shè)H為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH(Prime等人，科學(xué)，2521164-1167)。用機(jī)器使成細(xì)尖的刻蝕器具的直線陣列光學(xué)對(duì)準(zhǔn)接觸一個(gè)對(duì)齊的金表面，并用該直線陣列對(duì)所述表面的X和Y兩個(gè)方向進(jìn)行刻蝕，從而產(chǎn)生SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH區(qū)域的一個(gè)兩維格柵陣列。然后，用疏水性的SH(CH2)11-(OCH2CH2)6CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗底片幾秒鐘(例如，2至10秒鐘)。然后，用氮?dú)饬髀馗稍锼玫降谋砻?。之后，用機(jī)器使含有親水性溶液的毛細(xì)管陣列與上述表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，所述表面使毛細(xì)管與SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH區(qū)域?qū)?zhǔn)接觸。毛細(xì)管陣列中的每個(gè)毛細(xì)管含有抗體或核酸，對(duì)所感興趣的被分析物特異性，能與在親水性區(qū)域上的活性O(shè)H基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。
6.4、在PMAMS表面上的夾層測(cè)定如上所述制備透明的PMAMS表面，它基本上是透明的且具有與表面連接的初級(jí)抗體(primary antibody)的成圖案多特異性陣列。選用透明的載體、電極陣列、單層表面。然后，使PMAMS表面暴露于被猜想含有要被測(cè)定的所感興趣的被分析物的溶液樣品。之后，清洗掉所述樣品，在表面上留下結(jié)合了抗體的被分析物。然后，使PMAMS表面暴露于含次級(jí)的ECL標(biāo)記的對(duì)在該表面上所結(jié)合的被分析物特異性的抗體的溶液。之后，從PMAMS表面上清洗掉這種溶液，留下與存在有被分析物的區(qū)域結(jié)合的ECL標(biāo)記的次級(jí)抗體。
用可拆除的屏障保護(hù)電極檢測(cè)，以便防止樣品與電極表面的過早接觸，避免污染影響。之后，拆除所述屏障，并使用測(cè)定緩沖劑浸濕了的電極陣列與PMAMS表面對(duì)齊接觸。使電極陣列與電子波形信號(hào)發(fā)生器連接，并把電位施加給工作電極/反電極對(duì)。然后，CCD判讀所發(fā)射的光，而信號(hào)被送至微處理器，把此信號(hào)轉(zhuǎn)化為所想要的測(cè)量結(jié)果輸出形式。
把測(cè)量結(jié)果輸出與利用已知量的所感興趣的被分析物作對(duì)照所得到的測(cè)量結(jié)果輸出作比較，以便計(jì)算被分析物的實(shí)際量。
6.5、在第一和第二PMAMS表面上的測(cè)定如上所述制備透明的PMAMS表面，其中成圖案的多特異性的初級(jí)抗體陣列連至表面。然后，使PMAMS表面暴露于被猜想含有要被測(cè)定的所感興趣的被分析物的溶液樣品。之后，清洗掉所述樣品，在表面上留下結(jié)合了抗體的被分析物。
給在保護(hù)性覆蓋物下的第二PMAMS配置交替的疏水性/親水性圖案，在圖案上有成圖案的用ECL標(biāo)記物標(biāo)記的許多次級(jí)抗體的微液滴。
去除保護(hù)與第一PMAMS對(duì)齊的第二PMAMS的屏障，并使微液滴與第一PMAMS上的初級(jí)抗體結(jié)合區(qū)域?qū)?zhǔn)。升離第二PMAMS，并使電極陣列與第一PMAMS表面對(duì)齊接觸。使電極陣列與電位波形信號(hào)發(fā)生器連接，并給工作電極/反電極對(duì)施加電位。然后，光電倍增管判讀所發(fā)射的光，而信號(hào)被送至微處理器，把所述信號(hào)轉(zhuǎn)化為所想要的測(cè)量結(jié)果輸出形式。
把測(cè)量結(jié)果輸出與利用已知量的所感興趣的被分析物作對(duì)照所得到的測(cè)量結(jié)果輸出作比較，以便計(jì)算被分析物的實(shí)際量。
6.6、在PMAMS表面上的核酸測(cè)定如上所述制作透明的PMAMS表面，其中單鏈的核酸探針的成圖案的多特異性陣列與表面連接。所述探針與所感興趣的核酸被分析物的5′區(qū)域互補(bǔ)。然后，使PMAMS表面暴露于被猜想含有要被測(cè)定的所感興趣的可雜交的核酸被分析物的溶液樣品，已預(yù)先使該樣品變性，即被處理，以便使所感興趣的被分析物成為單鏈。然后，清洗掉所述樣品，在上述表面上留下雜交了的被分析物。之后，使PMAMS表面暴露于溶液，這種溶液含有對(duì)結(jié)合在表面上的核酸被分析物的3′末端特異性的次級(jí)ECL標(biāo)記的核酸探針。然后，從PMAMS表面上清洗掉這種溶液，留下與存在有被分析物的區(qū)域結(jié)合的ECL標(biāo)記的核酸探針。
去除保護(hù)與第一PMAMS對(duì)準(zhǔn)的第二PMAMS的屏障，并使微液滴對(duì)準(zhǔn)第一PMAMS上的初級(jí)抗體結(jié)合區(qū)域。升離第二PMAMS，并使電極陣列與第一PMAMS表面對(duì)準(zhǔn)接觸。
使電極陣列連接一個(gè)電位波形信號(hào)發(fā)生器，并給工作電極/反電極對(duì)施加電位。然后，CCD判讀所發(fā)射的光，而信號(hào)被送至一個(gè)微處理器，把該信號(hào)轉(zhuǎn)化為所想要的測(cè)量結(jié)果輸出形式。
把測(cè)量結(jié)果輸出與利用已知量的所感興趣的被分析物作對(duì)照所得到的測(cè)量結(jié)果輸出作比較，以便計(jì)算被分析物的實(shí)際量。
6.7、用光電倍增器檢測(cè)器的在PMAMS表面上的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定如上所述制備透明的PMAMS表面，這表面具有連接到該表面的、對(duì)所感興趣的被分析物特異性的初級(jí)抗體的成圖案的多特異性陣列。然后，使PMAMS表面暴露于要測(cè)定的溶液樣品，溶液樣品是被猜想含有所感興趣的被分析物的樣品和已知量的ECL標(biāo)記的分子的混合物，已知量的ECL標(biāo)記的分子與用于結(jié)合抗體的所感興趣的被分析物競(jìng)爭(zhēng)。之后，清洗掉所述樣品，在上述表面上留下結(jié)合抗體的被分析物和/或被標(biāo)記了的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物。
用可去除的屏障保護(hù)電極陣列，以便防止樣品與電極表面接觸，避免污染影響。然后，去除所述屏障，并使得用測(cè)定緩沖劑浸濕的電極陣列與PMAMS表面接觸對(duì)準(zhǔn)。5使電極陣列連接電位波形信號(hào)發(fā)生器，并給工作電極/反電極對(duì)施加電位。之后，用光電倍增管判讀所發(fā)射的光，而信號(hào)送至一個(gè)微處理器，把該信號(hào)轉(zhuǎn)化為所想要的測(cè)量結(jié)果輸出形式。
把測(cè)量結(jié)果輸出與利用已知量的所感興趣的被分析物作對(duì)照所得到的測(cè)量結(jié)果輸出作比較，以便計(jì)算被分析物的實(shí)際量。
6.8、用CCD檢測(cè)器在PMAMS表面上的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定如上所述制備透明的PMAMS表面，這表面具有連接到該表面的、初級(jí)抗體的成圖案的多特異性陣列。然后，使PMAMS表面暴露于被猜想含有要被測(cè)定的所感興趣的被分析物的溶液樣品。之后，清洗掉所述樣品，在上述表面上留下結(jié)合抗體的被分析物。
給在保護(hù)性覆蓋物下面的第二PMAMS配置交替的疏水性/親水性圖案，在此圖案上有與所感興趣的被分析物競(jìng)爭(zhēng)的許多已知量的ECL標(biāo)記的分子的成圖案的微液滴。
去除保護(hù)與第一PMAMS對(duì)準(zhǔn)的第二PMAMS的屏障，并使微液滴對(duì)準(zhǔn)在第一PMAMS上的初級(jí)抗體結(jié)合區(qū)域。升離第二PMAMS，并使電極陣列對(duì)準(zhǔn)接觸PMAMS表面。使電極陣列連接電位波形信號(hào)發(fā)生器，并給工作電極/反電極對(duì)施加電位。然后，用CCD判讀所發(fā)射的光，而信號(hào)送至一個(gè)微處理器，把該信號(hào)轉(zhuǎn)化為所想要的測(cè)量結(jié)果輸出形式。
把測(cè)量結(jié)果輸出與利用已知量的所感興趣的被分析物作對(duì)照所得到的測(cè)量結(jié)果輸出作比較，以便計(jì)算被分析物的實(shí)際量。
6.9、通過用SH(CH2)10CH3鏈烷硫醇進(jìn)行微觀壓印制備MAB PMAMS表面按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影的光刻膠底板制備成方形陣列圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184(可從DowCorning得到的聚(二甲基硅氮烷))和相應(yīng)的SYLGARD 184固化劑的10∶1的混合物倒到底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。通過暴露于親水性的、在乙醇溶液(1至10mM)中的、以O(shè)H為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)11OH，給所得到的彈性印記“涂墨”，用機(jī)器使該所得到的彈性印記與對(duì)齊的金表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，并去除該所得到的彈性印記。然后，用疏水性的以CH3為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)10CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗底片幾秒鐘(例如，2秒到10秒)(Kumar等人的上述的文章)。然后，用氮?dú)饬髀馗稍锼玫降谋砻?。之后，用機(jī)器使含有親水性溶液的毛細(xì)管陣列與上述對(duì)齊的表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，所述對(duì)齊的表面使毛細(xì)管與SH(CH2)11OH區(qū)域?qū)?zhǔn)，以便在每個(gè)區(qū)域放置特異性抗體。毛細(xì)管陣列中的每個(gè)毛細(xì)管含有單克隆抗體，這些單克隆抗體對(duì)所感興趣的被分析物特異性，能與在親水性區(qū)域上的活性O(shè)H基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。
6.10、通過用SH(CH2)10CH3鏈烷硫醇進(jìn)行微觀壓印制備MAB和核酸PMAMS表面按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影的光刻膠底板制備成方形陣列圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1的混合物倒到硅底板上并加以固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。通過暴露于親水性的、在乙醇溶液(1至10mM)中的、以O(shè)H為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)11OH，給所得到的彈性印記“涂墨”，用機(jī)器使該所得到的彈性印記與一個(gè)對(duì)齊的金表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，并去除該所得到的彈性印記。然后，用疏水性的以CH3為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)10CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗底片幾秒鐘(例如，2秒到10秒)(Kumar等人的上述文章)。然后，用氮?dú)饬髀馗稍锼玫降谋砻妗Ｖ?，用機(jī)器使含有親水性溶液的毛細(xì)管陣列與上述對(duì)齊的表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，所述對(duì)齊的表面使毛細(xì)管與一些SH(CH2)11OH區(qū)域?qū)?zhǔn)，以便在每個(gè)區(qū)域上放置一些特異性抗體和/或可雜交的核酸。毛細(xì)管陣列中的每個(gè)毛細(xì)管含有一些單克隆抗體或改性的核酸，這些單克隆抗體或改性的核酸對(duì)所感興趣的被分析物特異性，能通過酰胺鍵與在親水性區(qū)域上的活性O(shè)H基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。
6.11、用鏈霉抗生物素蛋白-生物素接頭物制備PMAMS表面按照眾所周知的方法把1毫米至2毫米厚的已曝光且顯影的光刻膠底板制備成方形陣列圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1的混合物倒到硅底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。通過暴露于巰基十一醇和12-巰基(8-生物素酰胺-3，6-二氧雜辛基)十二酰胺的混合物，給所得到的彈性印記“涂墨”，這里，生物素化了的硫醇的摩爾分?jǐn)?shù)為0.1(參見Spinke等人，1993年，Langmuir，91821-5，和Spinke等人，1993年，J.Chem.Phys.99(9)7012-9)。然后，用疏水性的以CH3為末端的鏈烷硫醇、HS(CH2)10CH3鏈烷硫醇(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗底片幾秒(例如，2秒到10秒)(參見Kumar等人，如上，Biebuyck，Whitesides)。然后，用氮?dú)饬髀馗稍锼玫降谋砻?。之后用機(jī)器使在每個(gè)毛細(xì)管中含有鏈霉抗生物素蛋白溶液的毛細(xì)管陣列與上述對(duì)齊的表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸。使毛細(xì)管陣列中的每個(gè)毛細(xì)管對(duì)準(zhǔn)并接觸生物素化的區(qū)域，而且去除該毛細(xì)管陣列，清洗所述表面。然后，用機(jī)器使含有許多生物素化的抗體和生物素化的核酸溶液的第二毛細(xì)管陣列與上述對(duì)齊的表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，以便在每個(gè)區(qū)域上放置一些特異性抗體和核酸。
6.12、MAB單獨(dú)的表面的制備用本領(lǐng)域中已知的方法制作在硅表面上的金上的交錯(cuò)對(duì)插工作電極和反電極對(duì)的電極陣列(例如，參見上文的Kumar等人的文章)。在這個(gè)例子中，電極陣列和離散的結(jié)合區(qū)域陣列存在于載體的同一表面上。按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影的光刻膠底板制備成方形陣列圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184(可從Dow Corning得到的聚(二甲基硅氧烷(PDMS)))和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1的混合物倒到硅底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。通過暴露于親水性的、在乙醇溶液(1至10mM)中的、以O(shè)H為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH，給所得到的彈性印記“涂墨”，用機(jī)器使該所得到的彈性印記與在金電極陣列表面上的對(duì)齊的工作電極用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，之后去除該所得到的彈性印記。然后，通過使毛細(xì)管與在電極陣列表面上的SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH區(qū)域?qū)?zhǔn)，用機(jī)器使含有親水性溶液的毛細(xì)管陣列用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，以便把一些特異性抗體放在每個(gè)區(qū)域上。毛細(xì)管陣列中的每個(gè)毛細(xì)管含有一些單克隆抗體，這些單克隆抗體對(duì)所感興趣的被分析物特異性，可通過酰胺鍵與在親水性區(qū)域上的活性O(shè)H基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。
6.13、在MAB單獨(dú)的表面上進(jìn)行測(cè)定制作上文6.12節(jié)所述的載體。如前所述，從成環(huán)形圖案的光刻膠底板制作PDMS印記，這些環(huán)的每一個(gè)獨(dú)立地限定了一個(gè)工作電極/反電極對(duì)的范圍。之后，使電極陣列表面暴露于要被分析的樣品，該電極陣列表面用ECL標(biāo)記的次級(jí)抗體的混合物清洗，然后用含有三丙胺的測(cè)定緩沖劑溶液清洗。然后，對(duì)齊PDMS印記，并使該P(yáng)DMS印記對(duì)準(zhǔn)接觸，對(duì)齊PDMS印記的環(huán)，以便把測(cè)定緩沖劑的單獨(dú)的體積限定并確定在每個(gè)電極對(duì)上面。把過電位施加給電極對(duì)，以便從表面上釋放單層，使工作電極暴露于ECL標(biāo)記的次極抗體。然后，光電倍增管判讀穿過透明的PDMS所發(fā)射的光，而信號(hào)送至一個(gè)微處理器，把該信號(hào)轉(zhuǎn)化為所想要的測(cè)量結(jié)果輸出形式。
把測(cè)量結(jié)果輸出與利用已知量的所感興趣的被分析物作對(duì)照所得到的測(cè)量結(jié)果輸出作比較，以便計(jì)算被分析物的實(shí)際量。
6.14、制備具有工作電極和反電極的單獨(dú)的表面用本領(lǐng)域中已知的方法，制作在硅載體的金上的兩個(gè)交錯(cuò)對(duì)插電極之間具有金結(jié)合區(qū)域的、交錯(cuò)對(duì)插工作金電極和金反電極對(duì)的電極陣列(例如，參見上文的Kumar等人的文章)。在這個(gè)例子中，電極陣列和離散的結(jié)合區(qū)域陣列存在于同一表面上。按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影的光刻膠底板制備成結(jié)合區(qū)域的圖案，這些結(jié)合區(qū)域處于交錯(cuò)對(duì)插電極對(duì)之間。把SYLGARD硅酮彈性體184(可從Dow Corning得到的聚(二甲基硅氧烷(PDMS)))和相應(yīng)的SYLGARD 184固化劑的10∶1混合物倒到硅底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合的SYLGARD 184。通過暴露于親水性的、在乙醇溶液(1至10mM)中的、以O(shè)H為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH，給所得到的彈性印記“涂墨”，用機(jī)器使該所得到的彈性印記與在電極陣列表面上的對(duì)齊的金結(jié)合區(qū)域用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，之后，去除該所得到的彈性印記。然后，用機(jī)器使含有親水性溶液的毛細(xì)管陣列用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，使毛細(xì)管與在電極陣列表面上的SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH區(qū)域?qū)?zhǔn)，以便把一些特異性抗體放在每個(gè)區(qū)域上。毛細(xì)管陣列中的每個(gè)毛細(xì)管含有一些單克隆抗體，這些單克隆抗體對(duì)所感興趣的被分析物特異性，可通過酰胺鍵與在親水性區(qū)域上的活性O(shè)H基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。
6.15、在具有工作電極和反電極的單獨(dú)的表面上進(jìn)行測(cè)定用上述方法制作上文6.14節(jié)所述的載體表面。使所制備的表面暴露于要分析的樣品，所制備的表面用ECL標(biāo)記的次級(jí)抗體的混合物清洗，然后，再用含有三丙胺的測(cè)定緩沖劑溶液清洗。使電極陣列連接電位波形信號(hào)發(fā)生器，并給工作電極/反電極對(duì)施加電位。然后，光電倍增管判讀所發(fā)射的光，而信號(hào)送至一個(gè)微處理器，把該信號(hào)轉(zhuǎn)化為所想要的測(cè)量結(jié)果輸出形式。
把測(cè)量結(jié)果輸出與利用已知量的所感興趣的被分析物作對(duì)照所得到的測(cè)量結(jié)果輸出作比較，以便計(jì)算被分析物的實(shí)際量。
6.16、制備具有反電極的表面按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影的光刻膠底板制備成方形陣列圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1混合物倒到硅底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。通過暴露于親水性的、在乙醇溶液(1至10mM)的、以O(shè)H為末端的鏈烷硫醇、SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH，給所得到的彈性印記“涂墨”，用機(jī)器使該所得到的彈性印記與在金表面上的對(duì)齊的成圖案的反電極和方形結(jié)合區(qū)域用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，并去除該所得到的彈性印記。成圖案的金表面由一些可訪問的環(huán)形反電極構(gòu)成，這些可訪問的環(huán)形反電極限定了已壓印有SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH的一些結(jié)合區(qū)域的范圍。在每個(gè)金反電極和每個(gè)用于每個(gè)單層結(jié)合區(qū)域的方形金底片之間有一個(gè)縫隙或分開的空間。之后，用機(jī)器使含有親水性溶液的毛細(xì)管陣列與上述對(duì)齊的表面用銷釘對(duì)準(zhǔn)接觸，所述對(duì)齊的表面使毛細(xì)管與一些SH(CH2)11OH區(qū)域?qū)?zhǔn)，以使在每個(gè)區(qū)域上放置一些特異性抗體和核酸。毛細(xì)管陣列中的每個(gè)毛細(xì)管含有一些抗體或核酸，這些抗體或核酸對(duì)所感興趣的被分析物特異性，能與在親水性區(qū)域上的活性O(shè)H基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。
6.17、工作電極和反電極處于不同表面上的在單獨(dú)表面上進(jìn)行的測(cè)定使上面6.16節(jié)的例子中所述的載體表面暴露于要分析的樣品溶液。然后，該載體表面被清洗并暴露于含有許多不同特異性的ECL標(biāo)記的單克隆抗體或ECL標(biāo)記的核酸的溶液，之后，用含有三丙胺的測(cè)定緩沖劑清洗。制作透明的可訪問的工作電極陣列，使該陣列中的每個(gè)工作電極對(duì)應(yīng)于如上述6.16節(jié)中所述的載體上的一個(gè)離散的結(jié)合區(qū)域/反電極區(qū)域。兩個(gè)載體用測(cè)定緩沖劑弄濕，并用機(jī)器對(duì)準(zhǔn)排齊形狀相適應(yīng)地接觸。使電極陣列與一個(gè)電位波形信號(hào)發(fā)生器連接，并給對(duì)準(zhǔn)了的工作電極/反電極對(duì)施加電位，工作電極/反電極對(duì)在上述兩上載體之間產(chǎn)生電位場(chǎng)。之后，CCD判讀穿過透明工作電極所發(fā)射的光，而信號(hào)送至一個(gè)微處理器，使該信號(hào)轉(zhuǎn)化為所想要的測(cè)量結(jié)果輸出形式。
把測(cè)量結(jié)果輸出與利用已知量的所感興趣的被分析物作對(duì)照所得到的測(cè)量結(jié)果輸出作比較，以便計(jì)算被分析物的實(shí)際量。
6.18、用真空過濾作用制作CC(分散了的)原纖維墊通過混合0.1％w/w的CC原纖維/去離子水，制備每毫升溶液1毫克原纖維的CC原纖維的含水漿液。通過使400瓦的聲處理裝置(Sonication horn)浸入所述漿液10分鐘到1小時(shí)之間來在漿液中分散CC原纖維(較大的、微米尺度的聚集體被分散成小的聚集體或單根的纖維)。用光學(xué)顯微鏡監(jiān)控分散的程度。
把尼龍過濾膜(孔尺寸為0.47μm，直徑25mm)放在直徑25mm的燒結(jié)玻璃過濾物上。通過用抽吸過濾的膜/過濾物裝置過濾分散的原纖維漿液(圖23A)。用20ml的去離子水稀釋漿液(5ml)的等分試樣，之后，通過上述膜/過濾器裝置過濾該漿液的等分試樣。對(duì)于大約0.25至0.33g/cc的普通的墊來說，大約100μm的墊需要6個(gè)等分試樣。
繼續(xù)進(jìn)行抽吸過濾，直到從墊中去除所有來自分散物的水(通過目視檢查)。直接從過濾膜上剝離(用手)上述墊。
使墊在60℃爐子中干燥大約10分鐘至15分鐘。所述墊被切割、打孔或以其他方式切開備用。
6.19、通過蒸發(fā)在金屬網(wǎng)狀載體上制作原纖維墊通過混合0.1％w/w的CC原纖維/去離子水，制備每毫升溶液1毫克原纖維的CC原纖維的含水漿液。通過使400瓦聲處理裝置浸入漿液10分鐘到1小時(shí)之間，分散CC原纖維(較大的、微米尺度的聚集體被分散成小的聚集體或單獨(dú)的纖維)。用光學(xué)顯微鏡監(jiān)控分散的程度。
把一塊1cm2的不銹鋼網(wǎng)狀物(400支)放在直徑25mm的濾紙上。把5ml的漿液等分試樣吸移到篩網(wǎng)/濾紙的整體的表面上。使?jié){液中的水蒸發(fā)，蒸發(fā)在室溫和壓力下或在一個(gè)加熱爐中進(jìn)行。
一旦原纖維干燥，加入另外的等分試樣。把原纖維和篩網(wǎng)作為一個(gè)單獨(dú)的單元從濾紙上剝離。
上述墊被切割、打孔或以其他方式切開，以備使用。
6.20、生物素固定在載有NHS-酯官能團(tuán)的原纖維上使得用COOH衍生的原纖維(由Hyperion Catalysts公司提供)懸浮在～10mg/ml的無水的二 烷中，并不停地?cái)噭?dòng)。加入超過20倍摩爾數(shù)的N-羥基琥珀酰亞胺，并使之溶解。其次，加入超過20倍摩爾數(shù)的乙基-二氨基-丙基-碳二亞胺(EDAC)，并在室溫?cái)噭?dòng)混合物2小時(shí)。
在攪動(dòng)后，抽吸上清液，并用無水的二烷清洗固體三次，用無水甲醇清洗-次，并在0.45μm的聚砜膜上過濾。用另外的甲醇清洗濾液，并把該濾液放在真空的玻璃小瓶中，直到不再觀察到重量的減少。
用PBS-1(～70mM的磷酸鹽、150mM的NaCl)清洗10.4mg NHS-酯原纖維(ORIGEN試劑402-130-01，pH7.8，IGEN公司)。使清洗過的原纖維懸浮在2.3ml的抗生物素蛋白溶液中(8.3mg抗生物素蛋白/每ml PBS-1)。
使懸浮液處于室溫1.5小時(shí)，不停地轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶，以便攪動(dòng)。
1.5小時(shí)后，在4℃儲(chǔ)存懸浮液16小時(shí)，然后，使該懸浮液處于室溫，并用PBS-1清洗，而且使此懸浮液作為在PBS-1中的懸浮液儲(chǔ)存。
6.21、單克隆抗體(抗AFP)固定在碳原纖維上如6.20節(jié)的例子所述的那樣，制備用NHS酯官能化的碳原纖維。
使14mg原纖維-NHS酯與500ml PBS-1緩沖劑混合。聲處理該混合物20分鐘，直到它變?yōu)檎硿臐{液。加入另外500ml PBS-1緩沖劑。
把在80ml的PBS-1中的抗AFP(α-胎蛋白質(zhì))抗體加到上述漿液中。使反應(yīng)能在室溫進(jìn)行2.5小時(shí)。
加入6ml的PBS-1緩沖劑，并在4℃離心反應(yīng)混合物5分鐘。用吸移管去除上清液。重復(fù)這個(gè)步驟9次。
在最后的清洗之后，去除上清液，并在4℃儲(chǔ)存原纖維-抗AFP產(chǎn)物。
6.22、原纖維墊的周期性的伏安記錄原纖維墊與金箔電極的比較測(cè)量在0.5M的K2SO4中的6mM Fe3+/2+(CN)6的周期性伏安記錄。在圖30A中，在0.10mA/cm、在10、25和50mV/秒處測(cè)量CC(分散了的)的平原纖維的墊CV。如6.18節(jié)的例子所述制作墊。在圖30B中，在0.05mA/cm、在10、25和50mV/秒處測(cè)量對(duì)于金箔電極的CV。所有的電位以對(duì)Ag/AgCl的伏特計(jì)。
6.23、原纖維墊電極的電化學(xué)性質(zhì)陽極峰電流與所述墊的厚度的比較對(duì)于相同幾何面積(0.20cm2)但不同厚度的原纖維墊，測(cè)量在0.5M的K2SO4中的6mM Fe3+/2+(CN)6的周期性的伏安記錄。對(duì)于在24μm到42.5μm范圍內(nèi)的厚度，陽極峰電流(圖31)隨墊的厚度增加而增加。對(duì)每一厚度，陽極峰電流還隨掃描速率(例如，速率在10mV/秒到150mV/秒的范圍內(nèi))的增加而增加。作為厚度的函數(shù)，陽極峰電流增加的速率還隨厚度增加而增加。厚度為24μm的原纖維墊工作情況與金箔電極不相上下。
6.24、蛋白質(zhì)與原纖維的非特異性結(jié)合如下測(cè)量蛋白質(zhì)與碳原纖維(CC)的非特異性結(jié)合i)使Ru(bipy)32+(“TAG 1”)標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液暴露于已知量的碳原纖維，直到達(dá)到平衡；ii)使所標(biāo)記的蛋白質(zhì)/原纖維溶液離心，并收集上清液，以及iii)用電化學(xué)發(fā)光(ECL)測(cè)定留在所述上清液中所標(biāo)記的蛋白質(zhì)的量。
為產(chǎn)生圖32所示的曲線，給在0.1M pH值為7的磷酸鉀緩沖液中的CC(平的)原纖維的系列稀釋液加入3μg/ml的附著到衍生化的TAG1上的抗CEA抗體(對(duì)于附著到一種衍生化的TAG1 ECL標(biāo)記物上的癌胚抗原的抗體)。在旋轉(zhuǎn)20分鐘后，用離心法去除原纖維。在ORIGEN1.5(IGEN公司)的分析器中，對(duì)用ORIGEN測(cè)定緩沖劑稀釋了5倍的反應(yīng)混合物上清液等分試樣進(jìn)行ECL測(cè)定，測(cè)出留在上清液中的蛋白質(zhì)(未結(jié)合的)量。當(dāng)存在較高濃度的碳原纖維時(shí)，用衍生的TAG 1標(biāo)記的蛋白質(zhì)的結(jié)合增加時(shí)，導(dǎo)致ECL信號(hào)的減弱(相對(duì)于未暴露于原纖維的反應(yīng)混合物的對(duì)象的ECL信號(hào))。
6.25、蛋白質(zhì)與具有洗滌劑/表面活性劑的原纖維的非特異性結(jié)合的減弱用6.24節(jié)的例子中所述的方法分析上清液對(duì)與原纖維結(jié)合的蛋白質(zhì)的影響。給附著到衍生化的TAG 1/原纖維的混合物上的抗CEA加入曲通X-100，溫育溶液20分鐘，使試管離心，并用ECL分析用ORIGEN測(cè)定緩沖劑稀釋了5倍的上清液等分試樣。下面的表和圖33中示出了結(jié)果。
圖33中示出通過在溶液中用衍生化的TAG 1標(biāo)記的蛋白質(zhì)的ECL強(qiáng)度對(duì)曲通X-100的濃度作圖所得到的曲線。較強(qiáng)的ECL信號(hào)對(duì)應(yīng)于在上清液中更多的衍生化的-TAG 1標(biāo)記的蛋白質(zhì)，這又對(duì)應(yīng)于更少的衍生化的-TAG 1標(biāo)記的、與原纖維結(jié)合的蛋白質(zhì)。范圍從10ppm到100ppm的曲通X-100的濃度減弱了結(jié)合的程度，把所述濃度從100ppm增加到200ppm并不進(jìn)一步減弱結(jié)合的程度。
6.26、采用原纖維墊電極的溶液中的自由TAG的ECL把如6.18節(jié)的例子中所制備的原纖維墊安置在圖34所示的“FibrilCell”夾具的工作電極的電極夾3401的安裝區(qū)域3403中。使電極夾3401塞進(jìn)電化學(xué)元件室3400底部。把3M Ag/AgCl參考電極(Cyprus #EE008)穿過參考元件的孔3402裝入電化學(xué)元件室。上述元件填充有測(cè)定緩沖劑(IGEN #402-005-01批號(hào)#5298)，并附著在PMT夾具3404上。用EG & G PARC 175型萬能程序設(shè)計(jì)器和EG & G 175型穩(wěn)壓器/恒流器，使電位以在100mV/秒對(duì)Ag/AgCl從0伏掃到3伏。用Hamamatsu R5600U-01測(cè)量ECL，用Pacific Instruments 126型光度計(jì)在900V給所述Hamamatsu R 5600U-01供電。通過由HEM Snap-Master驅(qū)動(dòng)的CIO-DAS-1601 A/D板在10Hz時(shí)使模擬數(shù)據(jù)數(shù)字化。排干Fibril Cell，并用1000pM的TAG 1(IGEN#402-004-C批號(hào)#4297)沖洗，且填充1000pM的TAG 1。就像用測(cè)定緩沖劑時(shí)那樣掃過電位。圖35中示出了對(duì)于測(cè)定緩沖劑3501和1000pM TAG13502的ECL記錄線(在24.0±0.2℃時(shí)測(cè)量)。校正過暗區(qū)的ECL峰區(qū)域?qū)τ跍y(cè)定緩沖劑為22.10nAs，而對(duì)于1000pM的TAG 1為46.40nAs。
6.27、用原纖維墊電極所吸收的被標(biāo)記的抗體的ECL以6.18節(jié)的例子中所述的方式從平的CC分散的原纖維制作厚度0.0035英寸的原纖維墊。之后，弄干的墊被沖壓成3mm的圓盤，并裝到載體上。由0.030英寸的聚酯板制作用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)中的載體，通過絲網(wǎng)印刷的導(dǎo)電金墨使所述聚酯板形成圖案。導(dǎo)電金墨形成反電極、參考電極，并提供了用于工作電極和其它電極的引線。用含有雙側(cè)碳的導(dǎo)電帶(Aahesives Research)把兩個(gè)原纖維墊的圓盤裝到每個(gè)成圖案的載體上。安裝后，用0.5μl的附著到去離子水中的衍生的TAG 1上的10μg/ml的抗TSH抗體(Ru-TSH mono 1∶2 26JUN95，IGEN公司)或0.5μl的在去離子水中的10μg/ml的抗TSH未用TAG 1標(biāo)記的俘獲抗體，給上述那些圓盤涂上斑點(diǎn)，并使之干燥。干燥后，用IGEN測(cè)定緩沖劑充滿上述那些墊。把載體上的充滿了的那些墊放到以IGEN Origen 1.5為基礎(chǔ)的儀器上，并用從0mV到4500mV的500mV/秒的掃描速率判讀ECL。圖43比較了來自含有TAG 1-抗體墊4301和來自含有未用TAG1標(biāo)記的俘獲抗體墊4302的信號(hào)。
6.28、用于夾層測(cè)定的采用原纖維墊電極的ECL如上所述，把抗AFP俘獲抗體固定在原纖維上。使抗AFP原纖維洗入去離子水(dI)，并重新懸浮成密度為1mg/ml。采用如6.18節(jié)的例子中所述的真空過濾生產(chǎn)四層原纖維墊。把2mg的抗AFP原纖維加到3mg的平滑的、CC分散了的原纖維中，并使混合物在去離子水中稀釋成20ml的總體積。在0.45μm的尼龍過濾物上過濾稀釋了的混合物。之后，在這個(gè)初始的墊層后面還有兩個(gè)芯層，每個(gè)芯層由5mg的平滑的、CC分散了的原纖維組成。然后，用一個(gè)等同于上述初始層的混合了的原纖維層蓋上所述墊芯。這導(dǎo)致這樣一種原纖維墊，約40％的抗AFP原纖維在上表面和下表面，而約100％的平滑的原纖維在芯里。使這個(gè)混合而成的墊在真空中風(fēng)干，并將這個(gè)混合而成的墊沖壓成3mm的圓盤。然后，如6.27節(jié)的例子中所述，把這些圓盤裝到載體上。干的、被承載的、抗AFP的墊用AFP校準(zhǔn)物A、C和F(IGEN公司)充滿，并且在試驗(yàn)臺(tái)頂上在室溫被溫育15分鐘。溫育后，所承載的電極用去離子水流沖洗10秒鐘，之后，用無纖維屑的拭子吸干。然后，原纖維墊用附著到用衍生的TAG 1(IGEN公司)標(biāo)記的抗體上的抗AFP抗體充滿，并在試驗(yàn)臺(tái)頂上在室溫被溫育15分鐘。溫育后，所承載的電極用去離子水沖洗，并用拭子弄干。之后，原纖維墊用IGEN測(cè)定緩沖劑充滿，并如6.27節(jié)的例子中所述的那樣被判讀。
6.29、在聚丙烯酰胺表面上的TAG 1標(biāo)記的抗生物素蛋白的ECL檢測(cè)用眾所周知的條件(用過硫酸銨和TEMED引發(fā))，通過共聚合丙烯酰胺、雙-丙烯酰胺和N-丙烯酰-N′-生物素基-3，6-二氧雜辛烷-1，9-二胺(生物素通過三(乙二醇)接頭物與丙烯酰胺部分連接)，制備含有共價(jià)結(jié)合的生物素的交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，三種單體物質(zhì)的濃度分別為2.6M、0.065M和0.023M(報(bào)道過丙烯酰胺和雙-丙烯酰胺的這些濃度會(huì)導(dǎo)致孔尺寸小于絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的凝膠)。在保持分開大約0.7mm的距離的兩個(gè)玻璃板之間含有上述那些單體的溶液的聚合導(dǎo)致形成具有同樣厚度的厚片凝膠。在完成聚合反應(yīng)后，使凝膠在更換四次的PBS中浸濕，清洗掉未結(jié)合的生物素。通過使凝膠在含有處于PBS中的濃度為50μg/mL的蛋白質(zhì)的溶液中浸濕20分鐘，使得用衍生的TAG 1標(biāo)記的抗生物素蛋白(這里，抗生物素蛋白是指NeutrAvidin，用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)中的是設(shè)計(jì)用來展示還原了的NSB的一種改性抗生物素蛋白)結(jié)合到所述凝膠的表面。之后，通過使凝膠在更換四次的ECL測(cè)定緩沖劑(200mM的磷酸鈉、100mM的三丙胺、0.02％(w/v)吐溫20，pH值7.2)中浸濕，清洗掉過量的、TAG 1標(biāo)記的抗生物素蛋白。如圖39所示，然后把凝膠(3900)放置得與在一個(gè)玻璃載體(3903)上成圖案的金工作電極(3901)和反電極(3902)接觸。使在兩個(gè)電極之間的電壓以500mV/秒的速率從0.0V到3.0V呈直線上升并再回到0.0V，這導(dǎo)致ECL光信號(hào)，從放在凝膠上面的一個(gè)PMT(3904)測(cè)量該ECL光信號(hào)(圖40)。不包括含有丙烯酰胺衍生物的生物素而制備的凝膠沒有ECL信號(hào)(圖41)。含有生物素的聚合物所得到的信號(hào)表明，幾乎是一個(gè)完全的蛋白質(zhì)的單層存在于凝膠的表面上。
6.30、在聚丙烯酰胺表面上的ECL夾層免疫測(cè)定如6.29節(jié)的例子中所述的那樣制備含有共價(jià)結(jié)合的生物素的、交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠。鏈霉抗生物素蛋白吸收到凝膠的表面上，以便形成能俘獲生物素標(biāo)記的物質(zhì)。用一種溶液處理上述表面，這種溶液含有三丙胺、未知濃度的被分析物、抵抗所述被分析物的生物素標(biāo)記的抗體以及抵抗所述被分析物的一種不同的ECL TAG 1標(biāo)記的抗體。存在有上述被分析物導(dǎo)致形成一種被分析物和上述兩種抗體的復(fù)合物，這兩種抗體然后被俘獲在鏈霉抗生物素蛋白表面上。如6.29節(jié)的例子中所述的那樣測(cè)量與存在于上述表面上的次級(jí)抗體結(jié)合了的ECL標(biāo)記物。
6.31、在承載于電極上的聚丙烯酰胺表面上的多ECL夾層免疫測(cè)定按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影的光刻膠底板制備成安置成陣列的圓形凹陷的圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD184的固化劑的10∶1的混合物倒到底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。所得到的彈性印記通過暴露于含有以羥基為末端的在乙醇中的硫醇HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH(1至10mM)的溶液而被“涂墨”，并被使得與一個(gè)對(duì)準(zhǔn)的金底片接觸，而后被去除。用含有硫醇HS-(CH2)10-CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗上述底片幾秒鐘。之后，所得到的表面用乙醇清洗并用氮?dú)饬鞲稍铩Ｓ煤性诙橹械南┍Ｂ群腿野返娜芤禾幚肀砻鎸?dǎo)致以羥基為末端的區(qū)域用丙烯酸基團(tuán)官能化。之后，使含有丙烯酰胺、雙-丙烯酰胺、N-丙烯酰琥珀酰亞胺、偶氮-雙-氰基戊酸以及有氨基的抗體的混合物的毛細(xì)管陣列與對(duì)準(zhǔn)的表面接觸，該對(duì)準(zhǔn)的表面使毛細(xì)管與以丙烯酸為末端的一些區(qū)域?qū)?zhǔn)，以便把含有特異性抗體的預(yù)聚物溶液放在每個(gè)區(qū)域處。上述毛細(xì)管陣列中的每個(gè)毛細(xì)管含有對(duì)所感興趣的一種不同的被分析物特異性的抗體。使成圖案的預(yù)聚物液滴暴露于紫外光照射，導(dǎo)致在上述底片上形成交聯(lián)的凝膠，每塊交聯(lián)的凝膠在表面上給出一個(gè)結(jié)合區(qū)域。通過用一些被分析物的混合物處理上述底片進(jìn)行測(cè)定，所述這些被分析物能在一種緩沖過的溶液中結(jié)合在存在于上述凝膠表面上的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域處，這種緩沖過的溶液含有三丙胺和ECL-TAG 1標(biāo)記的次級(jí)抗體。然后，用圖42A至圖42B所示，把結(jié)合區(qū)域(4200，4201，4202)(在處于金電極(4232)上的聚丙烯酰胺液滴(4203)上)放置得緊靠ITO工作電極(4204)。從上述那些結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)所發(fā)射的光用CCD攝像機(jī)(4205)定量，并與用包含在樣品溶液中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合區(qū)域比較。
6.32、在承載于電極上的聚丙烯酰胺表面上的多ECL競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影了的光刻膠底板制備成安置成陣列的圓形凹陷的圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1的混合物倒到底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。所得到的彈性印記通過暴露于含有以羥基為末端的在乙醇中的硫醇HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH(1至10mM)的溶液而被“涂墨”，并被使得與一個(gè)對(duì)準(zhǔn)的金底片接觸，而后被去除。用含有硫醇HS-(CH2)10-CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗上述底片幾秒鐘。之后，所得到的表面用乙醇清洗并用氮?dú)饬鞲稍?。用含有在二烷中的烯丙酰氯和三乙胺的溶液處理表面?dǎo)致以羥基為末端的區(qū)域用丙烯酸基團(tuán)官能化。之后，使含有丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N-丙烯酰琥珀酰亞胺、偶氮-雙-氰基戊酸以及抗體混合物的毛細(xì)管陣列與對(duì)準(zhǔn)的表面接觸，這對(duì)準(zhǔn)的表面使毛細(xì)管與以丙烯酸為末端的一些區(qū)域?qū)?zhǔn)，以便把含有特異性抗體的預(yù)聚物溶液放在每個(gè)區(qū)域處。上述毛細(xì)管陣列中的那些毛細(xì)管含有對(duì)所感興趣的不同被分析物特異性的抗體。使成圖案的預(yù)聚物液滴暴露于紫外光照射，導(dǎo)致在上述底片上形成交聯(lián)的凝膠，每塊交聯(lián)的凝膠在表面上給出一個(gè)結(jié)合區(qū)域。通過用一些被分析物的混合物處理上述底片進(jìn)行測(cè)定，所述這些被分析物能在一種緩沖過的溶液中結(jié)合在存在于上述凝膠表面上的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域處，這種緩沖過的溶液含有三丙胺和ECL-TAG 1標(biāo)記的上述被分析物的類似物(也就是說，確立ECL-TAG 1標(biāo)記的和未標(biāo)記的被分析物對(duì)于與上述那些結(jié)合區(qū)域結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng))。然后，如圖42所示，把結(jié)合區(qū)域(4200，4201和4202)(在處于金電極(4232)上的聚丙烯酰胺液滴(4203)上)放置得緊靠ITO工作電極(4204)。從上述那些結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)所發(fā)射的光用一個(gè)CCD攝像機(jī)(4205)定量，并與用于包含在樣品溶液中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)合區(qū)域比較。
6.33、用于結(jié)合在承載于電極上的聚丙烯酰胺表面上的細(xì)胞的多ECL測(cè)定按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影了的光刻膠底板制備成安置成陣列的圓形凹陷的圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1的混合物倒到底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。所得到的彈性印記通過暴露于含有以羥基為末端的在乙醇中的硫醇HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH(1至10mM)的溶液而被“涂墨”，并被使得與一個(gè)對(duì)準(zhǔn)的金底片接觸，而后被去除。用含有硫醇HS-(CH2)10-CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗上述底片幾秒鐘。之后，所得到的表面用乙醇清洗并用氮?dú)饬鞲稍?。用含有在二烷中的烯丙酰氯和三乙胺的溶液處理表面?dǎo)致以羥基為末端的區(qū)域用丙烯酸基團(tuán)官能化。之后，使含有丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N-丙烯酰琥珀酰亞胺、偶氮-雙-氰基戊酸、以及針對(duì)細(xì)胞表面的抗體的混合物的毛細(xì)管陣列與對(duì)準(zhǔn)的表面接觸，這對(duì)準(zhǔn)的表面使毛細(xì)管與以丙烯酸為末端的一些區(qū)域?qū)?zhǔn)，以便把預(yù)聚物溶液放在每個(gè)區(qū)域處。使成圖案的預(yù)聚物液滴受到紫外光照射，導(dǎo)致在上述底片上形成交聯(lián)的凝膠，每塊交聯(lián)的凝膠在表面上給出一個(gè)結(jié)合區(qū)域。通過首先用細(xì)胞的懸浮液處理結(jié)合區(qū)域，之后用一些結(jié)合試劑的混合物處理所述結(jié)合區(qū)域來進(jìn)行測(cè)定，所述那些結(jié)合試劑能結(jié)合在一種緩沖過的溶液中與凝膠表面結(jié)合的一種或多種細(xì)胞，所述這種緩沖過的溶液含有三丙胺和ECL-TAG 1標(biāo)記的次級(jí)抗體和/或?qū)Ρ环治鑫锾禺愋缘钠渌Y(jié)合試劑。然后，如圖42所示，把結(jié)合區(qū)域(4200，4201，和4202)(在處于金電極(4232)上的聚丙烯酰胺液滴(4203)上)放置得緊靠ITO工作電極(4204)。從上述那些結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)所發(fā)射的光用一個(gè)CCD攝像機(jī)(4205)定量，并與從用于包含在樣品溶液中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣的發(fā)射的光比較。
6.34、用于將被分析物結(jié)合到在承載于電極上的聚丙烯酰胺表面上的細(xì)胞的多ECL測(cè)定按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影了的光刻膠底板制備成安置成陣列的圓形凹陷的圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1的混合物倒到底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。所得到的彈性印記通過暴露于含有以羥基為末端的在乙醇中的硫醇HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH(1至10mM)的溶液而被“涂墨”，并被使得與一個(gè)對(duì)準(zhǔn)的金底片接觸，而后被去除。用含有硫醇HS-(CH2)10-CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗上述底片幾秒鐘。之后，所得到的表面用乙醇清洗并用氮?dú)饬鞲稍?。用含有在二烷中的烯丙酰氯和三乙胺的溶液處理表面?dǎo)致以羥基為末端的區(qū)域用丙烯酸基團(tuán)官能化。之后，使含有丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N-丙烯酰琥珀酰亞胺、偶氮-雙-氰基戊酸以及細(xì)胞的混合物的毛細(xì)管陣列與對(duì)準(zhǔn)的表面接觸，這對(duì)準(zhǔn)的表面使毛細(xì)管與以丙烯酸為末端的一些區(qū)域?qū)?zhǔn)，以便把含有特異細(xì)胞類型的預(yù)聚物溶液放在每個(gè)區(qū)域處。使成圖案的預(yù)聚物液滴受紫外光照射，導(dǎo)致在上述底片上形成交聯(lián)的凝膠，每塊交聯(lián)的凝膠在表面上給出一個(gè)結(jié)合區(qū)域。通過用含有被分析物混合物的樣品處理凝膠進(jìn)行測(cè)定，所述這些被分析物能在一種緩沖過的溶液中結(jié)合到存在于上述凝膠表面上的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域處，這種緩沖過的溶液含有三丙胺和ECL-TAG 1標(biāo)記的抗體和/或?qū)ι鲜霰环治鑫锾禺愋缘钠渌Y(jié)合試劑。然后，如圖42所示，把結(jié)合區(qū)域(4200，4201，和4202)(在處于金電極(4232)上的聚丙烯酰胺液滴(4203)上)放置得緊靠ITO工作電極(4204)。從上述那些結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)所發(fā)射的光用CCD掇像機(jī)(4205)定量，并與從用于包含在樣品溶液中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)合區(qū)域發(fā)射的光比較。
6.35、在承載于電極上的聚丙烯酰胺表面上的多ECL競(jìng)爭(zhēng)性雜交測(cè)定按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影了的光刻膠底板制備成安置成陣列的圓形凹陷的圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1的混合物倒到底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。所得到的彈性印記通過暴露于含有以羥基為末端的在乙醇中的硫醇HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH(1至10mM)的溶液而被“涂墨”，并被使得與一個(gè)對(duì)準(zhǔn)的金底片接觸，而后被去除。用含有硫醇HS-(CH2)10-CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗上述底片幾秒鐘。之后，所得到的表面用乙醇清洗并用氮?dú)饬鞲稍?。用含有在? 烷中的烯丙酰氯和三乙胺的溶液處理表面導(dǎo)致以羥基為末端的區(qū)域用丙烯酸基團(tuán)官能化。之后，使含有丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N-丙烯酰琥珀酰亞胺、偶氮-雙-氰基戊酸、以及用氨基官能化了的核酸探針的混合物的毛細(xì)管陣列與對(duì)準(zhǔn)的表面接觸，這對(duì)準(zhǔn)的表面使毛細(xì)管與以丙烯酸為末端的一些區(qū)域?qū)?zhǔn)，以便把含有特異性探針的預(yù)聚物溶液放在每個(gè)區(qū)域處。上述毛細(xì)管陣列中的毛細(xì)管含有對(duì)所感興趣的核酸序列特異的探針。使成圖案的預(yù)聚物液滴受到紫外光照射，導(dǎo)致在上述底片上形成交聯(lián)的凝膠，每塊交聯(lián)的凝膠在表面上給出一個(gè)結(jié)合區(qū)域。通過用樣品混合物處理上述底片來進(jìn)行測(cè)定，該樣品混合物可含有能在一種緩沖過的溶液中結(jié)合在存在于上述凝膠表面上的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域處的一些序列，所述這種緩沖過的溶液含有三丙胺和可與用于結(jié)合到上述表面上的所感興趣的被分析物競(jìng)爭(zhēng)的ECL-TAG 1標(biāo)記的一些序列。然后，如圖42所示，把結(jié)合區(qū)域(4200，4201，和4202)(在處于金電極(4232)上的聚丙烯酰胺液滴(4203)上)放置得緊靠ITO工作電極(4204)。從上述那些結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)所發(fā)射的光用CCD攝像機(jī)(4205)定量，并與從用于包含在樣品溶液中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)合區(qū)域發(fā)射的光比較。
6.36、在承載于電極上的聚丙烯酰胺表面上的多ECL雜交夾層測(cè)定按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影了的光刻膠底板制備成安置成陣列的圓形凹陷的圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1的混合物倒到底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。所得到的彈性印記通過暴露于含有以羥基為末端的在乙醇中的硫醇HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH(1至10mM)的溶液而被“涂墨”，并被使得與一個(gè)對(duì)準(zhǔn)的金底片接觸，而后被去除。用含有硫醇HS-(CH2)10-CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗上述底片幾秒鐘。之后，所得到的表面用乙醇清洗并用氮?dú)饬鞲稍?。用含有在二烷中的烯丙酰氯和三乙胺的溶液處理表面?dǎo)致以羥基為末端的區(qū)域用丙烯酸基團(tuán)官能化。之后，使含有丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N-丙烯酰琥珀酰亞胺、偶氮-雙-氰基戊酸以及用氨基官能化的核酸探針的混合物的毛細(xì)管陣列與對(duì)準(zhǔn)的表面接觸，這對(duì)準(zhǔn)的表面使毛細(xì)管與以丙烯酸為末端的一些區(qū)域?qū)?zhǔn)，以便把含有特異性探針的預(yù)聚物溶液放在每個(gè)區(qū)域處。上述毛細(xì)管陣列的毛細(xì)管含有對(duì)所感興趣的核酸序列特異的探針。使成圖案的預(yù)聚物液滴受到紫外光照射，導(dǎo)致在上述底片上形成交聯(lián)的凝膠，每塊交聯(lián)的凝膠在表面上給出一個(gè)結(jié)合區(qū)域。通過用樣品混合物處理上述底片來進(jìn)行測(cè)定，該樣品混合物可含有能在一種緩沖過的溶液中結(jié)合在存在于上述凝膠表面上的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域的一些序列，所述這種緩沖過的溶液含有三丙胺以及一些ECL-TAG 1標(biāo)記的序列，這些ECL-TAG 1標(biāo)記的序列可結(jié)合在一些序列處的被分析物，這些序列并不互補(bǔ)于結(jié)合于表面的那些探針。然后，如圖22所示，把結(jié)合區(qū)域(4200，4201，和4202)(在處于金電極(4232)上的聚丙烯酰胺液滴(4203)上)放置得緊靠ITO工作電極(4204)。從上述那些結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)所發(fā)射的光用CCD攝像機(jī)(4205)定量，并與從用于包含在樣品溶液中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)合區(qū)域發(fā)射的光比較。
6.37、在承載于電極上的聚丙烯酰胺表面上的不同類型的多種測(cè)定按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影了的光刻膠底板制備成安置成陣列的圓形凹陷的圖案。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1的混合物倒到底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。所得到的彈性印記通過暴露于含有以羥基為末端的在乙醇中的硫醇HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH(1至10mM)的溶液而被“涂墨”，并被使得與一個(gè)對(duì)準(zhǔn)的金底片接觸，而后被去除。用含有硫醇HS-(CH2)10-CH3(在乙醇中1至10mM)的溶液清洗上述底片幾秒鐘。之后，所得到的表面用乙醇清洗并用氮?dú)饬鞲稍?。用含有在二烷中的烯丙酰氯和三乙胺的溶液處理表面?dǎo)致以羥基為末端的區(qū)域用丙烯酸基團(tuán)官能化。之后，使含有丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N-丙烯酰琥珀酰亞胺、偶氮-雙-氰基戊酸、以及在6.31節(jié)至6.36節(jié)的那些例子中所述的任何結(jié)合試劑的混合物的毛細(xì)管陣列與對(duì)準(zhǔn)的表面接觸，這對(duì)準(zhǔn)的表面使毛細(xì)管與以丙烯酸為末端的一些區(qū)域?qū)?zhǔn)，以便把含有特異性探針的預(yù)聚物溶液放在每個(gè)區(qū)域處。上述毛細(xì)管陣列的每個(gè)毛細(xì)管含有對(duì)所感興趣的被分析物特異的一些結(jié)合區(qū)域。使成圖案的預(yù)聚物液滴受到紫外光照射，導(dǎo)致在上述底片上形成交聯(lián)的凝膠，每塊交聯(lián)的凝膠在表面上給出一個(gè)結(jié)合區(qū)域。通過用樣品混合物處理上述底片來進(jìn)行測(cè)定，該樣品混合物可含有能在一種緩沖過的溶液中結(jié)合在存在于上述凝膠表面上的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)域處的被分析物，所述這種緩沖過的溶液含有三丙胺以及與用于結(jié)合到上述結(jié)合區(qū)域的被分析物競(jìng)爭(zhēng)的ECL-TAG 1標(biāo)記的被分析物的類似物和/或?qū)τ谒信d趣的被分析物的ECL-TAG 1標(biāo)記的輔助的結(jié)合試劑。然后，如圖22所示，把結(jié)合區(qū)域(4200，4201，和4202)(在處于金電極(4232)上的聚烯酰胺液滴(4203)上)放置得緊靠ITO工作電極(4204)。從上述那些結(jié)合區(qū)域的每一個(gè)所發(fā)射的光用CCD攝像機(jī)(4205)定量，并與從用于包含在樣品溶液中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)合區(qū)域發(fā)射的光比較。
6.38、高度可逆的ECL用0.5μm和0.03μm的剛玉軟膏用手順序拋光，隨后通過用1∶3的H2O2/H2SO4化學(xué)刻蝕以及在H2SO4的稀釋液中在對(duì)于Ag/AgCl-0.2V和1.7V之間的電化學(xué)循環(huán)，來清潔多晶金電極(由Bio-AnalylicalServices可得到，2mm2)。之后，使清潔的電極浸沒在溶解在乙醇中的辛基硫醇(C8SH)的稀釋溶液中過夜。通過用20μl溶解在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，0.15M NaCl/0.1M NaPi，pH值7.2)中的TAG 1標(biāo)記的牛血清蛋白質(zhì)(BSA)覆蓋C8SH改性的電極，并在溫育10分鐘后用同樣的緩沖劑徹底清洗表面，進(jìn)行蛋白質(zhì)的吸收。
在具有Ag/AgCl參考電極、白金線反電極、和EG & G 283穩(wěn)壓器的三電極的元件中進(jìn)行ECL。用放在電化學(xué)元件的底部處的PacificInstruments的光度計(jì)和Hamamatsu光電倍增管測(cè)量光強(qiáng)。使吸附了蛋白質(zhì)的電極浸沒在0.1 M的TPA和0.2M的磷酸鹽、pH值為7.2的溶液中。如圖44A所示，當(dāng)電位在0.0V和1.2V之間周期性變化時(shí)，觀察到高度可逆的ECL響應(yīng)(基本上類似于向前和向后掃描的強(qiáng)度，這表明了ECL過程的可逆性和在電極上的硫醇和蛋白質(zhì)層的穩(wěn)定性。
在與用于ECL相同的儀器上進(jìn)行周期性的伏安測(cè)量實(shí)驗(yàn)，但不用PMT和光度計(jì)。在此實(shí)驗(yàn)中，把一個(gè)C8SH覆蓋的電極(無蛋白質(zhì))放在1mM的鐵氰化鉀(在PBS中)的溶液中，并從+0.5V到1.2V來回掃過所述電極，隨后接著另一個(gè)在+0.5V和-0.3V之間的循環(huán)。結(jié)果表明單層仍就是未受觸動(dòng)，并且在1.2V時(shí)不吸收，這是由于在+0.5V和-0.3V之間的伏安記錄中只有電容性電流而沒有鐵氰化物的感應(yīng)電流(圖44B)。
6.39、準(zhǔn)可逆的ECL如上述同樣的方式進(jìn)行電極改性和蛋白質(zhì)吸收。在ECL實(shí)驗(yàn)中，電位在0.0V和1.5V之間掃描，并記錄相應(yīng)的光強(qiáng)。如圖45A所示，在同一周期的向前和向后的掃描之間有一些ECL的損失，在不同的兩個(gè)周期之間也有一些ECL的損失。在1.5V時(shí)氧化后，在鐵氰化物中的硫醇/金的周期性伏安記錄表明了顯著的感應(yīng)電流的量，這表明在1.5V時(shí)硫醇單層的至少是局部的吸收(圖45B)。
6.40、不可逆的ECL在這些實(shí)驗(yàn)中，以和6.38節(jié)的例子中相同的方式進(jìn)行電極改性和蛋白質(zhì)吸收。為測(cè)量ECL，使電位從頭到尾掃描一直到2.0V并返回到0.0V。對(duì)向前的掃描觀察到強(qiáng)光(比在6.38節(jié)的例子中的可逆情況下觀察到更多的光)，但如圖46A所示，它降落到逆向掃描的背景上。在2.0V時(shí)氧化后，在鐵氰化物中的改性的電極的周期性的伏安記錄表明絕大多數(shù)的硫醇單層解除吸附。
6.41、利用固定在成圖案的金電極上的初級(jí)抗體的ECL夾層免疫測(cè)定在這個(gè)例子中，把對(duì)衰竭特異性抗原(PSA)的抗體固定在成圖案的金電極上，用于對(duì)PSA的免疫測(cè)定。
按照眾所周知的方法把1微米至2微米厚的已曝光且顯影了的光刻膠底板制備成在一個(gè)硅載體上的一層光刻膠，這個(gè)硅載體具有一個(gè)去除了光刻膠的、1mm×1mm的補(bǔ)片。把SYLGARD硅酮彈性體184和相應(yīng)的SYLGARD 184的固化劑的10∶1的混合物倒到底板上并固化。小心地從硅底板上去除聚合了的SYLGARD 184。所得到的彈性“印記”通過使其暴露于含有在乙醇中的、以羥基為末端的HS-(CH2)11(OCH2CH2)3-OH和以次氮基三乙酸(NTA)為末端的硫醇HS-(CH2)11(OCH2CH2)3OC(O)NH(CH2)4CH(CO2H)N(CH2CO2H)2的溶液而被“涂墨”。使“涂墨的”印記接觸金底片并被去除，以便形成1mm×1mm的SAM。用只含有在乙醇中的以羥基為末端的硫醇的溶液清洗上述底片幾秒鐘，以防止蛋白質(zhì)與在帶有印記的特征外邊的區(qū)域非特異性地結(jié)合。之后，用乙醇清洗所得到的表面并用氮?dú)饬鞲稍?。用NiCl2的溶液處理上述表面，隨后再用含有給出抗PSA老鼠單克隆和肽(His)6的結(jié)合部位的融合蛋白標(biāo)記物的溶液處理該表面，這導(dǎo)致上述融合蛋白標(biāo)記物以一種可控制的方式固定在所述表面上。這個(gè)過程產(chǎn)生了可再現(xiàn)的和預(yù)定量的固定在上述表面上的蛋白質(zhì)。通過把(His)6序列定位在上述融合蛋白標(biāo)記物的原始結(jié)構(gòu)上，控制蛋白質(zhì)在所述表面上的取向。通過以NEA為末端的硫醇與在帶有印記的SAM中的以羥基為末端的硫醇的比例，并通過帶有印記的特征的表面積，控制固定了的蛋白質(zhì)的絕對(duì)量。通過制備含有在血清中的已知濃度的PSA(濃度范圍為1fM到1μM)的溶液，確定對(duì)于PSA的校準(zhǔn)曲線。如上所述制備的大量的表面用PSA校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣處理，然后用含有最佳濃度的抗PSA(用標(biāo)記物1的衍生物標(biāo)記的)次級(jí)抗體的溶液處理。通過使上述那些表面浸沒在含有0.1M的TPA和0.2M的磷酸鹽的溶液(pH值為7.2)中，并當(dāng)在金表面處的電位在0.0V和2.0V之間以0.5V/秒的掃描速率周期性變化時(shí)測(cè)量所發(fā)射的光的峰值強(qiáng)度，這樣來確定校準(zhǔn)曲線。用同樣的步驟，只是通過參考上述校準(zhǔn)曲線從峰值ECL信號(hào)來計(jì)算PSA的濃度，進(jìn)行確定樣品中的血清里的未知濃度的PSA的工作。
7、結(jié)合參考文獻(xiàn)本發(fā)明并不限定于此處所述的那些特定的實(shí)施例所確定的范圍。的確，由上述說明和附圖，除了此處所述的那些改進(jìn)之外的本發(fā)明的各種改進(jìn)對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說會(huì)變得顯而易見。打算使這樣的一些改進(jìn)處于權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。此處所引用的各種出版物所公開的內(nèi)容整個(gè)作為參考而被引用。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)雜交反應(yīng)的方法，其包括(a)形成一種包含第一核酸、第二核酸和標(biāo)記的組合物，其中所述第二核酸通過接頭物固定在電極上，并且其中所述標(biāo)記(i)與所述第一或第二核酸連接，或其中所述標(biāo)記是(ii)一種核酸嵌入劑；(b)測(cè)量所述標(biāo)記與所述電極之間的電子傳遞以確定所述第一核酸是否已與所述第二核酸雜交，其中所述接頭物(i)具有小于10個(gè)原子的長(zhǎng)度；(ii)是傳導(dǎo)性接頭物；和/或(iii)包括聚乙炔。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述標(biāo)記與所述電極之間的電子傳遞通過阻抗測(cè)量方法進(jìn)行測(cè)量。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述標(biāo)記與所述電極之間的電子傳遞通過電化學(xué)發(fā)光測(cè)量方法進(jìn)行測(cè)量。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二核酸是固定在金電極上的5′硫醇化的DNA。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二核酸通過長(zhǎng)度小于10個(gè)原子的接頭物與所述電極連接。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二核酸通過傳導(dǎo)性接頭物與所述電極連接。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述傳導(dǎo)性接頭物包括聚乙炔。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述電極包括一種混合的單層，且所述混合單層的至少一種成分促進(jìn)電位的傳遞。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述標(biāo)記連接到所述第一核酸。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述標(biāo)記連接到所述第二核酸。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述標(biāo)記是核酸嵌入劑。
12.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括區(qū)分產(chǎn)生完全互補(bǔ)雙鏈的雜交反應(yīng)和產(chǎn)生部分互補(bǔ)雙鏈的雜交反應(yīng)的步驟。
13.一種檢測(cè)或測(cè)量具有第一核酸鏈和第二核酸鏈的雙鏈核酸中雜交程度的方法，其包括測(cè)量標(biāo)記和電極之間的電子傳遞，其中所述第二核酸鏈固定在所述電極上，并且所述標(biāo)記(i)與所述第一核酸鏈或所述第二核酸鏈連接，或(ii)是一種核酸嵌入劑，其中所述電子傳遞與所述第一核酸鏈和所述第二核酸鏈之間的互補(bǔ)性程度相關(guān)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述標(biāo)記與所述電極之間的電子傳遞通過阻抗測(cè)量方法進(jìn)行測(cè)量。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述標(biāo)記與所述電極之間的電子傳遞通過電化學(xué)發(fā)光測(cè)量方法進(jìn)行測(cè)量。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述第二核酸是固定在金電極上的5′硫醇化的DNA。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述第二核酸通過長(zhǎng)度小于10個(gè)原子的接頭物與所述電極連接。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述第二核酸鏈通過傳導(dǎo)性接頭物與所述電極連接。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述傳導(dǎo)性接頭物包括聚乙炔。
20.權(quán)利要求13的方法，其中所述電極包括一種混合的單層，且所述混合單層的至少一種成分促進(jìn)電位的傳遞。
21.權(quán)利要求13的方法，其中所述標(biāo)記連接到所述第一核酸。
22.權(quán)利要求13的方法，其中所述標(biāo)記連接到所述第二核酸。
23.權(quán)利要求13的方法，其中所述標(biāo)記是核酸嵌入劑。
24.權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括區(qū)分產(chǎn)生完全互補(bǔ)雙鏈的雜交反應(yīng)和產(chǎn)生部分互補(bǔ)雙鏈的雜交反應(yīng)的步驟。
25.一種通過雜交反應(yīng)檢測(cè)核酸的方法，其包括(a)形成一種包括第一核酸和第二核酸的組合物，其中所述第二核酸固定在電極上并且附著于標(biāo)記；(b)測(cè)量所述標(biāo)記與所述電極之間的電子傳遞以確定所述第一核酸是否已與所述第二核酸雜交。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述標(biāo)記與所述電極之間的電子傳遞通過阻抗測(cè)量方法進(jìn)行測(cè)量。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述標(biāo)記與所述電極之間的電子傳遞通過電化學(xué)發(fā)光測(cè)量方法進(jìn)行測(cè)量。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述第二核酸是固定在所述電極上的5′硫醇化的DNA。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述電極是金電極。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述第二核酸通過長(zhǎng)度小于10個(gè)原子的接頭物與所述電極連接。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述第二核酸通過傳導(dǎo)性接頭物與所述電極連接。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述傳導(dǎo)性接頭物包括聚乙炔。
33.權(quán)利要求25的方法，其中所述電極包括一種混合的單層，且所述混合單層的至少一種成分促進(jìn)電位的傳遞。
34.權(quán)利要求25的方法，其中所述標(biāo)記共價(jià)附著到所述第二核酸。
35.權(quán)利要求25的方法，其中所述標(biāo)記非共價(jià)附著到所述第二核酸。
36.權(quán)利要求25的方法，其中所述標(biāo)記嵌入所述第二核酸。
全文摘要
提供了用于產(chǎn)生成圖案的、多陣列、多特異性表面的材料和方法，所述表面可用電子激發(fā)而用于基于電化學(xué)發(fā)光的檢驗(yàn)。提供了用于化學(xué)和/或物理控制導(dǎo)電區(qū)域及試劑沉積的材料和方法，所述化學(xué)和/或物理控制導(dǎo)電區(qū)域及試劑沉積用于平板顯示器以及多特異性檢驗(yàn)方法。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1661115SQ200510005720
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期1996年3月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月10日
發(fā)明者J·沃爾斯塔德特爾, J·維爾布爾, G·思加爾, M·馬爾丁, L·H·古奧, A·弗斯徹爾, J·勒蘭德 申請(qǐng)人:梅索磅秤技術(shù)有限公司