專利名稱：一種適用于牛結(jié)核抗體檢測(cè)的試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)菌學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種適用于牛結(jié)核抗體檢測(cè)的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
牛結(jié)核病是一種由牛分枝桿菌引起的慢性消耗性人畜共患病，被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)定為B類動(dòng)物傳染病。2001年和2002年的部分統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明我國(guó)個(gè)別省市奶牛結(jié)核病陽(yáng)性率高達(dá)10％以上。牛結(jié)核病的防制主要是采用牛提純結(jié)核菌素進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)檢疫，對(duì)檢出的陽(yáng)性牛進(jìn)行隔離或撲殺，從源頭上杜絕疾病傳播。但是由于牛提純結(jié)核菌素成分復(fù)雜，其特異性受其他非致病性分枝桿菌影響而出現(xiàn)假陽(yáng)性，同時(shí)敏感性也較低，其診斷結(jié)果可信度不高，使“檢疫-撲殺”政策的實(shí)施效果大打折扣。目前國(guó)際上診斷試劑的研究趨勢(shì)是使用成分明確的抗原蛋白代替PPD進(jìn)行牛結(jié)核病診斷(Pollock JM等，Tuberculosis，2001，81(1/2)65-69)。MPB70是牛分枝桿菌特異性分泌蛋白質(zhì)，因其相對(duì)遷移率為0.7而得名(Harboe M等Infect Immun，1986，52(1)293-302)，分泌量占毒力牛分枝桿菌培養(yǎng)基蛋白總量10％，是牛分枝桿菌感染過(guò)程中重要的體液和細(xì)胞免疫目標(biāo)抗原(Harboe M等，Am Rev Resp Dis，1984，129444-452)也是PPD的主要成分之一。MPB70最初由Nagai等人從BCG Tokyo 172株的培養(yǎng)基中純化得到，通過(guò)SDS-PAGE測(cè)得分子量為18kD(Nagai S等Infect Immun，1981，31(3)1152-1160.)。其基因序列1989年被測(cè)定，推測(cè)出其蛋白序列有一個(gè)含30個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，成熟蛋白質(zhì)有163個(gè)氨基酸(Terasaka K等，Complete nucleotide sequence of immunogenic protein MPB70 fromMycobacterium bovis BCG，F(xiàn)EMS Microbiol Lett，1989，49(2-3)273-276具有熱穩(wěn)定性，等電點(diǎn)為4.8。Hewinson等人第一次在大腸桿菌中使用MPB70自身起始密碼子進(jìn)行了MPB70的異源表達(dá)，結(jié)果觀察到了26kD和22kD兩種分子量的MPB70蛋白質(zhì)，22kD蛋白大量存在于細(xì)胞周質(zhì)中，因此推測(cè)26kD是信號(hào)肽未剪切產(chǎn)物(Hewinson RG，等J Gen Microbiol，1993，139(6)1253-1259)。在BCG Tokyo和Moreau亞株之外的其他亞株中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MPB70所存在或僅微量表達(dá)(Miura K等，Infect Immun，1983，39(2)540-545)，在結(jié)核分枝桿菌中也僅微量表達(dá)(Wiker HG等，J.Immunol，1996，43374-380)。對(duì)PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性牛中分離出的49株環(huán)境分枝桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，包括禽結(jié)核、副結(jié)核在內(nèi)的各種分枝桿菌中無(wú)一含有MPB70蛋白質(zhì)(Hughes MS等，Veterinary Microbiology，2005，108101-112)。MPB70在各分枝桿菌菌株間表達(dá)量的差異主要是由于Sigma因子(SigK基因)起始密碼子的一個(gè)點(diǎn)突變引起(Charlet D等，Molecular Microbiology，2005，56(5)1302-1313)。
鑒于牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70的特性，利用該蛋白研制出快速、準(zhǔn)確、安全、廉價(jià)的診斷試劑盒，將為牛結(jié)核病的防制和消滅提供有效工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，制備一種適用于牛結(jié)核抗體檢測(cè)的試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)建立間接血凝方法，制備出一種特異性好、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)牛結(jié)核病的抗體的試劑盒，為我國(guó)牛結(jié)核病防制提供一種新型試劑盒和新方法。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明通過(guò)建立間接血凝方法，制備了一種適用于牛結(jié)核抗體檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的V形底96孔反應(yīng)板、牛結(jié)核分支桿菌野毒感染標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、健康牛陰性血清、血清稀釋液和1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液。其中牛結(jié)核分支桿菌野毒感染標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(診斷抗原)是利用牛分枝桿菌MPB70蛋白的重組大腸桿菌PHVO14Escherichia coliPHVO14，保藏在CCTCC，保藏編號(hào)CCTCC-M205135得到的。
其中的1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液是用牛分枝桿菌特異性抗原蛋白MPB70致敏的紅細(xì)胞，它是通過(guò)下列方法制備的將紅細(xì)胞懸液中加入等體積的抗原蛋白MPB70，經(jīng)水浴，攪拌；離心棄上清，用PBS洗滌2次，再用含1％兔血清的PBS洗滌一次，配成1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液，加入0.01％硫柳汞，分裝后放2-8℃保存，備用，即得到本發(fā)明所述的1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液。
(一)包含牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70基因的克隆及在重組大腸桿菌中表達(dá)的制備方法，它包括下列步驟(1)以牛型分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(Mycobacterium bovis AF2122/97，該菌株的基因序列已經(jīng)登錄Genebank，，登錄號(hào)為NC002945)細(xì)菌培養(yǎng)物加少量雙蒸水煮沸10min裂解菌體，離心后取上清液作為PCR模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到牛型分枝桿菌mpb70基因片段的cDNA序列；在原核表達(dá)載體pET-28a的EcoRI和HindIII多克隆位點(diǎn)中定向插入牛型分枝桿菌mpb70基因片段的cDNA序列，構(gòu)建得到原核表達(dá)載體pET-28a-mpb70；(2)將步驟(1)所說(shuō)的原核表達(dá)載體pET-28a-mpb70轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，用卡那霉素抗性篩選單個(gè)重組菌，誘導(dǎo)該菌株，得到特異表達(dá)牛型分枝桿菌mpb70蛋白；(3)純化步驟(2)所表達(dá)的MPB70蛋白，得到所需的診斷抗原。
(二)牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70表達(dá)純化的具體步驟
將酶切和序列鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3(購(gòu)自Stratagene公司)株，挑取50μg/mL的卡那霉素抗性平皿上的陽(yáng)性單菌落，加入含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中在37℃下劇烈振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600＝0.6-0.8)，向培養(yǎng)基中加入IPTG(異丙基-β-D硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，設(shè)置0.4mM和0.8mM兩個(gè)IPTG濃度梯度。37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別在誘導(dǎo)后第0、1、2、3小時(shí)取1mL細(xì)菌培養(yǎng)物，12000r/min離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗沉淀并用40uL重懸，加入50uL 2×SDS上樣緩沖液和10uL二硫蘇糖醇(DTT)，100℃煮沸10min，取20uL一定量進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯).分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第二版，北京，科學(xué)出版社，1992版)，觀察分析外源基因表達(dá)情況。誘導(dǎo)的菌體經(jīng)離心、超聲波破碎(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯).分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第二版，北京，科學(xué)出版社，1992版)后提取包涵體，經(jīng)純化、變性、復(fù)性處理(參見(jiàn)實(shí)施例)后分裝于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (三)牛結(jié)核抗體試劑盒的應(yīng)用(1)利用上述牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70蛋白建立間接血凝試驗(yàn)；(2)用步驟(1)所說(shuō)的方法制備用于牛結(jié)核病的抗體檢測(cè)試劑盒。
更詳細(xì)的技術(shù)方案如下所述(1)牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(Mycobacterium bovis AF2122/97，由湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局郭明星研究員惠贈(zèng)，該菌株的基因序列已經(jīng)登錄Genebank，，登錄號(hào)為NC002945)。本發(fā)明以牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(Mycobacterium bovis AF2122/97)基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到mpb70基因的cDNA，經(jīng)測(cè)序分析確定該mpb70基因的cDNA序列與Genebank公布的基因序列進(jìn)行比對(duì)，證明得到的基因序列如預(yù)期的基因序列大小一致參見(jiàn)附圖2。
(2)原核表達(dá)載體pET-28a-mpb70的構(gòu)建將牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70的cDNA序列定向插入到原核表達(dá)載體pET-28a(購(gòu)自invitrogen公司)的EcoRI和HindIII多克隆位點(diǎn)。
(3)重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-mpb70的構(gòu)建將步驟(2)所述的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選得到陽(yáng)性重組菌株。該菌株保藏在保藏在CCTCC，保藏日期2005年11月25日，保藏編號(hào)CCTCC-M205135。
(4)牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70蛋白基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化方法將上述步驟(3)所述的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-mpb70挑取單個(gè)菌落至LB培養(yǎng)基加卡那霉素至終濃度50μg/mL，37℃搖床培養(yǎng)12小時(shí)后放4℃冰箱過(guò)夜；用含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基將該菌液按1∶100比例稀釋后，分裝至細(xì)菌培養(yǎng)瓶中，置37℃搖床培養(yǎng)至OD600≈0.6，用0.4mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3小時(shí)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，誘導(dǎo)的菌體經(jīng)離心、超聲波破碎后提取包涵體，經(jīng)純化、變性、復(fù)性等處理后分裝于-20℃保存?zhèn)溆?。參照《分子克隆?shí)驗(yàn)指南》(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯).第二版，北京科學(xué)出版社，1992版)對(duì)純化的蛋白進(jìn)行斑點(diǎn)雜交分析，證實(shí)該重組大腸桿菌可以特異性地表達(dá)牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70，表達(dá)的蛋白以包涵體的形式存在大腸桿菌BL21中，且具有免疫學(xué)活性。
(5)牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70蛋白抗體檢測(cè)和牛結(jié)核病間接血凝診斷方法的建立與試劑盒的制備1)1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液的制備從步驟(4)中得到所述的包涵體中純化mpb70表達(dá)蛋白；用牛分枝桿菌特異性抗原蛋白MPB70致敏紅細(xì)胞，它是通過(guò)下列方法制備的，取制備好的含量為2.5％的紅細(xì)胞懸液中加入等體積的含量為100μg/ml的抗原蛋白MPB70，置37℃下水浴30分鐘，其間不斷攪拌，離心棄上清；用pH7.2的PBS懸浮血球，壓積離心洗滌2次；再用含1％正常兔血清PBS洗滌一次，最后用此液配成1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液，加入0.01％硫柳汞，分裝后放2-8℃保存、備用，即為本發(fā)明所述的1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液。
2)阿氏(簡(jiǎn)稱阿氏液參見(jiàn)何昭陽(yáng)等主編，《動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》長(zhǎng)春吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2002)紅細(xì)胞保存液的制備取葡萄糖2.05g，枸櫞酸鈉(Na3C6H507.2H2O)0.8g，枸櫞酸0.55g，NaCl0.42g，用蒸餾水定容到100毫升，在121℃滅菌15分鐘，置4度冰箱保存。
3)陰性對(duì)照血清的制備對(duì)經(jīng)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、細(xì)菌培養(yǎng)和PCR驗(yàn)證的健康牛進(jìn)行無(wú)菌采集血液，采得的血液于37℃靜置1h，4℃靜置過(guò)夜，分離血清；無(wú)菌過(guò)濾是在血清中加入0.01％疊氮鈉防腐，加入時(shí)充分搖勻。
4)陽(yáng)性對(duì)照血清的制備在奶牛場(chǎng)中經(jīng)皮試反應(yīng)初步篩選后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、PCR檢驗(yàn)確診的牛分枝桿菌感染的奶牛10頭，并通過(guò)病理剖檢和組織病理學(xué)證實(shí)其中8頭為典型的牛結(jié)核分枝桿菌重病牛，采集其血液制備成血清，該血清作為本試劑盒的陽(yáng)性血清對(duì)照樣品。
具體如下制備5)抗原稀釋液的制備PBS(磷酸鹽緩沖液)0.15mol/L pH7.2甲液 將磷酸氫二納配制成含量為0.15mol/L的溶液具體方法是取磷酸氫二納21.3g，加蒸餾水定容至1000ml。
乙液 將磷酸二氫鉀配制成含量為0.15mol/L溶液具體方法是取磷酸二氫鉀20.42g，加蒸餾水定容至1000ml。
如用含有結(jié)晶水的磷酸鹽，則稱量時(shí)要按帶水的克分子量乘以0.15稱量。上述配制好的甲液和乙液按照常規(guī)方法滅菌(121℃，滅菌15分鐘)。
將上述甲液、乙液和氯化納按照以下配比混合甲液87ml乙液13ml氯化納 0.85g6)試劑盒的組裝將間接血凝板、牛結(jié)核分支桿菌野毒感染標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、健康牛陰性血清、血清稀釋液組裝成牛型分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明的試劑盒生物安全性高。本發(fā)明所涉及到的原核表達(dá)載體pET-28a是分子生物學(xué)中常用的原核表達(dá)載體，沒(méi)有生物危險(xiǎn)性，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-28a-mpb70也沒(méi)有任何生物危險(xiǎn)性。重組大腸桿菌BL21/pET-28a-mpb70是將原核表達(dá)載體pET-28a-mpb70轉(zhuǎn)化至分子生物學(xué)中常用的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得，也不具生物危險(xiǎn)性。本發(fā)明所用的抗原是用牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70蛋白制備的，制備過(guò)程中不涉及牛型分支桿菌活菌，因此沒(méi)有牛型分支桿菌逃逸、擴(kuò)散的潛在危險(xiǎn)。
2、本發(fā)明的試劑盒生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70抗體診斷方法和診斷試劑盒所需抗原是牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70蛋白。該蛋白可以通過(guò)重組大腸桿菌BL21/pET-28a-mpb70在體外得到大量的表達(dá)，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。而目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有專門(mén)檢測(cè)牛型分支桿菌血清抗體的試劑盒。
3、本發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單易行，非常適合牛結(jié)核分支桿菌臨床大規(guī)模檢測(cè)。


圖1是本發(fā)明的主要技術(shù)路線。
圖2是本發(fā)明的載體構(gòu)建物理圖。
圖3mpb70基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。
MDL 2000的分子量標(biāo)準(zhǔn)1，2，3擴(kuò)增出的基因圖4重組質(zhì)粒pET28a-mpb70酶切鑒定結(jié)果M1為DL15000分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為EcoRI酶切處理；2為HindIII酶切處理；3為EcoRI和HindIII雙酶切處理。
圖5是本發(fā)明誘導(dǎo)表達(dá)的牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70的SDS-PAGE電泳圖，不同誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間條件MPB70表達(dá)情況。
圖6是本發(fā)明臨床檢測(cè)陽(yáng)性牛病理解剖結(jié)果。
圖中(A)大網(wǎng)膜(瘤胃部)見(jiàn)彌散性結(jié)節(jié)存在，部分成簇；(B)肺外壁兩個(gè)淡黃色核桃大小的鈣化灶，剖切有沙感；(C)胸膜肋骨內(nèi)壁上有大量豆樣結(jié)節(jié)；(D)隔肌覆蓋有大量珍珠樣結(jié)節(jié)。
圖7是本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例在同一塊血凝板板上進(jìn)行的臨床血清檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70蛋白cNDA序列的克隆1、PCR引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genbank公布的mpb70基因序列(登錄號(hào)1008916)設(shè)計(jì)上、下游引物。上游引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)(如引物中的下劃線所示)，下游引物引入HindIII酶切位點(diǎn)(如引物中的下劃線所示)。本發(fā)明的引物由北京奧科生物公司合成。
mpb70上游引物5’-AGTTCAGAATTCATGAAGGTAAAGAACACAATTGC-3’mpb70下游引物5’-ACGTCGAAGCTTTTACGCCGGAGGCATTAGC-3’2、MPB70蛋白質(zhì)編碼基因擴(kuò)增與處理將牛型分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株((Mycobacterium bovis AF2122/97，該菌株由湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局郭明星研究員惠贈(zèng)，Genebank，，登錄號(hào)為NC002945)細(xì)菌培養(yǎng)物加少量雙蒸水煮沸10min裂解菌體，離心后取上清液作為PCR模板。mpb70的擴(kuò)增反應(yīng)按25個(gè)循環(huán)，94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，最后72℃完全延伸7min程序進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，使用DNA凝膠快速回收試劑盒(購(gòu)自上海生物工程公司)純化mpb70基因片段。
實(shí)施例2牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建用EcoRI和HindIII雙酶切pET28a(+)(購(gòu)自invitrogen公司)和PCR產(chǎn)物，用DNA凝膠快速回收試劑盒(購(gòu)自上海生物工程公司)純化回收后進(jìn)行粘末端連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-mpb70。載體構(gòu)建如附圖2所示。
實(shí)施例3重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-mpb70的構(gòu)建將重組表達(dá)載體pET-28a-mpb70轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(大腸桿菌菌株購(gòu)自Stratagene公司)感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB卡那霉素平皿，挑選多個(gè)單菌落放入LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)8小時(shí)后分別用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，然后進(jìn)行SDS-PAGE和斑點(diǎn)雜交分析(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，金冬雁，黎孟楓等譯，第二版，科學(xué)出版社，北京，1992版)，從中篩選出能夠在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-mpb70。該菌株保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)吳保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為M205135。
實(shí)施例4最佳誘導(dǎo)物濃度及最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定挑取單個(gè)重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-mpb70菌落至5mL LB培養(yǎng)基，加卡那青霉素(Kana)至終濃度為50μg/mL，37℃搖床培養(yǎng)8小時(shí)后放4℃冰箱過(guò)夜。用含50μg/mL卡那青霉素(Kana)的LB培養(yǎng)基將該菌液按1∶100比例稀釋后，分裝至5支細(xì)菌培養(yǎng)瓶中(5mL/瓶)，置37℃搖床培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3h后，等量取樣進(jìn)行SDS-PAGE。根據(jù)MPB70蛋白表達(dá)情況確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.4mmol/L。
挑取單個(gè)重組大腸桿菌BL21/pET-28a-mpb70菌落至5mL LB培養(yǎng)基，加至終濃度為50μg/mL，37℃搖床培養(yǎng)8小時(shí)后放4℃冰箱過(guò)夜。用含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基將該菌液按1∶100比例稀釋后，分裝至5支細(xì)菌培養(yǎng)瓶中(5mL/瓶)，置37℃搖床培養(yǎng)至OD600≌0.60-0.80，以最佳誘導(dǎo)物濃度(IPTG濃度為0.4mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)，每小時(shí)取樣1mL，共誘導(dǎo)5小時(shí)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯).第二版，北京科學(xué)出版社，1992版)，根據(jù)mpb70表達(dá)情況確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為3小時(shí)。
實(shí)施例5牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70的大量誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化按LB培養(yǎng)基體積的1％接種重組大腸桿菌BL21/pET-28a-mpb70，在37℃下培養(yǎng)12小時(shí)，置4℃過(guò)夜，次日將2毫升菌液接種于200毫升新鮮的加有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至0D600達(dá)到0.60-0.80，加終濃度為0.4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)。以8000r/min離心10分鐘，棄上清，收集菌體。將收集的菌體用1/10培養(yǎng)液體積含1％Trinton-X100的緩沖液A(由50mmol/l Tris-cl pH8.0，0.5mmol/L EDTA pH8.0，50mmol/L NaCL，0.5mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)，5％甘油配制)懸浮后，室溫靜置0.5小時(shí)，用大超聲頭，設(shè)定10個(gè)循環(huán)和50％的間隔時(shí)間，在冰浴中超聲破碎至溶液清亮為止。破碎后的溶液經(jīng)10000r/min，離心12min，收集沉淀，棄上清。沉淀用1/10培養(yǎng)液體積含0.2％DOC(脫氧膽酸鈉)的緩沖液A懸浮，置室溫靜置0.5小時(shí)，10000r/min，離心12min，收集沉淀，棄上清。沉淀用1/10培養(yǎng)液體積含0.3％十二烷基基胺酸鈉的緩沖液A懸浮，置室溫靜置1.5小時(shí)至包涵體完全溶解。然后經(jīng)10000r/min，離心12min后，棄沉淀(含細(xì)胞碎片)，收集上清，加入終濃度為0.2％聚乙二醇4000(PEG4000)，1mmol/L氧化型谷胱甘肽和2mmol/L還原型谷胱甘肽，置4℃過(guò)夜，最后用10mmol/L TE(pH8.0)透析2-3天，每天換液3-4次。透析后的溶液分裝成小管后置-20℃保存?zhèn)溆?，作為紅細(xì)胞致敏抗原。
實(shí)施例6醛化紅細(xì)胞診斷試劑的制備1、敏醛化綿羊紅細(xì)胞診斷試劑的制備及檢驗(yàn)(1)綿羊紅細(xì)胞的制備選擇鏈球菌2型抗體陰性的健康公綿羊，無(wú)菌操作采血脫纖后，加入等量的阿氏液(配方同前)，放2-8C穩(wěn)定3-5日，用生理鹽水離心洗滌5次。
(2)紅細(xì)胞醛化(固定)用0.15mol/L pH7.2 PBS配成5％紅細(xì)胞懸液，放電磁攪拌器上徐徐加入1/5容量的2.5％戊二醛溶液，在1小時(shí)左右加完，然后繼續(xù)攪拌10分鐘，離心棄上清，再用PBS洗滌1次，最后用PBS配成10％懸液，加0.01％硫柳汞，放2-8℃保存，該紅細(xì)胞懸液使用期不超過(guò)6個(gè)月。
(3)醛化紅細(xì)胞的鞣化將醛化紅細(xì)胞先離心后用PBS懸浮洗滌一次，然后用PBS成2.5％懸液，加入等容量的1∶20000濃度的鞣酸(用PBS配制)，放37℃水浴15分鐘，期間攪拌數(shù)次，離心棄上清，再用PBS懸浮洗滌一次，最后用pH6.4 PBS液配成2.5％懸液用于致敏。
實(shí)施例7牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白mpb70抗體診斷試劑盒組裝及制備方法1、mpb70-IHA試劑盒包括致敏的綿羊紅細(xì)胞抗原 1瓶/盒陽(yáng)性血清和陰性血清各1瓶(0.5m1)/盒血清稀釋液1瓶(5m1)/盒V型血凝板 2塊(96孔)/盒2mpb70-IHA試劑盒相關(guān)溶液配方血清稀釋液(即磷酸緩沖液)的制備甲液 將磷酸氫二納配制成含量為0.15mol/L的溶液。
具體方法取磷酸氫二納21.3g，加蒸餾水定容至1000ml。
乙液 將磷酸二氫鉀配制成含量為0.15mol/L的溶液。
具體方法取磷酸二氫鉀20.42g，加蒸餾水定容至1000ml。
如用含有結(jié)晶水的磷酸鹽，則稱量時(shí)要按帶水的克分子量乘以0.15稱量。甲液和乙液均121磅高壓滅菌15分鐘。
甲液87ml
乙液 13ml氯化鈉0.85g3、最佳抗原濃度、抗原致敏時(shí)間和結(jié)果判定最佳時(shí)間的選擇取1份5mL/L醛化鞣酸化紅細(xì)胞與1份超聲波粉碎儀破碎最佳濃度的抗原，在37℃水浴中作用30min，其間不斷輕輕搖振，最后以3000r/min離心3min，棄上清液，用含健康兔血清1％PBS洗滌后，配成1％致敏紅細(xì)胞懸液。試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)抗原稀釋度為1∶128時(shí)，血凝效價(jià)低；隨抗原濃度升高，血凝效價(jià)也提高。但抗原稀釋度超過(guò)1∶8時(shí)血凝效價(jià)不再明顯提高，因而確定最適抗原濃度為1∶8-1∶16之間，用此濃度抗原制備的1％致敏紅細(xì)胞血凝效價(jià)較高，且圖像清晰，經(jīng)反復(fù)試用效果亦穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果表明在確定致敏抗原量的情況下，改變致敏時(shí)間，當(dāng)致敏時(shí)間為60分鐘時(shí)，同陽(yáng)性血清反應(yīng)，敏感性最高，血清最高血凝效價(jià)可以達(dá)到1∶1024，此時(shí)，制備的1％致敏紅細(xì)胞血凝效價(jià)最高，且圖像清晰，經(jīng)反復(fù)試用效果亦穩(wěn)定。用“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”表示紅細(xì)胞的凝集強(qiáng)度，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照完全成立時(shí)，出現(xiàn)“+”的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的血凝效價(jià)，經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證本試驗(yàn)中45分鐘時(shí)判定結(jié)果為最佳時(shí)間，此時(shí)陽(yáng)性血清出項(xiàng)明顯的凝集現(xiàn)象，而陰性血清不凝集。
實(shí)施例8mpb70-IHA檢測(cè)步驟及判斷標(biāo)準(zhǔn)操作步驟(1)從4℃冰箱中取出本發(fā)明的試劑盒，平衡各組分至室溫。
(2)用微量移液器吸取稀釋液25μL，滴于96孔“V”型微量反應(yīng)板孔中；(3)用微量移液器取被檢滅活血清25μL于微量反應(yīng)板的第1孔，然后依次作倍比稀釋至第11孔，。第12孔為空白對(duì)照，僅加稀釋液；(4)另設(shè)下列對(duì)照致敏紅細(xì)胞加陽(yáng)性血清、致敏紅細(xì)胞加稀釋液及陰性血清；(5)每孔加25μL抗原致敏的紅細(xì)胞懸液；(6)在微型振蕩器上輕振1min，使其充分混合，室溫放置45分鐘后觀察結(jié)果。
mpb70-IHA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的確定結(jié)果成立條件致敏紅細(xì)胞加陽(yáng)性血清出現(xiàn)100％凝集，致敏紅細(xì)胞加稀釋液及陰性血清不凝集，表明結(jié)果成立；凝集價(jià)的判定用“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”表示紅細(xì)胞的凝集強(qiáng)度，出現(xiàn)“++”的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的血凝效價(jià)。
“++++”100％凝集，紅細(xì)胞均勻地分布于孔底周圍；“+++”75％凝集，紅細(xì)胞均勻地分布于孔底周圍，但孔底中心有紅細(xì)胞形成的針尖大的小點(diǎn)；“++”表示50％凝集，孔底周圍有不均勻的紅細(xì)胞分布，孔底有紅細(xì)胞沉下的小點(diǎn)；“+”表示25％凝集，孔底周圍有不均勻的紅細(xì)胞分布，但大部分紅細(xì)胞已經(jīng)沉積于孔底。
“-”表示不凝集，紅細(xì)胞完全沉積于孔底形成一圓點(diǎn)。
實(shí)施例9本發(fā)明的應(yīng)用效果舉例本例中所指的mpb70-IHA檢測(cè)方法參照實(shí)施例8所述的操作步驟，其檢測(cè)結(jié)果如表1和表2，1、特異性試驗(yàn)致敏好的醛化紅細(xì)胞試劑牛結(jié)核分枝桿菌分枝桿菌病反應(yīng)呈強(qiáng)陽(yáng)性，與副結(jié)核病牛血清、布病牛血清、弓形蟲(chóng)病牛血清和口蹄疫牛血清均不反應(yīng)，達(dá)到了較好的特異性。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1特異性試驗(yàn)(單位log2)

2、試劑盒的敏感性牛結(jié)核分枝桿菌MPB70蛋白間接血凝試驗(yàn)抗體診斷試劑盒和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)敏感性的比較，將10份牛結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性的牛血清倍比稀釋后分別用牛結(jié)核分枝桿菌MPB70蛋白間接血凝試驗(yàn)抗體診斷試劑盒和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGIP)檢測(cè)，血清的AGIP效價(jià)為1～4；IHA效價(jià)為128-512。IHA的敏感性為AGIP的128-512倍(見(jiàn)表2)。
表2倍比稀釋的10份陽(yáng)性血清IHA和AGIP的檢測(cè)結(jié)果

盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書(shū)限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.表達(dá)牛分枝桿菌MPB70蛋白的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET-28a-MPB70，保藏在CCTCC，保藏編號(hào)CCTCC-M205135。
2.包含權(quán)利要求1的檢測(cè)試劑盒。
3.權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒是用于檢測(cè)牛結(jié)核病抗體的試劑盒。
4.權(quán)利要求2或3所述的適用于檢測(cè)牛結(jié)核病抗體的試劑盒，它包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的V形底96孔反應(yīng)板、牛結(jié)核分支桿菌野毒感染標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、健康牛陰性血清、血清稀釋液和1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液。
5.權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中的1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液是用牛分枝桿菌特異性抗原蛋白MPB70致敏的紅細(xì)胞，它是通過(guò)下列方法制備的將紅細(xì)胞懸液中加入等體積的抗原蛋白MPB70，經(jīng)水浴，攪拌；離心棄上清，用PBS洗滌2次，再用含1％兔血清的PBS洗滌一次，配成1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液，加入0.01％硫柳汞，分裝后放2-8℃保存，備用。
6.權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)牛結(jié)核病抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。公開(kāi)了一種適用于牛結(jié)核檢測(cè)試劑盒及其制備方法，所述的試劑盒，包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的V形底96孔反應(yīng)板、牛結(jié)核分支桿菌野毒感染標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、健康牛陰性血清、血清稀釋液和1％致敏綿羊紅細(xì)胞懸液。其中致敏綿羊紅細(xì)胞懸液是由大腸桿菌表達(dá)的牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB70致敏得到的。本發(fā)明的試劑盒具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，可應(yīng)用于牛結(jié)核病抗體的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1982439SQ20051001999
公開(kāi)日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2005年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日
發(fā)明者譚亞娣, 胡巧云, 晁彥杰, 欽博, 張桂容, 陳煥春, 張書(shū)環(huán) 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)