專利名稱：治療心腦血管疾病的腦心清顆粒及其制備與有效成分含量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種用于心腦血管疾病的腦心清顆粒及其制備與有效成分含量測(cè)定方法，特別涉及以含有中藥柿葉活性成分的提取物為原料，與適宜可藥用的輔料一起制備而成的一種藥物組合物口服制劑。
背景技術(shù)：
腦心清片是以中藥柿葉為原料經(jīng)提取加工而制成的一種口服制劑，其標(biāo)準(zhǔn)來(lái)源于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3974-98。具有增加冠脈和腦動(dòng)脈血流量，改善心、腦組織的供血供氧狀態(tài)，增加紅細(xì)胞電泳率作用，用于治療冠心病心絞痛，腦動(dòng)脈硬化，缺血性腦血管病，臨床驗(yàn)證表明，療效確切，不良反應(yīng)較少，是臨床常用藥物。
但由于制備技術(shù)本身的原因，現(xiàn)有的腦心清片劑、膠囊等劑型，由于存在著溶散時(shí)限較長(zhǎng)，溶出度較低，影響其吸收和生物利用度等指標(biāo)，從而影響藥效的發(fā)揮，甚至治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于補(bǔ)充現(xiàn)有用于治療冠心病心絞痛，腦動(dòng)脈硬化，缺血性腦血管病的口服藥物制劑的不足，特別是不同于已有腦心清片劑、膠囊劑等劑型，提供一種分散度高，生物利用度好，且具有快速釋藥，快速吸收和快效顯效的藥物組合物口服制劑腦心清顆粒，包括無(wú)糖與有糖(含低糖)型顆粒。
本發(fā)明所涉及的腦心清顆粒，以中藥柿葉為原料，與作為輔料的可藥用添加劑一起制備而成。其成品每克顆粒相當(dāng)于藥材柿葉干浸膏25～500mg，所含乙酸乙酯浸出物為50mg～220mg。同時(shí)，進(jìn)行了質(zhì)量控制方法研究，結(jié)果為每克顆粒所含柿葉以槲皮素(C15H10O7)計(jì)，不得少于0.50mg。
本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案，研究了腦心清顆粒制備工藝方案及其質(zhì)量控制技術(shù)。
1、工藝流程(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1)2、制備工藝研究(1)提取工藝路線的設(shè)計(jì)本品為顆粒劑，是由片劑改劑而成，為了使其改劑后的藥效學(xué)不發(fā)生變化，在工藝研究時(shí)，其藥材提取方法與片劑一樣，即為水提醇沉法，所得浸膏加水溶解，濾過(guò)，濾液用醋酸乙酯提取四次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，由于原技術(shù)對(duì)溶劑用量等工藝因素未確定，因此，此次工藝研究時(shí)對(duì)溶劑用量、干燥溫度等工藝因素進(jìn)行試驗(yàn)研究。
(2)藥材的前處理藥材經(jīng)凈選后，制成飲片。
(3)柿葉水提條件考察(3.1)吸水率考察稱取柿葉三批，每批500g，分別加10倍量水，浸泡至透心，濾過(guò)，測(cè)得平均吸水率為405％。
(3.2)柿葉水提條件考察以提取次數(shù)，加水倍數(shù)，提取時(shí)間為考察因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，并以收膏率、槲皮素含量(％)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳工藝條件(收膏率、槲皮素含量權(quán)重系數(shù)分別為0.6，0.4)。
實(shí)驗(yàn)方法取柿葉藥材9份，每份各500g，水提，濾過(guò)，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.12(60℃)的清膏。測(cè)收膏率和槲皮素含量。
收膏率按處方稱取柿葉，水提，濾過(guò)，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.12(60℃)的清膏。計(jì)算清膏與所提藥材重量的百分比。
槲皮素的含量測(cè)定(HPLC)應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙醇(30～95％)-0.1％磷酸(1∶20～1∶50)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。
對(duì)照品溶液的制備 取槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加乙醇(30％～90％)溶解并稀釋成每1ml含槲皮素約40μg的溶液。
供試品溶液的制備 取本品約2g，精密稱定，置具塞燒瓶中，加乙醇20ml，25％硫酸5ml，稱定重量。水浴回流30min，冷卻后稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，濾過(guò)，再用濾膜過(guò)濾，即得。
樣品測(cè)定法 分別精密吸取上述兩種對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測(cè)定，計(jì)算槲皮素含量(％)。結(jié)果見(jiàn)表1-2。
表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)表

注以下收膏率、槲皮素含量(C15H10O7)二個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，均采用綜合評(píng)分法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，收膏率、槲皮素含量(C15H10O7)權(quán)重系數(shù)分別為0.6，0.4。
收膏率評(píng)分＝清膏量/最大清膏量*0.6*100％槲皮素含量評(píng)分＝槲皮素含量/最大槲皮素含量*0.4*100％
綜合評(píng)分＝收膏率評(píng)分+槲皮素含量評(píng)分由表2可知，A因素中(K1、K2)結(jié)果相差較大，A因素中(K2、K3)結(jié)果相差不大，考慮到大生產(chǎn)節(jié)約成本等因素，確定A2(提取2次)為最佳條件；C因素對(duì)結(jié)果影響不大，綜合考慮后，確定最佳工藝條件為A2B3C3，由于C因素對(duì)結(jié)果影響不大，為了節(jié)約燃能和縮短工期，可以考慮第二次提取時(shí)間為1小時(shí)，即為柿葉加水煎煮二次，第一次2小時(shí)，加12倍量水，第二次1小時(shí)，加12倍量水。
(3)醇沉工藝條件考查以所加的乙醇濃度、靜止時(shí)間、藥液的含醇量。為考查因素，各取三個(gè)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)，并以槲皮素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選醇沉條件。
試驗(yàn)方法取柿葉藥材9份，每份各500g，按照上面正交篩選出的水提工藝，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.12～1.15(60℃)，加乙醇至含醇量達(dá)85％，靜置過(guò)夜，濾取上清液備用；沉淀用65％乙醇洗滌兩次，收集洗滌液，靜置，吸取上清液與前上清液合并，回收乙醇，得浸膏(ρ＝1.35)。槲皮素含量測(cè)定方法同上，計(jì)算出槲皮素含量(mg/g)。結(jié)果見(jiàn)表3-4。
表3 因素水平表

表4 正交試驗(yàn)表


由表4可知，醇沉因素影響大小依次為A＞B＞C，由于B、C因素較小，考慮大生產(chǎn)實(shí)際情況，最佳工藝條件為A3B2C3。
(4)醋酸乙酯提取工藝條件考查以醋酸乙酯提取次數(shù)、藥液的密度、藥液的溫度為考查因素，各取三個(gè)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)，并以提取物(干膏)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選醋酸乙酯提取工藝條件。
試驗(yàn)方法取柿葉藥材9份，每份各500g，按照上面正交篩選出的水提醇沉工藝，將所得浸膏加水溶解，濾過(guò)，濾液用醋酸乙酯提取，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，稠膏低溫干燥成干浸膏。以干浸膏為評(píng)價(jià)指標(biāo)。
結(jié)果見(jiàn)表5-6。
表5 因素水平表

表6 正交試驗(yàn)表


由表6可知，醋酸乙酯提取影響大小依次為A＝B＞C，最佳工藝條件為A3B1C3。
(5)提取液的濃縮在中藥生產(chǎn)中，減壓濃縮所需時(shí)間短，又能防止有效成分長(zhǎng)時(shí)間受熱破壞，結(jié)合工廠實(shí)際生產(chǎn)條件，采用三效減壓濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮。將提取液濃縮成稠膏，測(cè)得其相對(duì)密度為1.12(60℃)。
(6)最佳工藝重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)為了驗(yàn)證上述結(jié)果的準(zhǔn)確性，以保證提取工藝的合理可行，按上述已確定的工藝條件安排3批驗(yàn)證試驗(yàn)，每批取干柿葉1000g，加水煎煮二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.12(60℃)，加乙醇至含醇量達(dá)85％，靜置過(guò)夜，濾取上清液備用；沉淀用65％乙醇洗滌兩次，收集洗滌液，靜置，吸取上清液與前上清液合并，回收乙醇，所得浸膏加水溶解，濾過(guò)，濾液用醋酸乙酯提取四次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，稠膏低溫干燥成干浸膏，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 柿葉浸膏粉提取工藝重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出所篩選出來(lái)的工藝合理可行，穩(wěn)定可靠，具有可操作性和重現(xiàn)性。
(7)柿葉中槲皮素含量轉(zhuǎn)移率的計(jì)算取柿葉藥材3份，每份1000g，按上面測(cè)槲皮素含量方法測(cè)定其藥材中槲皮素含量(mg)，然后按正交篩選出的最佳工藝提取，測(cè)定其干膏量和干膏中槲皮素含量(mg)，柿葉中槲皮素含量的轉(zhuǎn)移率如下表8 柿葉的轉(zhuǎn)移率

3、顆粒制劑工藝研究本品為顆粒劑，由部頒中藥腦心清片改劑而成。因此，我們對(duì)每次服用的藥物量(干膏量)以原標(biāo)準(zhǔn)為參照，并以此推算出制顆粒時(shí)需要加入的輔料量輔料種類的確定常用制粒的輔料有糊精、淀粉、蔗糖等。本品是根據(jù)部頒中藥腦心清片改劑而成，原標(biāo)準(zhǔn)選用淀粉為輔料。我公司將片劑改劑成顆粒后，根據(jù)顆粒的性質(zhì)和患者的服用情況，將輔料改為了蔗糖和糊精。
輔料用量按上述計(jì)算方法可知每次服用的浸膏量為0.1g，按3g/袋設(shè)計(jì)，每袋中含有的干浸膏量為0.1g，輔料為2.9g，干浸膏∶輔料＝1∶29，由于提取物為醋酸乙酯提取出來(lái)的，為了使醋酸乙酯充分揮發(fā)，將其浸膏完全干燥，仍用淀粉漿作為粘合劑，其比例為干浸膏∶蔗糖∶糊精＝1∶25∶4。
制粒原料前述12.5.1.節(jié)“半成品制備工藝研究”所制得的干膏。
操作稱取干膏0.1kg，取蔗糖和糊精分別為2.5kg、0.4kg置桶式預(yù)混機(jī)中，逐漸加入淀粉漿0.1kg混勻，制成松緊適度的軟材，過(guò)14目篩制粒。用14目篩在操作上較16目篩容易，，粒度也較為均勻，因此采用14目篩濕法制粒。制粒中干浸膏∶蔗糖∶糊精混合比例的考察表9

由表9可見(jiàn)，干浸膏∶蔗糖∶糊精的比例1∶25∶4，乙醇濃度35％時(shí)制粒效果最好。
顆粒的干燥與整粒本品制粒后，在烘干過(guò)程中，用低溫干燥，起始溫度設(shè)定為40℃，然后在1小時(shí)之內(nèi)緩慢升至60℃，干燥至顆粒的水分含量低于2.0％時(shí)，干燥完畢。
整粒為使顆粒大小均勻，保證劑量，便于分裝，需進(jìn)行整粒，本品用14目篩進(jìn)行整粒，1好篩和5號(hào)篩篩選。
整粒后合格顆粒的收率約為94.2％。
顆粒的物理性質(zhì)性狀 本品為淡黃色至棕褐色顆粒；味甜，微苦。
堆密度 取顆粒15g，置于50ml量筒中，測(cè)定顆粒體積，計(jì)算堆密度。測(cè)定結(jié)果如下表10 顆粒堆密度測(cè)定

本品堆密度為0.46g/ml。
流動(dòng)性采用漏斗法測(cè)定顆粒的流動(dòng)性，計(jì)算休止角，測(cè)定結(jié)果如下表11 顆粒的流動(dòng)性測(cè)定

本品的休止角為29.3°，顆粒的流動(dòng)性較好，易于顆粒的分裝。
臨界相對(duì)濕度的測(cè)定本品為顆粒劑，顆粒在分裝的過(guò)程中容易吸濕，影響產(chǎn)品的質(zhì)量。因此須考察顆粒在分裝過(guò)程中受環(huán)境的影響，尤其是濕度的影響，進(jìn)行了吸濕性試驗(yàn)，測(cè)定臨界相對(duì)濕度。取顆粒5份，置稱量瓶中，精密稱定，分別放入相對(duì)濕度為33％、42.8％、59.7％、75.3％、92.5％的環(huán)境中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)放置48小時(shí)，取出測(cè)定其水分。以相對(duì)濕度為橫坐標(biāo)，水分為縱坐標(biāo)，繪制吸濕平衡曲線(見(jiàn)圖)，試驗(yàn)結(jié)果如下表12 臨界相對(duì)濕度測(cè)定結(jié)果

腦心清顆粒吸濕曲線圖見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖2。
由測(cè)定結(jié)果可知，腦心清顆粒在不同的相對(duì)濕度的環(huán)境中，其吸濕量不同，在相對(duì)濕度小于60％以下的環(huán)境中顆粒的吸濕性不強(qiáng)，在此環(huán)境中分裝不影響本品的水分。因此，本品分裝時(shí)相對(duì)濕度應(yīng)控制在60％以下。
本品裝量由上述可知3g/袋，每次服用1-2袋，1日3次。
包裝材料的確定由于本品的臨界相對(duì)濕度較低，容易吸濕，因此應(yīng)選擇隔氣、隔濕性強(qiáng)的復(fù)合膜袋，作為本品的包裝材料。
4、質(zhì)量控制與HPLC方法的研究采用薄層色譜法，對(duì)處方中含有的糠酸、原兒茶酸、琥珀酸對(duì)照品進(jìn)行了定性鑒別研究，對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備按照原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制備如下取本品約8g，加乙酸乙酯50ml，加熱回流1小時(shí)，濾過(guò)，濾液濃縮至約2ml，作為供試品溶液。另取糠酸、原兒茶酸、琥珀酸對(duì)照品各1mg，分別用乙酸乙酯1ml溶解，制成對(duì)照品溶液。
檢測(cè)照薄層色譜法(附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述四種溶液各6μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在105℃加熱半小時(shí)，放冷，噴以0.05％溴酚藍(lán)乙醇溶液。發(fā)現(xiàn)在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上斑點(diǎn)不明顯，故考慮是因?yàn)楸酒吩诟膭┻^(guò)程中輔料比例增加的原因，因此在供試品制備過(guò)程中又增加了乙酸乙酯提取過(guò)程，具體供試品制備如下取本品約8g，加乙酸乙酯50ml，加熱回流1小時(shí)，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀暼芙?，過(guò)濾，濾液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯液濃縮至約2ml，作為供試品溶液。
照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和各對(duì)照溶液各6μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在105℃加熱半小時(shí)，放冷，噴以0.05％溴酚藍(lán)乙醇溶液。在供試品色譜中，在分別與各對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
其余條件不變，以甲苯-乙酸乙酯-乙酸(2∶2∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，也可取得較好的分離效果。陰性無(wú)干擾。
砷鹽檢查依法(《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版一部附錄IX F第一法古蔡氏法)對(duì)三批小試樣品進(jìn)行檢查。
標(biāo)準(zhǔn)砷溶液的制備稱取三氧化二砷0.132g，置1000ml量瓶中，加20％氫氧化鈉溶液5ml溶解后，用適量的稀硫酸中和，再加稀硫酸10ml，用水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。
臨用前，精密量取貯備液10ml，置1000ml量瓶中，加稀硫酸10ml，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml相當(dāng)于1μg的As)。
儀器裝置用藥典規(guī)定的儀器，于導(dǎo)氣管C中裝入醋酸鉛棉花60mg(裝管高度為70mm)，再于旋塞D的頂端平面上放一片溴化汞試紙，蓋上旋塞蓋E并旋緊，即得。
標(biāo)準(zhǔn)砷斑的制備精密量取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液2ml，置A瓶中，加鹽酸5ml與水21ml，再加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞錫試液5滴，在室溫放置10分鐘后，加鋅粒2g，立即將已裝妥的導(dǎo)氣管C密塞于A瓶上，并將A瓶置30℃水浴中，反應(yīng)45分鐘，取出溴化汞試紙，即得。
檢查稱取三批供試品各1g(每批兩份)，置古蔡氏瓶中，各加水20ml使溶解，照標(biāo)準(zhǔn)砷斑的制備，自“再加碘化鉀試液5ml”起，依法操作。將生成的三批樣品的6個(gè)砷斑與標(biāo)準(zhǔn)砷斑(2ppm)比較，結(jié)果顏色更淺，說(shuō)明三批供試品中砷含量均小于2ppm。按有關(guān)規(guī)定，不將此項(xiàng)檢查列于正文標(biāo)準(zhǔn)。
微生物限度照微生物限度檢查法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄XIII C)試驗(yàn)，樣品均符合規(guī)定。
表 顆粒劑通則檢查結(jié)果表

結(jié)論實(shí)驗(yàn)樣品制劑通則檢查結(jié)果全部合格。
乙酸乙酯浸出物檢查取本品三批小試樣品各約10g(準(zhǔn)確至0.01g)，用乙酸乙酯為溶劑，照醇溶性浸出物測(cè)定法測(cè)定。
檢測(cè)對(duì)象選擇原顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中并沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)，在本次研究中新增加了含量測(cè)定項(xiàng)。
本品是由柿葉經(jīng)提取制成的顆粒劑，根據(jù)柿葉的藥理文獻(xiàn)資料可知，柿葉黃酮在心腦血管系統(tǒng)方面有較大的藥理作用，故在增訂含量測(cè)定項(xiàng)時(shí)我們優(yōu)先考慮了柿葉黃酮類成分，而柿葉黃酮類成分中含有槲皮素，其含量測(cè)定方法研究很多，用的最廣泛的是高效液相色譜法，此檢測(cè)法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，是現(xiàn)代藥物檢測(cè)中常用的方法。因此，本品采用高效液相色譜法測(cè)定其槲皮素的含量。
含量測(cè)定方法學(xué)研究本次研究參照了其他制劑中含有槲皮素成分的含測(cè)方法(高效液相色譜法)，起草了測(cè)定本品中槲皮素含量的方法，并在測(cè)定中試產(chǎn)品的槲皮素含量基礎(chǔ)上初步確定了本品中槲皮素的含量限度。
檢測(cè)波長(zhǎng)的確定取槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，在200～400nm范圍內(nèi)用紫外儀掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素在270nm處有最大吸收，故將檢測(cè)波長(zhǎng)定為270nm。
色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)流動(dòng)相的選擇參考其他制劑的槲皮素含量測(cè)定的流動(dòng)相，進(jìn)行了流動(dòng)相的篩選試驗(yàn)，最后選定流動(dòng)相為甲醇-0.1％磷酸(1∶20～1∶50)；柱溫40℃，流速1.0ml/min，同時(shí)空白輔料實(shí)驗(yàn)證明陰性樣品無(wú)干擾(見(jiàn)圖3～5)。
色譜柱的篩選本次研究對(duì)色譜柱進(jìn)行了篩選，先后分別以KromasilC18柱(4.6×250mm，5μm)，Dikma diamonds C18(4.6×250mm 5μm)為分析柱進(jìn)行分析，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以Kromasil C18柱(4.6×250mm，5μm)進(jìn)行分析的分離效果最好，理論塔板數(shù)高。
對(duì)照品溶液的制備精密稱取槲皮素對(duì)照品9.5mg，置25ml量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液(0.38mg/ml)。精密吸取貯備液1ml，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml含槲皮素0.038mg的對(duì)照品溶液。
提取條件的考察參考其他含有槲皮素成分的制劑含量測(cè)定項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法，我們選擇以甲醇和25％的鹽酸作為提取溶劑，并進(jìn)行了提取方式和提取時(shí)間進(jìn)行了考察。
提取方式的考察取本品各兩份，每份約2g，精密稱定，均置具塞燒瓶中，加甲醇20ml，25％鹽酸5ml，稱定重量。一份水浴回流30min，冷卻后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，濾過(guò)，再用0.45μm的濾膜過(guò)濾，即得供試品樣1。
另一份用超聲提取30min，冷卻后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，濾過(guò)，再用0.45μm的濾膜過(guò)濾，即得供試品樣2。
精密吸取對(duì)照品溶液10μl，供試品溶液1、2各10μl注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算結(jié)果，回流提取與超聲提取的結(jié)果比較見(jiàn)表3(圖6～8)。
表3 不同提取方法樣品中槲皮素含量

二種方法提取樣品，結(jié)果差異較大，回流提取效果較好，故選用回流提取法。
提取時(shí)間的考察取本品三份，每份約2g，精密稱定，均置具塞燒瓶中，加甲醇20ml，25％鹽酸5ml，稱定重量。一份水浴回流1小時(shí)，一份回流1.5小時(shí)，一份回流2小時(shí)，冷卻后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，濾過(guò)，再用0.45μm的濾膜過(guò)濾，即得供試品樣3、4、5。
精密吸取對(duì)照品溶液10μl，供試品溶液3、4、5各10μl注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算結(jié)果，提取時(shí)間考察結(jié)果比較見(jiàn)表4(圖9～12)。
表4 提取時(shí)間的考察試驗(yàn)

提取0.5小時(shí)后含量基本穩(wěn)定，故選擇提取時(shí)間為0.5小時(shí)。
線性關(guān)系考察及回歸方程精密吸取槲皮素對(duì)照品貯備液(0.38mg/ml)0.5ml、2ml、4ml、5ml分別置10ml量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，濃度為0.019mg/ml、0.076mg/ml、0.152mg/ml、0.19mg/ml。精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液各10μl，按上述色譜法條件測(cè)定峰面積，以峰面積和進(jìn)樣量計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 槲皮素進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系

槲皮素線性關(guān)系圖見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖3。
槲皮素在0.19～1.9μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(見(jiàn)上圖)。
精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取上述對(duì)照品溶液(0.038mg/ml)10μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，槲皮素對(duì)照品峰面積的RSD＜2％，結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性試驗(yàn)取本品平行6次試驗(yàn)，按正文方法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果槲皮素含量平均值為1.0474mg/g，RSD為1.02％，詳見(jiàn)表7。
表7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取上述供試品溶液1，分別在第0、2、4、6、8小時(shí)進(jìn)樣，每次10μl，記錄峰面積積分值，RSD為1.77％，表明樣品溶液中槲皮素在8小時(shí)內(nèi)測(cè)定有良好穩(wěn)定性。
表8 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

回收率試驗(yàn)采用加樣回收率法，精密稱取已知含量本品9份各約1g，精密稱定，置具塞燒瓶中，分別加入一定量對(duì)照品(精密稱取槲皮素對(duì)照品17.4mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濃度為0.174mg/ml，分別加入不同的量，見(jiàn)表9)，加甲醇20ml，25％鹽酸5ml，稱定重量。水浴回流30min，冷卻后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，濾過(guò)，再用0.45μm的濾膜過(guò)濾，即得。
精密吸取對(duì)照品溶液和各供試品溶液各10μl注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算結(jié)果，以下式計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表9

表9 回收率測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，本法回收率較好。


圖1工藝流程圖2腦心清顆粒吸濕曲線3槲皮素線性關(guān)系圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1取干柿葉，加水煎煮二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，每次加12倍量水，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.12～1.15(60℃)，加乙醇至含醇量達(dá)85％，靜置過(guò)夜，濾取上清液備用；沉淀用65％乙醇洗滌兩次，收集洗滌液，靜置，吸取上清液與前上清液合并，回收乙醇，所得浸膏加水溶解，濾過(guò)，濾液用醋酸乙酯提取四次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，稠膏低溫干燥成干浸膏，每33.4g干浸膏加蔗糖和糊精970g(蔗糖∶糊精＝25∶4)，混勻，用35％的乙醇適量，制成顆粒，低溫干燥，制成1000g，即得。
實(shí)施例2如上法所制得柿葉乙酸乙酯提取物干浸膏150g，加入糊精2000g及適量甜葉菊甙矯味劑，混勻，用30％乙醇適量，制粒，低溫干燥，整粒即得腦心清無(wú)糖型顆粒。
權(quán)利要求
1.一種用于心腦血管疾病的腦心清顆粒及其制備與有效成分含量測(cè)定方法。其特征為顆粒劑劑型，包括無(wú)糖型與有糖型(含低糖)型。所有輔料為淀粉糊精及矯味劑等。
2.如權(quán)利要求1所述的腦心清顆粒，其特征為由柿葉的乙酸乙酯提取物為活性有效成分制得的顆粒劑，每克顆粒所含乙酸乙酯提取物(或干浸膏)為25mg～220mg。
3.如權(quán)利要求1所述的腦心清顆粒，其特征在于所述藥物提取物與所用輔料的混合比例可為1∶0.5～1∶9.5。
4.如權(quán)利要求1所述的腦心清顆粒制劑有效成分的含量測(cè)定方法，其特征在于采用HPLC方法進(jìn)行，所測(cè)定結(jié)果為每克顆粒所含柿葉以槲皮素(C15H10O7)計(jì)，不得少于0.50mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是柿葉提取物顆粒劑及其制備與有效成分含量測(cè)定方法。本發(fā)明目的，在于補(bǔ)充現(xiàn)有用于治療冠心病、心絞痛、腦動(dòng)脈硬化與缺血性腦血管疾病的口服藥物制劑的不足，提供一種生物利用度高、并且有快速釋藥、快速吸收、快速顯效，攜帶服用方便，且在生產(chǎn)中無(wú)污染的腦心清顆粒劑，提高患者的順應(yīng)性。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1813859SQ20051002219
公開(kāi)日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月2日
發(fā)明者冀廣沁, 陳家偉, 石萬(wàn)棋, 支春, 左治國(guó), 李先楞, 萬(wàn)玲, 徐琨 申請(qǐng)人:四川國(guó)康藥業(yè)有限公司