專利名稱：一種檢測人外周靜脈血單核細(xì)胞中谷胱甘肽含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生化檢驗領(lǐng)域，涉及一種檢測人外周靜脈血單核細(xì)胞(PMN)中谷胱甘肽含量的方法。
背景技術(shù)：
二十一世紀(jì)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率仍然很高，而臨床上常用的放射治療和化學(xué)藥物治療的方案，基本上是按照惡性腫瘤的種類及部位，采用常規(guī)的統(tǒng)一方案，沒有考慮到不同患者個體之間的差異，特別是影響腫瘤細(xì)胞對射線和化療藥物敏感性的人體內(nèi)生物小分子物質(zhì)谷胱甘肽(Glutathionine，簡稱GSH)。谷胱甘肽存在于人外周靜脈血單核細(xì)胞中，是人體內(nèi)重要的生物小分子物質(zhì)，它與患者的放射治療和化學(xué)藥物治療療效密切相關(guān)。但是每種不同類型的腫瘤以及每個患者個體之間的GSH差異較大，因此在接受基本上統(tǒng)一的放射和化療治療方案時，所獲得的療效可以相差較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測人外周靜脈血單核細(xì)胞中谷胱甘肽含量的方法，進(jìn)一步可用于檢測所制訂的治療惡性腫瘤的方案是否恰當(dāng)，和預(yù)測所制訂的治療惡性腫瘤的方案其療效如何。本發(fā)明通過檢測人外周靜脈血單核細(xì)胞中谷胱甘肽(GSH)含量.可進(jìn)行指導(dǎo)制訂臨床惡性腫瘤治療方案和預(yù)測其療效指標(biāo)。
本發(fā)明方法的關(guān)鍵是，在腫瘤患者進(jìn)行治療方案選擇前，對接受治療的個體分別進(jìn)行GSH定量的測定，根據(jù)患者的外周血單核細(xì)胞內(nèi)的GSH含量高低狀況，選擇適宜的治療方案，并預(yù)測其療效。若患者的外周血單核細(xì)胞內(nèi)的GSH含量高，則表明其腫瘤細(xì)胞對射線的敏感性差、對化療藥物會產(chǎn)生多藥耐藥性，則預(yù)測其療效較差，所說的病例可選擇在進(jìn)行放療或化療同時，采用降低GSH的藥物，以促使細(xì)胞內(nèi)的GSH含量下降，使腫瘤細(xì)胞的敏感性增加，療效提高。
本發(fā)明方法其中檢測外周血單核細(xì)胞內(nèi)的GSH含量的方法通過下述步驟施行1.取腫瘤患者靜脈血于加有抗凝劑的試管中，加生理鹽水稀釋。
另取兩支試管，每管加淋巴細(xì)胞分離液，將上述稀釋血樣加到分離液上層，2500-3500轉(zhuǎn)/分，離心后分成四層血漿層、界面層即PMN層、分離液層、紅細(xì)胞層。
2.吸取界面層即PMN層于離心管內(nèi)，加PBS液，1500-4000轉(zhuǎn)/分，離心，取沉淀即PMN細(xì)胞，加PBS精確稀釋，PMN細(xì)胞計數(shù)，再1500-4000轉(zhuǎn)/分，離心，棄PBS液，沉淀為PMN備用，放入4℃冰箱保存。
3.取上述沉淀PMN細(xì)胞加水，加硫代水楊酸溶解使蛋白沉淀，吸至指性管，10500-15000轉(zhuǎn)/分，離心去蛋白，取上清液，用紫外分光光度儀于波長在312-470nm處.進(jìn)行測定，測得的光密度值(OD)，進(jìn)行計算得到在PMN細(xì)胞中的GSH含量。
采用本發(fā)明方法，對非小細(xì)胞肺癌兩組外周血單核細(xì)胞GSH含量變化情況進(jìn)行治療方案選擇，A組化療前采用降低GSH的藥物，B組不采用降低GSH的藥物，通過對每個患者治療前的PMN細(xì)胞中GSH含量的測定并對于含量高的患者，采用降低GSH的藥物后，再進(jìn)行常規(guī)化療，使患者的治療療效得到提高。
表1是非小細(xì)胞肺癌兩組外周血單核細(xì)胞GSH含量變化情況。
表2.非小細(xì)胞肺癌兩組化療的療效比較。
表1

P＝0.0835
表2

具體實施方式
實施例1 檢測外周血單核細(xì)胞內(nèi)的GSH含量取腫瘤患者靜脈血3～4毫升于加有抗凝劑的試管中，加生理鹽水1∶2進(jìn)行稀釋。
另取兩支試管，每管加淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077)4ml，再將上述稀釋的血樣立即緩慢加到分離液上層(兩層之間使其成一清晰的界面)，2500-3500轉(zhuǎn)/分，離心15min，離心后分成四層血漿層、界面層即PMN層、分離液層、紅細(xì)胞層。
小心吸取界面層即PMN層于10ml離心管內(nèi)，加PBS液至5-15ml，1500-4000轉(zhuǎn)/分，離心10-25min，取沉淀即PMN細(xì)胞，加PBS精確稀釋至10ml，進(jìn)行PMN細(xì)胞計數(shù)，再1500-4000轉(zhuǎn)/分，離心10-25min，棄PBS液，沉淀為PMN備用，放入4℃冰箱保存。
取上述的沉淀PMN細(xì)胞加0.75ml水加0.25ml硫代水楊酸溶解使蛋白沉淀，吸至1ml指性管，10500-15000轉(zhuǎn)/分，2-4分鐘離心去蛋白，取上清液，用紫外分光光度儀于波長在312-470nm處，進(jìn)行測定，測得的光密度值(OD)，進(jìn)行計算得到在PMN細(xì)胞中的GSH含量。
實施例2不同癌癥患者的GSH差異性隨機(jī)獲取已經(jīng)臨床確實的非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌患者各100例(男女均有)，年齡在18～75歲之間，分別取靜脈血3～4毫升于加有抗凝劑的試管中，加生理鹽水1∶2進(jìn)行稀釋，定量測定外周血單核細(xì)胞中GSH，另取兩支試管，每管加淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077)4ml，再將上述稀釋的血樣立即緩慢加到分離液上層(兩層之間使其成一清晰的界面)，2500-3500轉(zhuǎn)/分，離心15min，離心后分成四層血漿層、界面層即PMN層、分離液層、紅細(xì)胞層。
小心吸取界面層即PMN層于10ml離心管內(nèi)，加PBS液至10ml，3000轉(zhuǎn)/分，離心10min，取沉淀即PMN細(xì)胞，加PBS精確稀釋至10ml，進(jìn)行PMN細(xì)胞計數(shù)，再3000轉(zhuǎn)/分，離心10min，棄PBS液，沉淀為PMN備用，放入4℃冰箱保存。
取上述的沉淀PMN細(xì)胞加0.75ml水加0.25ml硫代水楊酸溶解使蛋白沉淀，吸至1ml指性管，12000轉(zhuǎn)/分，2-4分鐘離心去蛋白，取上清液，用紫外分光光度儀于波長在420nm處，進(jìn)行測定，測得的光密度值(OD)，進(jìn)行計算得到在PMN細(xì)胞中的GSH含量。
經(jīng)過統(tǒng)計處理后得到上述3種臨床常見癌癥患者的GSH含量分別如下非小細(xì)胞肺癌 1.58±2.86×10-12μmol/細(xì)胞乳腺癌2.47±3.31×10-12μmol/細(xì)胞卵巢癌3.23±4.42×10-12μμmol/細(xì)胞上述3種臨床常見癌癥中，以卵巢癌患者的GSH含量為高。
實施例3所選患者均采用本發(fā)明方法檢測人外周靜脈血單核細(xì)胞中谷胱甘肽含量1、陳××，男，46歲，非小細(xì)胞肺癌，鱗癌，X線檢查腫瘤大小為10×8.2cm2，并有淋巴結(jié)和骨轉(zhuǎn)移?；熐捌渫庵苎獑魏思?xì)胞中GSH為0.9880×10-12μmol/細(xì)胞，低于非小細(xì)胞肺癌的平均值，預(yù)示陳××所患的非小細(xì)胞肺癌對化療藥物的敏感性較好。2001年9月入院治療，在進(jìn)行常規(guī)化療前，用抑制GSH合成酶的藥物，使其GSH含量下降至0.3065×10-12μmol/細(xì)胞(下降61.68％)，治療后X線檢查腫瘤大小為5.5×3.8cm2，縮小74.5％，達(dá)到部分緩解(PR)，療效明顯。
2、××，男，46歲，非小細(xì)胞肺癌，化療前其外周血單核細(xì)胞中GSH為0.9880×10-12μmol/細(xì)胞，外周血單核細(xì)胞中GSH 0.9880，上升，治療后SD3、許××，女，62歲，乳腺癌(左右雙乳腫瘤)，伴腋下及鎖骨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。住院進(jìn)行化療，乳腺部腫瘤大小右乳6×4cm2，左乳2×2cm2；轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)大小2×2.5cm2?；熐巴庵苎獑魏思?xì)胞中GSH為2.1130×10-12μmol/細(xì)胞，屬平均水平，預(yù)示有一定的療效。在進(jìn)行常規(guī)化療前，用抑制GSH合成酶的藥物，使其GSH含量下降至1.4350×10-12μmol/細(xì)胞(下降32.08％)后觀察療效，應(yīng)該更佳。治療后檢查腫瘤大小分別為右乳2×2cm2(縮小83.3％)左乳1×1.5cm2(縮小62.5％)，療效明顯，達(dá)到部分緩解(PR)。
4、××，女，62歲，乳腺癌?；熐巴庵苎獑魏思?xì)胞中GSH為2.1130×10-12μmol/細(xì)胞，化療后外周血單核細(xì)胞中GSH為2.1130×10-12μmol/細(xì)胞，上升，PD。
5、陳××，女，40歲，卵巢癌，手術(shù)切除后復(fù)發(fā)，卵巢腫瘤大小為8.8×8.5cm2，化療前外周血單核細(xì)胞中GSH為5.2349×10-12μmol/細(xì)胞，在進(jìn)行常規(guī)化療前，用抑制GSH合成酶的藥物，使其GSH含量下降至0.3642×10-12μmol/細(xì)胞(下降93.46％).化療后卵巢腫瘤大小為7.1×4.1cm2(縮小61.1％)，療效顯著。
6、方××，女，52歲，卵巢癌，盆腔腫塊大小為3.1×3.1cm2，化療前外周血單核細(xì)胞中GSH為1.4220×10-12μmol/細(xì)胞，低于平均值，用臨床常規(guī)方案進(jìn)行化療后，患者外周血單核細(xì)胞中GSH升高至3.3781×10-12μmol/細(xì)胞(上升)，4.0562×10-12μmol/細(xì)胞(上升118.689％)PD。
權(quán)利要求
1.一種檢測人外周靜脈血單核細(xì)胞中谷胱甘肽(GSH)含量的方法，其特征是在腫瘤患者進(jìn)行治療方案選擇前，對接受治療的個體分別進(jìn)行GSH定量的測定，根據(jù)患者的外周血單核細(xì)胞內(nèi)的GSH含量高低狀況，選擇治療方案，并預(yù)測其療效；所述的檢測人外周靜脈血單核細(xì)胞中GSH含量的方法，包括下述步驟1)取腫瘤患者靜脈血3～4毫升于加有抗凝劑的試管中，加生理鹽水1∶2進(jìn)行稀釋；另取兩支試管，每管加淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077)4ml，再將上述稀釋的血樣加到分離液上層，2500-3500轉(zhuǎn)/分，離心15min，離心后分成四層血漿層、界面層即PMN層、分離液層、紅細(xì)胞層；2)吸取界面層于10ml離心管內(nèi)，加PBS液至5-15ml，1500-4000轉(zhuǎn)/分，離心10-25min，取沉淀細(xì)胞，加PBS精確稀釋至10ml，進(jìn)行PMN細(xì)胞計數(shù)，再1500-4000轉(zhuǎn)/分，離心10-25min，棄PBS液，沉淀為PMN備用，放入4℃冰箱保存；3)取上述沉淀細(xì)胞加0.75ml水加0.25ml硫代水楊酸溶解使蛋白沉淀，吸至1ml指性管，10500-15000轉(zhuǎn)/分，2-4分鐘離心去蛋白，取上清液，用紫外分光光度儀于波長在312-470nm處，測定光密度值(OD)，計算得到PMN細(xì)胞中的GSH含量。
2.按權(quán)利要求1所述的檢測人外周靜脈血單核細(xì)胞中谷胱甘肽含量的方法，其特征是步驟2)，吸取界面層于10ml離心管內(nèi)，加PBS液至10ml，3000轉(zhuǎn)/分，離心10min，取沉淀即PMN細(xì)胞，加PBS精確稀釋至10ml，進(jìn)行PMN細(xì)胞計數(shù)，再3000轉(zhuǎn)/分，離心10min，棄PBS液，沉淀為PMN備用，放入4℃冰箱保存。
3.按權(quán)利要求1所述的檢測人外周靜脈血單核細(xì)胞中谷胱甘肽含量的方法，其特征是步驟3)，取上述的沉淀PMN細(xì)胞加0.75ml水加0.25ml硫代水楊酸溶解使蛋白沉淀，吸至1ml指性管，12000轉(zhuǎn)/分，2-4分鐘離心去蛋白，取上清液，用紫外分光光度儀于波長在420nm處，進(jìn)行測定，測得的光密度值(OD)，進(jìn)行計算得到在PMN細(xì)胞中的GSH含量。
全文摘要
本發(fā)明屬生化檢驗領(lǐng)域，涉及一種檢測人外周靜脈血單核細(xì)胞(PMN)中谷胱甘肽(GSH)含量的方法，包括稀釋，分離，沉淀靜脈血后，用紫外分光光度儀于波長312－470nm處，測定光密度值，計算PMN細(xì)胞中的GSH含量。本方法的關(guān)鍵是，在腫瘤患者進(jìn)行治療方案選擇前，對患者個體進(jìn)行GSH定量測定，根據(jù)患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)的GSH含量，選擇適宜的治療方案，并預(yù)測其療效。根據(jù)本方法檢測結(jié)果，患者可選擇在進(jìn)行放療或化療同時，采用降低GSH的藥物，以促使細(xì)胞內(nèi)的GSH含量下降，使腫瘤細(xì)胞的敏感性增加，療效提高。
文檔編號G01N1/34GK1851465SQ200510025338
公開日2006年10月25日 申請日期2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月22日
發(fā)明者金一尊 申請人:上海中敏新技術(shù)有限責(zé)任公司