專利名稱：一種測(cè)定非小細(xì)胞肺癌血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜，具體涉及一種測(cè)定非小細(xì)胞肺癌血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)有蛋白芯片技術(shù)和質(zhì)譜鑒定技術(shù)組成，而后者有分為基質(zhì)輔助的激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)，近來(lái)有研究發(fā)展了表面增強(qiáng)的激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)可直接應(yīng)用血漿等體液樣本，具有需要樣本量少(如血漿0.5ul-500ul，細(xì)胞約2000個(gè))，可檢測(cè)低豐度(1fmol)、低分子量的未知蛋白，由于以上特點(diǎn)，比較適合臨床應(yīng)用。
SELDI-TOF-MS技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤、新藥開發(fā)、傳染病、神經(jīng)、精神疾病等領(lǐng)域。已有研究報(bào)道，關(guān)于腫瘤診斷的研究結(jié)果于2002年Lancet上由美國(guó)FDA和NCI合作研究的卵巢癌的早期診斷上(Lancet 2002，359(2)590-7)，與傳統(tǒng)的CA125單項(xiàng)指標(biāo)相比(陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅35％)，僅蛋白質(zhì)指紋圖譜的多項(xiàng)指標(biāo)診斷模型的敏感度在100％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高達(dá)94％，以后的幾年中，該方法已用于如小細(xì)胞肺癌(Lancet 2003，362(9382)433-9)、前列腺癌(J Urol2004，172(4pt)1302-5)、腎癌(Int J Mol Med 2005。15(2)285-90)、乳腺癌(Breast Cancer Res Treat2004，86(3)281-91)、頭頸部腫瘤(Clin Cancer Res2004，10(14)4806-12)國(guó)內(nèi)已開展此項(xiàng)技術(shù)，如上海華山醫(yī)院用于膀胱癌(Clin Biochem 2004，37(9)772-9)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究；瑞金醫(yī)院用于胰腺癌和血液病研究，中山醫(yī)院用于慢性肝病，包括肝炎、肝硬化和肝癌及其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的研究；浙江大學(xué)用于結(jié)腸癌(Clin Cancer Res 2004，10(14)8380-5)等。展現(xiàn)了廣闊的臨床應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定非小細(xì)胞肺癌的血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜的方法。具體涉及血漿蛋白質(zhì)的表面增強(qiáng)激光解析離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定和肺癌的特異性蛋白峰比較識(shí)別的方法。
本方法可用于提高鑒別肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌的特異性。
本發(fā)明方法的主要技術(shù)方案是采用表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)，包括患者血漿樣本的采集標(biāo)準(zhǔn)，化學(xué)芯片的選擇、處理和閱讀，測(cè)定條件的優(yōu)化；判別模式及驗(yàn)證。
本方法對(duì)經(jīng)查體各項(xiàng)指標(biāo)正常，且血脂、血糖、肝腎功能，乙肝五項(xiàng)化驗(yàn)均正常的健康人血漿進(jìn)行測(cè)定，和經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)為肺癌病人或非小細(xì)胞肺癌病人或肺部疾患(包括支氣管擴(kuò)張、肺炎、肺梗塞)的血漿進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在非小細(xì)胞肺癌患者的血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜中顯示有判別意義的蛋白質(zhì)峰，其準(zhǔn)確率對(duì)肺癌而言為93.75％(30/32)，正常人為93.93％(31/33)。
本方法能進(jìn)一步為篩查肺癌，尤其是非小細(xì)胞肺癌病人提供簡(jiǎn)易的、特異性技術(shù)手段。也適用于大規(guī)模人群如體檢、流行病學(xué)調(diào)查等，還可用于對(duì)臨床患者的判別。表1是篩查非小細(xì)胞肺癌病人的血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜總結(jié)表。
表1



圖1是同一樣品同一芯片血漿樣品檢測(cè)重復(fù)性分析圖(WCX芯片/SELDI-TOF/MS)，其中顯示，強(qiáng)度重復(fù)性CV＝16.81％，分子量重復(fù)性CV＝0.0233％。
圖2是同一樣品不同芯片血漿樣品檢測(cè)重復(fù)性分析圖(WCX芯片/SELDI-TOF/MS)，其中顯示，強(qiáng)度重復(fù)性CV＝17.74％，分子量重復(fù)性CV＝0.0237％。
圖3是血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜中有判別意義的蛋白質(zhì)峰蛋白質(zhì)峰1M/Z 3944；蛋白質(zhì)峰2M/Z 2826，其中，第1、2行NSCLC病人；第3、4行正常人血漿。
圖4是區(qū)分正常人和非小細(xì)胞肺癌病人的血漿蛋白質(zhì)圖譜的判別模式(決策樹模型)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)實(shí)驗(yàn)1.標(biāo)本收集及預(yù)處理標(biāo)本來(lái)源正常健康人血漿由上海體育大學(xué)提供，查體各項(xiàng)指標(biāo)正常，且血脂、血糖、肝腎功能，乙肝五項(xiàng)化驗(yàn)均正常，非小細(xì)胞肺癌病人血漿由上海胸科醫(yī)院胸部腫瘤研究所提供，肺癌病人均經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)。
標(biāo)本收集空腹靜脈抽血5-10ml，室溫靜置30分鐘左右，6000rpm～1000rpm離心15分鐘，收集上清(血漿)分裝，-80℃保存。避免溶血和脂血標(biāo)本。
芯片選擇比較血漿蛋白在WCX、SAX、H4、IMAC四種蛋白芯片上蛋白指紋峰的分布、表達(dá)情況，優(yōu)先選擇蛋白指紋峰分布和表達(dá)均理想的WCX2蛋白芯片對(duì)血漿的蛋白譜進(jìn)行檢測(cè)。
血漿樣品前處理1).從-80℃冰箱中取出血漿樣品，置冰盒上融解；2).以10000rpm，4℃離心2分鐘；3).每個(gè)芯片點(diǎn)需要血漿3ul，將血漿用2倍體積U9緩沖液(9M urea，2％CHAPS，50mM Tris-Hcl，1％DTT，pH 9.0)稀釋。稀釋時(shí)，避免產(chǎn)生大量氣泡，將樣品充分混勻；
4).將以上樣品冰浴振蕩30分鐘；5).將9ul上述變性后樣品加入108ul相應(yīng)的結(jié)合緩沖液，使得血漿的總稀釋倍數(shù)達(dá)到約40倍，混勻，避免氣泡產(chǎn)生；6).將處理好的血漿樣品上樣到芯片上。
2.實(shí)驗(yàn)操作1)取出WCX2的芯片，在芯片背后標(biāo)記時(shí)間，芯片種類等資料；2).將芯片裝入生物芯片處理器(Bioprocessor)，在組裝生物芯片處理器時(shí)，不觸碰加樣孔，同時(shí)將芯片上帶有”A”的一頭放在外端，注意密封；3).每孔加入200ul結(jié)合緩沖液(50mM NaAC，pH 4.0，或試劑盒中的binding buffer)，置振蕩器(MS1 Minishaker)400-600轉(zhuǎn)/分震蕩5分鐘，甩掉緩沖液。重復(fù)上述操作。保持芯片上每點(diǎn)的濕潤(rùn)，加緩沖液后保持芯片無(wú)氣泡，槍頭不接觸芯片上各點(diǎn)表面；4).上樣(劑量根據(jù)實(shí)際需要而定)，在芯片處理器每孔中加入100ul處理好的樣品，置振蕩器(MS1 Minishaker)400-600轉(zhuǎn)/分，4℃震蕩1小時(shí)；5).甩出樣品，其中生物樣品(如血液，尿樣，腦脊液，癌細(xì)胞液等)甩入預(yù)裝消毒劑的容器；6).每孔加入200ul的結(jié)合緩沖液(50mM NaAc，pH 4.0或試劑盒中的binding buffer)，室溫置振蕩器(MS1 Minishaker)400-600轉(zhuǎn)/分震蕩5分鐘，甩去孔中液體，再加入結(jié)合緩沖液200ul，重復(fù)操作；7).每孔加入200ul HPLC水，甩出；8).拆開芯片處理器，取出芯片，待干后，每個(gè)加樣孔上加SPA 0.5ul，待干后，重復(fù)加SPA 0.5ul一次；9).待干后，即可上機(jī)測(cè)定。
3.設(shè)置芯片閱讀參數(shù)1)設(shè)定最高質(zhì)量5000道爾頓，最適范圍2000-20000道爾頓；
2)設(shè)定初始激光強(qiáng)度為185；3)設(shè)定檢測(cè)敏感度為8；4)校正聚焦點(diǎn)于孔中央；5)設(shè)定質(zhì)量檢測(cè)器為1000道爾頓；6)設(shè)置數(shù)據(jù)處理為SELDI位置；7)設(shè)定SELDI參數(shù)為22delta至4轉(zhuǎn)換，終點(diǎn)為82；8)設(shè)定濕熱位置至2，強(qiáng)度為10；9)置入樣品。
4，血清樣品檢測(cè)重復(fù)性分析(SELDI-TOF-MS/WCX2蛋白芯片)，同一樣品同一芯片重復(fù)性分析結(jié)果表明，強(qiáng)度重復(fù)性CV＝16.81％，分子量重復(fù)性CV＝0.0233％；同一樣品不同芯片重復(fù)性分析結(jié)果表明，強(qiáng)度重復(fù)性CV＝17.74％，分子量重復(fù)性CV＝0.0237％。
5，在上述基礎(chǔ)上，確定正常人與非小細(xì)胞肺癌患者血漿鑒別模式，1)建模組正常人血漿33份，非小細(xì)胞肺癌病人血漿32份。
2)獲得血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜中有判別意義的蛋白質(zhì)峰蛋白質(zhì)峰1M/Z 3944；蛋白質(zhì)峰2M/Z 2826。
建立區(qū)分正常人和非小細(xì)胞肺癌病人的血漿蛋白質(zhì)圖譜的判別模式(決策樹模型)，通過血漿中M/Z為3944和2826二個(gè)蛋白質(zhì)即可將肺癌病人鑒別出來(lái)，其準(zhǔn)確率對(duì)肺癌而言為93.75％(30/32)，正常人為93.93％(31/33)。
上述判別模式用于判別實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示特異蛋白質(zhì)3944Da在正常組低表達(dá)，在肺癌患者高表達(dá)，其中I、III期表達(dá)水平高于II期。手術(shù)后即刻血漿表達(dá)水平高于手術(shù)前。在腺癌，鱗癌和腺鱗混合型中表達(dá)無(wú)差異。
肺部疾患(包括支氣管擴(kuò)張、肺炎、肺梗塞)15人血漿SEDLI-TOF-MS檢測(cè)未見特異蛋白質(zhì)3944Da高表達(dá)；胸水患者10人SEDLI-TOF-MS檢測(cè)，其中9例胸水檢測(cè)到癌細(xì)胞，有8例可見特異蛋白質(zhì)3944Da表達(dá)；1例患者為炎性胸水未檢測(cè)到癌細(xì)胞，也沒有特異蛋白質(zhì)3944Da表達(dá)。
表2是特異蛋白質(zhì)3944Da在33例正常和手術(shù)前后的表達(dá)。
表2

6，驗(yàn)證(盲篩結(jié)果)共64份標(biāo)本，其中，病理及臨床證實(shí)其中含正常人標(biāo)本33例，NSCLC病人例31例，33例被判別為正常人中，30例被證明為正常(真陰性)，5例NSCLC病人被判斷為正常人(假陰性)3例被判斷為病人(假陽(yáng)性)，31例被判別為NSCLC病人中，26例被證明為病人(真陽(yáng)性)，5例被判為正常人(假陽(yáng)性)，診斷敏感性＝30/(26+5)＝96.77％診斷特異性＝30/(30+3)＝90.90％陽(yáng)性預(yù)期值＝26/(26+5)＝83.87％陰性預(yù)期值＝30/(30+5)＝85.71％總有效率＝(30+26)/64＝87.50％。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定非小細(xì)胞肺癌血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜的方法，其特征是采用表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)，包括非小細(xì)胞肺癌血漿樣本的采集標(biāo)準(zhǔn)，化學(xué)芯片的選擇、處理和閱讀，測(cè)定條件的優(yōu)化；判別模式及驗(yàn)證，所述的芯片閱讀參數(shù)設(shè)置為1)設(shè)定質(zhì)量范圍2000-20000道爾頓；2)設(shè)定初始激光強(qiáng)度為185；3)設(shè)定檢測(cè)敏感度為8；4)校正聚焦點(diǎn)于孔中央；5)設(shè)定質(zhì)量檢測(cè)器為1000道爾頓；6)設(shè)置數(shù)據(jù)處理為SELDI位置；7)設(shè)定SELDI參數(shù)為22delta至4轉(zhuǎn)換，終點(diǎn)為82；8)設(shè)定濕熱位置至2，強(qiáng)度為10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定非小細(xì)胞肺癌血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜的方法，其中所述的化學(xué)芯片確定為WCX2蛋白芯片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定非小細(xì)胞肺癌血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜的方法，其中所述的芯片閱讀參數(shù)設(shè)置1)，設(shè)定最高質(zhì)量5000道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定非小細(xì)胞肺癌血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜的方法，其特征是所述的判別模式是正常人與非小細(xì)胞肺癌病人鑒別的血漿蛋白質(zhì)M/Z3944，2826及決策樹的判別模式。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種測(cè)定非小細(xì)胞肺癌血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜的方法。本方法采用表面增強(qiáng)激光解析離子化－飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定技術(shù)進(jìn)行肺癌的特異性蛋白峰比較識(shí)別，對(duì)經(jīng)查體各項(xiàng)指標(biāo)正常，且血脂、血糖、肝腎功能，乙肝五項(xiàng)化驗(yàn)均正常的健康人，和經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)為肺癌病人或非小細(xì)胞肺癌病人或肺部疾患的血漿進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在非小細(xì)胞肺癌患者的血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜中顯示有判別意義的蛋白質(zhì)峰，其準(zhǔn)確率對(duì)肺癌而言為93.75％，正常人為 93.93％。本方法能進(jìn)一步為篩查肺癌，尤其是非小細(xì)胞肺癌病人提供簡(jiǎn)易的、特異性技術(shù)手段。也適用于大規(guī)模人群如體檢、流行病學(xué)調(diào)查等，還可用于對(duì)臨床患者的判別。
文檔編號(hào)G01N33/72GK1854732SQ200510025478
公開日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2005年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月27日
發(fā)明者馮久賢, 沙慧芳 申請(qǐng)人:上海市胸科醫(yī)院