專利名稱：新藥物靶點(diǎn)基因CK1α的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物藥物領(lǐng)域，特別是涉及CK1α的拮抗劑在治療疾病中的用途以及用CK1α篩選可能的治療藥物的用途。
背景技術(shù)：
“高質(zhì)量”的藥物靶點(diǎn)基因(簡(jiǎn)稱藥靶)是新藥開(kāi)發(fā)的源頭。人類基因組計(jì)劃的完成雖然為人類帶來(lái)了治療疾病的令人向往的前景，但除大分子蛋白藥外，基因產(chǎn)物本身并不一定是藥靶。從基因到新藥，這一鏈條仍然缺少許多必不可少的環(huán)節(jié)。其中，基因功能研究，因其可以在分子層面上揭示人類健康和疾病的奧秘，尋找出最重要的致病基因，而成為確定基因產(chǎn)物能否成為藥靶的關(guān)鍵步驟。
國(guó)外大型制藥廠已發(fā)現(xiàn)，單靠基因序列數(shù)據(jù)和生物信息分析雖然能夠找到大量潛在藥物靶點(diǎn)基因，但這類基因只能被歸類為“低質(zhì)量”藥靶。藥物開(kāi)發(fā)人員面對(duì)數(shù)目巨大的低質(zhì)量藥靶變得無(wú)所適從，迫切需要大量的基因功能研究加以驗(yàn)證，才能篩選出新藥開(kāi)發(fā)可以依賴的“高質(zhì)量”靶點(diǎn)。所以，功能基因組學(xué)研究蘊(yùn)藏著巨大的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)前景。
在目前可以作為靶點(diǎn)的5,000個(gè)基因中，磷酸激酶(kinase)的序列有很大的保守性(conservativity)，是公認(rèn)的藥物篩選基因靶點(diǎn)，與磷酸酶(phosphatase)、蛋白酶(protease)以及各類受體統(tǒng)稱為一類靶點(diǎn)。磷酸激酶(kinase)將ATP或GTP位的磷酯基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上，催化蛋白質(zhì)磷酸化，蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)其功能/活性的一種重要方式。如MAPK和轉(zhuǎn)錄因子CREB，Jun等，在磷酸化狀態(tài)時(shí)具有活性，而在非磷酸化狀態(tài)時(shí)沒(méi)有活性；而抑制因子IκB等則相反，在磷酸化狀態(tài)時(shí)被降解而失去活性，而在非磷酸化狀態(tài)時(shí)具有活性。蛋白質(zhì)的磷酸化-去磷酸化是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是指細(xì)胞通過(guò)位于胞膜或胞內(nèi)的受體，感受細(xì)胞外信息分子的刺激，經(jīng)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而幾乎調(diào)節(jié)著生命活動(dòng)的所有過(guò)程，包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化，神經(jīng)活動(dòng)，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發(fā)生等。人類很多疾病都與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)，如在腫瘤壞死因子(TNF)導(dǎo)致的炎癥(inflammation)反應(yīng)中，腫瘤壞死因子通過(guò)結(jié)合受體激活一系列蛋白磷酸激酶之間的相互作用，最終激活NF-κB而引起炎癥反應(yīng)。生物化學(xué)家以及不少公司都在通過(guò)研究蛋白之間的相互作用來(lái)揭示信號(hào)傳遞通路的關(guān)鍵部位，并開(kāi)發(fā)影響信號(hào)傳遞的藥物，以達(dá)到治療疾病的目的。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的順利進(jìn)行有賴于多種蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、蘇氨酸殘基磷酸化及絲氨酸殘基磷酸化，而這個(gè)過(guò)程正是由磷酸激酶催化完成的。
鑒于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化和多種疾病發(fā)生過(guò)程中的重要、甚至決定性的作用，以及磷酸激酶在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路極其重要的地位，設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)以磷酸激酶為靶點(diǎn)的新藥，通過(guò)調(diào)節(jié)、控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療疾病，無(wú)疑是一種針對(duì)性強(qiáng)、高效的理想途徑，具有治療多種疾病的潛在前景。目前針對(duì)激酶的藥物包括PKC活性調(diào)節(jié)劑、PKA抑制劑、PTK抑制劑和受體介導(dǎo)的鈣通道調(diào)節(jié)劑等，其中部分已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。但現(xiàn)有的激酶藥物靶點(diǎn)尚遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類戰(zhàn)勝疾病、攻克腫瘤的需求，我們?nèi)孕韪禺?、更有效的新的激酶作為藥靶，從而有效拓寬治療疾病的途徑，增進(jìn)人類的健康。
腫瘤壞死因子(TNFα)是一個(gè)多功能的細(xì)胞因子，主要參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)和免疫功能的調(diào)節(jié)，也能夠調(diào)控某些腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程。TNFα與受體結(jié)合后，在效應(yīng)細(xì)胞中可以激活不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括NF-κB、JNK及細(xì)胞調(diào)亡途徑的活化，從而表現(xiàn)出不同的細(xì)胞效應(yīng)。異常的TNFα產(chǎn)生和持續(xù)活化與多種人類疾病有關(guān)，如敗血癥，休克，糖尿病，移植排斥，以及多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和免疫性腸病等多種自身免疫疾病。在TNFα異常引起的炎癥性疾病中，NF-κB通路的活化是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。后者是一類細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。最近的研究也顯示，在慢性炎癥進(jìn)展至癌前病變，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的過(guò)程中，NF-κB起了非常重要的促進(jìn)作用。因此，在臨床治療當(dāng)中，開(kāi)發(fā)TNα的阻斷劑，或者拮抗TNFα激活NF-κB環(huán)節(jié)的藥物，是未來(lái)抑制炎癥藥物的研究開(kāi)發(fā)方向。對(duì)于前者，全球最大生物技術(shù)公司Amgen的Enbrel，制藥巨頭強(qiáng)生公司的Remicade和雅培公司的Humira，這些藥物都是TNFα的基因工程可溶性受體，可以阻斷與細(xì)胞受體的結(jié)合；這些藥物的年銷售額突破了十億美金，已經(jīng)成為藥物界名副其實(shí)的新型“重磅炸彈”藥物。針對(duì)于阻斷TNFα細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的藥物開(kāi)發(fā)，已成為下一步藥物開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)，目前尚無(wú)有針對(duì)性的藥物報(bào)道。
因此，目前對(duì)于尋找TNFα細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通道的抑制劑及其作用機(jī)制有迫切的需要。

發(fā)明內(nèi)容
為了這種需求，本發(fā)明人通過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)CK1α能夠?qū)F-κB通路的活性產(chǎn)生影響，并利用該機(jī)制確定了在該通路中與其作用的受體蛋白為RIP(receptorinteracting protein受體結(jié)合蛋白)。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種篩選NF-κB通道受體的方法，該方法包括a)使CK1α和可能的受體在細(xì)胞中接觸；b)測(cè)定NK-κB表達(dá)的上調(diào)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了CK1α蛋白拮抗劑在制備下調(diào)NF-κB的藥物中的用途。優(yōu)選該藥物用于治療TNFα異常引起的炎癥性疾病。更優(yōu)選的，炎癥性疾病選自敗血癥、休克、糖尿病、移植排斥、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和免疫性腸病。
在該方面的一個(gè)實(shí)施例中，CK1α蛋白拮抗劑是CK1α蛋白的46位賴氨酸突變?yōu)楸彼帷?br> 在該方面的另一個(gè)實(shí)施例中，CK1α拮抗劑作用與CK1α競(jìng)爭(zhēng)RIP受體位點(diǎn)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了CK1α蛋白拮抗劑在制備抑制p53基因的藥物中的用途。優(yōu)選CK1α蛋白拮抗劑是CK1α蛋白的46位賴氨酸突變?yōu)楸彼岬耐蛔凅w。
在此，“拮抗劑”指能夠抑制CK1α功能的那些物質(zhì)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白，其可以是突變的無(wú)活性蛋白質(zhì)，與野生型蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)；或與CK1α蛋白結(jié)合使其失活的化合物；還包括核酸水平上的反義核酸；能夠表達(dá)CK1α失活蛋白的表達(dá)載體等。


圖1是應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究CK1a對(duì)NF-κB活性的影響的結(jié)果。用加入的各種樣品對(duì)NF-κB-Luc的表達(dá)活性作圖。圖1A顯示了CK1α能增強(qiáng)TNFα對(duì)NF-κB報(bào)告基因的激活作用，而CK1αM可以抑制該效應(yīng)。圖1B顯示了CK1α對(duì)NF-κB報(bào)告基因有激活作用。
圖2是實(shí)施例2的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。
圖3是實(shí)施例3的反向及半內(nèi)源性免疫共沉淀的結(jié)果。圖3A是在293T細(xì)胞中共表達(dá)FLAG-RIP與MYC空載體或MYC-CK1a，用抗MYC免疫沉淀表達(dá)蛋白，用抗FLAG檢測(cè)。圖3B是內(nèi)源性RIP結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)的FLAG-CK1a。在293T細(xì)胞中表達(dá)FLAG-CK1a，用FLAG抗體和對(duì)照MYC抗體免疫沉淀，用RIP抗體檢測(cè)。
圖4A是RIP的結(jié)構(gòu)域組成及其分段克隆策略的示意圖。
圖4B是實(shí)施例4的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。
圖5A是實(shí)施例5的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。
圖5B是實(shí)施例5中的體外磷酸化實(shí)驗(yàn)的放射性自顯影分析結(jié)果。
圖6是應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究CK1a對(duì)RIP對(duì)NF-κB報(bào)告基因的激活作用的結(jié)果。用加入的各種樣品對(duì)NF-κB-Luc的表達(dá)活性作圖。圖6A顯示在293T細(xì)胞中，CK1α能增強(qiáng)RIP對(duì)NF-κB報(bào)告基因的激活作用，而CK1αM可以抑制該效應(yīng)。圖6B顯示在Hela細(xì)胞中，CK1α增強(qiáng)RIP-IM對(duì)NF-κB報(bào)告基因的激活作用，而CK1αM可以抑制該效應(yīng)。
圖7A顯示了突變體CK1αM抑制p53介導(dǎo)的熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)果。
圖7B顯示了不同劑量的野生型CK1αW和突變體CK1αM對(duì)p53介導(dǎo)的熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。
圖7C是蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果，顯示了不同劑量野生型CK1αW和突變體CK1αM轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞裂解液中的蛋白含量的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
我們的研究重點(diǎn)為，尋找TNFα激活NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)通路中新的藥靶分子。為此，我們首先建立了應(yīng)用熒光素酶作為報(bào)告基因檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞NF-κB活性的篩選平臺(tái)，即將含有NF-κB啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒與目標(biāo)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在目標(biāo)蛋白表達(dá)后一定時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的活性即可判斷目標(biāo)蛋白是否能夠活化或者抑制NF-κB通路。在對(duì)一批功能未明確的蛋白激酶的篩選過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)野生型(WT)CK1α[其核酸序列g(shù)enebank登錄號(hào)NM_001892]能增強(qiáng)TNFα對(duì)NF-KB報(bào)告基因的激活作用，而磷酸激酶功能域中一個(gè)點(diǎn)突變(Mut)所至的激酶失活的突變體CK1αM就能達(dá)到抑制TNFα效應(yīng)的50％，說(shuō)明CK1α確實(shí)對(duì)NF-KB的通路有影響。
我們的功能學(xué)研究顯示，CK1α能夠?qū)F-KB通路的活性產(chǎn)生影響，但因?yàn)榧?xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的復(fù)雜性，要確立CK1α對(duì)NF-KB通路的作用不是一種非特異性的現(xiàn)象，則必需尋找其在NF-KB通路上的相互作用蛋白以證實(shí)CK1α是NF-KB通路上的一個(gè)新的成員，這也有助于闡明CK1α在NF-κB活化通路中的作用機(jī)制。我們選取了該通路中的一些關(guān)鍵成員TNFR1(胞內(nèi)區(qū))、TRAF2、RIP和TRAF6與CK1α進(jìn)行了哺乳動(dòng)物過(guò)表達(dá)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK1α可與TNFR1(胞內(nèi)區(qū))、RIP和TRAF6免疫共沉淀，而與TRAF2未能共沉淀，這提示CK1α與TNFR1、RIP和TRAF6間有相互作用關(guān)系，而與TRAF2無(wú)相互作用，表明CK1α確實(shí)是TNFα引起的NF-κB活化通路中一個(gè)新的成員。發(fā)現(xiàn)CK1α與RIP[其核酸序列的genebank獲取號(hào)NM_003804]間的相互作用是很令人興奮的，因?yàn)榛蚯贸龑?shí)驗(yàn)顯示，RIP對(duì)TNF引起的NF-κB激活是不可或缺的，RIP敲除細(xì)胞在TNFα刺激時(shí)完全喪失了NF-κB轉(zhuǎn)錄活化效應(yīng)(見(jiàn)參考文獻(xiàn)1)，而TRAF2敲除后仍然保留大部分活化效應(yīng)。這意味著抑制或阻斷RIP的功能就可以成為一種抑制NF-κB活化的新方法。同時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)也觀察到CK1α與RIP間的相互作用非常強(qiáng)，故此我們進(jìn)一步研究了CK1α與RIP的相互關(guān)系以及兩者之間的功能上的影響。
我們應(yīng)用反向免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，RIP能夠與免疫沉淀的CK1α相結(jié)合；為驗(yàn)證兩者在細(xì)胞生理狀態(tài)下是否結(jié)合，我們采取了更為嚴(yán)謹(jǐn)、接近生理狀態(tài)的半內(nèi)源性免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)方法，也能夠確認(rèn)CK1α與RIP間的相互作用關(guān)系。為明確CK1α與RIP的結(jié)合區(qū)段，我們進(jìn)行了RIP分段的免疫共沉淀研究。根據(jù)RIP的功能結(jié)構(gòu)域，我們將其分為三段，即激酶結(jié)構(gòu)域(KD)、死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain；DD)以及兩者之間的中間區(qū)(Intermediate domain；IM)，與CK1α全長(zhǎng)進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK1α不能與死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而與另兩個(gè)區(qū)段都可以結(jié)合。就RIP結(jié)構(gòu)域的功能來(lái)看，中間區(qū)(Intermediate domain)是激活NF-κB的重要區(qū)域，而死亡結(jié)構(gòu)域則主要介導(dǎo)RIP引起的細(xì)胞凋亡。我們?cè)诶迷诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)的方法分別觀察了CK1α及其CK1αM對(duì)RIP和RIP-IM引起的NF-κB激活的影響。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染RIP及其中間區(qū)均可引起NF-κB報(bào)告基因的顯著活化，前兩者分別與CK1α共轉(zhuǎn)染時(shí)，都能夠增加NF-κB報(bào)告基因的活化；而與CK1αM共轉(zhuǎn)染時(shí)，則表現(xiàn)為相反的效應(yīng)，都能夠抑制NF-κB報(bào)告基因的活化。這表明，CK1α不僅與RIP有確實(shí)的相互作用，而且存在功能上的影響。
有關(guān)CK1α的多項(xiàng)研究顯示它影響多種細(xì)胞信號(hào)通路的傳導(dǎo)。以往文獻(xiàn)研究表明，其作用的通常方式為與細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白相互作用，并且磷酸化后者，改變了后者的生物學(xué)活性，從而對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生影響(見(jiàn)參考文獻(xiàn)2)。我們前述研究顯示了CK1α與CK1αM對(duì)NF-κB活性效應(yīng)表現(xiàn)為相反的影響，這說(shuō)明其對(duì)NF-κB的效應(yīng)是與其激酶活性密切相關(guān)的。這提示，RIP可能是CK1α作用的底物，我們又進(jìn)一步進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)及體外磷酸化研究。因?yàn)镽IP本身也是一種激酶，為排除其自身磷酸化的影響，我們構(gòu)建了激酶失活的突變體RIP-M。RIP-M與CK1α或CK1αM共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，進(jìn)行蛋白表達(dá)的分析，可以發(fā)現(xiàn)RIP-M與CK1α共轉(zhuǎn)的反應(yīng)中，RIP-M蛋白表達(dá)有一條類似于磷酸化的電泳延遲帶(supershift)，而CK1αM和空對(duì)照質(zhì)粒未見(jiàn)此條帶，表明CK1α可以使RIP獲得某種方式的修飾。我們又進(jìn)行了體外磷酸化實(shí)驗(yàn)研究，RIP-M與CK1α(或CK1αM)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，將表達(dá)產(chǎn)物免疫共沉淀，加入[γ-32P]-ATP體外反應(yīng)后放射自顯影分析，與CK1α共轉(zhuǎn)的反應(yīng)中有RIP-M的放射性條帶，而RIP-M與CK1αM和空載體共轉(zhuǎn)的樣品中沒(méi)有該條帶，表明發(fā)現(xiàn)RIP-M確實(shí)可以特異地被CK1α所磷酸化。我們?cè)诖竽c桿菌中表達(dá)并純化了RIP激酶結(jié)構(gòu)域、死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain)以及兩者之間的中間區(qū)(Intermediate domain)的GST融合蛋白，將其作為底物分別與免疫沉淀純化的CK1α，CK1αM蛋白進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示RIP中間區(qū)的GST融合蛋白磷酸化最為顯著。
我們的實(shí)驗(yàn)研究表明，CK1α能夠影響NF-κB的通路的信號(hào)傳導(dǎo)，野生型CK1α能增強(qiáng)TNFα對(duì)NF-KB的激活作用，而激酶失活的突變體CK1αM對(duì)此有抑制作用。我們觀察到CK1α跟TNFR1、RIP間存在相互作用關(guān)系，而與TRAF2沒(méi)有相互作用；進(jìn)一步研究表明CK1α可以和RIP的激酶結(jié)構(gòu)域(KD)和中間區(qū)(IM)結(jié)合，而與死亡結(jié)構(gòu)域(DD)間不結(jié)合。同時(shí)這種相互作用也有功能上的影響，對(duì)于RIP及其中間區(qū)過(guò)表達(dá)所引起NF-κB報(bào)告基因的活化，與CK1α共轉(zhuǎn)染時(shí)，都能夠增加該效應(yīng)；而與CK1αM共轉(zhuǎn)染時(shí)，則能表現(xiàn)為該效應(yīng)的抑制。我們進(jìn)一步的研究顯示，CK1α可以磷酸化RIP。這種修飾可能跟RIP引起NF-κB激活的活性有關(guān)。
應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，野生型(WT)CK1α(CK1αW)能增強(qiáng)p53的激活作用，而磷酸激酶功能域中一個(gè)點(diǎn)突變(Mut)所至的激酶失活的突變體CK1αM(K46A)，就能達(dá)到抑制p53功能的50％。
P53基因是人類惡性腫瘤中最常見(jiàn)的基因改變，位于17號(hào)染色體短臂1區(qū)4帶，有兩種構(gòu)型。野生型P53是抗癌基因，正常情況下，致突變因子引起DNA破壞，迅速誘導(dǎo)野生型p53，它激活p21的轉(zhuǎn)錄，從而阻滯細(xì)胞周期于G1期，并結(jié)合增殖細(xì)胞核抗株(PCNA)而抑制DNA復(fù)制，使破壞的DNA在復(fù)制之前有修復(fù)的時(shí)間；突變型p53則喪失了DNA破壞后細(xì)胞周期停頓的能力，還具有促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化的活性。缺乏野生型p53的腫瘤細(xì)胞不能凋亡，維持了腫瘤細(xì)胞的生存，也增加了對(duì)化療和放療的耐藥性。p53基因突變率高達(dá)50％以上，在大多數(shù)的人類癌癥如白血病、淋巴瘤、肉瘤、腦瘤、乳腺癌、胃腸道癌及肺癌等癌癥中常呈失活狀態(tài)。因此，CK1α(CK1αW)對(duì)p53的激活作用，在腫瘤的診治領(lǐng)域具有重要的研究應(yīng)用價(jià)值。
綜上所述，我們的研究結(jié)果提示，CK1α在NF-κB和P53通路信號(hào)傳導(dǎo)中有重要的價(jià)值，而且我們的研究也初步確立了CK1α的作用機(jī)制。從中可以看出，CK1α可以作為一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)、篩選針對(duì)性抑制CK1α激酶的藥物或治療方法，能夠抑制NF-κB的過(guò)度活化、并激活P53功能。這一點(diǎn)，為治療臨床NF-κB的過(guò)度活化所致的炎性疾病，防止慢性炎癥癌變，以及腫瘤藥物篩選，提供了新的藥物開(kāi)發(fā)途徑。
實(shí)施例1、應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究CK1a對(duì)NF-κB活性的影響我們構(gòu)建了在5’側(cè)含有NF-κB啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pNF-κB-Luc)，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，熒光素酶的表達(dá)及活性就會(huì)依賴于細(xì)胞內(nèi)NF-κB基因的激活。在此基礎(chǔ)上，我們建立了應(yīng)用熒光素酶作為報(bào)告基因檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞NF-κB活性的篩選平臺(tái)，并應(yīng)用此平臺(tái)對(duì)一批功能未明確的蛋白激酶進(jìn)行了活性篩選。我們選用了Hela和293T細(xì)胞株進(jìn)行相應(yīng)的研究。研究中發(fā)現(xiàn)野生型(WT)CK1α能增強(qiáng)TNF對(duì)NF-KB報(bào)告基因的激活作用，而磷酸激酶功能域中一個(gè)點(diǎn)突變(Mut)所至的激酶失活的突變體CK1αM就能達(dá)到抑制TNFα功能的50％。具體實(shí)施如下將Hela細(xì)胞以5*104/500μl的密度接種(293T細(xì)胞為8*104/500μl)至24孔皿，培養(yǎng)24小時(shí)后用Lipofectamine2000試劑及推薦方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔總的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量0.5μg，包括0.05μg pNF-κB-Luc質(zhì)粒和不同劑量的目的質(zhì)粒，不足者用pEF-BOS空質(zhì)粒補(bǔ)齊；每個(gè)樣品作3個(gè)重復(fù)孔以消除實(shí)驗(yàn)誤差；設(shè)立pEF-BOS空質(zhì)粒作為空白對(duì)照(MOCK)。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，每孔換液，加入200μl含TNFα(20ng/ml)的含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液。刺激12小時(shí)后，吸干培養(yǎng)液，24孔板中每孔加入100μl的1×PBL緩沖液裂解液，在搖床上振蕩10-15分鐘。置于冰上后，取出5μl裂解液，加入發(fā)光管中，在生物發(fā)光檢測(cè)儀上進(jìn)行檢測(cè)。另外，我們也單獨(dú)轉(zhuǎn)染了不同劑量的CK1α，24小時(shí)后，觀察分析了它對(duì)NF-κB報(bào)告基因活性的影響。PBL緩沖液與熒光素酶檢測(cè)底物均來(lái)自“Promega Dual-luciferase assay system”。
結(jié)果顯示TNFα刺激能顯著增加NF-κB報(bào)告基因活性，而野生型(WT)CK1α能增強(qiáng)TNFα對(duì)NF-KB報(bào)告基因的激活作用，而CK1αM在400ng劑量時(shí)就能達(dá)到抑制TNFα激活NF-κB報(bào)告基因活性的50％以上。而單轉(zhuǎn)CK1α也能夠刺激NF-KB報(bào)告基因的活化。(見(jiàn)圖示1A，1B。)實(shí)施例2、篩選與CK1a相互作用NF-κB途徑上的關(guān)鍵分子我們選取了該通路中的一些關(guān)鍵成員TNFR1(胞內(nèi)區(qū))、TRAF2和RIP與CK1α進(jìn)行了哺乳動(dòng)物過(guò)表達(dá)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究。具體實(shí)施如下以3×106/10cm培養(yǎng)皿的293T細(xì)胞鋪板培養(yǎng)24小時(shí)后，用磷酸鈣方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中每個(gè)樣品加CK1α質(zhì)粒(帶HA表達(dá)標(biāo)簽)6μg，另一帶FLAG表達(dá)標(biāo)簽的共轉(zhuǎn)質(zhì)粒6μg(RIP質(zhì)粒為4μg加CrmA質(zhì)粒2μg)。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收獲293T細(xì)胞，加入1ml含1％NP40的裂解液，4℃振蕩30min。4℃12,000rpm 15min離心，吸取上清。取500μl上清用于免疫共沉淀研究，加入2μg的小鼠抗FLAG抗體，混勻后置于4℃振蕩1小時(shí)。加入20μl的50％protein G beads懸液，混勻后置于4℃振蕩過(guò)夜。4℃ 2,000rpm 2min離心，棄上清。用預(yù)冷裂解液洗三次，再用含500mM氯化鈉預(yù)冷的預(yù)冷高鹽裂解液洗兩次，最后加預(yù)冷TBS洗三次，棄上清，加入20μl 2×蛋白上樣緩沖液，電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用抗HA抗體蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)。
結(jié)果顯示帶HA表達(dá)標(biāo)簽CK1α蛋白可存在于FLAG-TNFR1(胞內(nèi)區(qū))、FLAG-RIP和FLAG-TARF6的抗體免疫沉淀產(chǎn)物中，而在FLAG-TARF2的免疫沉淀產(chǎn)物中不存在(見(jiàn)圖2)。表明CK1α與TNFR1、RIP和TARF6間有相互作用，而與TRAF2無(wú)相互作用[注圖中IP指用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫沉淀；WB指用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)]。
實(shí)施例3、用反向及半內(nèi)源性免疫共沉淀的方法確認(rèn)RIP與CK1a的相互作用為了確認(rèn)RIP與CK1a間的相互作用，我們又用CK1α質(zhì)粒所攜帶的標(biāo)簽抗體進(jìn)行了免疫沉淀，用RIP質(zhì)粒的標(biāo)簽進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)，即反向免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)RIP確實(shí)存在于CK1α的免疫沉淀中。
我們又采取了更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)陌雰?nèi)源性免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)方法。以3×106/10cm培養(yǎng)皿的293T細(xì)胞鋪板培養(yǎng)24小時(shí)后，用磷酸鈣方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每個(gè)10cm培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染12μgFLAG表達(dá)標(biāo)簽CK1α質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收獲細(xì)胞，加入1ml含1％NP40的裂解液，4℃振蕩30min。4℃12,000rpm 15min離心，吸取上清。取1ml上清用于免疫共沉淀研究，加入2μg的小鼠抗FLAG抗體，設(shè)另一管加2μg的小鼠抗MYC抗體作為陰性對(duì)照，混勻后置于4℃振蕩1小時(shí)。后續(xù)免疫沉淀方法同上述實(shí)施例2，最后樣品用抗RIP的小鼠單抗進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果顯示，抗FLAG抗體免疫沉淀的產(chǎn)物中，細(xì)胞內(nèi)源性的RIP可與過(guò)表達(dá)FLAG-CK1α共沉淀；而作為對(duì)照的抗MYC抗體免疫沉淀產(chǎn)物中，無(wú)RIP蛋白。說(shuō)明，細(xì)胞內(nèi)源性的RIP可與過(guò)表達(dá)的FLAG-CK1α相互作用。(見(jiàn)圖3)實(shí)施例4、確認(rèn)RIP與CK1a結(jié)合的結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上，RIP蛋白可以分為三個(gè)顯著的功能結(jié)構(gòu)域，即激酶結(jié)構(gòu)域(17-289AA)、死亡結(jié)構(gòu)域(583-669AA)(Death domain)以及兩者之間的中間區(qū)(Intermediate domain)。三種結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)不同的細(xì)胞效應(yīng)，激酶結(jié)構(gòu)域決定RIP的蛋白激酶活性，RIP所引起的NF-κB的活化主要由中間區(qū)介導(dǎo)，而RIP的死亡結(jié)構(gòu)域與RIP引起的細(xì)胞凋亡相關(guān)。為了確認(rèn)與CK1α相互作用的結(jié)構(gòu)域，并以此來(lái)判斷CK1α對(duì)RIP的主要功能影響，我們分段表達(dá)了RIP的三個(gè)結(jié)構(gòu)域，并與全長(zhǎng)的RIP進(jìn)行了免疫共沉淀研究。
RIP的分段克隆策略引物設(shè)計(jì)(實(shí)線下為sfiI酶切位點(diǎn))FRIP-1 ACAGCGGCCAATCCGGCCCAACCAGACATGTCCTTGAATGTRRIP-301 TCGAGGGCCTCTAAGGCCTTACACGTCCTCTTCTACACTTTCTTCFRIP-293 ACAGCGGCCAATCCGGCCGAAGAAAGTGTAGAAGAGGACGTGRRIP-558 TCGAGGGCCTCTAAGGCCTTAGTCTAGTAGTGATGAACTCGTCCCFRIP-550 ACAGCGGCCAATCCGGCCGGGACGAGTTCATCACTACTAGACRRIP-671 TCGAGGGCCTCTAAGGCCGTTCTGGCTGACGTAAATCAAGCTG以引物FRIP-1，RRIP-301；FRIP-293，RRIP-558；FRIP-550，RRIP-671配對(duì)，以包含RIP全長(zhǎng)的pEF-BOS-FLAG-RIP質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳，回收正確的擴(kuò)增片段，用sfiI酶切，回收酶切片段，與經(jīng)過(guò)sfiI酶切的pEF-BOS質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，我們獲得了帶有FLAG表達(dá)標(biāo)簽的RIP分段表達(dá)載體即pEF-BOS-FLAG-RIP(1-301AA)；pEF-BOS-FLAG-RIP(293-558AA)；pEF-BOS-FLAG-RIP(550-671AA)(圖4A)。
含有不同RIP片段的質(zhì)粒與帶HA標(biāo)簽的CK1α質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，細(xì)胞裂解產(chǎn)物用FLAG抗體免疫沉淀，用抗HA抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)(圖4B)。
結(jié)果顯示HA-CK1α可與存在于pEF-BOS-FLAG-RIP(1-301AA)及pEF-BOS-FLAG-RIP(293-558AA)的免疫沉淀產(chǎn)物中，而不在pEF-BOS-FLAG-RIP(550-671AA)的免疫沉淀產(chǎn)物中，表明CK1α可與RIP的激酶結(jié)構(gòu)域和中間區(qū)(Intermediate domain)結(jié)合，而與死亡結(jié)構(gòu)域間沒(méi)有相互作用(見(jiàn)圖4B)。
實(shí)施例5、用體外磷酸化技方法研究CK1a對(duì)RIP的磷酸化作用CK1α是一種蛋白激酶，多項(xiàng)研究顯示它影響多種細(xì)胞信號(hào)通路的傳導(dǎo)。從以往文獻(xiàn)看，其作用的通常方式為與細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白相互作用，并且磷酸化后者，改變了后者的生物學(xué)活性，從而對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生影響。鑒于CK1α與RIP的相互作用，為證實(shí)它們之間是否存在彼此磷酸化的的修飾，我們又進(jìn)行了相應(yīng)的磷酸化實(shí)驗(yàn)研究。因?yàn)镽IP本身也是一種激酶，為排除其自身化的影響，我們突變了激酶結(jié)構(gòu)域中結(jié)合ATP的氨基酸位點(diǎn)，將其45位的賴氨酸(K)突變?yōu)楸彼?A)，獲得了激酶失活的突變體RIP-M。在RIP-M與CK1α共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行蛋白表達(dá)的分析的研究中，我們發(fā)現(xiàn)RIP與CK1α共轉(zhuǎn)的反應(yīng)中，RIP蛋白表達(dá)有一條磷酸化的電泳延遲帶(supershift band)，而CK1αM和空對(duì)照質(zhì)粒未見(jiàn)此條帶，表明CK1α可以使RIP獲得某種方式的修飾。在體外磷酸化實(shí)驗(yàn)研究中，我們發(fā)現(xiàn)CK1α可以磷酸化RIP-M。
以1.6*104/1ml的密度鋪293T至12孔皿，培養(yǎng)24小時(shí)后用Lipofectamine2000試劑及推薦方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)染0.25μg FLAG-RIP-M及等量的CrmA質(zhì)粒，分別1.1μg pEF-BOS空質(zhì)粒，F(xiàn)LAG-CK1α和FLAG-CK1αM共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，加入含有1％磷酸酶抑制劑的1×PBL緩沖液裂解液，4℃振蕩30min，取樣加相同量的2×蛋白上樣緩沖液，電泳后轉(zhuǎn)膜，用抗FLAG抗體蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)，可見(jiàn)FLAG-RIP-M與CK1a共轉(zhuǎn)染蛋白電泳分析有一電泳延遲條帶。(圖5A)。
體外磷酸化實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)中，首先FLAG-RIP-M與FLAG-CK1α質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并設(shè)立FLAG-RIP-M與pEF-BOS空質(zhì)粒；FLAG-RIP-M與FLAG-CK1αM為對(duì)照，F(xiàn)LAG-RIP-M加量4μg，另一質(zhì)粒為6μg，每個(gè)樣品中均加入2μg CrmA質(zhì)粒。裂解收獲蛋白后用抗FLAG進(jìn)行免疫沉淀。293T細(xì)胞的鋪板、轉(zhuǎn)染和免疫沉淀方法參見(jiàn)實(shí)施例2。免疫沉淀產(chǎn)物依次用裂解液、高鹽裂解液和激酶緩沖液(配方見(jiàn)附錄2)洗滌，均于冰上操作，各洗三遍。取1/3的免疫沉淀產(chǎn)物用于蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)，其余樣品用于激酶分析。臨用前在激酶緩沖液中加入終濃度為1mM的MnCl2，和1％的磷酸酶抑制劑(來(lái)自sigma公司)。每個(gè)樣品中加入20μl激酶緩沖液和5微居的(μCi)的[γ-32P]-ATP，30℃溫育30分鐘，其間每隔五分鐘混勻一次。加入4μl的6×蛋白上樣緩沖液終止反應(yīng)，95℃保溫5分鐘，冷卻后離心，取10μl在8％的SDS-PAGE膠上進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行放射自顯影分析。圖5B顯示，在Hela細(xì)胞中，CK1α增強(qiáng)RIP-IM對(duì)NF-κB報(bào)告基因的激活作用，而CK1αM可以抑制該效應(yīng)(見(jiàn)圖5B)。
實(shí)施例6、觀察CK1a對(duì)RIP激活NF-κB的影響前述實(shí)驗(yàn)證實(shí)CK1α可與RIP全長(zhǎng)及RIP的激酶結(jié)構(gòu)域和中間區(qū)結(jié)合，這種結(jié)合是否有功能上的相互影響，我們又進(jìn)行了相應(yīng)的研究。對(duì)于RIP的功能，目前已經(jīng)確認(rèn)的主要是介導(dǎo)NF-κB激活，另外RIP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過(guò)表達(dá)也會(huì)引起細(xì)胞凋亡。我們利用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)的方法分別觀察了CK1α及其CK1αM對(duì)RIP和RIP-IM對(duì)NF-κB激活的改變。
RIP及RIP-IM和CK1α/CK1αM共轉(zhuǎn)染的報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)方法參見(jiàn)實(shí)施例1，其中RIP與RIP-IM的轉(zhuǎn)染劑量為25ng，加同等劑量的CrmA質(zhì)粒，其共轉(zhuǎn)質(zhì)粒pEF-BOS/CK1α/CK1αM劑量為0.4μg，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后裂解細(xì)胞，分析其發(fā)光值。結(jié)果見(jiàn)圖6。
實(shí)施例7、應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究CK1a對(duì)P53活性的影響我們構(gòu)建了在5’側(cè)含有p53啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(p53-luciferase reporter plasmid)，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，熒光素酶的表達(dá)及活性就會(huì)依賴于細(xì)胞內(nèi)p53基因的激活。在此基礎(chǔ)上，我們建立了應(yīng)用熒光素酶作為報(bào)告基因檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞p53活性的篩選平臺(tái)，并應(yīng)用此平臺(tái)對(duì)一批功能 未明確的蛋白激酶進(jìn)行了活性篩選。我們選用了Hela和293T細(xì)胞株進(jìn)行相應(yīng)的研究。研究中發(fā)現(xiàn)野生型(WT)CK1α(CK1αW)能增強(qiáng)p53對(duì)p53報(bào)告基因的激活作用，而磷酸激酶功能域中一個(gè)點(diǎn)突變(Mut)所至的激酶失活的突變體CK1αM(K46A)就能達(dá)到抑制p53功能的50％。具體實(shí)施如下將Hela細(xì)胞以5×104/500μl的密度接種(293T細(xì)胞為8×104/500μl)至24孔皿，培養(yǎng)24小時(shí)后用Lipofectamine2000試劑及推薦方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔總的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量0.525μg，包括0.0255μg pCDEF-p53，pP53-Luc質(zhì)粒和不同劑量的目的質(zhì)粒，不足者用pEF-BOS空質(zhì)粒補(bǔ)齊；每個(gè)樣品作3個(gè)重復(fù)孔以消除實(shí)驗(yàn)誤差；設(shè)立pEF-BOS空質(zhì)粒作為空白對(duì)照(MOCK)。轉(zhuǎn)染后5小時(shí)，每孔換液，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，吸干培養(yǎng)液，24孔板中每孔加入100μl的1×PBL緩沖液裂解液，在搖床上振蕩10-15分鐘。置于冰上后，取出30μl裂解液，加入發(fā)光管中，在生物發(fā)光檢測(cè)儀上進(jìn)行檢測(cè)。另外，我們也單轉(zhuǎn)了不同劑量的CK1α，24小時(shí)后，觀察分析了它對(duì)p53報(bào)告基因活性的影響。PBL緩沖液與熒光素酶檢測(cè)底物均來(lái)自“PromegaDual-luciferase assay system”。
結(jié)果顯示野生型CK1αW能增強(qiáng)p53報(bào)告基因的激活作用，而CK1αM以劑量依賴的方式抑制p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因活性。而單轉(zhuǎn)CK1αM也能夠抑制p53報(bào)告基因的活化。(見(jiàn)圖示7。)實(shí)驗(yàn)中涉及主要試劑來(lái)源細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000為Invitrogen公司產(chǎn)品熒光素酶檢測(cè)底物來(lái)自Promega Dual-luciferase assay system實(shí)驗(yàn)中涉及載體來(lái)源報(bào)告基因質(zhì)粒pNF-κB-Luc，pP53-Luc由上海睿星公司生產(chǎn)提供細(xì)菌蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-1為Pharmacia Biotech Inc產(chǎn)品真核細(xì)胞表達(dá)載體為pEF-BOS；pEF-BOS-FLAG；pCDEF-MYC；pCDEF-HA均由上海睿星公司生產(chǎn)提供含有相應(yīng)基因的載體均是將目的基因克隆入上述帶有不同表達(dá)標(biāo)簽的載體中構(gòu)建獲得。如pEF-BOS-FLAG-RIP質(zhì)粒表示在pEF-BOS-FLAG載體上有RIP基因。
實(shí)驗(yàn)中涉及抗體來(lái)源抗-RIP單克隆抗體購(gòu)自BD biosciences公司抗-FLAG；抗-FLAG-HRP單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司抗-MYC；抗-HA；抗-MYC-HRP；抗-HA-HRP單克隆抗體均由上海睿星公司生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)中涉及細(xì)胞說(shuō)明及來(lái)源Hela人宮頸癌上皮細(xì)胞293T人胚腎細(xì)胞，包含SV40病毒的大T抗原以上細(xì)胞均由從ATCC獲得，由上海睿星公司冷凍保存參考文獻(xiàn)(1)Kelliher，M.A.，Grimm，S.，Ishida，Y.，Kuo，F(xiàn).and Leder，P.The death domainkinase RIP mediates the TNF-a induced NF-kB signal.Immunity，1998，8297-303(2)Knippschild U，Gocht A，Wolff S，Huber N，Lohler J，Stoter M.The casein kinase 1familyparticipation in multiple cellular processes in eukaryotes.Cell Signal.2005Jun；17(6)675-89.
權(quán)利要求
1.一種篩選NF-κB通道受體的方法，其特征在于，該方法包括a)使CK1α和可能的受體在細(xì)胞中接觸；b)測(cè)定NK-κB表達(dá)的上調(diào)。
2.CK1α蛋白拮抗劑在制備下調(diào)NF-κB的藥物中的用途。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述藥物用于治療TNFα異常引起的炎癥性疾病。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述炎癥性疾病選自敗血癥、休克、糖尿病、移植排斥、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和免疫性腸病。
5.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述CK1α蛋白拮抗劑是CK1α蛋白的46位賴氨酸突變?yōu)楸彼岬耐蛔凅w。
6.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述CK1α拮抗劑作用與CK1α競(jìng)爭(zhēng)RIP受體位點(diǎn)。
7.CK1α蛋白拮抗劑在制備抑制p53基因的藥物中的用途。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述CK1α蛋白拮抗劑是CK1α蛋白的46位賴氨酸突變?yōu)楸彼岬耐蛔凅w。
全文摘要
公開(kāi)了CK1α的拮抗劑在治療疾病中的用途以及用CK1α篩選可能的治療藥物的用途。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1873018SQ20051002628
公開(kāi)日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2005年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月30日
發(fā)明者羅楹, 王勇 申請(qǐng)人:上海睿星基因技術(shù)有限公司, 北京諾賽基因組研究中心有限公司, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所