專利名稱：檢測條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖作用的方法。
背景技術(shù)：
支持細(xì)胞能夠分泌免疫保護因子、多種生長因子和營養(yǎng)因子而倍受學(xué)者們關(guān)注，已有實驗研究報道，睪丸的支持細(xì)胞承擔(dān)了免疫豁免功能，共同移植支持細(xì)胞可延長同種異體移植物的存活時間，使睪丸支持細(xì)胞的功能研究擴展到了器官移植領(lǐng)域、并在臨床上展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，有人將支持細(xì)胞與其它種類的細(xì)胞如大鼠胎腦多巴胺能神經(jīng)元、豬胰腺細(xì)胞進行聯(lián)合培養(yǎng)，以利于此種細(xì)胞的生長分化及增殖，還有人將支持細(xì)胞與其它種類細(xì)胞如牛的嗜鉛細(xì)胞、豬的胰島細(xì)胞進行聯(lián)合移植來提高移植細(xì)胞的存活率及降低免疫排斥反應(yīng)，鑒于支持細(xì)胞分泌多種因子及蛋白的功能，可以大量地應(yīng)用于聯(lián)合細(xì)胞培養(yǎng)或聯(lián)合移植等實驗當(dāng)中去。除此之外，支持細(xì)胞與生精細(xì)胞共同構(gòu)成睪丸的精曲小管，支持細(xì)胞不僅在結(jié)構(gòu)上為生精細(xì)胞的分化成熟提供支架，供給生精過程所需的能量及營養(yǎng)物質(zhì)，同時可分泌如轉(zhuǎn)運蛋白類、調(diào)節(jié)蛋白類、生長因子類、類固醇類等數(shù)十種物質(zhì)參與生精細(xì)胞的分化成熟，具有精細(xì)的協(xié)調(diào)作用，保證精子發(fā)生的正常有序進行，因此有人稱其為生精細(xì)胞的“保姆細(xì)胞”(nursing cell)。支持細(xì)胞能合成一些精子的結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白使精子表面密布較多的負(fù)電荷，可能有助于精子在女性生殖管道內(nèi)受精。有研究發(fā)現(xiàn)，支持細(xì)胞功能的減退或數(shù)量的減少均可導(dǎo)致精子生成減少，相對于其它種屬，人類不論是青壯年還是老年，其每一個支持細(xì)胞支持的生精細(xì)胞數(shù)是減少的，說明人類支持細(xì)胞的功能是減退的。
目前還沒有紫菜多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞的作用的相關(guān)報導(dǎo)，我們研究發(fā)現(xiàn)，條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞的增殖作用，該作用可能對于支持細(xì)胞與其他功能細(xì)胞的聯(lián)合移植以及提高精子質(zhì)量及男性不育癥的治療有著重大的指導(dǎo)意義，可能開辟新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種檢測條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖作用的方法，由此，增加了條斑紫菜粗多糖的應(yīng)用范圍，并也拓展了其應(yīng)用前景。
為了實現(xiàn)上述的目的本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的檢測條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖作用的方法包括對大鼠睪丸支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)和用MTT法測定大鼠睪丸支持細(xì)胞的存活率，其實現(xiàn)步驟如下首先進行對大鼠睪丸支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)，用動物專用砸刀通過斷頭法處死一只雄性SD大鼠，摘取帶被膜的睪丸組織，然后，在細(xì)胞室內(nèi)實施如下無菌操作，用剪刀在睪丸包皮上剪開長約1cm的切口，用鑷子輕輕將皮內(nèi)部的睪丸擠出并去除血管，這樣可以得到去除大部分血管的睪丸組織，接著將睪丸組織放在消毒過的玻璃平板上，用滴管吸去少量的預(yù)冷(在4℃保存)的生理鹽水(無Ca2+，Mg2+)，反復(fù)沖洗睪丸組織2-3次，接著用剪刀將睪丸組織剪成約2mm小塊，用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗(約5ml)，將組織懸液移入小三角燒瓶內(nèi)，吸去生理鹽水，接著往三角燒瓶中加入5ml 0.1mg/ml膠原酶消化液，將三角燒瓶放入恒溫水浴振蕩器中，維持32℃，轉(zhuǎn)速135rpm，水浴振蕩55min，接著用吸管小心吸出三角燒瓶中明顯的團塊即去除間質(zhì)細(xì)胞團，用生理鹽水清洗三次燒瓶中分散的小顆粒物質(zhì)，獲得純化的管狀組織后，加入0.01％胰蛋白酶5ml，作用組織15-20min，接著用吸管小心去除三角燒瓶中較明顯的團塊即肌樣細(xì)胞的團塊，獲得較純的管狀片段后，將三角燒瓶中的管狀片段用滴管移至放在玻璃平板上的200目篩網(wǎng)，過濾，接著用生理鹽水反復(fù)隔篩沖洗管狀片段，收集濾液，將其移入15ml無菌離心管中，4℃離心，轉(zhuǎn)速800rpm，離心10min，棄去上清液，沉淀為支持細(xì)胞，再往離心管中加入適量生理鹽水，輕輕吹打細(xì)胞使其重懸，離心(條件同前)收集支持細(xì)胞，接著往離心管中加入含有15mmolHepes的DMEM和Ham’s F12(1∶1)的混合培養(yǎng)液，輕輕重懸細(xì)胞，最后將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細(xì)胞(條件37℃，0.5％CO2細(xì)胞孵箱)，上述所使用的器具都要進行高壓滅菌消毒，最后用MTT法測定大鼠睪丸支持細(xì)胞的存活率，將原代培養(yǎng)的支持細(xì)胞直接傳入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2.0×104個(2.0×105個/ml，100μl細(xì)胞液/孔)，培養(yǎng)過夜，接著加樣設(shè)置，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的設(shè)置，0為空白對照組；1為FBS組(胎牛血清)；2為陽性對照組；A1～A4為不同濃度粗多糖組，其中分別設(shè)置為0.05mg/ml、0.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml；條斑紫菜粗多糖用生理鹽水配成10mg/ml，微孔濾器過濾除菌，4℃保存，臨用前以生理鹽水稀釋至所需濃度，按照每組六個復(fù)孔，每孔10μl的方式加入96孔板，防止邊緣效應(yīng)，在四周孔內(nèi)加入生理鹽水，多余孔內(nèi)也加入生理鹽水，將加好樣的96孔板放入孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞3天后，小心吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μl的生理鹽水和10μl的MTT(5mg/ml)，37℃培養(yǎng)4h，觀察到96孔板的每個小孔底部有紫色結(jié)晶沉淀，小心吸去MTT后，每孔加入100μl的10％SDS，37℃過夜徹底溶解沉淀，次日，用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度即OD值，波長為494nm，然后計算支持細(xì)胞存活率，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，得到檢測結(jié)果條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞有促進其生長的作用，并且隨著條斑紫菜粗多糖濃度的增大，這種促進作用也越加明顯，尤其是當(dāng)多糖濃度為10mg/ml時，這種促進作用極為明顯，與此同時，其結(jié)果還表明，條斑紫菜粗多糖的這種促進作用比FBS組和陽性對照組的作用要顯著得多。
由于本發(fā)明提出了一種檢測條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖作用的方法，且主要通過MTT法檢測粗多糖對原代培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細(xì)胞的增殖率，檢測的結(jié)果表明，隨著粗多糖濃度的升高，其對支持細(xì)胞的增殖作用越明顯，該活性增加了條斑紫菜粗多糖的應(yīng)用范圍，拓展了其應(yīng)用前景。


圖1為96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加樣設(shè)置示意圖。
圖2為MTT法檢測大鼠睪丸支持細(xì)胞活性圖表。
圖3為條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞有促進其生長作用的示意圖。
具體實施例方式以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的檢測條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖作用的方法作進一步的詳細(xì)描述。
本發(fā)明的方法實施步驟如下(一)大鼠睪丸支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)1、用動物專用砸刀由斷頭法處死一只雄性SD大鼠，摘取帶被膜的睪丸組織；2、用剪刀在睪丸包皮上剪開長約1cm的切口，用鑷子輕輕將皮內(nèi)部的睪丸擠出并去除血管，這樣可以得到去除大部分血管的睪丸組織；3、將睪丸組織放在消毒過的玻璃平板上，用滴管吸去少量的預(yù)冷(在4℃保存)的生理鹽水(無Ca2+，Mg2+)，反復(fù)沖洗睪丸組織2～3次；4、用剪刀將睪丸組織剪成約2mm小塊，用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗(約5ml)，將組織懸液移入小三角燒瓶內(nèi)，吸去生理鹽水；5、往三角燒瓶中加入5ml 0.1mg/ml膠原酶消化液，將三角燒瓶放入恒溫水浴振蕩器中，32℃，轉(zhuǎn)速135rpm，水浴振蕩55min；
6、用吸管小心吸出三角燒瓶中明顯的團塊即去除間質(zhì)細(xì)胞團，用生理鹽水清洗三次燒瓶中分散的小顆粒物質(zhì)，獲得純化的管狀組織后，加入0.01％胰蛋白酶5ml，作用組織15-20min；7、用吸管小心去除三角燒瓶中較明顯的團塊即肌樣細(xì)胞的團塊，獲得較純的管狀片段后，將三角燒瓶中的管狀片段用滴管移至放在玻璃平板上的200目篩網(wǎng)，過濾；8、用生理鹽水反復(fù)隔篩沖洗管狀片段，收集濾液，將其移入15ml無菌離心管中，4℃離心，轉(zhuǎn)速800rpm，離心10min，棄去上清液，沉淀為支持細(xì)胞。再往離心管中加入適量生理鹽水，輕輕吹打細(xì)胞使其重懸，離心(條件同前)收集支持細(xì)胞；9、往離心管中加入含有15mmolHepes的DMEM和Ham’s F12(1∶1)的混合培養(yǎng)液，輕輕重懸細(xì)胞，最后將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細(xì)胞(條件37℃，0.5％CO2細(xì)胞孵箱)；上述方法均在細(xì)胞室內(nèi)無菌操作，所使用的器具都要進行高壓滅菌消毒，(二)MTT法測定大鼠睪丸支持細(xì)胞的存活率1、將原代培養(yǎng)的支持細(xì)胞直接傳入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2.0×104個(2.0×105個/ml，100μl細(xì)胞液/孔)，培養(yǎng)過夜；2、加樣設(shè)置，從圖1所示，96孔板中，0為空白對照組；1為FBS組(胎牛血清)；2為陽性對照組；A1～A4為不同濃度粗多糖組，分別設(shè)置為0.05mg/ml、0.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml；
3、條斑紫菜粗多糖用生理鹽水配成10mg/ml，微孔濾器過濾除菌，4℃保存，臨用前以生理鹽水稀釋至所需濃度；4、按照每組六個復(fù)孔，每孔10μl的方式加入96孔板，防止邊緣效應(yīng)，在四周孔內(nèi)加入生理鹽水，多余孔內(nèi)也加入生理鹽水；5、將加好樣的96孔板放入孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞3天后，小心吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μl的生理鹽水和10μl的MTT(5mg/ml)，37℃培養(yǎng)4h；6、觀察到96孔板的每個小孔底部有紫色結(jié)晶沉淀，小心吸去MTT后，每孔加入100μl的10％SDS，37℃過夜徹底溶解沉淀；7、次日，用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度即OD值(波長494nm)；8、計算細(xì)胞存活率支持細(xì)胞存活率＝(加樣組平均OD值/生理鹽水空白對照組平均OD值)×100％，生理鹽水空白對照組平均OD值設(shè)定為100％；按照不同濃度的百分比作圖；9、進行統(tǒng)計學(xué)分析；結(jié)果從圖3中可知條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞有促進其生長的作用，并且隨著條斑紫菜粗多糖濃度的增大，這種促進作用也越加明顯(P＜0.05)，尤其是當(dāng)多糖濃度為10mg/ml時，這種促進作用極為明顯(P＜0.01)，與此同時，實驗結(jié)果還表明，條斑紫菜粗多糖的這種促進作用比FBS組和陽性對照組的作用要顯著得多，另外，從圖2的MTT法檢測大鼠睪丸支持細(xì)胞活性的圖表中所示也足以顯現(xiàn)。
權(quán)利要求
一種檢測條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖作用的方法，其特征在于(一)大鼠睪丸支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)1、用動物專用砸刀通過斷頭法處死一只雄性SD大鼠，摘取帶被膜的睪丸組織；2、在細(xì)胞室內(nèi)無菌操作，用剪刀在睪丸包皮上剪開長約1cm的切口，用鑷子輕輕將皮內(nèi)部的睪丸擠出并去除血管，這樣可以得到去除大部分血管的睪丸組織；3、在細(xì)胞室內(nèi)無菌操作，將丸組織放在消毒過的玻璃平板上，用滴管吸去少量的在4℃保存過的預(yù)冷生理鹽水(無Ca2+，Mg2+)，反復(fù)沖洗睪丸組織2～3次；4、在細(xì)胞室內(nèi)無菌操作，用剪刀將睪丸組織剪成約2mm小塊，用在4℃保存過的預(yù)冷的約5ml生理鹽水反復(fù)沖洗，將組織懸液移入小三角燒瓶內(nèi)，吸去生理鹽水；5、在細(xì)胞室內(nèi)無菌操作，往三角燒瓶中加入5ml的0.1mg/ml膠原酶消化液，將三角燒瓶放入恒溫水浴振蕩器中，溫度為32℃，轉(zhuǎn)速為135rpm，水浴振蕩55min；6、在細(xì)胞室內(nèi)無菌操作，用吸管小心吸出三角燒瓶中明顯的團塊即去除間質(zhì)細(xì)胞團，用生理鹽水清洗三次燒瓶中分散的小顆粒物質(zhì)，獲得純化的管狀組織后，加入0.01％胰蛋白酶5ml，作用組織15-20min；7、在細(xì)胞室內(nèi)無菌操作，用吸管小心去除三角燒瓶中較明顯的團塊即肌樣細(xì)胞的團塊，獲得較純的管狀片段后，將三角燒瓶中的管狀片段用滴管移至放在玻璃平板上的200目篩網(wǎng)，過濾；8、在細(xì)胞室內(nèi)無菌操作，用生理鹽水反復(fù)隔篩沖洗管狀片段，收集濾液，將其移入15ml無菌離心管中，溫度控制在4℃時進行離心，轉(zhuǎn)速為800rpm，離心時間為10min，棄去上清液，沉淀為支持細(xì)胞，再往離心管中加入適量生理鹽水，輕輕吹打細(xì)胞使其重懸，再離心，離心溫度控制在4℃，轉(zhuǎn)速為800rpm，離心時間為10min，收集支持細(xì)胞；9、在細(xì)胞室內(nèi)無菌操作，往離心管中加入含有15mm olHepes的DMEM和Ham’s F12(1∶1)的混合培養(yǎng)液，輕輕重懸細(xì)胞，最后將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后，放入溫度為37℃的含有0.5％CO2的細(xì)胞孵箱中，培養(yǎng)細(xì)胞；上述所使用的器具都要進行高壓滅菌消毒；(二)MTT法測定大鼠睪丸支持細(xì)胞的存活率1、將原代培養(yǎng)的支持細(xì)胞直接傳入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2.0×104個(2.0×105個/ml，100μl細(xì)胞液/孔)，培養(yǎng)過夜；2、加樣設(shè)置如下在96孔板中0為空白對照組、1為FBS組(胎牛血清)、2為陽性對照組、A1～A4為不同濃度粗多糖組，分別設(shè)置為0.05mg/ml、0.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml；3、條斑紫菜粗多糖用生理鹽水配成10mg/ml，微孔濾器過濾除菌，以溫度為4℃保存，臨用前以生理鹽水稀釋至所需濃度；4、按照每組六個復(fù)孔，每孔10μl的方式加入96孔板，為防止邊緣效應(yīng)，在四周孔內(nèi)加入生理鹽水，多余孔內(nèi)也加入生理鹽水；5、將加好樣的96孔板放入孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞3天后，小心吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μl的生理鹽水和10μl的MTT(5mg/ml)，在環(huán)境溫度為37℃中培養(yǎng)4h；6、觀察到96孔板的每個小孔底部有紫色結(jié)晶沉淀，小心吸去MTT后，每孔加入100μl的10％SDS，保持37℃的溫度，過夜徹底溶解沉淀；7、次日，用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度即OD值，波長為494nm；8、計算細(xì)胞存活率支持細(xì)胞存活率＝(加樣組平均OD值/生理鹽水空白對照組平均OD值)×100％，生理鹽水空白對照組平均OD值設(shè)定為100％；按照不同濃度的百分比作圖；9、進行統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞有促進其生長的作用，并且隨著條斑紫菜粗多糖濃度的增大，這種促進作用也越加明顯(P＜0.05)，尤其是當(dāng)多糖濃度為10mg/ml時，這種促進作用極為明顯(P＜0.01)，與此同時，實驗結(jié)果還表明，條斑紫菜粗多糖的這種促進作用比FBS組和陽性對照組的作用要顯著得多。
全文摘要
一種檢測條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖作用的方法。目前還沒有紫菜多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞的作用的相關(guān)報導(dǎo)，我們研究發(fā)現(xiàn)，條斑紫菜粗多糖對大鼠睪丸支持細(xì)胞的增殖作用。本發(fā)明主要通過MTT法檢測粗多糖對原代培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細(xì)胞的增殖率，檢測的結(jié)果表明，隨著粗多糖濃度的升高，其對支持細(xì)胞的增殖作用越明顯，該活性增加了條斑紫菜粗多糖的應(yīng)用范圍，拓展了其應(yīng)用前景。該作用可能對于支持細(xì)胞與其他功能細(xì)胞的聯(lián)合移植以及提高精子質(zhì)量及男性不育癥的治療有著重大的指導(dǎo)意義，可能開辟新的途徑。
文檔編號G01N33/48GK1920051SQ200510029058
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者郭婷婷, 何培民 申請人:上海水產(chǎn)大學(xué)