專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于基質(zhì)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜靶板的蛋白酶解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生化分析技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種基于基質(zhì)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜靶板的蛋白酶解方法。適用于復(fù)雜生物樣品中蛋白的快速有效酶解。
背景技術(shù)：
隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的順利完成，生命科學(xué)的研究進(jìn)入了后基因組時(shí)代，其中功能基因組學(xué)成為研究重點(diǎn)，蛋白質(zhì)組學(xué)則是其中的重要支柱。然而蛋白質(zhì)組學(xué)則是基于質(zhì)譜技術(shù)的新興研究領(lǐng)域。現(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)鑒定提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。由于生物質(zhì)譜作為檢測(cè)器，不僅可提供蛋白質(zhì)分子的精確的分子量信息，同時(shí)還可以提供蛋白酶解后肽段的精確相對(duì)分子質(zhì)量信息，從而推斷出肽段的部分序列，這些信息的獲得對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定具有重要意義。
在蛋白質(zhì)的鑒定分析中，蛋白質(zhì)的酶解是關(guān)鍵的一步。在各種蛋白酶中，常見(jiàn)的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、金黃色葡萄球菌蛋白酶和V8等。胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)少且較為單一，是在肽譜分析中較為常見(jiàn)的蛋白酶。通常溶液中蛋白酶解有三個(gè)步驟第一步是蛋白質(zhì)變性，由于蛋白質(zhì)具有一定的空間結(jié)構(gòu)，在水溶液中由于蛋白分子不易深入一些蛋白質(zhì)的疏水位點(diǎn)，或者由于一些氨基酸序列包埋在蛋白質(zhì)的內(nèi)部使得酶分子不能與該肽段結(jié)合，常常使得蛋白質(zhì)酶解不完全。因此，在酶解反應(yīng)中，常采用一些物理、化學(xué)方法使蛋白質(zhì)變性，破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使之成為舒展開(kāi)的僅有一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。一般的變性方法有加入高濃度的尿素、蛋白質(zhì)的高溫加熱，同時(shí)對(duì)具有二硫鍵的蛋白質(zhì)也采用二硫蘇糖醇還原二硫鍵。實(shí)驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)的變性對(duì)酶解反應(yīng)的完全與否具有較為重要的影響；第二步是酶解，由于酶是具有高效催化效率的蛋白質(zhì)，因此在適宜的酶解條件下，蛋白酶將自身酶解，從而產(chǎn)生一定的背景。在酶解反應(yīng)中，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制酶與蛋白質(zhì)的比例。對(duì)胰蛋白酶的酶解反應(yīng)，一般采用50∶1(蛋白質(zhì)∶酶)的比例，最少不低于25∶1。同時(shí)在酶解反應(yīng)中，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制酶解溫度，不同的緩沖體系，酶解的適宜溫度有所不同。在胰蛋白酶的反應(yīng)中，0.1mol/L NH4HCO3(pH約為8.1)緩沖體系中，適宜的溫度一般為37℃，反應(yīng)時(shí)間12小時(shí)。第三步為酶解反應(yīng)的終止，酶解反應(yīng)的終止可以采用加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等方法，但由于其他試劑的加入，往往干擾了質(zhì)譜的測(cè)定，帶來(lái)不必要的背景。因此，在生物質(zhì)譜的肽譜分析中，采用冰凍或加熱的方法終止酶解反應(yīng)。從上面所述的常規(guī)酶解方法可知，該方法煩瑣且耗時(shí)長(zhǎng)，不利于實(shí)現(xiàn)蛋白分離、酶解及質(zhì)譜測(cè)定等過(guò)程的自動(dòng)化操作。因此隨著目前全球?qū)ι矬w中蛋白質(zhì)組學(xué)研究的大規(guī)模展開(kāi)，更有效、更簡(jiǎn)單同時(shí)可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化的蛋白酶解技術(shù)被迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)質(zhì)譜靶板的蛋白酶解方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述蛋白酶解方法的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種基于基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)質(zhì)譜靶板的蛋白酶解方法，包括以下步驟(1)將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)質(zhì)譜靶板上；(2)若蛋白樣品是液態(tài)則將靶板溫度調(diào)節(jié)至20-100℃，具體溫度視蛋白液滴體積的大小而定，目的在于使液滴體積減小到1微升以?xún)?nèi)或干掉；若蛋白樣品是固態(tài)則將靶板溫度調(diào)節(jié)至室溫(25℃)。
(3)將靶板置于密閉空間，加入蛋白酶溶液及其緩沖液，所加蛋白酶與樣品中蛋白的質(zhì)量比為2∶1-1∶500；調(diào)節(jié)溫度至蛋白酶的反應(yīng)溫度，一般為25-100℃，最好為所用蛋白酶的最佳反應(yīng)溫度；進(jìn)行酶解即可。
本發(fā)明中，蛋白樣品可通過(guò)色譜、電泳或者層析分離得到，例如采用安捷倫公司的HP1100微泵系統(tǒng)，戴安公司的LC-packing二維液相分離系統(tǒng)，安捷倫公司的毛細(xì)管電泳儀，Beckman公司的毛細(xì)管電泳儀，等等。蛋白樣品亦可來(lái)自未經(jīng)分離的蛋白混合物或純蛋白。所述的電泳包括等電聚焦凝膠電泳或者雙向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，或者是液態(tài)等電聚焦電泳(如毛細(xì)管等電聚焦電泳，制備型液態(tài)等電聚焦電泳)等。
本發(fā)明中，加入蛋白酶溶液及其緩沖液的體積可以取0.05-20微升。
本發(fā)明中，基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)靶板溫度調(diào)節(jié)范圍視具體蛋白混合物成分和酶的種類(lèi)而定，一般為0-100℃。MALDI靶板一般采用不銹鋼板、金屬或其他材料制作。例如，Applied Biosystem MALDI板(192-AB stype(192-AB型號(hào))不銹鋼)，Bruker MALDI板(涂層鍍金不銹鋼板)，等等。
本發(fā)明中，酶解反應(yīng)時(shí)間為1秒-60分鐘或數(shù)小時(shí)。反應(yīng)的溫度和緩沖溶液根據(jù)所使用的蛋白酶來(lái)決定，一般控制在30min以?xún)?nèi)。
本發(fā)明中，酶解反應(yīng)在密閉空間中進(jìn)行。該密閉空間的作用是保溫保濕，因?yàn)榉磻?yīng)體系暴露在空氣中時(shí)間一長(zhǎng)就干掉了。密閉空間可采用保溫箱等。
本發(fā)明中，酶解反應(yīng)后將基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)靶板溫度不變或調(diào)節(jié)到其它溫度下迅速空氣吹干以終止酶解反應(yīng)或自然干燥。最后加入有機(jī)基質(zhì)與蛋白酶解產(chǎn)物形成結(jié)晶。亦可采取加入變性劑的方法或者加入強(qiáng)酸改變pH的方法使酶解反應(yīng)終止。
本發(fā)明還提供上述蛋白酶解方法的應(yīng)用。
本發(fā)明中，可將含有蛋白酶解產(chǎn)物的基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)靶板置于質(zhì)譜儀中，對(duì)MALDI靶板上的樣品進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。MALDI靶板上的蛋白質(zhì)在蛋白酶催化下進(jìn)行的高度專(zhuān)一性的裂解后，酶解產(chǎn)物隨即進(jìn)行質(zhì)譜分析，從而實(shí)現(xiàn)蛋白組分解析的自動(dòng)化。通常，酶解結(jié)束后，MALDI靶板上液滴迅速被吹干(如何吹干)，隨即加入有機(jī)基質(zhì)使蛋白酶解產(chǎn)物與有機(jī)基質(zhì)形成結(jié)晶，再進(jìn)行MALDI-MS測(cè)定。
本發(fā)明中，可將上述系統(tǒng)與液體分離裝置連接，即將液體分離得到的蛋白液滴直接轉(zhuǎn)移到(MALDI)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜靶板上。蛋白酶解后隨即進(jìn)行質(zhì)譜分析，就可以實(shí)現(xiàn)蛋白從分離純化到組分解析的全自動(dòng)化。
本發(fā)明的蛋白酶解方法無(wú)需變性劑，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單且易于自動(dòng)化，省時(shí)且低耗，蛋白酶解完全，是一種適合商品化MALDI-MS靶板上操作的酶解新方法。此外，該方法可以作為蛋白混合物的液態(tài)分離裝置和MALDI-MS之間很好的接口，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中蛋白快速分離鑒定的高通量自動(dòng)化操作，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1 液相色譜分離蛋白和胰蛋白酶酶解蛋白質(zhì)混合物采用反相高壓液相色譜分離，例如采用安捷倫公司的HP1100微泵系統(tǒng)，采用30cm×250μm(長(zhǎng)度分離×內(nèi)徑)的C8分離柱，分離時(shí)間100min，流速為1μl/min，采用點(diǎn)樣機(jī)以1次/min的頻率將餾分收集到MALDI靶板上，靶板溫度為50℃，餾分迅速干掉，所有100份餾分收集結(jié)束后，再用點(diǎn)樣機(jī)以1200次/h的頻率將1μl濃度為1ng/μl胰蛋白酶(10mmol/L NH4HCO3，pH 8)加到所有100份餾分上，MALDI靶板溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10min。酶解結(jié)束后，MALDI靶板溫度調(diào)節(jié)為室溫(25℃)，再用點(diǎn)樣機(jī)以1200次/h的頻率將0.3μLα-cyano-4-hydroxycinnamic acid(α-氰基-4-羥基肉桂酸)加到所有100份餾分上(蛋白酶解產(chǎn)物與有機(jī)基質(zhì)會(huì)形成結(jié)晶)，所有樣品點(diǎn)干了以后進(jìn)行MALDI-MS分析。
實(shí)例2 毛細(xì)管電泳分離蛋白和V8酶解蛋白質(zhì)混合物采用毛細(xì)管等電聚焦電泳分離，可采用自制的餾份收集系統(tǒng)，采用30cm×100μm(長(zhǎng)度分離×內(nèi)徑)的涂層毛細(xì)管，分離時(shí)間24min，鞘流流速為1μl/min，餾份收集系統(tǒng)以4次/1min的頻率將餾分收集到MALDI靶板上，靶板溫度為50℃，餾分迅速干掉，所有96份餾分收集結(jié)束后，再用點(diǎn)樣機(jī)以1200次/h的頻率將1μl濃度為1ng/μl endoprotease Glu-C(V8)(10mmol/L NH4HCO3，pH 8)加到所有96份餾分上，MALDI靶板溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10min。酶解結(jié)束后，MALDI靶板溫度調(diào)節(jié)為室溫(25℃)，再用點(diǎn)樣機(jī)以1200次/h的頻率將0.3μLα-cyano-4-hydroxycinnamic酸(α-氰基-4-羥基肉桂酸)加到所有96份餾分上，所有樣品點(diǎn)干了以后進(jìn)行MALDI-MS分析。
權(quán)利要求
1.一種基于基質(zhì)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜靶板的蛋白酶解方法，其特征在于包括以下步驟(1)將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到基質(zhì)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜靶板上；(2)液態(tài)蛋白樣將靶板溫度調(diào)節(jié)至20-100℃，使液滴體積減小到0-1微升；固態(tài)蛋白樣品將靶板溫度調(diào)節(jié)至室溫20-35℃；(3)將靶板置于密閉空間，加入蛋白酶溶液及其緩沖液，所加蛋白酶與樣品中蛋白的質(zhì)量比為2∶1-1∶500；調(diào)節(jié)溫度至蛋白酶的反應(yīng)溫度進(jìn)行酶解，分析測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶解方法，其特征在于蛋白樣品通過(guò)色譜、電泳或者層析分離得到，或者是未經(jīng)分離的蛋白混合物或者純蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白酶解方法，其特征在于電泳是等電聚焦凝膠電泳、液態(tài)等電聚焦電泳或者雙向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶解方法，其特征在于酶解反應(yīng)時(shí)間為1秒-60分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶解方法，其特征在于酶解反應(yīng)后分析測(cè)定時(shí)，將基質(zhì)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜的靶板在酶解溫度下迅速干燥；然后加入有機(jī)基質(zhì)與蛋白酶解產(chǎn)物形成結(jié)晶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述蛋白酶解方法的應(yīng)用，其特征在于將含有蛋白酶解產(chǎn)物的基質(zhì)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜的靶板置于質(zhì)譜儀中，對(duì)基質(zhì)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜靶板上的樣品進(jìn)行分析測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明屬生化分析技術(shù)領(lǐng)域，是一種基于基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)質(zhì)譜靶板的蛋白質(zhì)快速酶解方法?，F(xiàn)有的傳統(tǒng)蛋白酶解存在耗時(shí)長(zhǎng)和需要大量蛋白變性劑等缺點(diǎn)，不適合用于復(fù)雜生物樣品中蛋白的大規(guī)模分離后所要求的高效酶解及質(zhì)譜測(cè)定。本發(fā)明是在MALDI(基質(zhì)輔助激光解吸電離源)靶板上加入蛋白和蛋白酶并在適當(dāng)?shù)膒H和溫度下進(jìn)行快速有效酶解，隨后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中蛋白分離、酶解及質(zhì)譜鑒定等操作步驟的連續(xù)自動(dòng)化。該酶解方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、無(wú)需蛋白變性劑及低耗等優(yōu)點(diǎn)，十分適合應(yīng)用于復(fù)雜生物樣品中蛋白的快速分離鑒定，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1773275SQ20051003067
公開(kāi)日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者張祥民, 于文佳 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)