專利名稱：四環(huán)素免疫層析半定量試紙檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物性食品中一種抗生素殘留檢測方法，特別是一種四環(huán)素免疫層析快速檢測方法。
背景技術(shù)：
抗生素殘留是全世界畜禽養(yǎng)殖中普遍存在的問題，其中四環(huán)素是一種比較常見的殘留抗生素。四環(huán)素是由金霉菌發(fā)酵液提得的一種抗生素，一般用其鹽酸鹽，其在治療家畜革蘭氏陽性和陰性菌、立克次體、螺旋體和某些原蟲感染性疾病中發(fā)揮了重要作用，但其殘留物毒副作用比較大。為了加強獸藥殘留管理工作，保證畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，我國農(nóng)業(yè)部于2002年修訂了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，其中規(guī)定牛/羊奶以及所有動物肌肉中四環(huán)素的最高殘留限量為100μg/kg，對動物肝臟、腎臟、蛋中四環(huán)素殘留也有規(guī)定了相應(yīng)限量。
對四環(huán)素殘留的檢測目前主要采用高效液相色譜法(HPLC)。然而，HPLC樣品前處理繁瑣，測定方法相當(dāng)復(fù)雜，需受過專門訓(xùn)練的人員才能操作，檢測通量很小。在我國目前動物養(yǎng)殖分散經(jīng)營的情況下，很難統(tǒng)一管理，因此造成動物源性食品的質(zhì)量很難一致，單純采用大型儀器檢測監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量，很不現(xiàn)實，而且儀器檢測費用高，很難普及使用。國外對四環(huán)素殘留的檢測普遍采用快速篩選檢測結(jié)合儀器確證的方法，我國在大量樣品快速篩選檢測技術(shù)方面尚研究不多。微生物抑制法是一種較為常用的抗生素篩選檢測方法，其主要原理是根據(jù)抗微生物藥對特異微生物的抑制作用來檢測受檢樣品中殘留的抗微生物藥，主要包括杯碟法、紙片法、瓊脂擴散法和氯化三苯基四氮唑法，雖然目前仍在使用，但這些方法特異性差，耗時費力，測定結(jié)果誤差很大。ELISA法是另一種目前研究較多的抗生素篩選檢測方法，具有靈敏度高、檢測量大、成本低等優(yōu)點，但該方法也需酶標儀等部分實驗室設(shè)備，分析時間一般1-4小時，仍有一定局限性。因此，目前我國相應(yīng)的四環(huán)素檢測技術(shù)并不很完備，很有必要研究更加簡單快捷方便的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于研制出一種簡便、靈敏、價格低廉的四環(huán)素快速半定量試紙檢測方法。
本發(fā)明在試紙背襯上依次貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應(yīng)部分、吸水部分。膠體金標記部分為玻璃纖維或醋酸纖維或尼龍膜，其上標記的物質(zhì)為第二種屬動物蛋白與四環(huán)素抗體的混合物，或第二種屬動物蛋白與四環(huán)素檢測用抗原的混合物。檢測反應(yīng)部分上面包被有四環(huán)素檢測用抗原1～3條作為檢測線，或包被有四環(huán)素抗體1～3條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1～3條作為參考線。檢測線和參考線組合時不能同時多于1條，組合線條數(shù)為2～4條，組合方式為1條檢測線+1條參考線、1條檢測線+2條參考線、1條檢測線+3條參考線、2條檢測線+1條參考線、3條檢測線+1條參考線五種形式。根據(jù)半定量檢測的準確度要求，組合線數(shù)越多，半定量越準確。
本發(fā)明中檢測用抗原是指四環(huán)素與載體物質(zhì)形成的偶合物，其中載體物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽、半合成多肽、多糖，如血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖，示例性的載體物質(zhì)包括牛血清白蛋白、卵清白蛋白、匙孔血藍蛋白、甲狀腺球蛋白、L-多聚賴氨酸等。另外，載體物質(zhì)也可以是具有活性基團的其他合成或天然聚合物，如白喉毒素、破傷風(fēng)毒素、酵母、尼龍、右旋葡聚糖、纖維素等，同樣也可以用來制備檢測用抗原。第二種屬動物蛋白指非抗體來源屬動物的蛋白，例如，抗體為鼠源性，則第二種屬動物蛋白可以是卵清白蛋白、兔血清白蛋白等雞、兔或其他非鼠源性動物蛋白。
本發(fā)明所描述的試紙的各部分處理與功能如下背襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。
樣液吸收部分制備將濾紙或玻璃纖維紙浸入pH7.0～8.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即作為樣液吸收部分，檢測時起吸收樣品溶液的作用，便于樣品溶液向上移動。
膠體金標記部分的制備該部分起固定膠體金標記的抗原或抗體的作用。制備步驟包括膠體金溶膠的制備、膠體金標記四環(huán)素抗體或四環(huán)素抗原、膠體金標記部分處理。
(1)膠體金溶膠的制備將氯金酸(HAuCL4)用超純水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超純水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加熱至沸騰，加入1～5mL的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱到出現(xiàn)透明的橙紅色為止，即為膠體金溶膠。
(2)膠體金標記四環(huán)素抗體將四環(huán)素單克隆抗體或多克隆抗體和第二種屬動物蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀釋至2～4mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1～3mL 2～4mg/mL的四環(huán)素抗體和1～1.5mL 2～4mg/mL第二種屬動物蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-100002mL，振蕩5min，8000～15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)復(fù)溶，以6000～13000r/min離心15min，除去上清，將沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)稀釋500～2000倍，產(chǎn)物作為金標四環(huán)素抗體(GAb)。
(3)膠體金標記四環(huán)素抗原將四環(huán)素檢測用抗原和第二種屬動物蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0～8.4)溶解稀釋至2～4mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1～3mL 2～4mg/mL的檢測用抗原和1～1.5mL 2～4mg/mL第二種屬動物蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-100002mL，振蕩5min，8000～15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)復(fù)溶，以6000～13000r/min離心15min，除去上清，將沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)稀釋500～2000倍，產(chǎn)物作為金標記的四環(huán)素抗原(GAg)。
(4)膠體金標記部分處理將GAb或GAg倒入一槽中，將玻璃纖維紙或濾紙浸入1min，取出，室溫干燥后，即作為膠體金標記部分。
檢測反應(yīng)部分制備用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜30min，取出，37℃烘干，上邊包被1～3條不同濃度的四環(huán)素檢測用抗原線或四環(huán)素抗體線作為檢測線，同時包被1～3條不同濃度的抗第二種屬動物蛋白的IgG線作為參考線。當(dāng)膠體金標記部分標記對象為四環(huán)素抗體和第二種屬動物蛋白時，檢測線則包被四環(huán)素檢測用抗原；當(dāng)膠體金標記部分標記對象為四環(huán)素檢測用抗原和第二種屬動物蛋白時，檢測線則包被四環(huán)素抗體；檢測線和參考線不能同時多于1條，組合線數(shù)2～4條。此即為檢測反應(yīng)部分，該部分主要作用是將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。
吸水部分制備將玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙室溫干燥后，即作為吸水部分。該部分主要作用在于將移動上來的多余的樣品溶液吸收。
試紙組裝在背襯上依次粘貼樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應(yīng)部分和吸水部分，即成四環(huán)素快速半定量檢測試紙。
檢測原理檢測原理因膠體金標記的對象不同，而稍有差異。
當(dāng)膠體金標記部分的標記對象為四環(huán)素抗體和第二種屬動物蛋白時，如果樣品中含有四環(huán)素，樣品溶液被試紙的樣液吸收部分吸收并通過毛細作用上移到達膠體金標記部分，樣品溶液中的四環(huán)素與膠體金標記的四環(huán)素抗體反應(yīng)形成結(jié)合物，結(jié)合物繼續(xù)上移到檢測線，因膠體金標記的四環(huán)素抗體只有一個結(jié)合位點，樣品溶液中的四環(huán)素與之結(jié)合后，檢測線上的檢測用抗原就不能再與膠體金標記的四環(huán)素抗體結(jié)合，于是檢測線無色；當(dāng)樣品中沒有四環(huán)素時，膠體金標記的四環(huán)素抗體到達檢測線時被檢測用抗原捕獲，則形成肉眼可見紅色，此即為陰性。無論樣品中是否含有四環(huán)素，膠體金標記的第二種屬動物蛋白上移到達參考線時都可被參考線上包被的抗第二種屬動物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見的紅色，此即為參考線。
當(dāng)膠體金標記部分的標記對象為四環(huán)素檢測用抗原和第二種屬動物蛋白時，如果樣品中含有四環(huán)素，樣品溶液被試紙的樣液吸收部分吸收并通過毛細作用上移，樣品中的游離四環(huán)素分子量小移動速度快，先到達檢測線，先與檢測線上包被的四環(huán)素抗體結(jié)合，因檢測線上包被的四環(huán)素抗體只有一個結(jié)合位點，而且樣品中游離的四環(huán)素結(jié)合能力比偶合態(tài)的四環(huán)素檢測用抗原強，于是膠體金標記的檢測用抗原不能再被檢測線上的四環(huán)素抗體捕獲，于是檢測線無色，此即為陽性；如果樣品中無四環(huán)素，則膠體金標記的四環(huán)素檢測用抗原到達檢測線后就被檢測線上包被的四環(huán)素抗體捕獲，形成肉眼可見的紅色，此即為陰性。無論樣品中是否含有四環(huán)素，膠體金標記的第二種屬動物蛋白上移到達參考線時都可被參考線上包被的抗第二種屬動物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見的紅色，此即為參考線。
以上兩種方式的試紙，在試紙制備時通過調(diào)節(jié)檢測線和參考線包被物濃度，控制檢測時檢測線和參考線的顯色深淺，并將其顯色深淺或顯色條數(shù)與標準物質(zhì)濃度對應(yīng)起來，即可達到半定量檢測目的。


圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1為樣液吸收部分、2為膠體金標記部分、3為檢測反應(yīng)部分、4為檢測線、5為參考線、6為吸水部分。
具體實施例方式(1)1條檢測線+1條參考線形式的試紙檢測線包被有濃度為0.1～30μg/mL的四環(huán)素單克隆抗體或四環(huán)素檢測用抗原1條，寬1mm；參考線包被有濃度為0.01～30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG 1條，寬1mm；兩條線之間間隔2～6mm。當(dāng)檢測線顏色與參考線顏色相同時，則樣品為陰性；當(dāng)檢測線比參考線顏色淺時，則樣品為陽性，濃度大于Aμg/kg，A為設(shè)定的檢測限，可以是大于或等于10μg/kg的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(2)2條檢測線+1條參考線形式的試紙2條檢測線包被有0.01～30μg/mL四環(huán)素單克隆抗體或四環(huán)素檢測用抗原，第2條檢測線上包被物的濃度小于第1條檢測線參考線包被物濃度；參考線包被有濃度為0.01～30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG，寬1mm；各條線之間間隔2～6mm。當(dāng)兩條檢測線都呈現(xiàn)顏色時，則樣品為陰性；當(dāng)檢測線第1條檢測線呈色，第2條檢測線不呈色時，則樣品中四環(huán)素濃度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；當(dāng)兩條檢測線都不呈色時，樣品中四環(huán)素濃度大于Bμg/kg。A、B為設(shè)定的檢測限，可以是大于或等于10μg/kg的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(3)3條檢測線+1條參考線形式的試紙3條檢測線包被有0.01～30μg/mL四環(huán)素單克隆抗體或四環(huán)素檢測用抗原，三條檢測線上包被物的濃度依次遞減；參考線包被有濃度為0.01～30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG；各條線之間間隔2～6mm。當(dāng)3條檢測線都呈現(xiàn)顏色時，則樣品為陰性；當(dāng)檢測線第1，2條檢測線呈色，第3條檢測線不呈色時，則樣品中四環(huán)素濃度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；當(dāng)?shù)?條檢測線呈色，第2，3條檢測線都不呈色時，樣品中四環(huán)素濃度大于Bμg/kg，小于Cμg/kg；當(dāng)3條檢測線都不呈色時，樣瓶中四環(huán)素含量大于Cμg/kg；A、B、C為設(shè)定的檢測限，可以是大于或等于10μg/kg的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(4)1條檢測線+3條參考線形式的試紙檢測線上包被有0.01～30μg/mL四環(huán)素單克隆抗體或四環(huán)素檢測用抗原，檢測線之后包被有3條參考線，參考線包被有濃度為0.01～30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG，調(diào)節(jié)參考線包被物濃度和膠體金標記的第2種屬動物蛋白的標記濃度，使3條參考線的顏色分別與標準樣品中四環(huán)素含量為C、B、Aμg/kg時檢測線的顏色相同，依此確定參考線包被物濃度；各條線之間間隔2～6mm；當(dāng)檢測線顏色深于第3條參考線顏色時，表明樣品為陰性；當(dāng)檢測線顏色深于第3條參考線顏色淺于第2條檢測時，表明樣品中四環(huán)素濃度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；當(dāng)檢測線顏色深于第2條參考線顏色淺于第1條參考線時，表明樣品中四環(huán)素濃度大于Bμg/kg，小于Cμg/kg；當(dāng)檢測線不呈色時，表明樣品中四環(huán)素濃度大于Cμg/kg。
(5)1條檢測線+2條參考線形式的試紙檢測線上包被有0.01～30μg/mL四環(huán)素單克隆抗體或四環(huán)素檢測用抗原，檢測線之后包被有2條參考線，參考線包被有濃度為0.01～30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG，調(diào)節(jié)參考線包被物濃度和膠體金標記的第2種屬動物蛋白的標記濃度，使2條參考線的顏色分別與標準樣品中四環(huán)素含量為B、Aμg/kg時檢測線的顏色相同，依此確定參考線包被物濃度；各條線之間間隔2～6mm；當(dāng)檢測線顏色深于第2條參考線顏色時，表明樣品為陰性；當(dāng)檢測線顏色深于第2條參考線顏色淺于第1條檢測時，表明樣品中四環(huán)素濃度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；當(dāng)檢測線顏色深于第1條參考線顏色淺于第1條參考線時，表明樣品中四環(huán)素濃度大于Bμg/kg。
下邊以1條檢測線+2條參考線結(jié)合方式為例進一步說明四環(huán)素偶合抗原合成四環(huán)素偶合抗原分為免疫用抗原和檢測用抗原，前者用于免疫動物，后者用于抗體制備中抗體的檢測篩選和試紙制備中的膠體金標記或檢測線包被。
免疫用抗原制備在0.6mol/L，pH2.0的5mL鹽酸水溶液中，加入100mg四環(huán)素，反應(yīng)24h，再加入2g亞硝酸鈉，避光4℃攪拌反應(yīng)4h，用1mol/L的氫氧化鈉調(diào)至pH8.0，立即加入50mg牛血清白蛋白BSA，避光4℃攪拌反應(yīng)4h，透析后，樣品用紫外分光光度計掃描，可見360nm處出現(xiàn)四環(huán)素特征吸收波長。將樣品稀釋至2mg/mL分裝，即得免疫用抗原。
檢測用抗原用卵清白蛋白OVA取代牛血清白蛋白BSA，其余步驟同免疫用抗原制備。
四環(huán)素單克隆抗體制備取健康5周齡雌性二級Balb/c小鼠6只進行免疫。第一次基礎(chǔ)免疫將0.1mL四環(huán)素免疫用抗原與等量完全弗氏佐劑用攪拌器充分混勻乳化，進行腹腔注射，注射量0.2mL/只。四周后開始進行加強免疫，佐劑換為不完全弗氏佐劑，每隔兩周加強免疫一次，末次免疫3d后取脾臟融合。
先將HAT培養(yǎng)液、IMDM不完全培養(yǎng)液、IMDM完全培養(yǎng)液和50％PEG-6000溶液于37℃水浴中預(yù)溫，同時將另一盛水的燒杯放入37℃水浴中預(yù)溫。將上述制備好的脾細胞和骨髓瘤細胞和脾細胞按1∶5的比例混合，在50mL塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200r/min離心8min，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。置37℃水浴中，將吸管插入管底，在90s內(nèi)邊攪拌邊加入預(yù)熱的1mL、50％PEG-6000。靜置90s后，于37℃水浴中60s內(nèi)加入10mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)液。輕輕懸浮一次，以1000r/min離心6min，棄去上清，先用6mL左右完全培養(yǎng)液輕輕懸浮。根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補加HAT培養(yǎng)液到76.8mL，輕輕混勻，將混勻懸液接種于有飼養(yǎng)細胞的96孔板中，每孔0.1mL，一次接種8塊板。將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后7d，用HT培養(yǎng)液半量換液1次，在13d后根據(jù)增殖情況改用20％NBS的完全培養(yǎng)液。約7d后出現(xiàn)雜交瘤細胞集落，細胞大、圓且透亮。待集落長至孔底1/3時，在培養(yǎng)板的蓋板上畫上克隆生長的標記，此時即可取上清檢測相應(yīng)的特異性抗體。細胞完全克隆化后，將細胞注入小鼠腹腔，間隔一段時間等腹水足夠多時，取腹水，將腹水用蛋白A免疫親和層析純化后，即得到四環(huán)素單克隆抗體。
樣液吸收部分處理將濾紙或玻璃纖維紙等浸入0.1mol/L pH7.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即成樣液吸收部分。
膠體金標記部分的制備和處理膠體金標記部分的制備和處理包括膠體金溶膠制備、膠體金標四環(huán)素抗體、膠體金標記部分處理。
膠體金溶膠制備將氯金酸(HAuCL4)用超純水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超純水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加熱至沸騰，加入一定量的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱到出現(xiàn)透明的橙紅色為止，即為膠體金溶膠。
膠體金標記四環(huán)素單克隆抗體制備將四環(huán)素單克隆抗體和豬血清白蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀釋至3mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1mL 4mg/mL的四環(huán)素單克隆抗體和1mL 2mg/mL豬血清白蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-100002mL，振蕩5min，15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)復(fù)溶，以6000～13000r/min離心15min，除去上清，將沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.5)稀釋1000倍，產(chǎn)物作為金標四環(huán)素單克隆抗體。
膠體金標記部分處理將金標四環(huán)素單克隆抗體倒入一槽中，將玻璃纖維紙或濾紙浸入1min，取出，室溫干燥或真空冷凍干燥，即成為膠體金標記部分。
1條檢測線+2條參考線組合形式的試紙檢測反應(yīng)部分處理用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜30min，取出，37℃烘干，上邊用噴涂機噴涂包被1條四環(huán)素檢測用抗原線作為檢測線，濃度為3μg/mL；包被2條羊抗豬血清白蛋白的IgG線作為參考線，靠近下端的濃度為2μg/mL，另一條為1μg/mL。此即為檢測反應(yīng)部分，檢測線和參考線組合形式為1條檢測線+2條參考線。
吸水部分處理及試紙組裝將吸水紙室溫干燥后，即作為吸水部分。
在背襯上依次粘貼樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應(yīng)部分和吸水部分，即成1條檢測線+2條參考線組合形式的四環(huán)素快速半定量檢測試紙。
檢測牛奶樣給試紙檢測部分直接滴2滴牛奶，約100μL，2min后，觀察顏色。若2條檢測線都呈現(xiàn)顏色，表明樣品為陰性；若第1條檢測線呈色，第2條不呈色，則表明樣品中四環(huán)素含量為45μg/kg以上；若第1條檢測線與第2條檢測線都不顯色，則表明樣品中四環(huán)素含量為90μg/kg以上。無論樣品中四環(huán)素含量如何，參考線應(yīng)該顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
動物肝臟、腎臟、肌肉等組織樣品移去脂肪的10g組織樣搗碎，加入30mL PBS(0.01mol/L pH7.4)中，在80℃孵育30min，然后置于冰浴10min，離心，小心去除表面的脂肪層，上清作為檢測液。余下操作同牛奶樣。
其他組合形式的試紙檢測方法與前類似，不再贅述。
本發(fā)明的積極效果①特異性強。該試紙檢測方法檢測特異性極強，與鹽霉素、氯霉素、紅霉素、恩諾沙星、青霉素、卡那霉素、磺胺二甲嘧啶等藥物基本沒有交叉反應(yīng)，避免了其它藥物對檢測的干擾，但與氯四環(huán)素、氧四環(huán)素交叉反應(yīng)率達到90％以上，這使得該方法可以同時檢測四環(huán)素、氯四環(huán)素、氧四環(huán)素單一藥物或混合藥物，符合農(nóng)業(yè)部同時檢測四環(huán)素類藥物的要求。
②靈敏度高。盡管我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的牛奶中四環(huán)素最大殘留量為100μg/kg，但如果需要，也可根據(jù)檢測要求在制備試紙時提高檢測下限，本方法最低檢測下限為3μg/kg。
③能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測。本方法不但能夠定性檢測，更重要的的是根據(jù)檢測線顏色與參考線顏色對比或根據(jù)檢測線呈色條數(shù)達到半定量檢測目的。
④操作簡單方便。對牛奶、動物尿液可直接檢測，肉類等組織樣品簡單處理后即可檢測。本方法不需任何專業(yè)培訓(xùn)，不需任何儀器設(shè)備，普通非專業(yè)人員都可操作，只要將試紙插入檢測液中，用肉眼判讀。因此，本方法適用面寬，衛(wèi)生檢驗監(jiān)督部門、動物養(yǎng)殖單位、屠宰場以及消費者個人均可使用。
⑤速度快，通量大，顏色穩(wěn)定。試紙插入樣液中，3min以后便可觀察結(jié)果，一個人可以同時、連續(xù)檢測，檢測通量遠遠高于HPLC法，比四環(huán)素ELISA試劑盒檢測速度則快40-160倍以上，并且其顏色可永久保存，而不會象ELISA底物那樣很快就變色。
⑥檢測溫度適宜范圍寬。在4-40℃均可使用，結(jié)果正常，不需在低溫下進行，不需采取保溫措施，室內(nèi)野外均可使用。
⑦試紙保質(zhì)期長。據(jù)加速老化試驗結(jié)果，干燥條件下試紙保質(zhì)期可達2年。
⑧成本低廉。本方法檢測成本遠遠低于四環(huán)素ELISA試劑盒檢測法，隨著規(guī)?；a(chǎn)后，其成本還會大幅度降低。
權(quán)利要求
1.四環(huán)素免疫層析半定量試紙檢測方法，在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應(yīng)部分及吸水部分，其特征在于膠體金標記部分被標記的的物質(zhì)為第二種屬動物蛋白與四環(huán)素抗體的混合物，或第二種屬動物蛋白與克倫特羅檢測用抗原的混合物，檢測反應(yīng)部分上面包被有四環(huán)素檢測用抗原1-3條作為檢測線，或包被有四環(huán)素抗體1-3條作為檢測線，同時包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1-3條作為參考線，檢測線和參考線組合時不能同時多于1條，組合線數(shù)為2-4條；各種組合形式的試紙，在試紙制備時通過調(diào)節(jié)檢測線和參考線包被物濃度，控制檢測時檢測線和參考線的顯色深淺，并將其顯色深淺或顯色條數(shù)與標準物質(zhì)濃度對應(yīng)起來，達到半定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的檢測方法，其特征在于四環(huán)素檢測用抗原為四環(huán)素與載體物質(zhì)形成的偶合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所說的載體物質(zhì)，為蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或合成多肽或半合成多肽或多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說的檢測方法，其特征在于第二種屬動物蛋白質(zhì)為非抗體來源屬動物的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說的檢測方法，其特征在于檢測線和參考線的組合方式為1條檢測線和1條參考線、1條檢測線和2條參考線、1條檢測線和3條參考線、2條檢測線和1條參考線、3條檢測線和1條參考線5種形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫層析半定量試紙檢測四環(huán)素的方法。本方法在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應(yīng)部分及吸水部分。檢測反應(yīng)部分上包被有四環(huán)素抗體1－3條或檢測用抗原1－3條作為檢測線，同時包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG1－3條作為參考線，組合時檢測線和參考線不能同時多于1條，組合線條數(shù)為2－4條。該試紙檢測方法特異性強，能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測，4－40℃都可使用，3min以后便可觀察結(jié)果，適合于衛(wèi)生、質(zhì)監(jiān)、海關(guān)、家畜養(yǎng)殖場等單位或個人對牛奶、肉類等樣品中的四環(huán)素進行快速檢測。
文檔編號G01N33/52GK1727898SQ20051003524
公開日2006年2月1日 申請日期2005年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月20日
發(fā)明者雷紅濤, 孫遠明, 黃曉鈺, 吳青, 王弘, 諶國蓮 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)