專利名稱：早期預(yù)測(cè)急性冠脈綜合癥診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該發(fā)明涉及早期預(yù)測(cè)急性冠脈綜合癥(ACS)的診斷試劑盒，具體的說(shuō)是涉及以原核表達(dá)人可溶性CD40配體(sCD40L)蛋白為抗原，制備單克隆和多克隆sCD40L抗體；以HRP-多聚賴氨酸-鏈親和素復(fù)合物作為檢測(cè)信號(hào)放大系統(tǒng)以檢測(cè)血清sCD40L的超靈敏ELISA試劑盒，以用于ACS的心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的
背景技術(shù)：
ACS是現(xiàn)今嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命和健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，因此早期預(yù)測(cè)該疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)對(duì)臨床上采取有效的防治措施具有重要意義。但目前對(duì)該疾病的臨床控制卻不夠理想，主要原因是不能對(duì)ACS的發(fā)病作出早期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，因而延誤了對(duì)該病的治療。診斷ACS，目前主要的生化檢查是測(cè)定心肌壞死的標(biāo)志物，包括酶類(lèi)及肌鈣蛋白(cTnT)，但這些標(biāo)志物只能反應(yīng)心肌壞死的程度或范圍，而不能給臨床提供有關(guān)心肌壞死前血栓形成階段的病理生理信息。因此不能更早期預(yù)測(cè)ACS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。原核表達(dá)人可溶性CD40配體(sCD40L)蛋白是腫瘤壞死因子家族中的跨膜II型膜蛋白，以同源三聚體形式存在，與其受體CD40在動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成過(guò)程起重要作用。研究證實(shí)免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血小板都可以表達(dá)CD40和/或CD40L，而95％的血清sCD40L來(lái)源于活化的血小板，它的水平增高發(fā)生在患者臨床癥狀出現(xiàn)之前，因此比其它指標(biāo)更能早期地預(yù)測(cè)ACS冠脈事件的發(fā)生。事實(shí)上，已有大量研究表明sCD40L是良好的早期預(yù)測(cè)ACS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的生化指標(biāo)。由于其血清含量在“微克/升”水平，普通ELISA試劑盒已不能符合檢測(cè)要求，所以目前迫切需要研制一種超靈敏檢測(cè)sCD40L ELISA試劑盒，以大大改善臨床治療效果，提高患者治愈率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)一種超靈敏檢測(cè)血清sCD40L ELISA試劑盒，以早期預(yù)測(cè)ACS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，大大改善臨床治療效果，提高患者治愈率。
本發(fā)明的技術(shù)方案在于一種早期預(yù)測(cè)急性冠脈綜合癥診斷試劑盒，包括sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白、sCD40L單克隆和多克隆抗體、封閉液、酶底物溶液、包被緩沖液、終止液、洗滌液及酶標(biāo)板，其特征是以sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白為生化指標(biāo)，用生物素標(biāo)記的sCD40L單抗作為二抗標(biāo)記物、用sCD40L多克隆抗體包被酶標(biāo)板、以HRP-多聚賴氨酸-鏈親和素復(fù)合物作為檢測(cè)信號(hào)放大系統(tǒng)。
所述的診斷試劑盒，其特征在于sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白是采用基因工程法制備，該方法包括從淋巴細(xì)胞提取mRNA，針對(duì)sCD40L的膜外部分氨基酸52-261設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增，cDNA克隆入pGEM-T載體，測(cè)序確證后再亞克隆入N斷帶His標(biāo)簽的pET-28a原核表達(dá)載體，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，用親和柱純化。
所述的診斷試劑盒，其特征在于sCD40L多克隆抗體是用原核表達(dá)純化的His-sCD40L蛋白免疫兔子，以獲得含sCD40L多克隆抗體的兔血清，先用(NH4)2SO4沉淀法初步純化IgG，再用親和層析柱進(jìn)一步純化，最后鑒定分離和純化。
所述的診斷試劑盒，其特征在于sCD40L單克隆抗體是將原核表達(dá)純化的His-sCD40L蛋白免疫小鼠，得到抗原刺激的脾細(xì)胞，取脾細(xì)胞與SP2細(xì)胞融合，用HAT選擇培養(yǎng)基選擇雜交瘤細(xì)胞株，用ELISA法鑒定產(chǎn)sCD40L抗體的細(xì)胞，挑取抗體陽(yáng)性的細(xì)胞株，單克隆化并擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞株注射小鼠腹腔，收集腹水，分裝，冷凍保存。
所述的診斷試劑盒，其特征在于HRP-多聚賴氨酸-鏈親和素復(fù)合物是采用碳二亞胺法把HRP標(biāo)記到活化的樹(shù)枝狀載體上，用過(guò)碘酸法將鏈親和素標(biāo)記到HRP-多聚賴氨酸復(fù)合物上，并層析純化。
所述的診斷試劑盒，其特征是用生物素標(biāo)記sCD40L單克隆抗體作為二抗，并純化用EZ-Link TFP-PEO-Biotin(Pierce)生物素標(biāo)記試劑盒，按常用操作方法標(biāo)記sCD40L單克隆抗體，透析去掉未標(biāo)記的生物素，用Dot-ELISA法鑒定生物素標(biāo)記效率。
所述的診斷試劑盒，其中封閉液是1％的白明膠溶液；酶底物溶液是TMB應(yīng)用液，即60ug/ml TMB、0.045％ H2O2與0.1M pH6.0磷酸鹽緩沖液的混合液；包被緩沖液為0.05MpH9.6的碳酸鹽緩沖液即1L溶液中含1.59g Na2CO3，2.93gNaHCO3；終止液為2M H2SO4溶液；洗滌液為0.01M pH7.4的PBS緩沖液，其中含0.05％Tween-20，即1L溶液中含8gNaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4.12H2O，0.2gKCl、0.5ml Tween-20。
發(fā)明原理及積極效果分析該發(fā)明以原核表達(dá)人可溶性CD40配體蛋白sCD40L為生化指標(biāo)，來(lái)早期預(yù)測(cè)ACS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。原理包括ACS的臨床發(fā)病機(jī)理和上述基本研發(fā)技術(shù)，最終目的是研制出一種高效、超靈敏檢測(cè)血清sCD40L水平ELISA試劑盒。
該發(fā)明用多抗包被ELISA板，不但節(jié)約了成本，而且簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)工序；用生物素標(biāo)記的單抗作為二抗，以提高檢測(cè)的特異性；以交聯(lián)8分子并具有HRP酶活性的HRP-多聚賴氨酸-鏈親和素復(fù)合物作為檢測(cè)信號(hào)放大系統(tǒng)，從而大大提高了檢測(cè)的靈敏度。該發(fā)明通過(guò)檢測(cè)sCD40L水平可早期預(yù)測(cè)ACS心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，能準(zhǔn)確反映血栓形成階段的病理生理信息，比常規(guī)反映心肌壞死的指標(biāo)如酶類(lèi)及肌鈣蛋白(cTnT)等要早，因此達(dá)到早期診斷和預(yù)測(cè)的目的。研究證實(shí)，檢測(cè)sCD40L水平可預(yù)測(cè)健康人及ACS患者心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，因此又可達(dá)到早期防治的目的，這也是臨床醫(yī)生期待實(shí)驗(yàn)工作者迫切需要解決的一個(gè)問(wèn)題。超靈敏檢測(cè)血清sCD40L水平ELISA試劑盒的研制正應(yīng)和了此要求，并行將解決此問(wèn)題，因此也必將產(chǎn)生巨大的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1、sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白的表達(dá)與純化采用基因工程法制備sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白從淋巴細(xì)胞提取mRNA，針對(duì)sCD40L的膜外部分氨基酸52-261設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增。cDNA克隆入pGEM-T載體，測(cè)序確證。再亞克隆入N斷帶His標(biāo)簽的pET-28a原核表達(dá)載體，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)；經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在39KD處有一條蛋白帶(圖1)；同時(shí)經(jīng)Western Blotting發(fā)現(xiàn)只在39KD處有一條蛋白帶(圖2)，表明得到的蛋白為目的蛋白。該發(fā)明利用基因工程的方法制備sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白，取代了從血清直接分離純化sCD40L的方法，不僅取材容易，而且簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)。
2、抗sCD40L抗體的制備與純化1)抗sCD40L單克隆抗體的制備及純化該發(fā)明制備了高親和力、高特異性、高效價(jià)的單抗IgG，利用(NH4)2SO4沉淀法和SPA-Sepharose親和層析柱從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離純化后得到抗sCD40L單克隆抗體，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在67KD和42KD處有兩條蛋白帶，分別為IgG的重鏈和輕鏈；同時(shí)經(jīng)WesternBlot鑒定可與純化的sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白雜交，表明分離純化所得到的IgG為特異性抗sCD40L單克隆抗體。
2)抗sCD40L多克隆抗體的制備及純化該發(fā)明利用(NH4)2SO4沉淀法和sCD40L-Sepharose親和層析柱從兔血清中分離純化得到高特異性、高親和力和高效價(jià)的抗sCD40L多克隆抗體，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在67KD和42KD處有兩條蛋白帶，分別為IgG的重鏈和輕鏈，同時(shí)經(jīng)Western Blot鑒定可與純化的sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白雜交，表明分離純化所得到的IgG為特異性抗sCD40L多克隆抗體。
3、抗sCD40L單克隆抗體及HRP-多聚賴氨酸復(fù)合物的標(biāo)記用試劑盒(碳二亞胺法，Pierce產(chǎn)品)把HRP(辣根過(guò)氧化酶)標(biāo)記到活化的樹(shù)枝狀多聚賴氨酸載體上，再用過(guò)碘酸法將鏈親和素標(biāo)記到HRP-多聚賴氨酸復(fù)合物上，用Dot-ELISA法檢測(cè)酶復(fù)合物具有高酶活性；用EZ-Link TFP-PEO-Biotin(Pierce)生物素標(biāo)記試劑盒，按常用的操作方法標(biāo)記抗sCD40L單克隆抗體，透析去掉未標(biāo)記的生物素，經(jīng)Dot-ELISA法鑒定，生物素的標(biāo)記效率高。
4、用該發(fā)明開(kāi)發(fā)的抗sCD40L多克隆抗體、生物素標(biāo)記的抗sCD40L單克隆抗體及HRP-多聚賴氨酸-鏈親和素復(fù)合物制備血清sCD40L試劑盒，經(jīng)精密度試驗(yàn)(批內(nèi)，批間CV)，靈敏度試驗(yàn)(系列稀釋法)，干擾試驗(yàn)(高脂血，溶血，黃膽的干擾)，回收試驗(yàn)(加入sCD40L標(biāo)準(zhǔn)品)，表明我們建立的超敏ELISA試劑盒具有高靈敏、高特異性。并測(cè)定223例健康成人、137例ACS患者的血清sCD40L水平，前者sCD40L濃度均小于0.52ng/ml；我們測(cè)定了137例經(jīng)6個(gè)月隨訪的ACS患者的血清sCD40L水平，并統(tǒng)計(jì)其心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(見(jiàn)附表和附圖)，事實(shí)上，我們的結(jié)果與臨床觀察結(jié)果高度一致，表明該指標(biāo)可早期預(yù)測(cè)ACS心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，因而對(duì)早期防治ACS具有重要臨床價(jià)值。
附表 6個(gè)月隨訪后發(fā)生死亡或非致命性心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)比率篩選結(jié)果



圖1不同時(shí)間ACS患者死亡或非致命性心肌梗塞的發(fā)生率圖2sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白的表達(dá)與純化。
蛋白Marker分子量為；18.4KD，29KD，43KD，68KD，97.4KD，200KD；sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量為39KD；圖3Western Blot進(jìn)一步鑒定sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白Western Blot鑒定sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在39KD處只有一條帶。
具體實(shí)施例實(shí)施例1、克隆、表達(dá)、純化、鑒定sCD40L從Gene Bank中搜索人sCD40L基因，并設(shè)計(jì)引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，將cDNA克隆入pGEM-T載體，測(cè)序確證。再亞克隆入N斷帶His標(biāo)簽的pET-28a原核表達(dá)載體，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定；鑒定正確的重組子轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定；挑取含重組子菌落，37℃振蕩培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)；用SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件，使目的蛋白以可溶的形式表達(dá)；大量表達(dá)目的蛋白，用NTA-Ni柱親和柱純化帶His標(biāo)簽的目的蛋白，SDS-PAGE分離鑒定所表達(dá)的目的蛋白。
實(shí)施例2、制備、純化、鑒定、標(biāo)記抗sCD40L單克隆抗體原核表達(dá)純化的His-sCD40L蛋白，免疫BALB/c小鼠隔3周后同樣加強(qiáng)免疫二次，最后一次加強(qiáng)免疫后2周，取脾細(xì)胞與SP2細(xì)胞融合，HAT選擇培養(yǎng)基，培養(yǎng)3周，取上清分別用純化的His-sCD40L初步篩選單抗，然后用sCD40L蛋白包被的ELISA板檢測(cè)抗體，分別挑取抗體陽(yáng)性的細(xì)胞株，單克隆化，HT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)三周后，取上清ELSIA法測(cè)抗體，陽(yáng)性克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞株注射BALB/c小鼠腹腔，2周后，收集腹水，分裝，-20℃，保存。Western Blotting和ELISA驗(yàn)證所制備的單抗。用EZ-Link TFP-PEO-Biotin(Pierce)生物素標(biāo)記試劑盒，按常用的操作方法標(biāo)記抗sCD40L單克隆抗體，透析去掉未標(biāo)記的生物素，經(jīng)Dot-ELISA法鑒定，生物素的標(biāo)記效率高。
實(shí)施例3、制備、純化、鑒定抗sCD40L多克隆抗體用純化的sCD40L蛋白免疫兔子，免疫2次，間隔1個(gè)月；取兔子全血，先利用(NH4)2SO4沉淀法從兔子的血清中初步純化IgG，再用自制sCD40L-Sepharose親和層析柱進(jìn)一步純化抗sCD40L的IgG，SDS-PAGE及Western Blot鑒定該多抗。
實(shí)施例4、用于超敏ELISA法測(cè)定血清sCD40L濃度時(shí)所需各種溶液的配制及操作步驟1)、酶底物溶液(TMB應(yīng)用液)①TMB原液TMB 60mg，加入DMSO至10ml，4℃保存；②TMB應(yīng)用液(現(xiàn)配)PBS緩沖液10ml+TMB原液100ul，30％H2O215ul；③0.1M pH6.0 PBS溶液；2)、包被緩沖液0.05M pH9.6 Na2CO3-NaHCO3溶液Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，用蒸餾水溶至1000ml；3)、洗滌液(pH7.4的PBS-Tween20溶液)NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 20 0.5ml，用蒸餾水溶至1000ml，備用；4)、封閉液(1％白明膠溶液)白明膠1g，用洗滌液溶至100ml；5)、終止液(2M H2SO4溶液)將22.2ml 98％ H2SO4濃緩慢加入177.3ml蒸餾水中，邊加邊攪動(dòng)。
實(shí)施例5、制定標(biāo)準(zhǔn)曲線用包被液將純化的抗sCD40L多克隆抗體稀釋至1ug/ml，加入到96孔ELISA板板孔中，每孔100ul，4℃包被過(guò)夜；用洗滌液洗板3次，甩干孔內(nèi)液體，加入1％白明膠封閉，每孔200ul，室溫下保溫1小時(shí)；用洗滌液洗板3次，甩干孔內(nèi)液體，加入不同濃度的sCD40L(0-20ug/l)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白抗原，每孔100ul，室溫下保溫1小時(shí)；用洗滌液洗板3次，甩干孔內(nèi)液體；加入生物素標(biāo)記的抗sCD40L單克隆抗體(用洗滌液稀釋全1ug/ml)，每孔100ul，室溫下保溫1小時(shí)；用洗滌液洗板3次，甩干孔內(nèi)液體；加入HRP-多聚賴氨酸-鏈親和素復(fù)合物，每孔100ul，室溫下保溫1小時(shí)；用洗滌液洗板3次，甩干孔內(nèi)液體，加入酶底物溶液，每孔100ul，暗處顯色5分鐘，加入終止液，每孔50ul，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定吸光度(A450)；以濃度(ug/l)為橫坐標(biāo)，A450為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例6、測(cè)定血清sCD40L濃度于已包被好的ELISA板孔中加入100ul待檢血清標(biāo)本，室溫下保溫1小時(shí)，用洗滌液洗板3次，甩干孔內(nèi)液體；加入生物素標(biāo)記的抗sCD40L單克隆抗體(用洗滌液稀釋至1ug/ml)，每孔100ul，室溫下保溫1小時(shí)；用洗滌液洗板3次，甩干孔內(nèi)液體；加入HRP-多聚賴氨酸-鏈親和素復(fù)合物，每孔100ul，室溫下保溫1小時(shí)；用洗滌液洗板3次，甩干孔內(nèi)液體，加入酶底物溶液，每孔100ul，暗處顯色5分鐘，加入終止液，每孔50ul，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定A450，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得血清sCD40L濃度。sCD40L的cut-off值為0.52ug/l，以此進(jìn)行ACS心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
權(quán)利要求
1.一種早期預(yù)測(cè)急性冠脈綜合癥診斷試劑盒，包括sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白、sCD40L單克隆和多克隆抗體、封閉液、酶底物溶液、包被緩沖液、終止液、洗滌液及酶標(biāo)板，其特征是以sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白為生化指標(biāo)，用生物素標(biāo)記的sCD40L單抗作為二抗標(biāo)記物、用sCD40L多克隆抗體包被酶標(biāo)板、以HRP-多聚賴氨酸-鏈親和素復(fù)合物作為檢測(cè)信號(hào)放大系統(tǒng)。
2.權(quán)利要求1的診斷試劑盒，其特征在于sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白是采用基因工程法制備，該方法包括從淋巴細(xì)胞提取mRNA，針對(duì)sCD40L的膜外部分氨基酸52-261設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增，cDNA克隆入pGEM-T載體，測(cè)序確證后再亞克隆入N斷帶His標(biāo)簽的pET-28a原核表達(dá)載體，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，用親和柱純化。
3.權(quán)利要求1的診斷試劑盒，其特征在于sCD40L多克隆抗體是用原核表達(dá)純化的His-sCD40L蛋白免疫兔子，以獲得含sCD40L多克隆抗體的兔血清，先用(NH4)2SO4沉淀法初步純化IgG，再用親和層析柱進(jìn)一步純化，最后鑒定分離純化。
4.權(quán)利要求1的診斷試劑盒，其特征在于sCD40L單克隆抗體是將原核表達(dá)純化的His-sCD40L蛋白免疫小鼠，得到抗原刺激的脾細(xì)胞，取脾細(xì)胞與SP2細(xì)胞融合，用HAT選擇培養(yǎng)基選擇雜交瘤細(xì)胞株，用ELISA法鑒定產(chǎn)sCD40L抗體的細(xì)胞，挑取抗體陽(yáng)性的細(xì)胞株，單克隆化并擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞株注射小鼠腹腔，收集腹水，分裝，冷凍保存。
5.權(quán)利要求1的診斷試劑盒，其特征在于HRP-多聚賴氨酸-鏈親和素復(fù)合物是采用碳二亞胺法把HRP標(biāo)記到活化的樹(shù)枝狀載體上，用過(guò)碘酸法將鏈親和素標(biāo)記到HRP-多聚賴氨酸復(fù)合物上，并層析純化。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了早期預(yù)測(cè)急性冠脈綜合癥(ACS)的診斷試劑盒，其組成是以sCD40L標(biāo)準(zhǔn)蛋白為生化指標(biāo)、包括sCD40L單克隆和多克隆抗體、用生物素標(biāo)記的sCD40L單抗作為二抗；用多sCD40L克隆抗體包被酶標(biāo)板；以HRP－多聚賴氨酸－鏈親和素復(fù)合物作為檢測(cè)信號(hào)放大系統(tǒng)。本試劑盒是一種超靈敏檢測(cè)血清sCD40L ELISA試劑盒，可以早期預(yù)測(cè)ACS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，大大改善臨床治療效果，提高患者治愈率。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1904616SQ200510036150
公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2005年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月28日
發(fā)明者徐邦牢, 貝春花, 王蓉, 劉萬(wàn)里, 張革 申請(qǐng)人:廣州市第一人民醫(yī)院