專利名稱：一種測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定T細(xì)胞STAT5a和STAT5b分布的方法，特別是涉及一種測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法，本發(fā)明還涉及該方法在新型抗腫瘤藥物研制和抗腫瘤效果的測定中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域(lipid rafts)為細(xì)胞膜液體脂雙層內(nèi)的功能性區(qū)域(見圖1)，富含糖脂、鞘磷脂和膽固醇?，F(xiàn)已明確膜脂肪微區(qū)域在一些細(xì)胞信號傳導(dǎo)的作用，許多重要受體和細(xì)胞信號傳導(dǎo)蛋白都集中在膜脂肪微區(qū)域，這種受體信號分子的區(qū)室化在功能上有重要的意義。近期研究結(jié)果表明，許多信號傳導(dǎo)途徑的重要分子，如T細(xì)胞受體(TCR/CD3)，B細(xì)胞受體(BCR)，IgE受體存在于lipid rafts區(qū)域中。T細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)分子如Src激酶家族、G蛋白家族和eNOS蛋白等作為其組成或誘導(dǎo)性位于膜脂肪微區(qū)域中，在該微區(qū)域中完成信號傳導(dǎo)過程。國內(nèi)關(guān)于膜脂肪微區(qū)域與受體信號蛋白的研究，未見報(bào)道。
信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)家族成員共有7個(gè)成員，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6，是JAK激酶(Janus kinase)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子通路(JAKs-STATs)非常重要的下游分子。許多細(xì)胞因子和多數(shù)造血生長因子均通過此途徑完成細(xì)胞信號傳遞過程，為細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與了多種免疫和造血細(xì)胞的發(fā)育、分化、成熟、凋亡和功能表達(dá)過程。
IL-2和IL-2受體(IL-2R)結(jié)合可以激活下游的JAK激酶家族，使其磷酸化，STAT5信號在胞漿內(nèi)激活的酪氨酸激酶激活STAT5分子并使之磷酸化，然后穿過細(xì)胞核膜進(jìn)入核內(nèi)，STAT5在核內(nèi)與特異性的DNA啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)(見圖2)。JAKs-STATs途徑是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中非常重要的一條通路，在調(diào)控機(jī)體一系列生理與病理反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如何有效地調(diào)控JAKs-STATs途徑對于許多疾病的防治有重要意義。
按目前的研究理論STAT家族蛋白應(yīng)存在于胞漿和核內(nèi)，目前僅有Sehgal的一篇論文報(bào)道在膜脂肪微區(qū)域組分檢測到STAT1和STAT3(見圖3)。為了解決STAT5a和STAT5b是否也存在于細(xì)胞膜的功能性區(qū)域——脂肪微區(qū)域中，本發(fā)明提供了測定STAT5a和STAT5b在T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域分布的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確有效地測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法。
本發(fā)明技術(shù)方案是根據(jù)細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域不溶于非離子活性劑，利用該化學(xué)特征可進(jìn)行細(xì)胞膜亞區(qū)域的分離，再采用蛋白免疫印記法分析分離的細(xì)胞膜亞區(qū)域中的STAT5a和STAT5b，從而可以測定STAT5a和STAT5b在細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域的分布。
本發(fā)明的目的是通過下列具體措施實(shí)現(xiàn)的一種測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法，其特征在于包含下列步驟a.T細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞破裂前用IL-2刺激T細(xì)胞；b.采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域；c.采用蛋白免疫印記法分析分離的T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域中的STAT5a和STAT5b。
所述的測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法，其中T細(xì)胞培養(yǎng)的方法為將人類Jurkat E6-1 T細(xì)胞加入RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積百分比10％的熱滅活新生牛血清、青霉素100U/ml培養(yǎng)基、鏈霉素100μg/ml培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在5％CO2于37℃條件下培養(yǎng)。
所述的測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法，其中采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域的方法是將2×107個(gè)/ml Jurkat T細(xì)胞用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)清洗后，用含1％Brij58的TKM緩沖液，并加入蛋白酶抑制劑，冰上孵育30min，破裂細(xì)胞；與等容量的溶解于TKM緩沖液的80％w/v蔗糖混合，5.5mL 36％蔗糖緩慢覆蓋其上層，然后再用2.5mL 5％蔗糖覆蓋在頂層，250000g于4℃下超速離心離心18小時(shí)，從頂部取每1mL收集不同的分離組分，-80℃保存。
所述的測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法，其中蛋白免疫印記法是用SDS-PAGE分離T細(xì)胞膜不同組分中的蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白到PVDF膜；分別用STAT5a、STAT 5b和磷酸酪氨酸抗體，二抗為辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG抗體，Western blot分析，BM化學(xué)發(fā)光，Westrn blot檢測盒檢測，感光膠片曝光即可。
所述的測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法在新型抗腫瘤藥物研制和抗腫瘤效果的測定中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果按目前的研究理論STAT5a和STAT5b應(yīng)該存在胞漿和核內(nèi)，我們用IL-2刺激JurkatT細(xì)胞、應(yīng)用不連續(xù)蔗糖密度超速離心法分離膜脂肪微區(qū)域、蛋白免疫印記分析的方法，在膜脂肪微區(qū)域組分和可溶膜組分中都檢測到STAT5a、STAT5b蛋白，這是在國內(nèi)外首次在膜功能性脂肪微區(qū)域組分中檢測到STAT5a、STAT5b蛋白。在細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域組分存在的STAT5a和STAT5b是細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)通路早期的一個(gè)階段，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)的早期階段進(jìn)行信號傳導(dǎo)過程，然后進(jìn)入胞內(nèi)，穿過核膜轉(zhuǎn)入核內(nèi)，表明細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域組分存在不同細(xì)胞因子與STATs作用的生理位點(diǎn)。
本發(fā)明采用的方法可以簡單準(zhǔn)確地測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布。STATs蛋白是一類具有信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的功能蛋白質(zhì)，控制細(xì)胞增殖、分化和生存，STATs激活后誘導(dǎo)某些與細(xì)胞增殖、分化、生存、凋亡密切相關(guān)的關(guān)鍵基因的異常高表達(dá)，通過各種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化、表現(xiàn)出致癌的作用。STATs蛋白在細(xì)胞內(nèi)不適當(dāng)?shù)幕罨蓪?dǎo)致的癌癥發(fā)生在許多研究中得到證實(shí)，在多種腫瘤細(xì)胞組織中都有激活，如乳腺癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、腦瘤、非小細(xì)胞性肺癌和各種白血病等。阻斷了這種蛋白，就會阻止癌細(xì)胞(如乳腺和前列腺)的生長和擴(kuò)散；STATs持續(xù)性激活與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程密切相關(guān)，利用STATs信號傳導(dǎo)途徑中的各個(gè)靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)腫瘤治療策略已成為當(dāng)今STATs研究中的熱點(diǎn)，本發(fā)明方法確定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布，為抗腫瘤藥物的一個(gè)新的作用位點(diǎn)，可用于新型抗腫瘤藥物研制和抗腫瘤效果的測定。


圖1是T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域示意圖。
圖2是STATs在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)分布示意圖。
圖3是Sehgal在細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域檢測的STAT1和STAT3分布圖。圖中2、3、4表面脂肪微區(qū)域，6表示可溶膜組分。
圖4是本發(fā)明測定的STAT5a、STAT5b在T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域的分布圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例11.實(shí)驗(yàn)材料人類Jurkat E6-1T細(xì)胞(American Type Culture Collection，Bethesda，MD)，RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清來源于Invitrogen公司(Grand Island，NY)；人類白介素-2(hIL-2)、蛋白酶抑制劑cocktail和BM化學(xué)發(fā)光Western blotting kit購于Roche公司(Indianapolis，IN)；兔抗人STAT5a、STAT5b抗體購自Upstate公司(Lake Placid，NY)；抗兔辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體購自Roche公司(Indianapolis，IN)。
2.細(xì)胞培養(yǎng)人類Jurkat E6-1T細(xì)胞加入RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積百分比10％的熱滅活新生牛血清(杭州四季青)、青霉素100U/ml培養(yǎng)基、鏈霉素100μg/ml培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在5％CO2于37℃條件下培養(yǎng)。細(xì)胞破裂前，用400U/ml IL-2刺激30min。
3.膜脂肪微區(qū)域的分離膜脂肪微區(qū)域的分離采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法。2×107個(gè)/ml Jurkat T細(xì)胞用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)清洗后，用含1％Brij58的TKM緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.4，25mmol/L KCl，5mmol/L MgCl2，1mmol/L EDTA)，并加入蛋白酶抑制劑cocktail(含0.12mg antipain-HCl，20μg bestatin，40μg chymostatin，0.12mg E-64，20μgleupeptin，20μg pepstatin，0.12mg phosphoramidon，0.8mg pefabloc，40μg aprotinin)，冰上孵育30min，破裂細(xì)胞。與等容量的溶解于TKM緩沖液的80％w/v蔗糖混合，5.5mL 36％蔗糖緩慢覆蓋其上層，然后再用2.5mL 5％蔗糖覆蓋在頂層，250000g于4℃下超速離心(Optima L-80 XP ultracentrifuge，Beckman Coulter Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)離心18小時(shí)。從頂部取每1mL收集不同的分離組分，-80℃保存。
4.蛋白免疫印記分析用10％SDS-PAGE分離(Bio-Rad，minigel裝置)T細(xì)胞膜不同組分中的蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白到PVDF膜，分別用STAT5a、STAT 5b和磷酸酪氨酸(phosphotyrosine)抗體，二抗為辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG(H&L)抗體，Western blot分析，BM化學(xué)發(fā)光Western blot檢測盒檢測，感光膠片(KODAK BioMAXXAR)曝光1分鐘，結(jié)果見圖4。
權(quán)利要求
1.一種測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法，其特征在于包含下列步驟a.T細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞破裂前用IL-2刺激T細(xì)胞；b.采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域；c.采用蛋白免疫印記法分析分離的T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域中的STAT5a和STAT5b。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法，其特征在于，其中T細(xì)胞培養(yǎng)的方法是將人類Jurkat E6-1 T細(xì)胞加入RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積百分比10％的熱滅活新生牛血清、青霉素100U/ml培養(yǎng)基、鏈霉素100μg/ml培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在5％CO2于37℃條件下培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法，其特征在于，其中采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域的方法為將2×107個(gè)/ml Jurkat T細(xì)胞用Hanks平衡鹽溶液清洗后，用含1％Brij58的TKM緩沖液，并加入蛋白酶抑制劑，冰上孵育30min，破裂細(xì)胞；與等容量的溶解于TKM緩沖液的80％w/v蔗糖混合，5.5mL 36％蔗糖緩慢覆蓋其上層，然后再用2.5mL 5％蔗糖覆蓋在頂層，250 000g于4℃下超速離心離心18小時(shí)，從頂部取每1mL收集不同的分離組分，-80℃保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法，其特征在于，其中蛋白免疫印記法為用SDS-PAGE分離T細(xì)胞膜不同組分中的蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白到PVDF膜；分別用STAT5a、STAT5b和磷酸酪氨酸抗體，二抗為辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG抗體，Western blot分析，BM化學(xué)發(fā)光，Western blot檢測盒檢測，感光膠片曝光即可。
5.權(quán)利要求1所述的測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法在新型抗腫瘤藥物研制和抗腫瘤效果的測定中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布的方法。該方法的步驟為對T細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞破裂前用IL－2刺激T細(xì)胞；采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域；采用蛋白免疫印記法分析分離的T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域中的STAT5a和STAT5b。該方法能夠簡單、有效、準(zhǔn)確地測定T細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域STAT5a和STAT5b分布，可用于新型抗腫瘤藥物研制和抗腫瘤效果的測定。
文檔編號G01N33/574GK1664583SQ20051003846
公開日2005年9月7日 申請日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月17日
發(fā)明者李秋榮, 黎介壽 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院