專利名稱：一種黃曲霉毒素b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種黃曲霉毒素B1金標(biāo)檢測(cè)試紙盒及其制備方法，屬于生物工程產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin)是常見霉菌——黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物。黃曲霉在自然界的存在較寄生曲霉普遍，很容易污染食品，又能在受侵染的糧食和油料作物(尤其是玉米和花生)上生長繁殖產(chǎn)生毒素。1960年，英國曾發(fā)生了約十萬只火雞幼仔短短幾個(gè)月內(nèi)相繼死亡的嚴(yán)重事故，后來查明是由于火雞吃了含有霉變花生餅的飼料引起的，并從霉變的花生餅中分離出黃曲霉產(chǎn)毒菌株。1961年已證實(shí)喂飼了含有黃曲霉毒素的花生餅可使大鼠發(fā)生原發(fā)性肝癌。大多數(shù)產(chǎn)毒黃典霉菌產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的量比其它黃曲霉毒素多，而且黃曲霉毒素B1的毒性又最大。黃曲霉毒素B1除主要可引發(fā)肝癌外，由于毒素侵入試驗(yàn)動(dòng)物的途徑不同，也可引起其它部位如腎、胃、支氣管、腺體和皮下組織的癌腫。根據(jù)一些流行病學(xué)的調(diào)查和研究結(jié)果表明，世界上許多肝癌高發(fā)區(qū)，食品的黃曲霉毒素污染率較高。江蘇省啟東市是全國肝癌發(fā)病率最高的地區(qū)，據(jù)一些專家研究顯示這與當(dāng)?shù)厝藗儗?duì)糧食儲(chǔ)存方法不當(dāng)，再加上氣候溫暖潮濕，糧食受黃曲霉菌污染所致。
黃曲霉毒素是一類結(jié)構(gòu)相似的化合物的總稱。其基本結(jié)構(gòu)都有一個(gè)二呋南環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?香豆素)。最初根據(jù)其在紫外光下發(fā)生熒光的顏色及薄層層折時(shí)Rf值的不同分別命名為黃曲霉毒素B1、B2和G1、G2。在365nm波長下B1、B2呈藍(lán)紫色熒光；G1、G2呈黃綠色熒光。以后又發(fā)現(xiàn)這類毒素在動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，種類有黃曲霉毒素P1、M1、M2、CM1等等，黃曲霉毒素可溶于多種溶劑中，如氯仿、甲醇等，但不溶于己烷、石油醚與乙醚中，在紫外光照射下毒素可產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，此種毒素用有機(jī)溶劑提取凈化后，可在硅膠板上作薄層層析。結(jié)構(gòu)如下所示。
動(dòng)物攝取黃曲霉毒素B1后，在體內(nèi)形成代謝物M1。M1是B1的羥基化衍生物，最初在羊奶中發(fā)現(xiàn)，故命名。牛、羊等動(dòng)物食入含有黃曲霉毒素B1的飼料后，其奶中即有M1排出。猴攝入B1后尿中排出代謝物為P1。P1是B1的去甲基衍生物，因而代以一個(gè)酚基命名。動(dòng)物攝入B1后，在奶、尿液、血液中都有B1或其它代謝物檢出。組織器官中以肝臟最為重要，各種動(dòng)物肝臟均有B1或其它代謝物出現(xiàn)，腎、脾、腎上腺中亦可含有B1，但在肝臟中的蓄積作用顯著較其它組織高。
黃曲霉毒素與人類的健康有著密切關(guān)系，全世界都在關(guān)心食品安全問題。世界衛(wèi)生組織(WHO)建議自1975年4月1日起將1970年所規(guī)定的果實(shí)及其產(chǎn)品中的黃曲霉毒素的“可行性標(biāo)準(zhǔn)”(“actionable level”)由20ppb降至15ppb以下，在將來隨著檢驗(yàn)水平的提高，限量標(biāo)準(zhǔn)將進(jìn)一步下降。國內(nèi)外檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法有很多，其中薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和免疫化學(xué)法是目前研究較多、且受人們關(guān)注的幾個(gè)代表性方法。(一)TLC該法是常規(guī)方法，一般實(shí)驗(yàn)室均可完成，但測(cè)定黃曲霉毒素B1的專一性差，且有其它熒光物質(zhì)干擾，分析時(shí)間較長。(二)HPLCHPLC法是一個(gè)靈敏快速的方法，分辨率高，往往一次可同時(shí)測(cè)定多種黃曲霉毒素，可定性、定量，但儀器較昂貴，技術(shù)水平要求高，不宜推廣使用。(三)免疫分析法包括放射免疫法、酶聯(lián)免疫法和親和層析法。免疫分析法有特異性強(qiáng)，靈敏度高等特點(diǎn)，但需要檢驗(yàn)人員有較高的專業(yè)知識(shí)或配有檢測(cè)儀器。以上三種方法的不足之處在于或檢測(cè)靈敏度不高、或一次不能檢測(cè)大量樣品、或需昂貴的設(shè)備、或安全性較差等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種黃曲霉毒素B1金標(biāo)檢測(cè)試紙盒及其制備方法，黃曲霉毒素B1金標(biāo)檢測(cè)試紙條屬于生物工程產(chǎn)品，主要用于檢測(cè)糧食、食品、飲料、酒類、飼料等中的黃曲霉毒素B1(AFB1)的含量。
本發(fā)明的技術(shù)方案檢測(cè)原理是樣品中的黃曲霉毒素B1(AFB1)首先與膠體金顆粒表面的抗AFB1單克隆抗體反應(yīng)，如果樣品中AFB1的含量超過限值，膠體金的抗體位點(diǎn)將不再有剩余，當(dāng)膠體金顆粒層析經(jīng)過檢測(cè)線時(shí)，膠體金顆粒將不會(huì)停留在該線的所在位置，繼續(xù)上行時(shí)與控制線上噴涂的羊抗鼠IgG反應(yīng)，呈現(xiàn)出膠體金的紅色。如果樣品中不含AFB1或AFB1含量低于限值，膠體金表面的抗體將與檢測(cè)線上的化合物反應(yīng)呈現(xiàn)出紅色，質(zhì)控線也呈現(xiàn)紅色。
黃曲霉毒素B1金標(biāo)檢測(cè)試紙盒的結(jié)構(gòu)是由盒殼體和試紙條所組成，試紙條被封裝在盒殼體內(nèi)，試紙條用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯，在試紙條一端的注樣區(qū)粘貼吸附膠體金-抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體結(jié)合物的玻璃纖維膜；在試紙條中間的測(cè)試區(qū)粘貼硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜連接處有一小段重疊區(qū)，玻璃纖維膜的一小段重疊在硝酸纖維素膜上，在試紙條另一端吸水區(qū)粘貼吸水紙；在硝酸纖維素膜上從注樣區(qū)到吸水區(qū)的方向，依次噴涂黃曲霉毒素B1-卵清白蛋白作檢測(cè)線，噴涂羊抗鼠IgG作質(zhì)控線，然后再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；盒殼體上面開有注樣孔，觀測(cè)孔，注樣孔的位置對(duì)應(yīng)于試紙條注樣區(qū)的玻璃纖維膜，觀測(cè)孔的位置對(duì)應(yīng)于試紙條的測(cè)試區(qū)，使能觀察到檢測(cè)線和質(zhì)控線的變色。
吸附膠體金-抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體結(jié)合物的玻璃纖維膜的制備將膠體金-抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體結(jié)合物稀釋至0.5-2μg/mL，放入10mm×300mm玻璃纖維膜，浸泡10-20分鐘，37℃烘干，4-8℃保存，粘貼在背襯一端的注樣區(qū)；在背襯中間檢測(cè)區(qū)粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜上噴涂濃度為100-500μg/mL黃曲霉毒素B1-卵清白蛋白作檢測(cè)線，噴涂濃度為50-200μg/mL羊抗鼠IgG作質(zhì)控線，再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；在背襯另一端吸水區(qū)粘貼吸水紙；所得黃曲霉毒素B1金標(biāo)檢測(cè)試紙條包封在上面開有注樣孔和觀測(cè)孔的盒殼體內(nèi)。硝酸纖維素膜厚度為120μm，蛋白質(zhì)負(fù)載量為5-20μg/cm2，聚氯乙烯或聚乙烯背襯厚度為100μm。試紙條的尺寸約為(55-65)mm×(3-5)mm，檢測(cè)線和質(zhì)控線的寬度為0.5-1mm。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用金標(biāo)檢測(cè)法，用于檢測(cè)糧食、食品、飲料、酒類、飼料等中的黃曲霉毒素B1(AFB1)的含量。檢測(cè)時(shí)只需將檢測(cè)樣品滴入注樣孔中，稍許，即可在觀測(cè)區(qū)中觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線的變色情況，確定樣品中黃曲霉毒素B1含量是否超標(biāo)。如果檢測(cè)線和質(zhì)控線均呈紅色，則樣品中黃曲霉毒素B1含量達(dá)標(biāo)，如果檢測(cè)線不變色，僅質(zhì)控線變色，則樣品中黃曲霉毒素B1含量超標(biāo)。與現(xiàn)有測(cè)試方法相比，不需要大型檢測(cè)儀器，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、明顯、靈敏度高。


圖1黃曲霉毒素B1金標(biāo)檢測(cè)試紙盒檢測(cè)示意圖。
圖2黃曲霉毒素B1金標(biāo)檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)圖。
1.盒殼體，2.試紙條，3.玻璃纖維膜，4.硝酸纖維素膜，5.檢測(cè)線，6.質(zhì)控線，7.吸水紙，8.注樣孔，9.觀測(cè)孔。
具體實(shí)施方法1.完全抗原AFB1-O-BSA的合成取AFB1的活化物5mg于5mL無水二甲基甲酰胺(DMF)溶解，置4℃冰箱中冷卻。取50mg碳二亞胺鹽(EDPC)溶于1.0mL蒸餾水中，取44mg牛血清白蛋白(BSA)溶于4.0mL0.01M的磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.4)中，冰箱中冷卻待用。在磁力攪拌的同時(shí)，將0.5mLEDPC溶液逐滴加入AFB1溶液中，4℃攪拌，避光反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)液中緩慢滴加BSA溶液，繼續(xù)攪拌1小時(shí)后，再加入0.5mLEDPC溶液，4℃下反應(yīng)16小時(shí)。將產(chǎn)物溶液用0.01M PBS溶液在4℃下透析72小時(shí)，每12小時(shí)換一次透析液。最后將透析好的溶液分裝，-20℃保存。
2.黃曲霉毒素B1(AFB1)單克隆抗體的制備1)動(dòng)物免疫用完全抗原AFB1-O-BSA免疫8周齡BALB/c小鼠，每鼠抗原量為200μg。第一次免疫，抗原與福氏完全佐劑1∶1乳化后，腹腔及皮下注射；第二次免疫于三周后進(jìn)行，采用抗原與福氏不完全佐劑1∶1乳化后，腹腔及皮下注射；間隔三周后，進(jìn)行第三次免疫，方法與第二次相同；2周后，加強(qiáng)免疫，直接用抗原通過尾靜脈免疫，抗原量為100μg。在免疫的過程中，監(jiān)測(cè)抗體的產(chǎn)生情況。加強(qiáng)免疫72小時(shí)后，殺死小鼠，取脾臟制備脾細(xì)胞懸液。
2)細(xì)胞融合免疫小鼠脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長期限的骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)以10∶1混合，用含20％胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液清洗細(xì)胞，4000KD聚乙二醇(PEG)為融合劑融合。離心，移去上清液。融合細(xì)胞懸浮于含20％胎牛血清的黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培養(yǎng)液中，稀釋至適當(dāng)濃度(2×106脾細(xì)胞/mL)，加入預(yù)先制備的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞，2×104個(gè)/孔)，放入CO2孵育箱中37℃培養(yǎng)，當(dāng)鏡檢雜交瘤克隆生長達(dá)1/2視野時(shí)，取上清液用間接競爭ELISA法進(jìn)行篩選得到適合的雜交瘤細(xì)胞。
3)克隆化采用準(zhǔn)確計(jì)數(shù)稀釋法，得到雜交瘤細(xì)胞株，凍存。
4)單克隆抗體的制備將培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞離心，棄去上清液，用生理鹽水將雜交瘤細(xì)胞懸浮，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至2×106個(gè)/mL，每只BALB/c小鼠腹腔注射1mL，對(duì)側(cè)腹腔注射1mL降植烷和不完全福氏佐劑，12天后收集腹水。將腹水離心(3000rpm，20min)，收集上清液。用33％飽和硫酸銨和50％飽和硫酸銨分級(jí)沉淀，得到抗AFB1單克隆抗體。
3、抗體與膠體金結(jié)合原液的制備1)膠體金的制備取0.01％的氯金酸100mL，加熱煮沸，然后快速加入1％的檸檬酸鈉1.0mL，繼續(xù)煮沸5分鐘。用0.1mol/L K2CO3和0.1mol/L HCl調(diào)整PH至8.0-8.6。
2)抗體準(zhǔn)備抗AFB1單克隆抗體用葡聚糖凝膠(Sephadex)G-25脫鹽。
3)抗體與膠體金結(jié)合原液的制備用純化好的抗AFB1單克隆抗體加入膠體金液中，體積比為1∶20，終濃度為50-70μg/mL，室溫?cái)嚢杈鶆颉＜尤?0％牛血清白蛋白(BSA)，終濃度為0.4％，再加入10％PEG(MW20000)，終濃度為0.2％，室溫?cái)嚢杈鶆?。加入與膠體金-抗體結(jié)合物液同體積的10％NaCl，靜置1小時(shí)。12000rpm離心60分鐘，沉淀溶解于適量0.01M PBS溶液中，用0.45μm的濾膜過濾，終濃度為40-50μg/mL。用0.01M PBS溶液稀釋到所需濃度0.5-2μg/mL，用于浸泡玻璃纖維膜使之吸附。
4)抗原AFB1-O-OVA的合成取AFB1的活化物1mg于1mL無水二甲基甲酰胺(DMF)溶解，置4℃冰箱中冷卻。取20mg碳二亞胺鹽(EDPC)溶于1.0mL蒸餾水中，取20mg卵清白蛋白(OVA)溶于2.0mL0.01M的磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.4)中，冰箱中冷卻待用。在磁力攪拌的同時(shí)，將0.5mL EDPC溶液逐滴加入AFB1溶液中，4℃攪拌，避光反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)液中緩慢滴加OVA溶液，繼續(xù)攪拌1小時(shí)后，再加入0.5mL EDPC溶液，4℃下反應(yīng)16小時(shí)。將產(chǎn)物溶液用0.01M PBS溶液在4℃下透析72小時(shí)，每12小時(shí)換一次透析液。最后將透析好的溶液分裝，-20℃保存。用0.01M PBS溶液稀釋到所需濃度100-500μg/mL，用于噴涂檢測(cè)線。
5)羊抗鼠IgG購買于上海華美試劑公司。羊抗鼠IgG用0.01MPBS溶液稀釋到所需濃度50-200μg/mL，用于噴涂質(zhì)控線。
權(quán)利要求
1.一種黃曲霉毒素B1金標(biāo)檢測(cè)試紙盒，其特征是由盒殼體(1)和試紙條(2)所組成，試紙條被封裝在盒殼體內(nèi)，試紙條用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯，在試紙條一端的注樣區(qū)粘貼吸附膠體金-抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體結(jié)合物的玻璃纖維膜(3)；在試紙條中間的測(cè)試區(qū)粘貼硝酸纖維素膜(4)，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜連接處有一小段重疊區(qū)，玻璃纖維膜的一小段重疊在硝酸纖維素膜上，在試紙條另一端吸水區(qū)粘貼吸水紙(7)；在硝酸纖維素膜上從注樣區(qū)到吸水區(qū)的方向，依次噴涂黃曲霉毒素B1-卵清白蛋白作檢測(cè)線(5)，噴涂羊抗鼠IgG作質(zhì)控線(6)，然后再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；盒殼體上面開有注樣孔(8)，觀測(cè)孔(9)，注樣孔的位置對(duì)應(yīng)于試紙條注樣區(qū)的玻璃纖維膜，觀測(cè)孔的位置對(duì)應(yīng)于試紙條的測(cè)試區(qū)，使能觀察到檢測(cè)線和質(zhì)控線的變色。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試紙盒的制備方法，其特征是所述吸附膠體金-抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體結(jié)合物的玻璃纖維膜的制備將膠體金-抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體結(jié)合物稀釋至0.5-2μg/mL，放入10mm×300mm玻璃纖維膜，浸泡10-20分鐘，37℃烘干，4-8℃保存，粘貼在背襯一端的注樣區(qū)；在背襯中間檢測(cè)區(qū)粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜上噴涂濃度為100-500μg/mL黃曲霉毒素B1-卵清白蛋白作檢測(cè)線，噴涂濃度為50-200μg/mL羊抗鼠IgG作質(zhì)控線，再用1％牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜；在背襯另一端吸水區(qū)粘貼吸水紙；所得黃曲霉毒素B1金標(biāo)檢測(cè)試紙條包封在上面開有注樣孔和觀測(cè)孔的盒殼體內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試紙盒的制備方法，其特征是硝酸纖維素膜厚度為120μm，蛋白質(zhì)負(fù)載量為5-20μg/cm2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試紙盒的制備方法，其特征是聚氯乙烯或聚乙烯背襯厚度為100μm。
全文摘要
一種黃曲霉毒素B
文檔編號(hào)G01N33/544GK1673748SQ20051003886
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2005年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日
發(fā)明者趙曉聯(lián), 龔燕, 陸茂林, 孫蔚榕, 趙春城, 孫秀蘭, 湯堅(jiān), 蔡建榮, 張東升, 蔡正森 申請(qǐng)人:江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司