專利名稱：一種2，4－d殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒，主要適用于大批量水和土壤等樣品中2，4-D殘留的快速測(cè)定。屬于酶免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2，4-D是一種有機(jī)氯除草劑，過(guò)去主要用于禾谷類作物，特別是麥田和玉米中防除一年生及多年生莎草和雙子葉雜草。2，4-D在環(huán)境中的殘留期長(zhǎng)，據(jù)報(bào)道，2，4-D是一種潛在的致癌物，并且由于它的廣泛使用，已造成了我國(guó)地下水和飲用水的污染。
除草劑2，4-D殘留常規(guī)的分析主要是應(yīng)用氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)等儀器在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。應(yīng)用這些理化分析技術(shù)對(duì)環(huán)境、生物、食品等樣品中痕量2，4-D殘留進(jìn)行分析，不儀儀器化程度要求較高，并且需要經(jīng)過(guò)繁復(fù)的分離、提取、凈化、衍生等前處理過(guò)程，分析速度慢、成本高，前處理過(guò)程需要使用大量的有機(jī)溶劑，又造成了二次污染。隨著待檢樣品、特別是要求現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)樣品量的迅速增加，傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析手段難以適應(yīng)要求，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)和應(yīng)用高效率農(nóng)藥殘留快速分析技術(shù)。
酶聯(lián)免疫吸附分析方法特異性強(qiáng)、靈敏度高而且簡(jiǎn)便快速，可以彌補(bǔ)色譜分析方法的缺陷，本發(fā)明對(duì)解決大批量樣品的2，4-D殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決目前農(nóng)藥殘留儀器分析方法成本高、操作復(fù)雜、特異性差、靈敏度低和檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種具有高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡(jiǎn)單，并能用于大批量樣品快速檢測(cè)的2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒。
2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的96孔酶標(biāo)板、海綿支架和支架內(nèi)包含有濃縮洗滌液(PBST)、不同濃度的2，4-D標(biāo)準(zhǔn)液、抗2，4-D多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體、A液、B液和反應(yīng)終止液。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是首先利用活性酯法將2，4-D與牛血清白蛋白偶聯(lián)后制備人工免疫原，用該免疫原免疫新西蘭大耳白兔制備出2，4-D多克隆抗體。再用混合酸酐法將2，4-D與卵清蛋白偶聯(lián)，它們的復(fù)合物作為包被抗原被固定于酶標(biāo)板孔壁上。預(yù)先將待測(cè)2，4-D樣品和多克隆抗體混合反應(yīng)30分鐘，再將反應(yīng)后的抗原抗體加入到酶標(biāo)板孔中，固相包被抗原和待測(cè)2，4-D相互競(jìng)爭(zhēng)與抗體反應(yīng)，由于每個(gè)孔中的固相抗原含量和加入的抗體含量均一致，所以當(dāng)待測(cè)的2，4-D濃度高時(shí)，被結(jié)合在固相抗原上的抗體(一抗)量就少，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(二抗)后，二抗與一抗的結(jié)合量少，最后加入底物液(A液)和顯色液(B液)，顯色反應(yīng)淺(OD值低)，表明抑制率高；反之，當(dāng)待測(cè)2，4-D濃度低時(shí)，則所測(cè)的OD值高，抑制率低。用已知的2，4-D濃度檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以推算出待測(cè)2，4-D的濃度。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)水和土壤中2，4-D殘留，樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，樣品檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法。試劑盒的保存期至少6個(gè)月。
四

附圖為2，4-D的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，曲線的回歸方程為y＝-0.2015x+0.4676(R2＝0.9757，IO＝0＝0.69μg/mL，IC20＝0.02μg/mL。
五具體實(shí)施例方式
試劑盒操作及結(jié)果計(jì)算待測(cè)樣品經(jīng)前處理后，用PBST定容備用。拆開(kāi)真空包裝袋并取出酶際板，在室溫下平衡5分鐘備用。將相同濃度的抗體分別與不同濃度(0μg/mL，0.01μg/mL，0.05μg/mL，0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL)的2，4-D標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)2，4-D液混合，37℃孵育30分鐘；然后將100μL此反應(yīng)混合溶液移入酶標(biāo)板中，37℃孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗2～6次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍干；加入按1∶1000稀釋好的酶標(biāo)羊抗兔二抗100μL，37℃孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用PBST洗板2～6次，拍干；取A液和B液等體積混勻，每孔加100μL，在暗處顯色10～15分鐘，每孔加入50μl的終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在波長(zhǎng)為450nm處的OD值。
將含0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值減去含最大濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值定為B0，其余孔經(jīng)同樣方法校正后的OD值定為B；以B/B0值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值(logC)為橫坐標(biāo)，繪制2，4-D標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。根據(jù)曲線的回歸方程可以推算出對(duì)應(yīng)樣品的濃度，也可以推算出IC50(B/B0＝50％)及最小檢測(cè)限IC20(B/B0＝80％)，其中IC50為抑制50％抗原抗體反應(yīng)所需2，4-D濃度，IC20為抑制20％抗原抗體反應(yīng)所需2，4-D濃度。
實(shí)施例12，4-D與載體蛋白偶聯(lián)(1)活性酯法偶聯(lián)2，4-D與牛血清白蛋白(BSA)稱42mg 0.19mmol)2，4-D和22mg(0.19mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于2mL無(wú)水二氧雜環(huán)己烷，緩慢滴加N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)溶液(39mg溶于0.5mL二氧雜環(huán)己烷)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)18小時(shí)，離心，取上清液。將30mgBSA溶于2mL 0.1mol/L pH9.1的硼酸緩沖溶液中，逐滴加入200μL上清液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)。反應(yīng)液裝入透析袋對(duì)0.01mol/L pH7.4的PB透析。每6小時(shí)換液一次，總共換液5～6次。透析后離心，上清液冷凍干燥，4℃保存。
(2)混合酸酐法偶聯(lián)2，4-D與卵清白蛋白(OVA)稱30mg 2，4-D(約18μmol)溶于200μL無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)中，然后按順序加入4.27μL(約18μmol)三正丁胺、2.34μL(約18μmol)氯甲酸異丁酯，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)。稱30mg OVA溶于2mL0.05mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖溶液中，返滴加入100μL上一步反應(yīng)液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，然后將反應(yīng)液透析、離心、冷凍干燥，4℃保存。
實(shí)施例22，4-D多克隆抗體制備將2，4-D與BSA的偶聯(lián)物作免疫原，稱2mg免疫原溶于1mL無(wú)菌生理鹽水中，與1mL完全弗氏佐劑混合，充分乳化后注射新西蘭大耳白兔大腿，以后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，換用不完全弗氏佐劑與免疫原混合，免疫部位為頸背部皮下，從第三次免疫開(kāi)始，每次免疫后一周從兔耳靜脈采血檢測(cè)血清效價(jià)?？偣裁庖?次，最后一次免疫后一周從兔頸動(dòng)脈采全血，先用35％的飽和硫酸銨鹽析法粗提兔抗血清，再用DE-52陰離子交換層析法進(jìn)一步純化，獲得較純的2，4-D多克隆抗體。
實(shí)施例3保存期實(shí)驗(yàn)將試劑盒放置于4℃保存，分別取0、10、20、30、60、90、120、150和180d的試劑盒，以最佳抗體抗原工作濃度為測(cè)定濃度，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)以測(cè)定其檢測(cè)效果。保存期測(cè)定結(jié)果如下表表1 試劑盒保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從以上結(jié)果可以看出，IC50變化不大，試劑盒在4℃下至少可保存6個(gè)月以上。
實(shí)施例4試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)選擇2，4-D的結(jié)構(gòu)類似物作為待測(cè)物，測(cè)得各物質(zhì)的抑制中濃度(IC50)，再用下式計(jì)算抗體對(duì)這些物質(zhì)的交叉反應(yīng)性；交叉反應(yīng)率愈小，則抗體對(duì)2，4-D的特異性愈強(qiáng)，反之則抗體的特異性差。
交叉反應(yīng)(CR％)＝IC50(2，4-D)/IC50(供試物)×100％。
實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，采用間接ELISA法，多克隆抗體與2甲4氯的交叉反應(yīng)是8.5％。與2，4-滴丁酯、2，4-二氯苯甲醛和2，4-二氯苯甲酸的交叉反應(yīng)均小于1％。2甲4氯也是一種除草劑，它和2，4-D一般不會(huì)同時(shí)存在于樣品中，所以不會(huì)影響該試劑盒對(duì)2，4-D的檢測(cè)。
表2 交叉反應(yīng)

實(shí)施例5添加回收實(shí)驗(yàn)取適量2，4-D標(biāo)樣添加到樣品中，設(shè)置0.5mg/kg，1mg/kg和5mg/kg三個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)，進(jìn)行測(cè)定。
ELISA檢測(cè)樣品的前處理水樣加入EDTA過(guò)濾后即可取樣進(jìn)行ELISA分析。
土樣取10g土壤用20～40mL甲醇提取三次，合并提取液，濃縮，然后用PBST稀釋定容至10mL，進(jìn)行ELISA分析。
試劑盒的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，水樣回收率為82～106％，變異系數(shù)5.6～11.2％，土壤樣品回收率為94～104％，變異系數(shù)6.6～7.8％。試劑盒的回收率在允許范圍內(nèi)，符合農(nóng)藥殘留分析對(duì)精確度的要求。
表3 試劑盒添加回收測(cè)定結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于由盒體、可拆卸96孔酶標(biāo)板、海綿支架和支架內(nèi)包含有濃縮洗滌液(PBST)、不同濃度的2，4-D標(biāo)準(zhǔn)液、抗2，4-D多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體、A液、B液和反應(yīng)終止液的試劑瓶組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于所述的海綿支架上有裝試劑瓶的孔槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于所述的可拆卸96孔酶標(biāo)板用鋁箔袋真空包裝，酶標(biāo)板的板條可拆卸下來(lái)，每個(gè)孔內(nèi)均吸附有相同量的包被抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的包被抗原，其特征在于為2，4-D與卵清蛋白(OVA)的偶聯(lián)復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于所述的抗2，4-D多克隆抗體制備方法如下將2，4-D與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)的復(fù)合物作為免疫原，免疫新西蘭大耳白兔，獲得2，4-D的多克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于所述的不同濃度的2，4-D標(biāo)準(zhǔn)液用甲醇和蒸餾水配制，溶液中甲醇的含量小于1％。濃度分別為0μg/mL，0.01μg/mL，0.05μg/mL，0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于所述的濃縮洗滌液(PBST)內(nèi)含有氯化鈉7～9g、磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉2～4g、氯化鉀3～6g、吐溫-20 1mL、雙蒸水50mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于所述的A液過(guò)氧化尿10mg，103mg檸檬酸，358mg Na2HPO4·12 H2O，吐溫-20 1μL，蒸餾水10mL，pH5；B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)4mg(用500μL二甲亞砜溶解)，103mg檸檬酸，蒸餾水9.5mL，pH2.4。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2，4-D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，其特征在于所述的反應(yīng)終止液為2mol/L的硫酸液。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種2，4－D殘留的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，屬于酶免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明克服了2，4－D理化分析方法操作復(fù)雜、檢測(cè)成本高及速度慢等缺點(diǎn)，能準(zhǔn)確快速地檢測(cè)水和土壤等樣品中2，4－D殘留。檢測(cè)過(guò)程中，酶標(biāo)板孔壁上吸附的包被抗原和待測(cè)2，4－D相互競(jìng)爭(zhēng)與溶液中的抗體反應(yīng)，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果通過(guò)酶催化反應(yīng)顯色顯示出來(lái)。通過(guò)檢測(cè)已知濃度的2，4－D并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以推算出待測(cè)2，4－D的濃度。試劑盒的保存期超過(guò)6個(gè)月。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1687781SQ200510041980
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者許艇, 潘峰, 李季, 井德明 申請(qǐng)人:西安綠盾生物科技發(fā)展有限責(zé)任公司