專(zhuān)利名稱(chēng)：流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流式細(xì)胞儀檢測(cè)血液白細(xì)胞各群(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)表面標(biāo)志時(shí)所用溶血素及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流式細(xì)胞儀已應(yīng)用于科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)的各個(gè)領(lǐng)域，如免疫功能的檢查，腫瘤抗原、轉(zhuǎn)移基因與抑癌基因及其他疾病相關(guān)基因檢測(cè)，細(xì)胞凋亡，艾滋病診斷與預(yù)后判斷等。隨著流式細(xì)胞儀的普及和應(yīng)用，其配套試劑的開(kāi)發(fā)和研制也顯得越來(lái)越重要。目前，流式細(xì)胞儀所用溶血素基本依靠進(jìn)口，主要有美國(guó)Becton Dickinson(BD)公司和Beckman Coulter公司的產(chǎn)品，其價(jià)格昂貴，并且不能及時(shí)供應(yīng)，給使用者帶來(lái)很大的不便和浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素及其制備方法與應(yīng)用。
本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素的組成如下NaCl5～12gNa2HPO4·12H2O 1～8g或Na2HPO4.2H2O 0.5～6g或K2HPO45～10gKH2PO40.1～0.6g或NaH2PO4.2H2O 0.1～3gKCl 0～0.5g多聚甲醛[(CH2O)n] 20～50g加雙蒸水至 1L多聚甲醛分子式(CH2O)n，其中n＝8-100。
本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素的制備方法如下1.原料稱(chēng)量將所需各種原料按以上配方比例分別稱(chēng)量。
2.配制將各種稱(chēng)量好的原料混合，置45-50℃水浴中4-5小時(shí)，其間每隔30-40分鐘攪拌混勻一次。
3.過(guò)濾將上述溶液用雙層濾紙過(guò)濾去除沉淀，即得本發(fā)明的溶血素。
然后進(jìn)行產(chǎn)品分裝將過(guò)濾好的產(chǎn)品進(jìn)行分裝，50ml/瓶。將分裝好的產(chǎn)品貼好標(biāo)簽，標(biāo)注使用說(shuō)明及注意事項(xiàng)等。成品驗(yàn)收合格入庫(kù)。
本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)血液白細(xì)胞各群(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)表面標(biāo)志。具體可用于BD、Beckman Coulter或其它公司生產(chǎn)的各系列的流式細(xì)胞儀。
具體使用方法如下方法一1.按外周血溶血素為1∶1的體積比將溶血素加入到抗凝外周血中，低速混勻，室溫10分鐘。
2.加入20倍體積的雙蒸水，混勻，室溫5-10分鐘，使紅細(xì)胞完全溶解。流式細(xì)胞儀檢測(cè)血液白細(xì)胞各群(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)表面標(biāo)志。
方法二1.使用前將溶血素用雙蒸水10倍稀釋?zhuān)靹颉?br> 2.按20∶1體積比將稀釋溶血素加入到抗凝外周血中，低速混勻，室溫5-10分鐘，使紅細(xì)胞完全溶解。流式細(xì)胞儀檢測(cè)血液白細(xì)胞各群(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)表面標(biāo)志。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)良效果如下1.本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素組分中包括多聚甲醛，多聚甲醛具有固定白細(xì)胞膜作用，可以最大程度地保護(hù)白細(xì)胞膜完整、不受破壞，并保持白細(xì)胞膜抗原性不受影響。多聚甲醛對(duì)血液中可能存在的病原微生物如乙肝病毒、SARS-CoV等具有固定作用，降低其毒性和傳染性。以保護(hù)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)操作人員免受病原生物的感染。
2.溶血素優(yōu)選的PH值5.0-8.0，如果PH值太低或太高，對(duì)白細(xì)胞的破壞增加。本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素組分中包括磷酸緩沖液，PH值為7.2-7.4，較為穩(wěn)定，這一PH值接近人體血液的PH值，是白細(xì)胞生存的最適合PH值，能夠保護(hù)白細(xì)胞免受破壞和抗原改變。
3.本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素使用濃度中含有大量的水成分，這是使紅細(xì)胞溶解的主要成分。水依靠低滲作用，使紅細(xì)胞漲裂，達(dá)到紅細(xì)胞溶解的作用。
4.本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素各成分價(jià)格低廉，供應(yīng)方便，容易獲得，使產(chǎn)品成本和造價(jià)降低。
5.本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素制作工藝簡(jiǎn)單，配置過(guò)程不需要昂貴的儀器設(shè)備條件，使生產(chǎn)簡(jiǎn)單易行。
6.本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素使用方法簡(jiǎn)易，多樣化，使用者可以根據(jù)自己的習(xí)慣自行選擇，方便易行。
7.本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素沒(méi)有毒性，對(duì)使用者和環(huán)境無(wú)危害。


圖1是使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的白細(xì)胞前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)的點(diǎn)密度圖，可見(jiàn)白細(xì)胞分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞三群。
圖2是BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的白細(xì)胞前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)的點(diǎn)密度圖?？梢?jiàn)白細(xì)胞分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞三群。另外還有一團(tuán)較明顯的細(xì)胞碎片，這是由于紅細(xì)胞的溶解不徹底造成的。
圖3、4分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的淋巴細(xì)胞CD14表達(dá)直方圖。
圖5、6分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的單核細(xì)胞CD14表達(dá)直方圖。
圖7、8分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的粒細(xì)胞CD14表達(dá)直方圖。
圖9、10分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的淋巴細(xì)胞CD45表達(dá)直方圖。
圖11、12分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的單核細(xì)胞CD45表達(dá)直方圖。
圖13、14分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的粒細(xì)胞CD45表達(dá)直方圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素的組成如下NaCl8gNa2HPO4.12H2O 2.89gKH2PO40.2gKCl 0.2g多聚甲醛30g加雙蒸水至 1L制備方法1.原料稱(chēng)量將所需各種原料按以上配方比例分別稱(chēng)量。
2.配制將各種稱(chēng)量好的原料混合，放入50℃水浴中4小時(shí)，其間每隔30分鐘攪拌混勻一次。
3.過(guò)濾雙層濾紙過(guò)濾去除沉淀。
然后進(jìn)行產(chǎn)品分裝將過(guò)濾好的產(chǎn)品進(jìn)行分裝，50ml/瓶。將分裝好的產(chǎn)品貼好標(biāo)簽，標(biāo)注使用說(shuō)明及注意事項(xiàng)等。成品驗(yàn)收合格入庫(kù)。
表1是40例人抗凝外周血在本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素實(shí)施例1和BD公司生產(chǎn)的溶血素分別作用下在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞CD14、CD45表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果，二者比較具有高度一直性。這表明使用本發(fā)明流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素檢測(cè)白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)膜抗原表達(dá)水平與使用BD公司生產(chǎn)的溶血素檢測(cè)白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)膜抗原表達(dá)水平結(jié)果具有很好的一直性。
表1.使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD溶血素淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞CD14、CD45表達(dá)結(jié)果
本實(shí)施例溶血素具體使用方法為按外周血溶血素為1∶1的體積比將溶血素加入到抗凝外周血中，低速混勻，室溫10分鐘。加入20倍體積的雙蒸水，混勻，室溫5-10分鐘，使紅細(xì)胞完全溶解。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血液白細(xì)胞各群(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)表面標(biāo)志。
圖1是使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的白細(xì)胞前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)的點(diǎn)密度圖，可見(jiàn)白細(xì)胞分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞三群。
圖2是BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的白細(xì)胞前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)的點(diǎn)密度圖?？梢?jiàn)白細(xì)胞分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞三群。另外還有一團(tuán)較明顯的細(xì)胞碎片，這是由于紅細(xì)胞的溶解不徹底造成的。
圖3、4分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的淋巴細(xì)胞CD14表達(dá)直方圖。可見(jiàn)二者CD14表達(dá)水平具有很好的一直性。
圖5、6分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的單核細(xì)胞CD14表達(dá)直方圖?？梢?jiàn)二者CD14表達(dá)水平具有很好的一直性。
圖7、8分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的粒細(xì)胞CD14表達(dá)直方圖?？梢?jiàn)二者CD14表達(dá)水平具有很好的一直性。
圖9、10分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的淋巴細(xì)胞CD45表達(dá)直方圖?？梢?jiàn)二者CD45表達(dá)水平具有很好的一直性。
圖11、12分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的單核細(xì)胞CD45表達(dá)直方圖?？梢?jiàn)二者CD45表達(dá)水平具有很好的一直性。
圖13、14分別為使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶血素和BD公司生產(chǎn)的溶血素作用于人抗凝外周血后在美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀上得到的粒細(xì)胞CD45表達(dá)直方圖?？梢?jiàn)二者CD45表達(dá)水平具有很好的一直性。
實(shí)施例2.
制備方法同實(shí)施例1，所不同的是溶血素組成如下NaCl 7.2gNa2HPO4·12H2O 3.73gKH2PO40.43g多聚甲醛 40g加雙蒸水至 1L實(shí)施例3.
制備方法同實(shí)施例1，所不同的是溶血素組成如下NaCl9gNa2HPO4·12H2O 6gNaH2PO4·2H2O 0.4g多聚甲醛25g加雙蒸水至 1L實(shí)施例4.
制備方法同實(shí)施例1，所不同的是溶血素組成如下NaCl 7.2gK2HPO47.52gNaH2PO4·2H2O 1.49g多聚甲醛 30g加雙蒸水至 1L
權(quán)利要求
1.流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素，其特征在于，組成如下NaCl5～12gNa2HPO4·12H2O 1～8g或Na2HPO4.2H2O 0.5～6g或K2HPO45～10gKH2PO40.1～0.6g或NaH2PO4.2H2O 0.1～3gKCl 0～0.5g多聚甲醛[(CH2O)n]，n＝8-10020～50g加雙蒸水至 1L。
2.權(quán)利要求1所述流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素的制備方法，步驟如下(1)原料稱(chēng)量將所需各種原料按比例分別稱(chēng)量；(2)配制將各種稱(chēng)量好的原料混合，置45-50℃水浴中4-5小時(shí)，其間每隔30-40分鐘攪拌混勻一次；(3)過(guò)濾將上述溶液用雙層濾紙過(guò)濾去除沉淀，即得溶血素。
3.權(quán)利要求1所述流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)血液白細(xì)胞各群表面標(biāo)志。
4.如權(quán)利要求3所述流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素的用途，其特征在于使用方法如下按外周血∶溶血素為1∶1的體積比將溶血素加入到抗凝外周血中，低速混勻，室溫10分鐘；加入20倍體積的雙蒸水，混勻，室溫5-10分鐘，使紅細(xì)胞完全溶解；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
5.如權(quán)利要求3所述流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素的用途，其特征在于使用方法如下使用前將溶血素用雙蒸水10倍稀釋?zhuān)靹颍话?0∶1體積比將稀釋溶血素加入到抗凝外周血中，低速混勻，室溫5-10分鐘，使紅細(xì)胞完全溶解；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
全文摘要
流式細(xì)胞儀專(zhuān)用溶血素及其制備方法與應(yīng)用，屬于醫(yī)療檢測(cè)用試劑技術(shù)領(lǐng)域。溶血素主要由NaCl、Na
文檔編號(hào)G01N33/50GK1632576SQ20051004200
公開(kāi)日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2005年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月4日
發(fā)明者肖東杰, 汪運(yùn)山, 李曉英, 王戒, 黃平, 張慧林, 劉杰 申請(qǐng)人:濟(jì)南市中心醫(yī)院