專利名稱：一種利用藻紅蛋白熒光探針檢測煙草花葉病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光探針，以及利用熒光探針檢測病毒的方法，特別涉及一種藻紅蛋白熒光探針，以及利用藻紅蛋白熒光探針快速檢測煙草花葉病毒的方法。
背景技術(shù)：
植物病毒檢測常用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法，酶免疫分析是將抗原抗體結(jié)合的特異性與酶的高效催化性相結(jié)合的技術(shù)，具有靈敏度高，特異性強等特點，但操作步驟多，耗時長，且需要相對昂貴的酶標(biāo)抗體和96孔酶標(biāo)板。
熒光免疫分析是利用各種熒光物作為探針分子的一種標(biāo)記免疫分析方法，目前在核酸、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、酶、激素、生長因子、細胞因子、細胞表面標(biāo)志物、腫瘤特異性抗原、受體、藥物、傳染源等各種微量生物活性物質(zhì)的分析中得到廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的熒光探針包括熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明(Rodam)等。熒光測定的檢測限值常受血清和其他生物樣品中本底熒光的制約，加之，傳統(tǒng)熒光探針非特異性吸附，嚴重影響檢測的敏感性，阻礙熒光免疫分析方法發(fā)展。藻紅蛋白是一種新型的熒光探針，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)診斷、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等諸多領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。
閆鳳英等2004年在中華醫(yī)藥雜志第4卷第10期發(fā)表文為“熒光染料R-藻紅蛋白標(biāo)記小鼠抗人CD系列單克隆抗體”，用R-藻紅蛋白(R-PE)標(biāo)記小鼠抗人CD系列單克隆抗體的熒光試劑，應(yīng)用于流式細胞儀分析，分析表明R-PE標(biāo)記的抗體特異性保持完好，且熒光強度高，還可配伍成雙標(biāo)試劑。1997年美國的Iannellli，D等在病毒學(xué)方法雜志上發(fā)表文為“利用流式細胞儀同時檢測黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(TMV)和馬鈴薯Y病毒(PVY)”，將PVY、CMV、TMV三種病毒侵染的植物組織汁液分別與大小不同的乳膠顆粒一起孵育，洗滌后依次在第一抗體和第二抗體中孵育，其中第二抗體分別用藻紅蛋白和熒光素這兩種可發(fā)不同熒光的染料進行標(biāo)記。根據(jù)產(chǎn)生熒光的不同和捕捉到病毒的乳膠顆粒的大小來判斷病毒的種類，從而實現(xiàn)了對這三種病毒的同時檢測。
目前，藻紅蛋白熒光探針的試劑化和商品化程度不高，尚未開發(fā)出普及型診斷試劑，對植物病毒的檢測研究更是鮮有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用藻紅蛋白的優(yōu)良熒光特性，開發(fā)藻紅蛋白熒光探針，并用于煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的檢測。
本發(fā)明是通過以下方法實現(xiàn)的一、材料所用的主要試劑藻紅蛋白為福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所制備；交聯(lián)試劑SPDP、2-IT、以及終止劑NEM購自Peirce公司；介質(zhì)Superdex200HR為Amersham公司的產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)為Sigma產(chǎn)品；硝酸纖維素膜0.45μ為Amersham公司產(chǎn)品；試驗中所使用的其他常規(guī)藥品和試劑均為一般的國產(chǎn)分析純或化學(xué)純試劑。
1、藻紅蛋白的制備在研碎機中充分磨碎叉節(jié)藻(Amphiroa ephdraea)或珊瑚藻(Corallinaofficinalis)，用0.01M PBS pH7.0緩沖液浸提過夜，三層紗布過濾后，4℃下10000rpm離心15min，取上清液；然后用飽和度30％-45％硫酸銨分級沉淀蛋白，得粗制藻紅蛋白紅色沉淀；紅色沉淀溶于0.01M PBS pH7.0緩沖液，然后上樣于Superdex G-15脫鹽柱，脫鹽；收集的脫鹽液即可上樣于預(yù)先已用0.15M NaCl+0.01M PBS pH7.0緩沖液平衡好的羥基磷灰石柱，繼續(xù)用緩沖液沖洗30min后，再用0.15M NaCl+0.01M～0.2M pH7.0PBS緩沖液作線性梯度洗脫；洗脫液收集、濃縮、離心。
2、TMV多克隆抗體的制備取4ml抗血清加8ml 0.06M pH4.0的醋酸緩沖液，用NaOH校正pH值至4.8，在振蕩條件下緩慢加入120μl正辛酸，在室溫中振蕩混合30min，在4℃中10000rpm離心15min，去沉淀，上清液裝入透析袋中，在0.01MpH7.4PBS緩沖液中，透析12h，然后緩慢加等體積飽和硫酸銨，在4℃靜置30min，12000rpm離心20min，取沉淀，透析后使用。
3、陽性、陰性樣品的制備陽性樣品為純化的煙草花葉病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液。
4.封閉緩沖液和洗滌緩沖液的配制封閉緩沖溶液20-100mmol/L pH7.5PBS+0.5-3％BSA洗滌緩沖溶液50-200mmol/L pH7.5PBS+0.05-0.3％Tween20二、藻紅蛋白熒光探針的制備
(1)交聯(lián)蛋白交聯(lián)的兩種蛋白分別為6mg/ml，1.25ml的藻紅蛋白與4mg/ml，0.75ml煙草花葉病毒(TMV)多克隆抗體，二者的摩爾比為1∶1～2∶1；(2)異功能試劑活化蛋白用異功能試劑SPDP活化藻紅蛋白，二者摩爾比為80∶1～200∶1，反應(yīng)時間為15～60min；異功能試劑2-IT巰基化TMV多克隆抗體，二者摩爾比為160∶1～320∶1，反應(yīng)時間為0.5～3h；(3)混合反應(yīng)異功能試劑活化反應(yīng)后，脫鹽去除未反應(yīng)活化試劑；取等體積反應(yīng)物混合反應(yīng)，4℃，反應(yīng)6h。
(4)中止反應(yīng)加入終止液NEM 80mmol/L 100μl中止交聯(lián)反應(yīng)，4℃反應(yīng)1h，將反應(yīng)物裝入透析夾中，透析濃縮。
(5)純化分離交聯(lián)混合物將交聯(lián)混合物上樣于Superdex200HR凝膠層析拄(1.6×60cm)，以0.15ml/min流速，用0.15M NaCL+100mmol/L pH7.0PBS緩沖液洗脫。
三、檢測方法檢測使用的材料由藻紅蛋白熒光探針、硝酸纖維素膜、TMV多克隆抗體、陽性陰性對照品、封閉緩沖溶液和洗滌緩沖溶液組成。
檢測方法如下(1)包被在硝酸纖維素膜上，滴加2-6μlTMV抗體，各點間相隔1-2cm的距離，置于4℃，吸附0.5-3h；(2)封閉將硝酸纖維素膜直接浸入20-100mmol/L pH7.5PBS+0.5-3％BSA封閉緩沖液內(nèi)，37℃溫育0.5-3h；(3)洗滌A配制50-200mmol/L pH7.5PBS+0.05-0.3％Tween20的洗滌緩沖液，并用洗滌緩沖液清洗硝酸纖維素膜至少三次，靜置干燥；(4)點樣滴加陽、陰性樣品和待測樣品，每孔2-6μl；(5)洗滌B待樣品液完全滲入硝酸纖維素膜，室溫靜置10-30min，用所述的洗滌緩沖液清洗膜片至少三次，靜置干燥；(6)熒光標(biāo)記示蹤加入藻紅蛋白熒光探針2-6μl，在37℃溫育0.5-3h；(7)洗滌C用所述的洗滌緩沖液清洗硝酸纖維素膜至少三次，取出膜片用干凈的吸水紙去除表面殘余的液體；(8)檢測判定將硝酸纖維素膜平鋪在干凈的玻璃片上，在倒置熒光顯微鏡下檢測觀察判定結(jié)果。
藻紅蛋白熒光探針免疫熒光檢測主要運用兩種抗體，藻紅蛋白標(biāo)記抗體和硝酸纖維素膜包被的固相抗體。檢測時固相抗體通過抗原反應(yīng)特異性捕獲待測抗原，形成免疫復(fù)合物，加入藻紅蛋白熒光探針，與免疫復(fù)合物充分反應(yīng)后，經(jīng)洗滌去除非特異性物質(zhì)，即可檢測判定結(jié)果。
為檢驗藻紅蛋白熒光探針直接免疫熒光法(DFIA)的檢測效果，用該法檢測了55份TMV樣品，檢測結(jié)果與ELISA的檢測結(jié)果相比較(見附表1)。
附表1 藻紅蛋白直接免疫熒光法與ELISA檢測結(jié)果的比較

注“+”代表陽性；“+/-”代表假陽性；“-”代表陰性。
41份由ELISA檢測為陽性的樣品，直接免疫熒光檢測也都為陽性；8份由ELISA檢測為假陽性的樣品，直接免疫熒光檢測其中的6份為假陽性，另2份為陽性；6份由ELISA檢測為陰性的樣品，直接免疫熒光檢測其中的5份為陰性，另1份為假陽性；從上述檢測的結(jié)果來看，藻紅蛋白直接免疫熒光檢測檢測具有較好的特異性，與ELISA檢測結(jié)果相比較，陽性的檢出率為100％、假陽性的檢出率為75％、陰性檢出率為83.3％、總體檢出率為94.55％，說明NC膜為固相載體的藻紅蛋白直接免疫熒光法與ELISA具有高的符合度。
利用藻紅蛋白熒光探針直接免疫熒光檢測煙草花葉病毒，具有選擇性強、試樣量少和方法簡便等優(yōu)點，與目前植物病毒常用的檢測方法ELISA相對比，直接免疫熒光檢測法以硝酸纖維素膜為載體，膜片狀載體操作簡單、方便、步驟少，檢測所用的時間短，同時不需要比較昂貴的酶標(biāo)抗體，相對經(jīng)濟。此外，藻紅蛋白來自天然海藻，作為熒光探針安全無害，克服傳統(tǒng)化學(xué)合成的熒光素類熒光探針的合成所帶來的危害，蛋白本身熒光強度高，長期保存無明顯衰減的熒光特性，這都預(yù)示的藻紅蛋白作為熒光探針在檢測上應(yīng)用具有巨大潛力。
具體實施例方式
為了充分公開本發(fā)明的一種利用藻紅蛋白熒光探針檢測煙草花葉病毒的方法，現(xiàn)結(jié)合實施例加以說明。
實施例一種利用藻紅蛋白熒光探針檢測煙草花葉病毒的方法，包括以下步驟1.包被在硝酸纖維素膜上滴加3μl TMV抗體，各點間相隔1cm，置4℃，吸附2h。
2.封閉將硝酸纖維素膜直接浸入50mmol/L pH7.5PBS+2％BSA封閉液內(nèi)，37℃，溫育1h。
3.洗滌A配制100mmol/L pH7.5PBS+0.1％Tween20的洗滌緩沖液，并用洗滌緩沖液清洗硝酸纖維素膜至少三次，靜置干燥。
4.點樣滴加陽、陰性和待測樣品，各點3μl。、5.洗滌B待樣品液完全滲入硝酸纖維素膜，室溫靜置15min，用所述的洗滌緩沖液清洗膜片至少三次，靜置干燥。
6.熒光示蹤加入藻紅蛋白熒光探針3μl，在37℃溫育1h。
7.洗滌C用所述的洗滌緩沖液清洗硝酸纖維素膜至少三次，取出膜片用干凈的吸水紙去除殘余的液體。
8.檢測判定在倒置熒光顯微鏡下檢測儀器上觀察判定結(jié)果。
熒光免疫檢測儀器與判定標(biāo)準(zhǔn)以Leica倒置式熒光顯微鏡為檢測儀器，用肉眼觀察判定時，熒光信號的強度按以下標(biāo)準(zhǔn)判斷“-”表示無熒光；“-+”表示熒光較弱；“+”表示熒光清晰可見；“++”表示熒光明顯可見，強度大“+++～++++”表示熒光非常明亮；“-”定為陰性，“-+”定為假陽性，“+”及“+”以上的結(jié)果，均定為陽性。
待測樣品按以上標(biāo)準(zhǔn)，定性判斷分析樣品檢測結(jié)果的陰、陽性。
根據(jù)上述方法，配置所用的相應(yīng)試劑和材料，也可以組裝成檢測煙草花葉病毒的試劑盒，方便使用。
權(quán)利要求
1.一種利用藻紅蛋白熒光探針檢測煙草花葉病毒(Tobacco mosaicvirus，TMV)的方法，其特征在于使用的材料由藻紅蛋白熒光探針、硝酸纖維素膜、TMV多克隆抗體、陽性陰性對照品、封閉緩沖液和洗滌緩沖液組成；檢測方法如下(1)包被在硝酸纖維素膜上，滴加2-6μlTMV抗體，各點間相隔1-2cm的距離，置于4℃，吸附0.5-3h；(2)封閉將硝酸纖維素膜直接浸入20-100mmol/L pH7.5PBS+0.5-3％BSA封閉緩沖液內(nèi)，37℃溫育0.5-3h；(3)洗滌A配制50-200mmol/L pH7.5PBS+0.05-0.3％Tween20的洗滌緩沖液，并用洗滌緩沖液清洗硝酸纖維素膜至少三次，靜置干燥；(4)點樣滴加陽、陰性樣品和待測樣品，每孔2-6μl；(5)洗滌B待樣品液完全滲入硝酸纖維素膜，室溫靜置10-30min，用所述的洗滌緩沖液清洗膜片至少三次，靜置干燥；(6)熒光標(biāo)記示蹤加入藻紅蛋白熒光探針2-6μl，在37℃溫育0.5-3h；(7)洗滌C用所述的洗滌緩沖液清洗硝酸纖維素膜至少三次，取出膜片用干凈的吸水紙去除表面殘余的液體；(8)檢測判定將硝酸纖維素膜平鋪在干凈的玻璃片上，在倒置熒光顯微鏡下檢測觀察判定結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用藻紅蛋白熒光探針檢測煙草花葉病毒的方法，其特征在于藻紅蛋白熒光探針的制備方法如下(1)交聯(lián)蛋白交聯(lián)的兩種蛋白分別為6mg/ml，1.25ml的藻紅蛋白與4mg/ml，0.75ml煙草花葉病毒(TMV)多克隆抗體，二者的摩爾比為1∶1～2∶1；(2)異功能試劑活化蛋白用異功能試劑SPDP活化藻紅蛋白，二者摩爾比為80∶1～200∶1，反應(yīng)時間為15～60min；異功能試劑2-IT巰基化TMV多克隆抗體，二者摩爾比為160∶1～320∶1，反應(yīng)時間為0.5～3h；(3)混合反應(yīng)異功能試劑活化反應(yīng)后，脫鹽去除未反應(yīng)活化試劑；取等體積反應(yīng)物混合反應(yīng)，4℃，反應(yīng)6h；(4)中止反應(yīng)加入終止液NEM 80mmol/L 100μl中止交聯(lián)反應(yīng)，4℃反應(yīng)1h，將反應(yīng)物裝入透析夾中，透析濃縮；(5)純化分離交聯(lián)混合物將交聯(lián)混合物上樣于Superdex200HR凝膠層析拄(1.6×60cm)，以0.15ml/min流速，用0.15M NaCL+100mmol/L pH7.0PBS緩沖液洗脫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用藻紅蛋白熒光探針檢測煙草花葉病毒的方法，其特征在于藻紅蛋白的制備方法是在研碎機中充分磨碎海藻，用0.01M PBS pH7.0緩沖液浸提過夜，三層紗布過濾后，4℃下10000rpm離心15min，取上清液；然后用飽和度30％-45％硫酸銨分級沉淀蛋白，得粗制藻紅蛋白紅色沉淀；紅色沉淀溶于0.01M PBS pH7.0緩沖液，然后上樣于Superdex G-15脫鹽柱，脫鹽；收集的脫鹽液即可上樣于預(yù)先已用0.15MNaCl+0.01M PBS pH7.0緩沖液平衡好的羥基磷灰石柱，繼續(xù)用緩沖液沖洗30min后，再用0.15M NaCl+0.01M～0.2M pH7.0PBS緩沖液作線性梯度洗脫；洗脫液收集、濃縮、離心。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用藻紅蛋白熒光探針檢測煙草花葉病毒的方法，其特征在于所述的封閉，是將硝酸纖維素膜直接浸入50mmol/LpH7.5PBS+2％BSA封閉液內(nèi)，37℃，溫育1h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用藻紅蛋白熒光探針檢測煙草花葉病毒的方法，其特征在于所述的洗滌，是用100mmol/L pH7.5PBS+0.1％Tween20的洗滌緩沖液。
全文摘要
一種利用藻紅蛋白熒光探針檢測煙草花葉病毒(Tobaccomosaic virus，TMV)的方法，使用的材料由藻紅蛋白熒光探針、硝酸纖維素膜、TMV多克隆抗體、陽性陰性對照品、封閉緩沖液和洗滌緩沖液組成。主要運用藻紅蛋白標(biāo)記抗體和硝酸纖維素膜包被的固相抗體兩種抗體。檢測時固相抗體通過抗原反應(yīng)捕獲待測抗原，形成免疫復(fù)合物，加入藻紅蛋白熒光探針，與免疫復(fù)合物充分反應(yīng)，洗滌后在倒置熒光顯微鏡下檢測判定結(jié)果。藻紅蛋白直接免疫熒光法具有特異性強、試劑用量少、方法簡單、相對經(jīng)濟等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/544GK1715924SQ200510044139
公開日2006年1月4日 申請日期2005年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月25日
發(fā)明者吳祖建, 陳良華, 王盛, 林奇英, 謝聯(lián)輝 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)